KR20220100490A

KR20220100490A - 상기도 조직 유래 세포 기반 바이러스 감염위해성 생체외 분석방법

Info

Publication number: KR20220100490A
Application number: KR1020210062168A
Authority: KR
Inventors: 박윤신; 김혜권; 정종평; 이주연
Original assignee: 충북대학교 산학협력단; 주식회사 나이벡
Priority date: 2021-01-08
Filing date: 2021-05-13
Publication date: 2022-07-15

Abstract

본 발명은 상기도 조직 유래 세포 기반 바이러스 감염위해성 생체외 분석방법에 관한 것으로, 구체적으로 본 발명은 수술 후 버려진 인간 상기도 조직으로부터 분리된 일차세포를 이용하는 단계를 포함하는 상기도 조직 유래 세포를 기반으로 하는 바이러스 감염 여부를 분석하는 방법 및 상기 일차세포를 이용한 상기도 조직 유래 세포를 기반으로 하는 항바이러스제의 스크리닝 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 인간 상기도 조직으로부터 분리된 일차세포를 이용한 바이러스 감염 여부의 분석방법은 종래 바이러스 감염 연구에 사용되던 불멸화된 세포주를 대체하여 인체 유래의 일차세포를 사용함으로써 보다 정확한 결과 및 경제적 효과를 얻을 수 있으며, 불필요한 동물실험을 감소시킬 수 있을 뿐만 아니라, 항바이러스제의 발굴 및 효능 평가에 소요되는 시간 및 경비를 효율적으로 감소시킬 수 있는 효과가 있다. 그러므로 본 발명에 따른 인간 상기도 조직으로부터 분리된 일차세포를 이용한 바이러스 감염 여부 분석 및 항바이러스제의 스크리닝 방법은 전세계적으로 발병율이 증가하고 있는 바이러스 감염질환에 대한 치료제 개발 과정에서 유효성 및 안정성 검증용 플랫폼으로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

상기도 조직 유래 세포 기반 바이러스 감염위해성 생체외 분석방법{In vitro analysis method of viral infection risk using human upper airway system-derived cells}

본 발명은 상기도 조직 유래 세포 기반 바이러스 감염위해성 생체외 분석방법에 관한 것이다.

질병 발생에 영향을 주는 역학의 기본요인인 병인, 숙주, 환경 중에서 병인은 생물학적, 물리-화학적, 사회적 요인 등으로 세분할 수 있는데, 이들은 질병 발생의 주요 요인이다. 병원체의 일반적인 침입 경로는 호흡기, 위장관, 피부 등이며 주로 호흡기를 통해 가장 많은 미생물이 흡입된다. 그 중 바이러스는 곰팡이나 박테리아보다 훨씬 작고 살아있는 세포에 침투하는 전염성 미생물이다. 바이러스는 세포에 달라붙어 침투하고 유전물질을 세포 안으로 방출하여 세포를 제어하고 바이러스를 복제하게 만든다. 결국 바이러스는 감염 세포가 정상 기능을 하지 못하도록 방해하고 죽게 만들며 죽을 때, 세포는 다른 세포들을 감염시킬 새로운 바이러스를 배출한다.

호흡기를 통한 바이러스의 감염은 주로 상기도감염으로 나타나며 감염된 사람과의 접촉이나 호흡기 비말을 통해 쉽게 전파된다. 상기도는 기도의 윗부분에 해당하며 인간의 호흡기 중에서 가장 침습이 쉬운 부위로 상기도 감염은 바이러스 감염 및 세균 감염이 주로 발생한다. 이러한 바이러스에 의한 상기도 감염은 임상적으로 매우 발병률이 높으며 미국에서는 급성 호흡기 감염이 전체 급성질환의 53%이며, 학교결석의 36%가 호흡기감염에 의한다고 보고된다. 급성 호흡기 감염은 우리나라에서도 가장 많이 걸리는 질병 1위이며 기저질환이 없는 건강한 성인에서도 발생하고, 대부분 바이러스로 인한 것으로 대증 치료가 원칙이다. 특히 2019년 중국 우한 시에서 COVID-19가 처음 발생된 이후 2020년 3월 11일 WHO에서 팬데믹을 선언하였고 세계적 대유행이 진행되고 있다. 이에 대해 각 국가에서 대응책을 내고 있으며 국내 및 해외 제약·바이오 기업들은 치료제 및 백신 개발에 열중하고 있다. 특히, COVID-19의 전파로 인한 어려운 상황에서 항바이러스 물질의 발굴은 바이러스 통제를 위해 반드시 필요한 대응 전략이다.

