RU2795135C2

RU2795135C2 - Способ культивирования клеток плодов свиньи для вирусологии

Info

Publication number: RU2795135C2
Application number: RU2021130242A
Authority: RU
Inventors: Ольга Семеновна Федотова; Юлия Александровна Захарова; Наталья Анатольевна Шмелева; Иван Владимирович Вылых; Анна Владимировна Остапчук
Filing date: 2021-10-18
Publication date: 2023-04-28

Abstract

Изобретение относится к биотехнологии. Описан способ получения неимортализованного штамма монослойной культуры клеток почек плодов свиньи. Эмбриональные клетки почки плодов свиньи на поздней стадии развития, полученные методом щадящей трипсинизации, выращивают на смеси питательных сред: 0,5% ГЛА и игла МЕМ 1:1 с 10% фетальной сывороткой крови телят (FBS). Предел культивирования клеток почек плодов свиньи составляет 22 пассажа. Для диспергирования клеточного пласта при пересевах используют смесь 0,25% раствора трипсина и 0,02% раствора Версена в соотношении 1:3 при температуре +37°С. Для криоконсервирования при температуре - 196°С используют 95% FBS с добавлением 5% DMSO, при концентрации клеток 2-3×10⁶ в мл. Изобретение позволяет получать чувствительный к энтеровирусам человека Coxsackievirus B5 и вирусу простого герпеса I типа. 4 табл., 3 пр.

Description

Изобретение относится к клеточной биологии и вирусологии, в частности к области культивирования клеток и тканей с целью наработки и изучения вирусов, и может быть использовано для изучения биологии вирусов, в диагностических исследованиях и в качестве тест-объектов для оценки безопасности и эффективности новых лекарственных препаратов.

Уровень техники

Развитие современной вирусологии в значительной мере определяется наличием эффективных клеточных систем, позволяющих проводить эксперименты и осуществлять диагностику. Для изучения свойств вирусов, используют органные культуры и клеточные культуры [1]. Широкое использование клеточных штаммов и линий в вирусологической практике связано с простотой их культивирования, однородностью клеточного состава и возможностью подсчета клеток [2]. Клеточные линии представляют собой незаменимую биосистему для титрования вирусов и изучения биохимических и молекулярно-биологических механизмов вирусного размножения в клетках [3].

В последние годы отмечен рост заболеваемости энтеральными вирусными инфекциями (ЭВИ) [4]. Особенностью энтеровирусных инфекций является то, что сходные клинические проявления болезни этиологически могут быть связаны с различными серотипами энтеровирусов; вместе с тем, представители одного и того же серотипа могут вызывать различные клинические формы заболевания [5].

Наиболее пригодными для проведения лабораторных исследований энтеровирусов считаются следующие перевиваемые клеточные культуры: RD, Hep-2 (Cincinnatti), BGM [6]. Культура клеток RD эмбриональная рабдомиосаркома человека, обладает высокой чувствительностью к вирусам полиомиелита, многим типам вируса ЕСНО, некоторым вирусам Коксаки А. Вирусы полиомиелита и вирусы Коксаки В хорошо размножаются в культуре клеток Нер-2, полученной из эпидермоидной карциномы человека. Культура клеток BGM - перевиваемая культура клеток почек африканской зеленой мартышки, чувствительна к вирусам полиомиелита и вирусам Коксаки В.

Недостаток этих культур состоит в том, что некоторые штаммы энтеровирусов не обладают цитопатогенностью ни для одной из них и могут быть выделены только с использованием эмбриональных клеток человека или чувствительных лабораторных животных, что достаточно сложно в условиях практической лаборатории [7].

Вирус простого герпеса I-типа (ВПГ-1) – высококонтагиозная инфекция, широко распространенная и эндемичная во всем мире. Инфицирование ВПГ-1 происходит в большинстве случаев в детстве, и инфекция остается на всю жизнь. По оценкам, в 2016 г. около 3,7 миллиарда человек в возрасте до 50 лет, или 67% населения, в мире инфицированы ВПГ-1 [8].Эффективными лекарственными средствами для лиц, инфицированных ВПГ, являются противовирусные препараты. Они способствуют облегчению симптомов и снижению частоты их появления, но не приводят к полному излечению. Для разработки более эффективных методов профилактики инфекций, вызываемых ВПГ, проводятся дополнительные исследования, в том числе таких, как вакцины. Таким образом, получение новых клеточных культур являются перспективными для производства вирусных вакцин [9].

