RU2795163C2 - Триацетил-3-гидроксифениладенозин для получения фармацевтических препаратов для уменьшения количества циркулирующих в крови моноцитов - Google Patents

Abstract

Группа изобретений относится к применению триацетил-3-гидроксифениладенозина, представленного формулой (I)

при получении фармацевтических препаратов, содержащих эффективное количество триацетил-3-гидроксифениладенозина, для уменьшения количества циркулирующих в крови моноцитов у субъекта с гиперлипидемией. При этом эффективное количество находится в диапазоне от 50 до 200 мг/кг массы тела. Изобретения позволяют значительно уменьшать количество воспалительных мононуклеарных клеток, циркулирующих в крови у субъекта с гиперлипидемией. 2 н. и 2 з.п. ф-лы, 5 ил., 3 табл.

Description

Область техники

Настоящее изобретение относится к путям применения триацетил-3-гидроксифениладенозина и содержащей его фармацевтической композиции при получении фармацевтических препаратов для предупреждения и/или лечения моноцитоза, ассоциированного с гиперлипидемией, а также для предупреждения и/или лечения атеросклероза, что относится к области медицины.

Уровень техники

Независимо от того, имеют ли они место в развитых странах Западного региона или в Китае, сердечно-сосудистые заболевания стали причиной номер один оказания пагубного влияния на здоровье и жизнь человека вследствие изменений в привычках питания и качестве жизни людей.

Атеросклероз является одной из основных патологических основ сердечно-сосудистых и цереброваскулярных заболеваний. В ходе возникновения атеросклероза, он всегда сопровождается обостренной иммунной реакцией и воспалительной реакцией, а лимфоциты и липиды накапливаются в интиме аорты. Мононуклеарные клетки индуцируются воспалительными факторами, такими как богатые на липиды макрофаги-пенистые клетки и секретируемые медиаторы воспаления MCP-1 и IL-6, которым надлежит мигрировать в эндотелий сосудов для стимуляции миграции и пролиферации гладких мышечных клеток, а также они участвуют в образовании бляшек, разрыва и тромбоза.

Мононуклеарные клетки, как промежуточные клетки, непрерывно продуцируются в костном мозге, циркулируют в крови и мигрируют в ткани, а затем дополнительно дифференцируются в макрофаги, дендритные клетки и т.д. У мышей ApoE^-/-, получавших рацион с высоким содержанием жиров, по сравнению с получавшими рацион «chow», количество мононуклеарных клеток в циркулирующей крови увеличилось в 4 раза, и количество мононуклеарных клеток воспалительного фенотипа Ly6C^hi увеличилось в 14 раз, что значительно увеличивает количество макрофагов в атеросклеротических бляшках. В исследованиях на мышах, страдающих атеросклерозом, было обнаружено, что воспалительные мононуклеарные клетки, полученные из костного мозга, являются предшественниками воспалительных макрофагов и составляют основные компоненты артериальной бляшки, а большое количество исследований продемонстрировало, что мононуклеарные клетки/макрофаги активированы при атеросклерозе. Ox-LDL непрерывно фагоцитируется макрофагами и развивается в пенистые клетки, и образование пенистых клеток является важным индикатором раннего атеросклероза. Таким образом, воспалительный сигнальный путь активируется, а затем усугубляет воспалительную реакцию. Следовательно, воспалительные мононуклеарные клетки играют важную роль в возникновении и развитии атеросклероза.

Триацетил-3-гидроксифениладенозин (патент № ZL200980101131.6, публикация № CN101874036B и дата публикации 25 января 2012 г.) представляет собой новое соединение структурного типа со значительной регулирующей липиды в крови активностью, выбранное Институтом фармакологии (IMM) при Китайской академии медицинских наук (CAMS) из производных кордицепина, и при этом соединение характеризуется низкой токсичностью и хорошими фармакокинетическими параметрами и в настоящее время находится на стадии доклинического исследования. О применении этого соединения при лечении ассоциированного с атеросклерозом воспалительного мононуклеоза не сообщалось.

