RU2784970C1 - Method for biological incrustation of legume seeds - Google Patents
Method for biological incrustation of legume seeds Download PDFInfo
- Publication number
- RU2784970C1 RU2784970C1 RU2021125425A RU2021125425A RU2784970C1 RU 2784970 C1 RU2784970 C1 RU 2784970C1 RU 2021125425 A RU2021125425 A RU 2021125425A RU 2021125425 A RU2021125425 A RU 2021125425A RU 2784970 C1 RU2784970 C1 RU 2784970C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- seeds
- stage
- solution
- biological
- culture
- Prior art date
Links
- 235000021374 legumes Nutrition 0.000 title claims abstract description 30
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims abstract description 46
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims abstract description 39
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 35
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 34
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 34
- 229920001222 biopolymer Polymers 0.000 claims abstract description 32
- 241000589174 Bradyrhizobium japonicum Species 0.000 claims abstract description 30
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims abstract description 30
- 229920002444 Exopolysaccharide Polymers 0.000 claims abstract description 28
- 241000881860 Paenibacillus mucilaginosus Species 0.000 claims abstract description 25
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 claims abstract description 24
- 239000004372 Polyvinyl alcohol Substances 0.000 claims abstract description 22
- 230000001580 bacterial Effects 0.000 claims abstract description 20
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims abstract description 20
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 claims abstract description 20
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims abstract description 18
- 150000004676 glycans Polymers 0.000 claims abstract description 16
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 claims abstract description 16
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 claims abstract description 16
- 150000004804 polysaccharides Polymers 0.000 claims abstract description 16
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N Trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 claims abstract description 13
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 claims abstract description 13
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims abstract description 13
- 241001532588 Mesorhizobium ciceri Species 0.000 claims abstract description 12
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims abstract description 11
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims abstract description 11
- 241000589191 Rhizobium leguminosarum bv. viciae Species 0.000 claims abstract description 6
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 claims abstract description 3
- 235000010521 Cicer Nutrition 0.000 claims abstract 2
- 241000220455 Cicer Species 0.000 claims abstract 2
- 241000970829 Mesorhizobium Species 0.000 claims abstract 2
- 230000001954 sterilising Effects 0.000 claims abstract 2
- FBPFZTCFMRRESA-KAZBKCHUSA-N D-Mannitol Natural products OC[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KAZBKCHUSA-N 0.000 claims description 15
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 claims description 15
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 claims description 15
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 claims description 14
- 240000008371 Bacillus subtilis Species 0.000 claims description 11
- 239000005018 casein Substances 0.000 claims description 11
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 claims description 11
- 125000000089 arabinosyl group Chemical class C1([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO1)* 0.000 claims description 10
- 239000011701 zinc Substances 0.000 claims description 10
- 230000000855 fungicidal Effects 0.000 claims description 8
- 241000589152 Azotobacter chroococcum Species 0.000 claims description 6
- 241000589540 Pseudomonas fluorescens Species 0.000 claims description 6
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 6
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 239000010949 copper Substances 0.000 claims description 4
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 claims description 4
- 239000011572 manganese Substances 0.000 claims description 4
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 229910015621 MoO Inorganic materials 0.000 claims description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N edta Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 3
- QGAVSDVURUSLQK-UHFFFAOYSA-N Ammonium heptamolybdate Chemical compound N.N.N.N.N.N.O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.[Mo].[Mo].[Mo].[Mo].[Mo].[Mo].[Mo] QGAVSDVURUSLQK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000011609 ammonium molybdate Substances 0.000 claims description 2
- 235000018660 ammonium molybdate Nutrition 0.000 claims description 2
- 229940010552 ammonium molybdate Drugs 0.000 claims description 2
- 229910052796 boron Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 229910052803 cobalt Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 239000010941 cobalt Substances 0.000 claims description 2