Решение этой проблемы возможно путём получения неимортализованного штамма культуры плодов клеток свиньи, как организма наиболее близкого к человеку по иммунобиологическому статусу [10].

Известна перевиваемая линия монослойной культуры клеток почки эмбриона свиньи, СПЭВ, полученная в 1959 г. К.С. Куликовой и др. в Московском научно-исследовательском институте вирусных препаратов.

Морфология:эпителиоподобная.

Способ культивирования:монослойный.

Условия культивирования:среда - ЕМЕМ или DMEM или 199.

сыворотка - эмбриональная бычья 10% или КРС 10%.

cнятие клеток - используя трипсин 0.25%: версен 0.02% (1:3) или версен 0,04%.

кратность рассева - 1:3-1:10.

оптимальная плотность - 0,9.0х10⁴клеток/мл.

криоконсервация - ростовая среда (можно добавить 30% КРС), 5-10% DMSO или глицерина, 1,0-1,5х10⁶клеток/мл в ампуле.

Жизнеспособность после криоконсервации:90-96% (окраска трипановым синим на нулевом пассаже).

Контроль контаминации:бактерии и грибы не обнаружены.

Кариология:2n= 38, пределы изменчивости по числу хромосом 39-42 , модальное число хромосом 40, количество маркеров – 10 (дифференциальная окраска), количество полиплоидов 1,6%.

Чувствительность к вирусам: арбовирусы А и В; энтеровирусы свиней; грипп; ротавирусы, коронавирусы, энцефаломиокардит свиней, ящур, ринопневмония лошадей.

Недостатки этой культуры состоят в низкой активности вирусного материала, выращенного в данной культуре клеток; отсутствии чувствительности к этеровирусам человека и присутствии лейковирусов Мезон-Пфайфер-подобных и онкорнавирусов.

Известна также имортализованная линия культуры клеток почки эмбриона свиньи СПЭВ-Г (Инф. бюлл. Ассоциации клеточных культур, С.-Петербург, 1997, N12.).

Морфология: эпителиоподобная.

Способ культивирования: монослойный.

Условия культивирования: среда – 0,5% ГСБМ, сыворотка - КРС 10%

cнятие клеток - используя трипсин 0,25%: версен 0,02% (1:9).

кратность рассева - 1:4-1:5.

криоконсервация - культуральная среда 50%, КРС 40%, DMSO 10%, 2,0-3,0х10⁶клеток/мл в ампуле.

Жизнеспособность после криоконсервации:78% (окраска трипановым синим на нулевом пассаже).

Контроль контаминации:бактерии, грибы не обнаружены.

Контроль видовой идентичности: кариологический анализ.

Кариология:2n= 38, модальное число хромосом 40.

Чувствительность к вирусам: рота- и коронавирусы свиней.

Недостаток этой культуры состоит в отсутствии чувствительности к вирусам человека.

Наиболее близким предлагаемому изобретению по совокупности существенных признаков является штамм диплоидных клеток легких эмбриона человека (ЛЭЧ-4(81), которая была получена в 1981 году Н.П. Глинских и др. в Свердловском научно-исследовательском институте вирусных инфекций [11].

Морфология: фибробластоподобных клеток

Способ культивирования: монослойный

Условия культивирования:

среда роста среда МЕМ: гидролизат лактальбумина (1:1) + 10% НБС;

способ пересева 1:2 . Снятие со стекла 0,02% раствором Версена;

доза посадки на пробирки: 200-220 тыс. кл./мл, на матрасы: 140-150 тыс. кл./мл.

Условия хранения: в среде роста + 10% глицерина в жидком азоте.

Восстановление культуры после криоконсервации: при размораживании восстанавливается 70 % клеток.

Кариологическая характеристика: соответствует кариотипу человека: 2n=46,разброс 44 - 49 хромосом. Модальный класс содержит 87 % клеток с нормальным диплоидным набором хромосом человека.