따라서 이러한 박테리아 및 바이러스 등 외부 물질에 의한 세포 감염을 신속하게 진단하고 평가할 수 있는 기술의 개발이 필요한 실정이나, 아직까지 신속한 감염의 진단 및 약물의 발굴과 평가를 위한 기술이 개발되지 못하고 있는 실정이다.

이에 본 발명자들은 상기도 유래 세포 배양 시스템을 이용한 바이러스 감염 체외 평가 플랫폼을 개발하였고, 이를 항바이러스 후보물질 및 치료제의 발굴, 효능및 안전성 확인에 사용 가능함을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

대한민국 공개특허 10-2020-0040211

따라서 본 발명의 목적은 수술 후 버려진 인간 상기도 조직으로부터 분리된 일차세포를 이용하는 단계를 포함하는, 상기도 조직 유래 세포를 기반으로 하는 바이러스 감염 여부를 분석하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 수술 후 버려진 인간 상기도 조직으로부터 분리된 일차세포를 이용한, 상기도 조직 유래 세포를 기반으로 하는 항바이러스제의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 수술 후 버려진 인간 상기도 조직으로부터 분리된 일차세포를 이용하는 단계를 포함하는, 상기도 조직 유래 세포를 기반으로 하는 바이러스 감염 여부를 분석하는 방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 일차세포는 편도 유래 중간엽 줄기세포(Tonsil-derived mesenchymal stem cells, TMSC)일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 일차세포는 상기 수술 후 버려진 인간 상기도 조직에 콜라게나제 I 및 DNase I을 처리하고 원심분리하여 상기 조직으로부터 분리된 세포일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 일차세포는 PDMS(polydimethylsiloxane) 몰드를 이용한 3차원 공배양을 통해 스페로이드 형태로 형성된 세포집단의 형태를 갖는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 바이러스는 코로나바이러스(Coronavirus) 또는 레오바이러스(Reovirus)일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 바이러스 감염 여부는 상기 인간 상기도 조직으로부터 분리된 일차세포를 이용하여 생체 외에서 RT-PCR 분석, 면역형광염색분석 또는 현미경 분석으로 수행하는 것일 수 있다.

또한 본 발명은 수술 후 버려진 인간 상기도 조직으로부터 분리된 일차세포를 이용한, 상기도 조직 유래 세포를 기반으로 하는 항바이러스제의 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 일차세포를 바이러스로 감염시키기 전 또는 후에 항바이러스 후보물질을 처리한 후, 바이러스 감염에 따른 상기 일차세포의 변화를 분석하는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 일차세포의 변화를 분석하는 것은 RT-PCR 분석, 면역형광염색분석 또는 현미경 분석으로 수행하는 것일 수 있다.