Краткое описание изобретения

Технической задачей, подлежащей решению в соответствии с настоящим изобретением, является обеспечение путей применения триацетил-3-гидроксифениладенозина, представленного формулой (I), при получении фармацевтических препаратов для предупреждения и/или лечения моноцитоза, ассоциированного с гиперлипидемией, а также для предупреждения и/или лечения атеросклероза.

Для решения технических задач по настоящему изобретению, настоящее изобретение предусматривает изложенные ниже технические решения.

Первый аспект технического решения по настоящему изобретению предусматривает пути применения триацетил-3-гидроксифениладенозина, представленного формулой (I), при получении фармацевтических препаратов для предупреждения и/или лечения моноцитоза, ассоциированного с гиперлипидемией,

Второй аспект технического решения по настоящему изобретению предусматривает пути применения триацетил-3-гидроксифениладенозина, представленного формулой (I), при получении фармацевтических препаратов для предупреждения и/или лечения атеросклероза,

Кроме того, предупреждение и/или лечение атеросклероза относится к предупреждению и/или лечению воспалительного моноцитоза, ассоциированного с атеросклерозом.

При этом лечение атеросклероза триацетил-3-гидроксифениладенозином относится к процессу, при котором воспалительные мононуклеарные клетки могут мигрировать из костного мозга в циркулирующую кровь. Значительное увеличение количества циркулирующих в крови воспалительных мононуклеарных клеток, ассоциированных с атеросклерозом, может быть нормализовано, при этом количество циркулирующих в крови воспалительных мононуклеарных клеток Ly6C^hi может быть уменьшено, уровень воспалительных хемокинов MCP-1 в сыворотке крови может быть снижен, воспалительная реакция может быть уменьшена и, таким образом, интенсивность образования артериальных бляшек может быть снижена.

Существенный эффект триацетил-3-гидроксифениладенозина в отношении лечения моноцитоза, ассоциированного с атеросклерозом, был продемонстрирован в настоящем изобретении с применением способов исследования фармакодинамики, так что существует научная основа для клинического применения триацетил-3-гидроксифениладенозина при лечении моноцитоза, ассоциированного с атеросклерозом.

Третий аспект технического решения по настоящему изобретению предусматривает пути применения фармацевтической композиции при получении фармацевтических препаратов для предупреждения и/или лечения моноцитоза, ассоциированного с гиперлипидемией, и при получении фармацевтических препаратов для предупреждения и/или лечения атеросклероза. При этом предупреждение и/или лечение атеросклероза относится к предупреждению и/или лечению воспалительного моноцитоза, ассоциированного с атеросклерозом. Фармацевтическая композиция содержит триацетил-3-гидроксифениладенозин в соответствии с первым аспектом и фармацевтически приемлемый носитель или добавку.

Фармацевтическая композиция может быть получена в соответствии со способами, известными из уровня техники. Соединение по настоящему изобретению может быть объединено с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми твердыми или жидкими наполнителями и/или вспомогательными веществами, которые подлежат получению в виде любых лекарственных форм, пригодных для применения человеком или животным. Содержание соединения по настоящему изобретению в его фармацевтической композиции обычно составляет от 0,1 до 95% по весу.

Соединение по настоящему изобретению или содержащую его фармацевтическую композицию можно вводить в виде единичной лекарственной формы внутривенно или парентерально, как, например, путем перорального введения, внутривенной инъекции, внутримышечной инъекции, подкожной инъекции, введения в полость носа, слизистой оболочки полости рта, введения в глаза, легкое и через дыхательный тракт, кожу, влагалище и прямую кишку и т. д.