Чувствительность к вирусам:культура высокочувствительна к полиовирусам 1, 2, 3 типов, Коксаки В3, ЕСНО 3,6,11,13,19,20,24,28, РС-вирусам, вирусу простого герпеса.

Данная культура клеток имеет существенный недостаток, такой как получение и использование клеток эмбриона человека.

Задача изобретения: получение нового штамма неимортализованной клеточной культуры животного происхождения чувствительной к наиболее актуальным в настоящий период энтеровирусам человека Coxsackievirus B5 и вирусу простого герпеса I типа.

Технический результат: впервые получен неимортализованный штамм монослойной культуры клеток почек плодов свиньи, чувствительных к энтеровирусам человека Coxsackievirus B5 и вирусу простого герпеса I типа.

Сущность изобретения состоит в том, что за основу был взяты не эмбрионы человека, а хорошо сформированные плоды свиньи (II-го триместра развития), из которых в стерильных условиях извлекают почки, тканевые экспланты трипсинизируют и помещают в смесь питательных сред 0,5% ГЛА и игла МЕМ (1:1). В результате был получен монослой клеток органа животного происхождения, чувствительный к энтеровирусам человека и вирусу простого герпеса I типа, что позволило решить ряд этических и экономических проблем, связанных с использованием эмбрионов человека, и увеличило выход биологического материала в 4 раза, благодаря использованию плодов свиньи вместо эмбрионов.

Заявляется способ получения неимортализованного штамма культуры клеток почек плодов свиньи (ППС), чувствительной к энтеровирусам человека Coxsackievirus B5 и вирусу простого герпеса I типа, заключающийся в том, что в результате субкультивирования первично-трипсинизированных клеток ППС получен новый штамм клеток почек животного происхождения. Полученные клетки выращивают на смеси питательных сред: 0,5% ГЛА и игла МЕМ (1:1) с 10% фетальной сыворотки крови телят (FBS), на матрасе формируется монослой через 3-4 дня, предел культивирования составляет 22 пассажа, для диспергирования клеточного пласта при пересевах используют смесь 0,25% раствора трипсина и 0,02% раствора Версена в соотношении 1:3 при температуре +37ºС, для криоконсервирования при температуре – 196° С используют 95% FBS с добавлением 5% DMSO, при концентрации клеток 2-3 х10⁶ в мл.

В результате получают неимортализованный монослойный штамм культуры клеток ППС, чувствительный к энтеровирусам человека и вирусу простого герпеса Iтипа.

Реализация изобретения:

Неимортализованный штамм клеток ППС, получают методом «щадящей» трипсинизации из почек 16 плодов свиньи II-триместра супоросности [12]. Изъятие и транспортировку матки с плодами проводят при соблюдении принципов этического кодекса «Международных рекомендаций по проведению биомедицинских исследований с использованием животных» (CIOMS).

Штамм клеток ППС характеризуется следующими признаками. Культуральные свойства. При посевной дозе 150-200х10³клеток/мл монослой формируется на 3-4 культивирования и сохраняется на пластике больше 14 дней. Коэффициент пересева – 1:2.

Штамм клеток ППС выращивается на смеси питательных сред: 0,5% ГЛА и игла МЕМ (1:1) с 10% фетальной сыворотки крови телят (FBS). Предел культивирования клеток ППС составляет 22 пассажа. Для диспергирования клеточного пласта при пересевах используют смесь 0,25% раствора трипсина и 0,02% раствора версена в соотношении 1:3 при температуре 37º С.

Для криоконсервирования при температуре – 196⁰ С используют 95% FBS с добавлением 5% DMSO, при концентрации клеток 2-3 х10⁶ в мл. Жизнеспособность клеток по тесту витального окрашивания трипановым синим после хранения в жидком азоте составляет 70%. Клетки восстанавливают исходные ростовые и морфологические свойства в течений 2-3 пассажей.

На хранение культура клеток ППС заложена в Главный банк культур на 5 пассаже в количестве 67 криопробирок и в Рабочий банк культур на 13 пассаже в количестве 43 криопробирок.