본 발명에 따른 인간 상기도 조직으로부터 분리된 일차세포를 이용한 바이러스 감염 여부의 분석방법은 종래 바이러스 감염 연구에 사용되던 불멸화된 세포주를 대체하여 인체 유래의 일차세포를 사용함으로써 보다 정확한 결과 및 경제적 효과를 얻을 수 있으며, 불필요한 동물실험을 감소시킬 수 있을 뿐만 아니라, 항바이러스제의 발굴 및 효능 평가에 소요되는 시간 및 경비를 효율적으로 감소시킬 수 있는 효과가 있다. 그러므로 본 발명에 따른 인간 상기도 조직으로부터 분리된 일차세포를 이용한 바이러스 감염 여부 분석 및 항바이러스제의 스크리닝 방법은 전세계적으로 발병율이 증가하고 있는 바이러스 감염질환에 대한 치료제 개발 과정에서 유효성 및 안정성 검증용 플랫폼으로 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 인간 상기도 조직이 있는 부위에 대한 사진 및 수술 후 버려진 인간 상기도 조직으로부터 분리 및 배양한 일차세포의 형태를 현미경으로 관찰한 사진을 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일실시예에서 수술 후 버려진 인간 상기도 조직으로부터 분리 및 배양한 일차세포를 세포수를 달리하여 3차원 공배양을 통해 스페로이드 형태의 세포집단을 형성한 결과를 나타낸 사진이다.
도 3은 본 발명의 일실시예에서 수술 후 버려진 인간 상기도 조직으로부터 분리 및 배양한 일차세포를 대상으로 인간 코로나바이러스 NL63을 감염시킨 군과 비감염군을 대상으로 세포변성효과(CPE)를 확인한 결과를 나타낸 것이고(A), 인간 코로나바이러스 NL63 특이 항체를 이용하여 면역형광염색을 수행하여 바이러스의 감염여부를 확인한 결과를 나타낸 것이다(B).
도 4는 본 발명의 일실시예에서 수술 후 버려진 인간 상기도 조직으로부터 분리 및 배양한 일차세포를 대상으로 레오바이러스를 감염시킨 군과 비감염군을 대상으로 상기 레오바이러스의 특이 유전자를 검출할 수 있는 프라이머 세트를 이용하여 RT-PCR 분석을 통해 바이러스의 감염여부를 확인한 결과를 나타낸 것이며(A), 전자현미경 분석을 통해 세포사멸의 정도를 확인한 결과를 나타낸 것이다(B).
도 5는 본 발명의 일실시예에서 수술 후 버려진 인간 상기도 조직으로부터 분리 및 배양한 일차세포를 대상으로 레오바이러스를 감염시킨 군과 비감염군을 대상으로 LIVE/DEAD 어세이키트를 이용하여 바이러스 감염 후 세포의 생존여부를 시각화하여 관찰한 사진(A) 및 세포생존 정도를 그래프로 비교분석한 결과를 나타낸 것이다(B).

본 발명은 상기도 조직 유래 세포 기반 바이러스 감염위해성 생체외 분석방법을 제공함에 특징이 있으며, 구체적으로 본 발명은 수술 후 버려진 인간 상기도 조직으로부터 분리된 일차세포를 이용하는 단계를 포함하는, 상기도 조직 유래 세포를 기반으로 하는 바이러스 감염 여부를 분석하는 방법을 제공함에 특징이 있다.

현재 세계적으로 전염병 발생이 증가하고 있으며, 스페인 독감과 조류 독감 등 치사율이 높은 전염병 역시 매해 증가하는 양상을 보일 뿐만 아니라 최근 COVID-19의 엄청난 감염성으로 인해 바이러스 감염에 대한 연구 및 신속한 치료제의 개발이 매우 시급한 실정이다.

이에 본 발명자들은 생체외에서 바이러스 감염 및 항바이러스제를 신속하고 정확하게 발굴할 수 있는 플랫폼을 개발하기 위해 연구하던 중, 수술 후 버려진 인간 상기도 조직으로부터 분리된 일차세포를 이용하여 생체 외에서 바이러스 감염 여부 및 항바이러스제를 스크리닝할 수 있는 방법을 확립하였다.