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 claims description 2
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 229910052748 manganese Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 239000002184 metal Substances 0.000 claims description 2
- 229910052750 molybdenum Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 239000011733 molybdenum Substances 0.000 claims description 2
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 claims description 2
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 claims description 2
- ZOXJGFHDIHLPTG-UHFFFAOYSA-N boron Chemical compound [B] ZOXJGFHDIHLPTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N cobalt Chemical compound [Co] GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- PWHULOQIROXLJO-UHFFFAOYSA-N manganese Chemical compound [Mn] PWHULOQIROXLJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- ZOKXTWBITQBERF-UHFFFAOYSA-N molybdenum Chemical compound [Mo] ZOKXTWBITQBERF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 claims 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 abstract description 18
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 abstract description 9
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 abstract description 8
- 238000004321 preservation Methods 0.000 abstract description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 5
- 230000000813 microbial Effects 0.000 abstract description 4
- 239000008174 sterile solution Substances 0.000 abstract description 4
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 abstract description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 abstract description 2
- 239000003124 biologic agent Substances 0.000 abstract 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 abstract 1
- 230000003019 stabilising Effects 0.000 abstract 1
- 240000007842 Glycine max Species 0.000 description 26
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 23
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L mgso4 Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 18
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 17
- 241000589180 Rhizobium Species 0.000 description 13
- 210000004027 cells Anatomy 0.000 description 10
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 10
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 10
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 10
- 230000000087 stabilizing Effects 0.000 description 10
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 9
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 9
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 9
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 8
- 229940075615 Bacillus subtilis Drugs 0.000 description 8
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 8
- 235000010419 agar Nutrition 0.000 description 8
- 239000004600 biostabiliser Substances 0.000 description 8
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 7
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K Tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 7
- -1 silt Substances 0.000 description 7
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 7
- 229940041514 Candida albicans extract Drugs 0.000 description 6
- 235000010523 Cicer arietinum Nutrition 0.000 description 6
- 240000000464 Cicer arietinum Species 0.000 description 6
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 6
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 6
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 6
- 210000004544 DC2 Anatomy 0.000 description 5
- 239000002998 adhesive polymer Substances 0.000 description 5
- 229910021486 amorphous silicon dioxide Inorganic materials 0.000 description 5
- VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L calcium carbonate Chemical compound [Ca+2].[O-]C([O-])=O VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 5
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000002530 ischemic preconditioning Effects 0.000 description 5
- 230000002503 metabolic Effects 0.000 description 5
- 239000010455 vermiculite Substances 0.000 description 5
- 229910052902 vermiculite Inorganic materials 0.000 description 5
- 235000019354 vermiculite Nutrition 0.000 description 5
- 229940111685 Dibasic potassium phosphate Drugs 0.000 description 4
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L Dipotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 241000206672 Gelidium Species 0.000 description 4
- 240000004713 Pisum sativum Species 0.000 description 4
- 235000010582 Pisum sativum Nutrition 0.000 description 4
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 4
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 4
- 239000003415 peat Substances 0.000 description 4
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 4
- 241000894007 species Species 0.000 description 4
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 4
- 241000763329 Alena Species 0.000 description 3
- 241000589173 Bradyrhizobium Species 0.000 description 3
- WHNWPMSKXPGLAX-UHFFFAOYSA-N N-Vinylpyrrolidone Chemical compound C=CN1CCCC1=O WHNWPMSKXPGLAX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010054107 Nodule Diseases 0.000 description 3