Морфологическая характеристика. Культура ППС представлена эпителиоподобными полигональными клетками средних размеров. В центре находится крупное ядро овальной формы с 1-2, 3 ядрышками. Цитоплазма гомогенная, базофильная. Аномальных форм митоза до 17,0%. Число 2-3х ядерных клеток до 21,5‰. Постоянно присутствуют клетки с гигантскими формами ядра в количестве 11,83‰. Адаптация в условиях культивирования происходит за счет 2-3х ядерных и клеток с гигантскими формами ядра, обладающих высокой метаболической активностью.

Кариологическая характеристика. Модальный класс с числом хромосом (2n = 38) составил 85% исследованных метафаз с разбросом числа хромосом в пределах 35-72.

Видовая принадлежность. Свинья, подтверждена кариологически.

Контроль контаминации. При обследовании клеток ППС на стерильность (бактерии, грибы, микоплазма) – отрицательно.

Чувствительность к вирусам. Энтеровирус Coxsackievirus B5, ВПГ-1

Пример №1

Первично-трипсинизированные клетки получают методом щадящей трипсинизации.

При вскрытии матки плоды помещают в стерильные банки с Хенксом с высоким содержанием гентамицина (80 mg.) на флакон. В стерильных условиях на чашки Петри из каждого плода извлекают почки. Освобождают их от капсулы, разрезают вдоль и удаляют мозговой слой вместе с сосудами и мочеточником. Корковый слой измельчают ножницами на кусочки 2-3 мм и отмывают несколько раз Хенксом. Далее дезагрегацию ткани проводят 0,25% раствором трипсина длительностью 10 мин., чередованием с 0,5% ГЛА на магнитной мешалке при +37°С 6-8 раз. Центрифугирование клеток проводят при 1500 об/мин в течение 10 минут, супернатант сливают, а клеточный осадок ресуспендируют. Клетки высевают на пластиковые флаконы объемом 175 см³ с плотностью посева 500-800 тыс. клеток/мл в ростовой среде ГЛА и Игла в равном соотношении (1:1) с добавлением 10% FBS. Матрасы помещают в CO²-инкубатор с автоматическим регулированием и контролем температуры +37,0±1°С, повышенным до 5% содержанием углекислого газа и относительной влажностью 90%. Изначально большой объем клеток предполагает пассивную стратегию культивирования. В дальнейшем используют культуры клеток с конфлюэнтным монослоем, снимают раствором трипсин/версена (1:3) и рассевают в новые флаконы (матрасы).

Пример №2.

Определение чувствительности полученного неимортализованного штамма клеточной культуры почек плодов свиньи к энтеровирусам человека Coxsackievirus B5.

Для эксперимента по определению чувствительности неимортализованной клеточной культуры ППС к энтеровирусам человека Coxsackievirus B5.