Лекарственные формы могут представлять собой жидкие, твердые или полутвердые лекарственные формы. Жидкие лекарственные формы могут представлять собой растворы (в том числе истинные растворы и коллоидные растворы), эмульсии (в том числе по типу «масло в воде», по типу «вода в масле» и несколько эмульсий), суспензии, растворы для инъекций (в том числе воду для инъекций, порошки для приготовления раствора для инъекций и растворы для инфузий), глазные капли, капли для носа, лосьоны и настойки. Твердые лекарственные формы могут представлять собой таблетки (в том числе обычные таблетки, таблетки, покрытые кишечнорастворимой оболочкой, буккальные таблетки, диспергируемые таблетки, жевательные таблетки, шипучие таблетки, таблетки, распадающиеся в полости рта), капсулы (в том числе твердые капсулы, мягкие капсулы и капсулы, покрытые кишечнорастворимой оболочкой), гранулы, порошки, микрокапсулы, быстро растворяющиеся в жидкости таблетки, суппозитории, пленки, пластыри, аэрозоли, спреи и т. д.; полутвердые лекарственные формы могут представлять собой мази, гели, пасты и т. д. Предпочтительные лекарственные формы фармацевтической композиции выбраны из группы, состоящей из таблеток, капсул, пилюль и растворов для инъекций.

Соединение по настоящему изобретению может быть получено в виде обычных препаратов или препаратов с замедленным высвобождением, препаратов с контролируемым высвобождением, препаратов для целенаправленной доставки и различных систем для доставки микрочастиц.

Для получения соединения по настоящему изобретению в виде таблеток могут широко применяться различные наполнители, известные из уровня техники, в том числе разбавители, связующие вещества, увлажняющие средства, разрыхлители, смазывающие средства и вещества, способствующие скольжению. Разбавитель может представлять собой крахмал, декстрин, сахарозу, глюкозу, лактозу, маннит, сорбит, ксилит, микрокристаллическую целлюлозу, сульфат кальция, гидрофосфат кальция, карбонат кальция и т. д. Увлажняющее средство может представлять собой воду, этанол, изопропанол и т. д.; связующее вещество может представлять собой крахмальный сироп, декстрин, сироп, мед, раствор глюкозы, микрокристаллическую целлюлозу, клейкое вещество из акации, желатиновую суспензию, карбоксиметилцеллюлозу натрия, метилцеллюлозу, гидроксипропилметилцеллюлозу, этилцеллюлозу, акриловую смолу, карбомер, поливинилпирролидон, полиэтиленгликоль и т. д. Разрыхлители могут представлять собой сухой крахмал, микрокристаллическую целлюлозу, гидроксипропилцеллюлозу с низким уровнем замещения, кросполивинилпирролидон, кроскармеллозу натрия, карбоксиметилкрахмал натрия, гидрокарбонат натрия и лимонную кислоту, сложный эфир полиоксиэтиленсорбита и жирной кислоты и додецилсульфат натрия и т. д. Смазывающие средства и вещества, способствующие скольжению, могут представлять собой тальк, кремнезем, стеарат, винную кислоту, жидкий парафин и полиэтиленгликоль и т. д.

Кроме того, таблетки также могут быть получены в виде таблеток, покрытых оболочкой, таких как таблетки с сахарной оболочкой, таблетки с пленочной оболочкой, таблетки с кишечнорастворимой оболочкой или двухслойные таблетки и многослойные таблетки.

Для получения единицы введения в виде капсулы, активный ингредиент по настоящему изобретению может быть смешан с разбавителем, веществом, способствующим скольжению, и смесь может быть непосредственно помещена в твердую или мягкую капсулу. Активный ингредиент по настоящему изобретению также может быть гранулирован или пеллетирован с разбавителем, связующим веществом или разрыхлителем, а затем помещен в твердую или мягкую капсулу. Широкое разнообразие разбавителей, связующих веществ, увлажняющих средств, разрыхлителей и веществ, способствующих скольжению, применяемых для получения таблеток на основе соединений по настоящему изобретению, можно также применять при получении капсул на основе соединений по настоящему изобретению.