특히 본 발명에서는 수술 후 버려진 인간 상기도 조직으로부터 분리된 일차세포를 이용하였는데, COVID-19 등 다양한 호흡기 바이러스들의 경우 인체 감염 시 상기도 조직 또는 세포에 일차적으로 감염이 된다. 목이 붓고 아픈 경우 인후두 조직에 바이러스나 원인균에 감염이 되어 있을 확률이 높다. 이때 바이러스가 원인일 확률이 약 85% 이다. 따라서 인후두 조직에서 유래한 일차세포를 사용하여 항바이러스제 스크리닝 플랫폼을 발명하였을 시, 다른 조직에서 유래한 세포나 기존에 판매되는 세포주를 사용하였을때보다 조직 특이적인 면역반응을 확인할 수 있다. 특히 편도는 림프계의 일부로 공기 중 및 섭취된 감염원에 대한 면역반응의 세포 생물학적 작용기전 및 치료물질 개발시 인체내 효능 및 부작용 발생가능성, 혹은 부작용억제 방법조사를 위한 플랫폼으로 매우 적합하다. 이러한 외부감염과 직결된 인체유래세포를 플랫폼으로 수립하고 활용하는 것은 필수불가결한 상황이다. 따라서 본 발명에서는 이러한 이유로 상기도 조직을 대상으로 일차세포를 분리하여 이를 사용하였다.

본 발명에서 상기 “일차세포(primary cell)”는 “일차배양세포”라고도 불리며, 동물 조직이나 기관으로부터 직접 일차 배양한 세포로서 살아있는 생물에게서 바로 얻은 정상적인 세포를 말한다. 이 세포들은 배양을 하면 어느 정도까지는 세포분열을 하면서 자라게 되지만 계대가 계속되는 경우에는 노화되는 제한성을 지닌다. 이러한 제한성에도 불구하고 일차세포는 생물의 실제적인 반응과 유사하다는 장점을 지니기 때문에 생물의약품 생산 등에 있어 사용되고 있다.

본 발명의 상기 일차세포는 상기도 조직, 구체적으로 인간의 상기도 조직으로부터 분리한 일차세포라면 모두 포함할 수 있으며, 이에 제한되지는 않으나, 편도 유래 중간엽 줄기세포(Tonsil-derived mesenchymal stem cells, TMSC), 편도유래 섬유아세포(Tonsil-derived Fibroblasts), 면역세포 및 수지상 세포(Tonsil-derived Dendritic cell)를 포함할 수 있다.

또한 상기 일차세포는 수술 후 버려진 인간 상기도 조직에 콜라게나제 I 및 DNase I을 처리하여 반응시킨 후, 원심분리하여 상기 조직으로부터 분리된 일차세포를 사용한다. 상기 원심분리는 1800~3000 RPM으로 25℃에서 5분간 수행할 수 있다.

또한 본 발명에서 사용할 수 있는 상기 일차세포는 3차원 공배양을 통한 스페로이드의 세포집단을 사용할 수 있다.

이때 상기 3차원 공배양은 PDMS(polydimethylsiloxane) 몰드를 이용하여 수행한다.

본 발명에서 상기 "스페로이드(spheroid)"는 3D 입체구조를 가지는 구 형상을 한 세포덩어리를 의미하는 것으로, 조직 또는 줄기세포에서 제조될 수 있으며, 자가재생 및 분화능력으로 인해 3차원으로 배양될 수 있다. 또한 세포의 성장 과정에서 주변 환경과 상호 작용하도록 허용되는 환경을 가질 수 있다. 이에 따라, 실제로 in vivo에서 상호 작용을 하고 있는 장기 또는 세포를 거의 유사 또는 완벽히 모사 가능하고 질병의 치료제 개발 및 등을 관찰할 수 있는 훌륭한 모델이 될 수 있다.

나아가 본 발명자들은 본 발명에 따른 수술 후 버려진 인간 상기도로부터 분리 및 배양된 일차세포를 이용하여 바이러스 감염 여부를 분석할 수 있는지를 확인하였는데, 본 발명의 일실시예에 의하면 상기 일차세포에 바이러스를 접종하여 감염시킨 후, 바이러스를 접종하지 않은 대조군과의 분석을 통해, 본 발명에 따른 상기 일차세포를 생체외에서 바이러스 감염 여부를 분석할 수 있는 세포 플랫폼으로 사용가능함을 확인하였다.