Культуру клеток ППС после 10-го пассажа в стадии активной пролиферации, выращивали при +37±1° C в виде монослоя в пластиковых культуральных плоскодонных пробирках (TFS, США) емкостью 15 мл. Плотность посева клеток составляла 200 тыс./мл. В качестве среды поддержания использовали питательную среду 199 (ИГЛА). Штамм CB5–8100 – клинический изолят энтеровируса человека Coxsackievirus B5, выделенный от больного серозным менингитом на культуре клеток рабдосаркомы человека (RD) [15]. При заражении клеточных культур ППС концентрация вируса в вируссодержащей жидкости (ВСЖ) составляла 10^6,0 ТЦД₅₀ /0,2 мл. Титром вируса при его определении в культурах клеток называется то наибольшее разведение вируссодержащего материала, в котором вирус способен вызвать ТЦД у 50% инфицированных культур клеток [13]. Эта величина называется 50%-ной тканевой цитопатической дозой (ТЦД ₅₀). Чувствительность клеточных культур к энтеровирусам определяли согласно «Руководству по лабораторным исследованиям полиомиелита» Всемирной организации здравоохранения (раздел «Выделение полиовируса и других энтеровирусов») [14]. Клеточный монослой в культуральной пробирке, предварительно отмытый раствором Эрла от среды роста, заражали по 200 мкл ВСЖ, затем добавляли 2,5 мл среды поддержания и инкубировали при 37 ± 1 °C 5 суток. В контрольную пробирку после предварительной отмывки раствором Эрла добавляли 2,5 мл среды поддержания без вируса и инкубировали аналогично опытным пробиркам. Визуальную оценку цитопатического действия (ЦПД) (округление клеток, дегенерация монослоя, отделение от поверхности стекла) проводили ежедневно с 1-го по 5-й день. При отсутствии (ЦПД) на 5-е сутки проводили второй, а затем и третий слепые пассажи. При отрицательном результате после третьего слепого пассажа клеточную культуру считали нечувствительной к энтеровирусу. Эксперимент по определению чувствительности проводили в четырех повторах. Степень ЦПД оценивали по проценту клеток в монослое с характерными для энтеровирусов признаками цитопатологии по условной четырехплюсовой шкале: «–» (0% ЦПД); «1+» (< 25%); «2+» (25% до < 50%), «3+» (50% до < 75%) и «4+» (75% до 100%). Затем вычисляли средние величины со стандартными отклонениями. Для исключения ложноположительных результатов, обусловленных дегенерацией клеточного монослоя вследствие контаминации образцов или питательной среды иными цитопатическими агентами или веществами, подтверждения репликации энтеровирусной РНК в чувствительных клеточных культурах, проводили оценку относительной концентрации энтеровирусной РНК в ВСЖ, полученной после переморозки проб третьего пассажа. Относительную концентрацию энтеровирусной РНК в ВСЖ определяли в ПЦР с регистрацией результатов амплификации в реальном времени с использованием набора реагентов «АмплиСенс Enterovirus-FL» (Интерлабсервис). Для оценки относительной концентрации энтеровирусной РНК в пробе применяли качественный пороговый метод – величину порогового цикла амплификации (Ct). Интерпретацию результатов тестирования исследуемых образцов проводили в соответствии с инструкцией к набору реагентов. Пробы, в которых значения Ct не превышали 40, считались положительными.

В первой серии опытов проведено изучение чувствительности неимортализованной клеточной культуры плодов свиньи к штамму энтеровируса Coxsackievirus B5 (CB5–8100).

По результатам исследования была выявлена высокая чувствительность клеточной культуры ППС к CB5–8100 (Таблица 1).

Таблица 1 – Цитопатическое действие штамма энтеровируса Coxsackievirus B5 (CB5–8100) на культуре клеток почек плодов свиньи

Клеточная культура	Цитопатическое действие энтеровируса Coxsackievirus B5 (CB5-8100) %
Клеточная культура	1 пассаж (%±m)	2 пассаж (%±m)	3 пассаж (%±m)
ППС	25±4,3	37,5±4,8	87,5±3,3

Полученные результаты были подтверждены методом ПЦР. Репликация РНК штамма CB5 – 8100 произошла на клеточной культуре почек плодов свиньи (Таблица 2).

Таблица 2 –Величина порогового цикла амплификации энтеровирусной РНК (C_t) в пробах третьего пассажа клинического изолята энтеровируса Coxsackievirus B5 (штамма CB5-8100) на культуре клеток почек плодов свиньи

№ строки	Клеточная культура	Проба	C_t
1	ППС	1	24,0
2	ППС	2	22,0

Пример № 3.

Определение чувствительности полученной неимортализованной клеточной культуры почек плодов свиньи к вирусу простого герпеса I типа (ВПГ-1).

Для эксперимента по определению чувствительности неимортализованной клеточной культуры ППС к вирусу простого герпеса I типа (ВПГ-1).