Для получения соединения по настоящему изобретению в виде инъекции в качестве растворителя могут быть добавлены вода, этанол, изопропиловый спирт, пропиленгликоль или их смеси и добавлено соответствующее количество солюбилизатора, сорастворителя, модификатора pH и регулятора осмотического давления, обычно применяемых в уровне техники. Солюбилизаторы или вещества, способствующие скольжению, могут представлять собой полоксамеры, лецитины, гидроксипропил-бета-циклодекстрины и т. д.; модификатор pH может представлять собой фосфат, ацетат, хлористоводородную кислоту и гидроксид натрия и т. д.; и модификатор осмотического давления может представлять собой хлорид натрия, маннит, глюкозу, фосфат и ацетат и т. д. Для получения лиофилизированных порошков для приготовления раствора для инъекций в качестве проппанта также могут быть добавлены маннит, глюкоза и т. д.

В дополнение, по необходимости к фармацевтическому препарату также могут быть добавлены красители, консерванты, отдушки, вкусоароматические вещества или другие добавки.

Для достижения цели введения и усиления терапевтического эффекта, фармацевтический препарат или фармацевтическую композицию по настоящему изобретению можно вводить любым известным способом введения.

Доза при введении фармацевтической композиции на основе соединения по настоящему изобретению может значительно варьировать в зависимости от природы и тяжести заболевания, которое подлежит предупреждению или лечению, индивидуального состояния пациента или животного, а также способов введения и лекарственных форм и т. д. В общем, подходящие суточные дозы для соединений по настоящему изобретению будут варьировать от 0,001 до 150 мг/кг массы тела, предпочтительно от 0,1 до 100 мг/кг массы тела, более предпочтительно от 1 до 60 мг/кг массы тела и наиболее предпочтительно от 2 до 30 мг/кг массы тела. Вышеуказанные дозы можно вводить в одной дозированной единице или в нескольких дозированных единицах, в зависимости от клинического опыта врача и режима дозирования, который включает применение других средств лечения.

Соединение или композицию по настоящему изобретению можно вводить отдельно или в сочетании с другими терапевтическими фармацевтическими препаратами или симптоматическими фармацевтическими препаратами. В случае если соединение по настоящему изобретению обладает синергическим эффектом с другими терапевтическими фармацевтическими препаратами, то его доза должна быть скорректирована в соответствии с фактическими условиями.

Положительные технические эффекты

Настоящее изобретение обеспечивает новый терапевтический фармацевтический препарат на основе триацетил-3-гидроксифениладенозина для лечения атеросклероза, который представляет собой сложное патологическое хроническое заболевание с неудовлетворительным терапевтическим эффектом. Терапевтический фармацевтический препарат характеризуется значительным лечебным эффектом при лечении воспалительного мононуклеоза, ассоциированного с атеросклерозом, с небольшими токсическими побочными эффектами и безопасностью.

Краткое описание графических материалов

Далее данное изобретение будет описано со ссылкой на варианты осуществления настоящего изобретения и прилагаемые чертежи, чтобы сделать содержание настоящего изобретения более понятным, на которых показано следующее.

На фиг. 1 проиллюстрировано сравнение количества циркулирующих в крови мононуклеарных клеток золотистых хомяков в соответствии с экспериментальным примером по настоящему изобретению.

На фиг. 2 проиллюстрировано сравнение результатов проточного анализа у мышей apoE^-/- циркулирующих в крови мононуклеарных клеток, воспалительных мононуклеарных клеток и резидентных фенотипических мононуклеарных клеток в соответствии с экспериментальным примером по настоящему изобретению; при этом количество мононуклеарных клеток Ly6C^hi периферической крови было уменьшено с помощью IMM-H007. (A) Мононуклеарные клетки периферической крови мышей apoE^-/-, получавших рацион с высоким содержанием жиров, разделяли и метили антителами к CD11b, CD90, B220, CD49b, NK1.1 и Ly-6G и соотношение мононуклеарных клеток CD11b^hiCD90^loB220^loCD49b^lo NK1.1^loLy-6G^lo подвергали анализу на категоризацию по типу и (B) мононуклеарные клетки Ly-6C и мононуклеарные клетки Ly-6C^lo дополнительно анализировали с помощью маркирования антителом к Ly6C, и соотношение клеток представлено средним значением ±SEM; (C) мононуклеарные клетки CD11b цельной крови, (D) мононуклеарные клетки Ly6C^hi всей периферической крови.