그러므로 본 발명에 따른 상기 일차세포는 상기도 조직 유래 세포를 기반으로 하는 바이러스 감염 여부를 분석하는데 유용하게 사용될 수 있다.

뿐만 아니라, 본 발명에 따른 상기 일차세포는 항바이러스제를 스크리닝하기 위한 세포 플랫폼으로도 사용할 수 있는데, 구체적으로 상기 본 발명의 일차세포를 바이러스로 감염시키기 전 또는 후에 항바이러스 후보물질을 처리한 후, 바이러스 감염에 따른 일차세포의 변화를 바이러스로 감염시키지 않은 대조군과 비교 분석함을 통해, 항바이러스제를 스크리닝할 수 있다.

이때 상기 일차세포의 분석은 이에 제한되지는 않으나, RT-PCR 분석, 면역형광염색분석 또는 현미경 분석으로 수행할 수 있다.

또한 본 발명에서 감염 여부를 분석할 수 있는 상기 바이러스는 주로 호흡기 질환을 유발하는 바이러스라면 모두 포함할 수 있으며, 구체적으로는 이에 제한되지는 않으나, 코로나바이러스(Coronavirus), 레오바이러스(Reovirus), 인플루엔자 바이러스(Influenza Virus), 파라인플루엔자 바이러스(Parainfluenza Virus), 호흡기 합포체 바이러스(Respiratory Syncytial Virus, RSV), 라이노바이러스(Rhinovirus), 아데노바이러스(Adenovirus), 메타뉴모바이러스(Metapneumovirus), 보카바이러스 (Bocavirus) 또는 엔테로바이러스(Enterovirus)를 포함할 수 있다.

이상 본 발명에서 제공하는 수술 후 버려진 인간 상기도 조직으로부터 분리된 일차세포를 이용한 바이러스 감염 여부를 분석하는 방법 및 항바이러스제를 스크리닝하는 방법은, 종래 바이러스 감염 연구에 사용되던 불멸화된 세포주를 대체할 수 있으며, 불멸화된 세포주보다 더 정확한 결과를 얻을 수 있고 경제적으로도 유리한 효과를 얻을 수 있다.

특히 불멸화 세포(immortalized cell)는 무한에 가까운 증식이 가능하지만 대신 세포 고유의 기능을 상실하게 되어 생체 내에 존재하는 세포와는 다른 세포의 특성을 가질 수 있으므로 불멸화 세포를 이용한 실험결과는 실제 생체 내에서의 결과와 다를 수 있어 정확한 결과 도출에 한계가 있다.

또한 본 발명의 일차세포를 이용한 방법은 불필요한 동물실험을 감소시킬 수 있는 장점이 있고, 항바이러스제의 발굴 및 효능 평가에 소요되는 시간 및 경비를 감소시킬 수 있어, 바이러스 감염질환에 대한 치료제 개발 과정에서 유효성 및 안정성 검증을 위한 새로운 분석 플랫폼으로 사용될 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1>

인간 상기도로부터 일차세포(primary cell)의 분리 및 배양

편도 조직 절제 수술 후 버려지는 조직을 수득하였고, 상기 조직으로부터 일차세포인 편도 유래 중간엽 줄기세포(Tonsil-derived mesenchymal stem cells, TMSC)를 다음과 같은 방법으로 분리 및 배양하였다. 수술 직후의 조직을 냉장 보관한 후, collagenase I 및 DNase I를 처리하여 상기 조직으로부터 세포의 분리가 용이할 수 있도록 하였고, 이후 조직을 절편화하였다. 그런 뒤, 다른 세포와의 분리를 위해 원심분리기를 이용하여 2000rpm으로 25℃에서 5분간 원심분리하여 중간엽 줄기세포를 분리하였다. 분리한 세포는 10%FBS 및 1%AA가 첨가된 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium) 배양배지를 이용하여 37℃의 온도 및 5% CO2가 보존되는 배양기에서 배양하였고, 각 조직에서 분리된 세포는 혼합하지 않고 따로 분리하여 각 세포의 특성을 분석하였다.