- OTYBMLCTZGSZBG-UHFFFAOYSA-L Potassium sulfate Chemical compound [K+].[K+].[O-]S([O-])(=O)=O OTYBMLCTZGSZBG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 241000589157 Rhizobiales Species 0.000 description 3
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 3
- 206010042602 Supraventricular extrasystoles Diseases 0.000 description 3
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 3
- 235000013312 flour Nutrition 0.000 description 3
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 3
- 230000003562 morphometric Effects 0.000 description 3
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 3
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 3
- 229910052939 potassium sulfate Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000011151 potassium sulphates Nutrition 0.000 description 3
- 229910021487 silica fume Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 3
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 3
- 239000000454 talc Substances 0.000 description 3
- 229910052623 talc Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000019798 tripotassium phosphate Nutrition 0.000 description 3
- XTXRWKRVRITETP-UHFFFAOYSA-N vinyl acetate Chemical compound CC(=O)OC=C XTXRWKRVRITETP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000005995 Aluminium silicate Substances 0.000 description 2
- PZZYQPZGQPZBDN-UHFFFAOYSA-N Aluminium silicate Chemical compound O=[Al]O[Si](=O)O[Al]=O PZZYQPZGQPZBDN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960003563 Calcium Carbonate Drugs 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N D-sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 229920001353 Dextrin Polymers 0.000 description 2
- 239000004375 Dextrin Substances 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- 239000004698 Polyethylene (PE) Substances 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-GDQSFJPYSA-N Sucrose Natural products O([C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)[C@@]1(CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-GDQSFJPYSA-N 0.000 description 2
- HWKQNAWCHQMZHK-UHFFFAOYSA-N Trolnitrate Chemical compound [O-][N+](=O)OCCN(CCO[N+]([O-])=O)CCO[N+]([O-])=O HWKQNAWCHQMZHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 2
- 230000001070 adhesive Effects 0.000 description 2
- 235000012211 aluminium silicate Nutrition 0.000 description 2
- 239000007900 aqueous suspension Substances 0.000 description 2
- 239000000440 bentonite Substances 0.000 description 2
- 229910000278 bentonite Inorganic materials 0.000 description 2
- 229910000019 calcium carbonate Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 2
- 239000004927 clay Substances 0.000 description 2
- 229910052570 clay Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019425 dextrin Nutrition 0.000 description 2
- 230000002708 enhancing Effects 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 229910052631 glauconite Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000002906 microbiologic Effects 0.000 description 2
- LPUQAYUQRXPFSQ-DFWYDOINSA-M monosodium L-glutamate Chemical compound [Na+].[O-]C(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O LPUQAYUQRXPFSQ-DFWYDOINSA-M 0.000 description 2
- 239000004223 monosodium glutamate Substances 0.000 description 2
- 235000013923 monosodium glutamate Nutrition 0.000 description 2
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 2
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000004215 spores Anatomy 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 2
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 2
- 239000010456 wollastonite Substances 0.000 description 2
- 229910052882 wollastonite Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000010457 zeolite Substances 0.000 description 2
- 102100001249 ALB Human genes 0.000 description 1
- 101710027066 ALB Proteins 0.000 description 1
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 1
- 241000589941 Azospirillum Species 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 1
- 229920001661 Chitosan Polymers 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 229960002989 Glutamic Acid Drugs 0.000 description 1
- 239000005807 Metalaxyl Substances 0.000 description 1
- ZQEIXNIJLIKNTD-UHFFFAOYSA-N Metalaxyl Chemical compound COCC(=O)N(C(C)C(=O)OC)C1=C(C)C=CC=C1C ZQEIXNIJLIKNTD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VLAPMBHFAWRUQP-UHFFFAOYSA-L Molybdic acid Chemical compound O[Mo](O)(=O)=O VLAPMBHFAWRUQP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000531763 Otididae Species 0.000 description 1
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 1
- 241000589187 Rhizobium sp. Species 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 229940080237 Sodium Caseinate Drugs 0.000 description 1
- 229940005550 Sodium alginate Drugs 0.000 description 1
- 240000001016 Solanum tuberosum Species 0.000 description 1
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 1
- 229940032147 Starch Drugs 0.000 description 1
- 239000005843 Thiram Substances 0.000 description 1
- KUAZQDVKQLNFPE-UHFFFAOYSA-N Thiram Chemical compound CN(C)C(=S)SSC(=S)N(C)C KUAZQDVKQLNFPE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating Effects 0.000 description 1