На фиг. 3 проиллюстрировано сравнение уровней MCP-1 и IL-6 в сыворотке крови у мышей apoE^-/- в соответствии с экспериментальным примером по настоящему изобретению.

На фиг. 4 проиллюстрировано сравнение количества воспалительных мононуклеарных клеток в артериальных бляшках мышей apoE^-/- в соответствии с экспериментальными примерами по настоящему изобретению.

На фиг. 5 проиллюстрировано сравнение корней аорты и окрашивание аорты на всю длину масляным красным О в каждой группе мышей apoE^-/- в соответствии с экспериментальным примером по настоящему изобретению.

Подробное описание изобретения

Следующие варианты осуществления используются для дополнительной иллюстрации настоящего изобретения, но это не означает каких-либо ограничений в отношении настоящего изобретения.

Экспериментальный пример 1: пути применения триацетил-3-гидроксифениладенозина (IMM-H007) при лечении моноцитоза, ассоциированного с гиперлипидемией.

I. Экспериментальные материалы

1. Реагенты

Реагенты Abbott CD3700 для анализа цельной крови, в том числе разбавители, гемолитические средства, растворы для оболочек, моющие жидкости и растворы для очистки ферментов; антикоагулянт EDTA-2К.

2. Аппарат

Анализатор цельной крови (Abbott, США).

3. Экспериментальное животное

Двадцать сирийских золотистых хомяков (хомяки LVG, полученные из лабораторий Charles River) в возрасте 6-8 недель, весом 90-120 г, самцы, степень SPF и приобретенные у Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.

II. Экспериментальный способ

1. Разделение на группы и кормление животных

Через 7 дней адаптивного питания животных случайным образом разделяли на нормальную контрольную группу (n=13), группу, получавшую корм с высоким содержанием жиров (n=13), группу, получавшую низкую дозу IMMH007 (50 мг/кг, n=13), группу, получавшую среднюю дозу IMMH007 (100 мг/кг, n=13), и группу, получавшую высокую дозу IMMH007 (200 мг/кг, n=13), и вводили им два раза в день через желудочный зонд. Животных кормили во втором отделении Экспериментального центра исследования животных Института фармакологии (IMM) при Китайской академии медицинских наук (CAMS); условием кормления была степень SPF, температура составляла 21±2 град. Цельсия, относительная влажность составляла 50±5%, цикл освещения составлял 12/12 и 5 на клетку. Нормальную группу кормили обычным основным кормом, а группу, получавшую корм с высоким содержанием жиров, кормили кормом с высоким содержанием жиров (79,8% основного корма, 20% полутвердого жира и 0,2% холестерина), и при этом животные свободно принимали пищу и пили. Корма были произведены Beijing HFK Bioscience Co., Ltd.

2. Наблюдение признаков и способы измерения

2.1. Измерение количества циркулирующих в крови мононуклеарных клеток

Животные голодали в течение 12 часов, и из кантуса каждого глаза брали приблизительно 200 мкл крови, кровь растворяли в 30 мкл антикоагулянта EDTA-2К (20 г/л, полученный с нормальным физиологическим раствором), слегка перемешивали, чтобы избежать коагуляции, и клетки цельной крови анализировали с помощью анализатора клеток цельной крови.

III. Результаты экспериментов

Эффект IMM-H007 в отношении циркулирующих в крови мононуклеарных клеток сирийских золотистых хомяков, получавших рацион с высоким содержанием жиров.