분석 결과, 도 1에는 상기 일차세포를 분리한 부위인 인간 인후두 부위에 대한 사진을 나타내었고, 상기 방법으로 분리한 일차세포에 대한 세포 형태를 현미경으로 관찰한 사진을 나타내었다.

<실시예 2>

인간 상기도 유래 일차세포를 이용한 스페로이드의 제조

본 발명자들은 상기 실시예 1에 의해 인간 상기도로부터 분리 및 배양된 일차세포(편도 유래 중간엽 줄기세포)를 3차원적 배양을 통해 스페로이드가 제조될 수 있는 환경을 구축하였다. 이를 위해 상기 일차세포의 세포 수를 각기 달리하여 조절하였고, PDMS(polydimethylsiloxane) 몰드를 이용하여 3차원 공배양시스템을 통해 스페로이드 형태의 세포집단이 형성되도록 배양하였다. 구체적으로 상기 3차원 공배양시스템을 통한 배양은 표면장력에 의해 메니스커스(meniscus)를 형성하는 폴리디메틸실록산(PDMS)의 액상 폴리머가 반구형 마이크로 형태로 경화된 반구형 마이크로웰에 상기 본 발명의 실시예에서 분리된 편도 유래 중간엽 줄기세포 현탁액을 투입하고 3일간 방치하여 자발적으로 구형배양형태가 형성되도록 배양하였다. 또한, 스페로이드 형태의 세포덩어리 형성을 위해, StemFIT 3D(microFIT사)제품을 사용하여 스페로이드를 제조하였고, 제조하고자 하는 스페로이드 크기를 고려하여 일정 수의 세포를 StemFIT 3D 제품에 분주한 후, 37℃ 및 5% Co2 배양기에서 2일 동안 배양하였다. 이때 배양을 위한 배지는 10% FBS 및 1% AA가 첨가된 DMEM 배지를 이용하였다.

그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, 상기 방법을 통해 각 세포수를 달리하여 배양한 조건에서 스페로이드가 형성되는 것을 확인할 수 있었으며, 세포수를 달리한 배양에도 생성된 스페로이드의 기본 너비는 평균 100um~150um로 거의 균일한 크기로 생성되는 것을 확인할 수 있었다.

<실시예 3>

본 발명에 따른 인간 상기도 유래 일차세포를 이용한 인간 코로나 바이러스 감염에 의한 세포변성 확인

상기 실시예 1의 방법에 따라 인간 상기도로부터 분리 및 배양된 일차세포를 대상으로 인간 코로나바이러스 NL63(human coronavirus NL63)을 사용하여 일차세포에 접종한 후, 2시간 배양한 다음, 세포의 변성효과(CPE: cytopathic effect)를 분석하였다.

그 결과 도 3에 나타낸 바와 같이, 인간 코로나바이러스 NL63으로 감염시킨 일차세포에서는 세포변성효과가 발생하는 것으로 나타났고, 바이러스를 감염시키지 않은 대조군에서는 세포변성효과가 나타나지 않았다(도 3a). 또한 인간 코로나바이러스 NL63에 대한 특이 항체를 이용한 면역형광염색 분석을 통해, 바이러스 감염 세포군에서 실제로 인간 코로나바이러스 NL63에 의해 세포가 감염되었음을 확인할 수 있었다(도 3b).

<실시예 4>

본 발명에 따른 인간 상기도 유래 일차세포를 이용한 레오 바이러스의 감염 여부 확인

실시예 1의 방법에 의해 인간 상기도로부터 분리 및 배양한 일차세포에 오르소레오바이러스(orthoreovirus)를 각각 감염시킨 후, 하기 실험에 사용하였다. 이때 대조군으로는 바이러스를 감염시키지 않은 군을 사용하였다.