Культуры после 10-го пассажа в стадии активной пролиферации, выращивали при +37 ± 1 °C в виде монослоя в пластиковых культуральных плоскодонных пробирках (TFS, США) емкостью 15 мл. Плотность посева клеток составляла 200 тыс./мл. В качестве среды поддержания использовали питательную среду ИГЛА (МЕМ). В работе использовали вирус простого герпеса I типа (ВПГ-1) штамм (Л-2), культивированный на клетках фибробластов эмбриона человека (ЛЭЧ). Исходная инфекционная активность вируссодержащей жидкости (ВСЖ) составляла 10^5,75 ТЦД₅₀ /0,2 мл. Титром вируса при его определении в культурах клеток называется то наибольшее разведение вируссодержащего материала, в котором вирус способен вызвать ТЦД у 50% инфицированных культур клеток [13]. Эта величина называется 50%-ной тканевой цитопатической дозой (ТЦД ₅₀). Для определения чувствительности исследуемой клеточной культуры ППС к ВПГ-1 клеточный монослой в культуральной пробирке, предварительно отмытый от ростовой среды средой Игла (МЕМ), заражали по 200 мкл ВСЖ, затем добавляли 1,8 мл среды поддержания и инкубировали при 37 ± 1 °C до 5 суток. В контрольную пробирку после предварительной отмывки средой Игла (МЕМ) добавляли 2,0 мл поддерживающей среды (среда Игла (МЕМ) с антибиотиками) и инкубировали аналогично опытным пробиркам. Визуальную оценку цитопатического действия (ЦПД) (округление клеток, дегенерация монослоя, отделение от поверхности пластика) проводили ежедневно с 1-го по 5-й день. При отсутствии (ЦПД) на 5-е сутки полученный материал «замораживали-оттаивали» и проводили второй, а затем и третий слепые пассажи. При отрицательном результате после третьего слепого пассажа клеточную культуру считали нечувствительной к ВПГ-1. При наличии ЦПД пробирку снимали при степени ЦПД «4+» либо при более низкой степени на 5 сутки, «замораживали-оттаивали» и проводили до 3 пассажей. Эксперимент по определению чувствительности проводили в четырех повторностях. Степень ЦПД оценивали по проценту клеток в монослое с характерными для герпесвирусов изменениями по условной четырехплюсовой шкале: «–» (0% ЦПД); «1+» (< 25%); «2+» (25% до < 50%), «3+» (50% до < 75%) и «4+» (75% до 100%). Затем вычисляли средние величины со стандартными отклонениями. Для выявления инфекционной активности ВПГ-1 в ВСЖ, полученной при культивировании в исследуемой клеточной культуре ППС, проводили титрование с использованием монослоя клеточной культуры, выращенной на 96-луночных культуральных планшетах. Титрование ВСЖ проводили десятикратно в разведениях от 10^-1 до 10^-8, для каждого материала в каждом разведении использовали не менее 4 лунок планшета. Учет результатов проводили по выявлению характерного ЦПД после культивирования в течение 5 суток в условиях СО₂-инкубатора с концентрацией углекислого газа 5%. Расчет титра вируса проводили по методу Спирмена-Кербера.

Во второй серии опытов проведено изучение чувствительности клеточной культуры ППС к ВПГ-1 штамм Л-2 (ВПГ-1/Л2)

По результатам исследования была выявлена высокая чувствительность неимортализованной клеточной культуры ППСв пробах третьего пассажа к ВПГ-1/Л2 (Таблица 3).

Таблица 3 – Цитопатическое действие ВПГ-1/Л2 на культуре клеток почек плодов свиньи

Клеточная культура	Цитопатическое действие ВПГ-1/Л2
Клеточная культура	1 пассаж (%±m)	2 пассаж (%±m)	3 пассаж (%±m)
ППС	35,6±5,3	54,6±5,9	92,1±5,5

Полученный результат чувствительности был дополнительно подтвержден при определении инфекционной активности ВПГ-1/Л2 в ВСЖ, полученные при культивировании в исследуемой клеточной культуре ППС (Таблица 4).

Таблица 4 – Инфекционная активность ВПГ-1/Л2 в ВСЖ, полученных при культивировании в клеточной культуре почек плодов свиньи

№ п/п	Клеточная культура	Инфекционная активность ВПГ-1/Л2 после третьего пассажа, ТЦД₅₀/0,1 см³
1	ППС	10^4,25

Полученный новый неимортализованный штамм культуры клеток ППС может быть использована в вирусологических исследованиях с целью диагностики энтеровирусной инфекции и обусловленной актуальным и распространенным на территории РФ штаммом энтеровируса Coxsackievirus CВ5.

Учитывая, что культуры является новыми для практической вирусологии, представляет интерес продолжить изучение спектра их чувствительности к различным серовариантам энтеровирусов.

Также, неимортализованная клеточная культура ППС можно широко использовать в качестве тест-объектов для оценки безопасности и эффективности новых лекарственных препаратов против герпесвирусных инфекций и для получения перспективных вакцин.