На фиг. 1 и в таблице 1 можно видеть, что по сравнению с модельной группой, IMM-H007 способен значительно уменьшать количество мононуклеарных клеток в циркулирующей крови сирийских золотистых хомяков.

Таблица 1. Эффект IMM-H007 в отношении циркулирующих в крови мононуклеарных клеток сирийских золотистых хомяков

Экспериментальный пример 2: пути применения триацетил-3-гидроксифениладенозина (IMM-H007) при обработке в мышиной модели моноцитоза циркулирующей крови, ассоциированного с атеросклерозом.

I. Экспериментальные материалы

1. Реагенты

Заливочное средство OCT для срезов, изготовленных из замороженных тканей, Sakura of America; пентобарбитал натрия, Sigma-Aldrich; PEG6000, Sigma-Aldrich; глицин, Sigma-Aldrich; параформальдегид, масляный красный О, Sigma-Aldrich; окрашенный раствор HE, Baso, Тайвань.

2. Аппарат

Многоцелевая низкотемпературная высокоскоростная центрифуга, Eppendorff, Германия; замораживающий микротом, Leica, Германия; термостатическая водяная ванна с водяной рубашкой; интерактивный считыватель En Vision, PerkinElmer, Inc., США; небольшая машина для анестезии животных, Matrx products, США.

3. Экспериментальное животное

Мыши ApoE^-/- (фон C57BL), возрастом 5-7 недель, масса тела 18-22 г, самцы, степень SPF; приобретено в Пекинском научном институте лабораторных животных.

II. Экспериментальный способ

1. Разделение на группы и кормление животных

Через 7 дней адаптивного питания животных случайным образом разделяли на группу, получавшую корм с высоким содержанием жиров (n=7), группу, получавшую низкую дозу IMMH007 (50 мг/кг, n=7), группу, получавшую среднюю дозу IMMH007 (100 мг/кг, n=7), и группу, получавшую высокую дозу IMMH007 (200 мг/кг, n=9), и вводили им один раз в день через желудочный зонд. Животных кормили во втором отделении Экспериментального центра исследования животных Института фармакологии (IMM) при Китайской академии медицинских наук (CAMS); условием кормления была степень SPF, температура составляла 21±2 град. Цельсия, относительная влажность составляла 50±5%, цикл освещения составлял 12/12 и 5 на клетку. Все группы получали рацион с высоким содержанием жиров (70% основного рациона плюс 20% полутвердого жира и 0,2% холестерина), и при этом животные свободно принимали пищу и пили. Корм был произведен Beijing HFK Bioscience Co., Ltd. Массу тела регистрировали один раз в неделю во время эксперимента.

2. Наблюдение признаков и способы измерения

2.1. Измерение количества циркулирующих в крови мононуклеарных клеток

Животные голодали в течение 12 часов; и экстрагировали приведенные ниже клетки.

Клетки рециркулирующей крови. Отбирали 50 мкл крови с помощью пункции сердца, помещали в 450 мкл антикоагулянта, представляющего собой гепарин, добавляли 1 мл буфера для лизиса эритроцитов, лизировали в течение 10 минут, центрифугировали при 1800 об./мин. в течение 3 мин., супернатант удаляли путем аспирации и для последующего применения получали 100 мкл суспензионных клеток PBS. У мертвой мыши отбирали кровь из угловой вены и сыворотку крови отделяли и хранили при -80 град. Цельсия.

К вышеуказанным клеткам крови добавляли антитела:

3 мкл CD90-PE, 3 мкл B220-PE, 3 мкл CD49b-PE, 3 мкл NK1.1-PE, 3 мкл Ly-6G-PE, 6 мкл CD11b-percp и 3 мкл Ly-6C-FITC и обеспечивали наличие единственной пробирки для положительных результатов и пустой пробирки для контроля, инкубировали их с выравниванием в течение 30 мин., промывали 3 раза с помощью PBS, и повторно отобранные клетки с 400 мкл PBS фильтровали, и осуществляли проточную цитометрию. Мононуклеарные клетки идентифицировали как клетки CD11b^hiCD90^loB220^loCD49b^loNK1.1^loLy-6G^lo. В соответствии с экспрессией Ly6C, Ly6C экспрессировался на высоком уровне как мононуклеарные клетки LY6C^hi в воспалительных мононуклеарных клетках, а Ly6C экспрессировался на низком уровне как мононуклеарные клетки Ly6Clo в резидентных фенотипических мононуклеарных клетках.