<4-1> RT-PCR 분석

바이러스가 감염된 세포를 얼렸다 녹였다 2회 반복한 후, 원심분리를 통해 상층액을 수득한 후, 상기 상층액으로부터 당업계에 사용되고 있는 RNA 추출키트를 사용하여 RNA를 추출한 후, 하기 오르소레오바이러스 검출 프라이머 세트를 이용하여 RT-PCR을 수행하였다.

L1 segment lambda-3 protein (Primer target size : 415bp)

L1-F Primer : 5'-GCATCCATTGTAAATGACGAGTCTG-3’

L1-R Primer : 5'-CTTGAGATTAGCTCTAGCATCTTCTG-3'

분석결과, 도 4a에 나타낸 바와 같이, 3명 환자의 상기도로부터 분리 및 배양된 일차세포에 5개의 바이러스 스탁이 감염된 군에서는 모두 RT-PCR을 통해 오르소레오바이러스의 감염을 확인할 수 있었다. 한편, 바이러스가 감염되지 않은 대조군에서는 RT-PCR의 반응산물이 검출되지 않았다.

이러한 결과를 통해 본 발명자들은 본 발명에서 확립한 인간 상기도유래 일차세포를 이용할 경우, 바이러스의 감염여부를 생체 외에서 정확하게 진단 및 검출할 수 있음을 알 수 있었다.

<4-2> 광학현미경 분석

오르소레오바이러스(orthoreovirus)를 감염시킨 인간 상기도 유래 일차세포와 대조군 세포에 대해, 바이러스 감염 시간에 따른 세포사멸 여부를 전자현미경을 통해 관찰하였다.

그 결과, 도 4b에 나타낸 바와 같이, 오르소레오바이러스 감염 후 5일부터 일부 감염된 세포에서 세포변성효과가 나타나는 것으로 확인되었다. 이를 통해 본 발명자들은 본 발명의 방법에 의해 확립된 인간 상기도 유래 일차세포를 이용할 경우, 광학현미경 분석을 통해서도 바이러스의 감염 여부를 확인할 수 있음을 알 수 있었다.

<4-3> 바이러스 감염에 의한 세포의 생존여부 확인

나아가 본 발명자들은 본 발명에 따른 인간 상기도로부터 분리 및 배양된 일차세포를 이용하여 바이러스 감염에 따른 세포의 생존여부의 확인이 가능한지를 분석하였다. 이를 위해 상기 <4-2>에서 사용한 오르소레오바이러스로 감염된 세포 및 바이러스로 감염되지 않은 대조군 세포에 대해, 감염 후 6일째에 세포의 생존정도를 LIVE/DEAD® assay 키트(Invitrogen)를 이용하여 분석하였다. 이때 살아있는 세포는 초록색 형광으로 표지되며, 죽은 세포는 빨간색 형광으로 표지되어, 세포의 생존여부를 시각화하여 관찰할 수 있다.

분석 결과, 도 5a에 나타낸 바와 같이, 바이러스가 감염된 세포에서는 죽은 세포가 빨간색으로 염색되어 있는 것으로 나타난 반면, 바이러스가 감염되지 않은 대조군 세포에서는 모두 초록색의 살아있는 세포를 확인할 수 있었다.

또한, 표지된 형광 강도를 수치화하여 그래프로 확인한 결과, 바이러스에 감염된 효과로 바이러스 감염군은 살아있는 세포의 수가 21.5%(0.8 ± 0.9 대조군대비) 감소한 것을 확인할 수 있었고, 죽은 세포의 수는 54.2% 증가(2.2 ± 0.1 대조군 대비)한 것을 확인할 수 있었다.