- 229940050528 albumin Drugs 0.000 description 1
- 229940072056 alginate Drugs 0.000 description 1
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000000560 biocompatible material Substances 0.000 description 1
- 238000006065 biodegradation reaction Methods 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L cacl2 Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000000417 fungicide Substances 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 230000002068 genetic Effects 0.000 description 1
- 230000035784 germination Effects 0.000 description 1
- 239000010439 graphite Substances 0.000 description 1
- 229910002804 graphite Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular Effects 0.000 description 1
- 229940099596 manganese sulfate Drugs 0.000 description 1
- 239000011702 manganese sulphate Substances 0.000 description 1
- 235000007079 manganese sulphate Nutrition 0.000 description 1
- ISPYRSDWRDQNSW-UHFFFAOYSA-L manganese(II) sulfate monohydrate Chemical compound O.[Mn+2].[O-]S([O-])(=O)=O ISPYRSDWRDQNSW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 229920005615 natural polymer Polymers 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic Effects 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 239000001120 potassium sulphate Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000001681 protective Effects 0.000 description 1
- MSXHSNHNTORCAW-UHFFFAOYSA-M sodium 3,4,5,6-tetrahydroxyoxane-2-carboxylate Chemical compound [Na+].OC1OC(C([O-])=O)C(O)C(O)C1O MSXHSNHNTORCAW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 235000010413 sodium alginate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000661 sodium alginate Substances 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 229940071440 soy protein isolate Drugs 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating Effects 0.000 description 1
- 230000031068 symbiosis, encompassing mutualism through parasitism Effects 0.000 description 1
- 229960002447 thiram Drugs 0.000 description 1
- 230000017260 vegetative to reproductive phase transition of meristem Effects 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
Abstract
Description
Изобретение относится к области биотехнологии и сельского хозяйства и заключается в предварительной инкрустации семян бобовых культур с помощью биополимерных оболочек на основе штаммов полезных микроорганизмов и полисахаридов биологического и микробного происхождения.The invention relates to the field of biotechnology and agriculture and consists in the preliminary encrustation of seeds of legumes using biopolymer shells based on strains of beneficial microorganisms and polysaccharides of biological and microbial origin.
Известен Европейский патент ЕР 0454291 А1 на ИЗ «Способ получения улучшенных инокулянтов ризобия» с приоритетом от 26.02.1990 г., зарегистрированный на Grace W.R. & Со (US), МПК A01G 7/00; А01Н 1/00; C12N 1/20; C12N 15/09, опубликован 30.10.1991 г.Known European patent EP 0454291 A1 for FROM "Method for obtaining improved inoculants of rhizobia" with a priority of 26.02.1990, registered on Grace W.R. & Co (US), IPC A01G 7/00; А01Н 1/00; C12N 1/20; C12N 15/09, published 10/30/1991
В описании к патенту раскрыт способ получения улучшенного инокулянта бактерий Rhizobium, который включает культивирование штамма Rhizobium в среде с мукой из семян бобовых или экстрактом такой муки (в частности, дополнительно содержит вермикулит и источник питательных веществ, например, дрожжевой экстракт-бульон маннита), инокуляцию семян бобовых культур (например, сои), культивированным штаммом бактерий Rhizobium (например, Rhizobium japonicum), стабилизированным вермикулитом, и проращивание семян бобовых.The patent specification discloses a method for producing an improved inoculant of Rhizobium bacteria, which includes cultivating a Rhizobium strain in a medium with legume seed flour or an extract of such flour (in particular, additionally contains vermiculite and a source of nutrients, for example, mannitol yeast extract-broth), inoculation legume seeds (eg soybeans), a cultivated strain of Rhizobium bacteria (eg Rhizobium japonicum) stabilized with vermiculite, and the germination of legume seeds.
То есть в данном случае предусмотрена стабилизация только одного штамма клубеньковых бактерий на поверхности семян бобовых.That is, in this case, stabilization of only one strain of nodule bacteria on the surface of legume seeds is provided.
Из уровня техники известно, что при инокулировании семян полезными бактериями для изоляции и сохранения биологического материала их стабилизацию осуществляют с помощью высокомолекулярных соединений химического происхождения и частично природного, так, например, в американском патенте US 7604807 B2 используют защитные природные полимеры: PVP, PVA, желатин, моно и полисахариды, крахмал, альбумин, альгинат натрия и т.п.It is known from the prior art that when seeds are inoculated with beneficial bacteria to isolate and preserve biological material, their stabilization is carried out using high-molecular compounds of chemical origin and partially natural, for example, in US patent US 7604807 B2, protective natural polymers are used: PVP, PVA, gelatin , mono and polysaccharides, starch, albumin, sodium alginate, etc.