Источники информации

1. Condit R.C. Principlts of virology. In the book: Field′s virology. 4 rd ed. Ed by Knipe D.N., Howley P.M. Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins. -2001. - Pp. 19-51.

2. Голубев Д.Б., Соминина А.А., Медведева М.Н. Руководство по применению клеточных культур в вирусологии.- Л.: Медицина. – 1976 – 55с.

3. Mak N. K., Leung C. Y., Wei X. Y., Shen X. L., Wong R. N. S., Leung K. N., Fung M. C. Inhibition of RANTES expression by indirubin in influenza virus-infected human bronchial epithelial cells . Biochemical Pharmacology. - 2004. - Vol. 67. No.1. Pp. 167-174.

4. Анохин В. А., Сабитова А. М., Кравченко И. Э., Мартынова Т. М. Энтеровирусные инфекции: современные особенности // Практическая медицина. Педиатрия. - №9 (85). - 2014. - С. 52-59.

5. Канаева О.И. Энтеровирусная инфекция: многообразие возбудителей и клинических форм //Инфекция и иммунитет. – 2014. – Т. 4. – №. 1.- C.27-36.

6. Санитарно-вирусологический контроль водных объектов: Методические указания 4.2.2029-05 / ГУ НИИ ЭЧ и ГОС им. А.Н. Сысина, ГУ ИПВЭ им. М.П. Чумакова и др. М., 2006. – С. 4.

7. Энтеровирусные заболевания: клиника, лабораторная диагностика, эпидемиология, профилактика: Методические указания 3.1.1.213 / Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора. – М., 2006. – 43с.

8. Яновский Л. М., Сергеева Н. Д. Лабиальный герпес: общая характеристика вирусов простого герпеса, этиология, патогенез и эпидемиология заболевания //Альманах сестринского дела. – 2017. – Т. 10. – №. 1. – С. 4-7.

9. Zahoor MA, Khurshid M, Qureshi R, Naz A, Shahid M (July 2016). "Cell culture-based viral vaccines: current status and future prospects". Future Virology. 11 (7): 549–62. doi:10.2217/fvl-2016-0006.

10. Станкова Н.В. Иммунобиологический статус свиней и возможности их использования в целях ксенотрансплантации: автореф. дис. канд. биол. наук. – п. Лесные поляны, Моск. обл.: Всероссийский НИИ племенного дела, 2009. – 18 с.

11. Авторское свидетельство №1147748, опубликовано: 30.03.1985 г. Глинских Н.П., Колесникова Г.Г., Устьянцев В.П. Штамм диплоидных клеток легкого эмбриона человека лэч-4(81), используемый для диагностики вирусных инфекций. https://findpatent.ru/patent/114/1147748.html

12. Момот Ю.А. К развитию эмбрионов свиньи крупной белой породы // Аграрный вестник Урала. - № 11-2(77). – 2010 г. – С. 36.

13. Hematian A. Et al. Traditional and modern cell culture in virus diagnosis // Osongpublic health and research perspectives. – 2016. – Т. 7, № 2. – С. 77–82.

14. Руководство по вирусологическим исследованиям полиомиелита / ВОЗ. – Женева, 1997. – 114 с.

Claims

Способ получения неимортализованного штамма монослойной культуры клеток почек в результате субкультивирования первично-трипсинизированной культуры клеток почек плодов свиньи, чувствительного к энтеровирусам человека Coxsackievirus B5 и вирусу простого герпеса I типа, заключающийся в том, что эмбриональные клетки почки плодов свиньи на поздней стадии развития, полученные методом щадящей трипсинизации, выращивают на смеси питательных сред: 0,5% ГЛА и игла МЕМ 1:1 с 10% фетальной сывороткой крови телят (FBS), предел культивирования клеток почек плодов свиньи составляет 22 пассажа, для диспергирования клеточного пласта при пересевах используют смесь 0,25% раствора трипсина и 0,02% раствора Версена в соотношении 1:3 при температуре +37°С, для криоконсервирования при температуре - 196°С используют 95% FBS с добавлением 5% DMSO, при концентрации клеток 2-3 ×10⁶ в мл.