После того, как у мыши были отобраны селезенка и костный мозг, сердце медленно перфузировали нормальным физиологическим раствором, и при этом сердце мыши выделяли и хранили в 4% параформальдегиде.

2.2. Анализ мононуклеарных клеток Ly6C^hi в артериальной бляшке во всей длине аорты

После того, как животные голодали в течение 12 часов, у животных брали кровь из кантуса глаз, и вырезали грудную клетку и живот под стереомикроскопом, при этом через сердце и кровеносные сосуды перфузировали физиологический раствор. Удерживая кровеносные сосуды во влажном состоянии, аорту очищали на всю длину, а жировую ткань ее поверхности удаляли. Жировую ткань отделяли, промывали с помощью PBS, добавляли смешанный фермент (125 ед./мл коллагеназы XI типа, 60 ед./мл гиалуронидазы, 60 ед./мл дезоксирибозасинтазы и 450 ед./мл коллагеназы I типа, растворяли в 2,5 мл PBS), кровеносные сосуды разрезали на части ножницами, инкубировали для переработки при 37 град. Цельсия в течение 1 ч., фильтровали с помощью 0,22 мкм фильтровальной мембраны, центрифугировали при 1600 об./3 мин., супернатант отбрасывали, добавляли 100 мкл PBS и добавляли антитела:

3 мкл CD90-PE, 3 мкл B220-PE, 3 мкл CD49b-PE, 3 мкл NK1.1-PE, 3 мкл Ly-6G-PE, 6 мкл CD11b-percp, 3 мкл Ly-6C-FITC, 10 мкл F4/80-APC, 4 мкл CD11C-APC и 4 мкл I-Ab-APC; и обеспечивали наличие единственной пробирки для положительных результатов и пустой пробирки для контроля, инкубировали их с выравниванием в течение 30 мин., промывали 3 раза с помощью PBS и повторно отобранные клетки с 400 мкл PBS фильтровали и осуществляли проточную цитометрию.

2.3. Анализ воспалительных факторов в сыворотке крови

Воспалительные факторы в сыворотке крови мышей анализировали с помощью набора для проточного измерения воспалительных факторов мышей BD (продукт № 552364).

2.4. Анализ корня аорты и площади бляшки аорты по всей длине

2.4.1. Получение срезов, изготовленных из замороженных тканей

Перед получением срезов сердечной ткани температуру морозильной камеры микротома устанавливали на -19 град. Цельсия, а для верхней части образца устанавливали -21 град. Цельсия. Сердце, хранящееся в 4% параформальдегиде, было залито в OCT. Жидкий азот быстро замораживал, и ткань помещали на столик для образцов микротома с целью уравновешивания температуры. После восстановления масс тканей, из них последовательно получали срезы с толщиной срезов, составляющей 8 мкм, и прикрепляли их к чистому стеклу, покрытому полилизином.

2.4.2. Окрашивание масляным красным O

2.4.2.1 Окрашивание масляным красным O срезов, изготовленных из замороженных тканей. Получали 5% исходный раствор масляного красного O с изопропиловым спиртом, затем равномерно смешивали с водой в соотношении 3:2, фильтровали с помощью двухслойной фильтровальной бумаги и добавляли его в резервуар для окрашивания. Выбранные срезы помещали в подвесную корзину, окрашивали в красильном баке в течение 2 часов, подвергали разделению по цвету с помощью 60% изопропилового спирта в течение нескольких секунд, слегка промывали водопроводной водой, докрашивали гематоксилином в течение 3-5 минут, промывали водопроводной водой в течение 2 минут и помещали обратно в корзину, герметично закрывали срезы глицерожелатином, и наблюдали, и фотографировали под стереомикроскопом.