이러한 결과를 통해 본 발명자들은 기존 바이러스의 감염연구 및 감염치료제 개발에 필수적으로 활용되던 숙주세포인 불멸화된 세포주 (immortalized cell line)에 대한 문제점이었던, 인체 내 세포가 아니라는 점과 불멸화 세포주의 제조를 위한 많은 시간 및 비용이 소요된다는 점을 본 발명을 통해 해결할 수 있음을 알 수 있었다. 특히, 본 발명은 실제 인체 유래 일차세포를 활용하여 바이러스의 감염 및 항바이러스제 발굴에 대한 유효성 및 안전성을 검증할 수 있는 상기도 세포기반 플랫폼을 제공할 수 있다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims

수술 후 버려진 인간 상기도 조직으로부터 분리된 일차세포를 이용하는 단계를 포함하는,
상기도 조직 유래 세포를 기반으로 하는 바이러스 감염 여부를 분석하는 방법.
제1항에 있어서,
상기 일차세포는 편도 유래 중간엽 줄기세포(Tonsil-derived mesenchymal stem cells, TMSC), 편도유래 섬유아세포(Tonsil-derived Fibroblasts), 면역세포 또는 수지상 세포(Tonsil-derived Dendritic cell)인 것을 특징으로 하는, 상기도 조직 유래 세포를 기반으로 하는 바이러스 감염 여부를 분석하는 방법.
제1항에 있어서,
상기 일차세포는 상기 수술 후 버려진 인간 상기도 조직에 콜라게나제 I 및 DNase I을 처리하고 원심분리하여 상기 조직으로부터 분리된 세포인 것을 특징으로 하는, 상기도 조직 유래 세포를 기반으로 하는 바이러스 감염 여부를 분석하는 방법.
제1항에 있어서,
상기 일차세포는 PDMS(polydimethylsiloxane) 몰드를 이용한 3차원 공배양을 통해 스페로이드 형태로 형성된 세포집단의 형태를 갖는 것을 특징으로 하는, 상기도 조직 유래 세포를 기반으로 하는 바이러스 감염 여부를 분석하는 방법.
제1항에 있어서,
상기 바이러스는 코로나바이러스(Coronavirus), 레오바이러스(Reovirus), 인플루엔자 바이러스(Influenza Virus), 파라인플루엔자 바이러스(Parainfluenza Virus), 호흡기 합포체 바이러스(Respiratory Syncytial Virus, RSV), 라이노바이러스(Rhinovirus), 아데노바이러스(Adenovirus), 메타뉴모바이러스(Metapneumovirus), 보카바이러스 (Bocavirus) 또는 엔테로바이러스(Enterovirus)인 것을 특징으로 하는, 상기도 조직 유래 세포를 기반으로 하는 바이러스 감염 여부를 분석하는 방법.
제1항에 있어서,
상기 바이러스 감염 여부는 상기 인간 상기도 조직으로부터 분리된 일차세포를 이용하여 생체 외에서 RT-PCR 분석, 면역형광염색분석 또는 현미경 분석으로 수행하는 것을 특징으로 하는, 상기도 조직 유래 세포를 기반으로 하는 바이러스 감염 여부를 분석하는 방법.
수술 후 버려진 인간 상기도 조직으로부터 분리된 일차세포를 이용한, 상기도 조직 유래 세포를 기반으로 하는 항바이러스제의 스크리닝 방법.
제7항에 있어서,
상기 일차세포를 바이러스로 감염시키기 전 또는 후에 항바이러스 후보물질을 처리한 후, 바이러스 감염에 따른 상기 일차세포의 변화를 분석하는 것을 특징으로 하는, 상기도 조직 유래 세포를 기반으로 하는 항바이러스제의 스크리닝 방법.
제8항에 있어서,
상기 일차세포의 변화를 분석하는 것은 RT-PCR 분석, 면역형광염색분석 또는 현미경 분석으로 수행하는 것을 특징으로 하는, 상기도 조직 유래 세포를 기반으로 하는 항바이러스제의 스크리닝 방법.