2.4.2.2. Окрашивание аорты по всей длине масляным красным О: аорту вырезали по всей длине, окрашивали масляным красным О в течение 4 ч., прополаскивали изопропиловым спиртом, закрепляли на стереомикроскопе и делали снимки с помощью камеры.

3. Анализ данных

Данные были представлены в виде среднего значения ± стандартная ошибка. Все данные были статистически проанализированы с помощью ONEWAY-ANOVA с использованием программного обеспечения Graphpad Prism 5.0. Изображения сравнивали и анализировали.

III. Результаты экспериментов

3.1. Эффект IMM-H007 в отношении циркулирующих в крови мононуклеарных клеток мышей, страдающих атеросклерозом

Как можно видеть на фиг. 2, по сравнению с модельной группой IMM-H007 способен значительно уменьшать количество циркулирующих мононуклеарных клеток у мышей apoE^-/- (фиг. 2C, таблица 2) и количество воспалительных мононуклеарных клеток (фиг. 2D, таблица 3).

Таблица 2. Эффект IMM-H007 в отношении циркулирующих в крови мононуклеарных клеток мышей apoE^-/-

Таблица 3. Эффект IMM-007 в отношении циркулирующих в крови воспалительных мононуклеарных клеток мышей apoE^-/-

3.2. Эффект IMM-H007 в отношении уровня воспалительных факторов в сыворотке крови мышей, страдающих атеросклерозом

Дополнительно наблюдали эффект IMM-H007 в отношении уровня воспалительных факторов в сыворотке крови мышей, чтобы выяснить, способен ли IMM-H007 значительно снижать уровень MCP-1 (фиг. 3A) и уровень IL-6 (фиг. 3B) в сыворотке крови.

3.3. Эффект IMM-H007 в отношении количества воспалительных мононуклеарных клеток в артериальных бляшках мышей, страдающих атеросклерозом

Дополнительно наблюдали эффект IMM-H007 в отношении количества воспалительных мононуклеарных клеток в артериальных бляшках мышей, чтобы выяснить, способен ли IMM-H007 значительно уменьшать количество воспалительных мононуклеарных клеток Ly6C^hi в артериальных бляшках мышей (фиг. 4).

3.4. Эффект IMM-H007 в отношении формирования артериальных бляшек у мышей, страдающих атеросклерозом

Посредством окрашивания масляным красным О корня аорты и аорты по всей длине мышей apoE^-/- может быть обнаружено, что IMM-H007 способен значительно уменьшать площадь артериальных бляшек по всей длине аорты и корня аорты мышей apoE^-/-. (фиг. 5).

Claims (8)

1. Применение эффективного количества триацетил-3-гидроксифениладенозина, представленного формулой (I), при получении фармацевтических препаратов для уменьшения количества циркулирующих в крови моноцитов у субъекта с гиперлипидемией,

отличающееся тем, что эффективное количество находится в диапазоне от 50 до 200 мг/кг массы тела.

2. Применение фармацевтической композиции при получении фармацевтических препаратов для уменьшения количества циркулирующих в крови моноцитов у субъекта с гиперлипидемией, где фармацевтическая композиция содержит эффективное количество триацетил-3-гидроксифениладенозина, представленного формулой (I), и фармацевтически приемлемых носителей или наполнителей,

отличающееся тем, что эффективное количество находится в диапазоне от 50 до 200 мг/кг массы тела.

3. Применение по п.2, где фармацевтическая композиция представлена в виде таблетки, капсулы, пилюли или раствора для инъекций.

4. Применение по п.2, где фармацевтическая композиция представляет собой препарат с замедленным высвобождением, препарат с контролируемым высвобождением или различные системы доставки на основе микрочастиц.

Images