Известна международная заявка WO 09830077 A1 «Готовые к употреблению семена, обработанные бактериями, и способ их получения» с приоритетом от 10.01.1997 г., зарегистрированная на Agronomique Inst Nat Rech (FR); Digat Bernard (FR), МПК A01C 1/06; A01N 63/00, опубликована 16.07.1998 г.Known international application WO 09830077 A1 "Ready-to-eat seeds treated with bacteria, and the method of obtaining them" with priority dated 10.01.1997, registered at Agronomique Inst Nat Rech (FR); Digat Bernard (FR), IPC A01C 1/06; A01N 63/00, published 07/16/1998
Способ предлагает покрытие семян пленкой, содержащей бактерии (например, рода Rhizobium, Bradyrhizobium, Pseudomonas, Agrobacterium, Bacillus или Azospirillum), биоразлагаемый, водоудерживающий, пленкообразующий, прилипающий к семенам полимер, такой как хитозан, альгинат, целлюлоза или одно из их производных, и агент, например, L-глутаминовая кислота для быстрого увеличения внутриклеточного осмотического давления бактерий.The method involves coating the seed with a film containing bacteria (for example, the genus Rhizobium, Bradyrhizobium, Pseudomonas, Agrobacterium, Bacillus, or Azospirillum), a biodegradable, water-retaining, film-forming, seed-adherent polymer such as chitosan, alginate, cellulose, or one of their derivatives, and an agent such as L-glutamic acid to rapidly increase the intracellular osmotic pressure of bacteria.
Известно также изобретение «Способ прикрепления бактерий к семенам и композиция для его осуществления» по патенту US №5113619 А с приоритетом от 05.10.1990 г., зарегистрированному на Leps Walter Т (CA); Thompson Bradley G (СА), МПК А01С 1/06, опубликовано 19.05.1992 г.It is also known the invention "Method of attaching bacteria to seeds and composition for its implementation" according to US patent No. 5113619 A with priority dated 05.10.1990, registered at Leps Walter T (CA); Thompson Bradley G (CA), IPC A01C 1/06, published 05/19/1992
В патенте описан способ покрытия семян бактериями, при котором предварительно выращивают бактерии при обеспечении среды, подходящей для поддержания их роста и образования концентрированного, не модифицированного биополимера, с извлечением этого биополимера из среды. После этого на семена наносят инокулянтную композицию, содержащую популяцию бактерий и концентрированный, не модифицированный биополимер с образованием семенной оболочки, в которой популяция бактерий способна выживать по меньшей мере до прорастания семян; и сушки покрытых семян.The patent describes a method of coating seeds with bacteria, which pre-grow the bacteria while providing an environment suitable for supporting their growth and the formation of a concentrated, unmodified biopolymer, with the extraction of this biopolymer from the environment. After that, an inoculant composition containing a population of bacteria and a concentrated, unmodified biopolymer is applied to the seeds to form a seed coat in which the population of bacteria is able to survive at least until the seeds germinate; and drying the coated seeds.
В частности, указанная композиция инокулянта содержит популяцию ризобактерий, а указанный биополимер представляет собой кислотный гетеро-эксополисахарид, секретируемый Rhizobium sp.In particular, said inoculant composition contains a population of rhizobacteria, and said biopolymer is an acidic hetero-exopolysaccharide secreted by Rhizobium sp.
То есть в данном патенте при инокуляции семян ризобактериями используют полисахариды, продуцируемые самими ризобиями, а не сторонними штаммами.That is, in this patent, when seeds are inoculated with rhizobacteria, polysaccharides produced by the rhizobia themselves, and not by third-party strains, are used.
Известно изобретение «Использование микроорганизмов в сочетании с семенами» по патенту Великобритании GB 2080669 A с приоритетом от 28.07.1980 г., зарегистрированное на Coated Seed Ltd (NZ), МПК A01C1/06; C12N 1/04, опубликовано 10.02.1982 г.Known invention "Use of microorganisms in combination with seeds" according to the UK patent GB 2080669 A with priority dated 28.07.1980, registered at Coated Seed Ltd (NZ), IPC A01C1/06; C12N 1/04, published 2/10/1982
В патенте описан способ получения семян бобовых с предварительным наружным покрытием, в котором покрытие содержит бактерию вида Rhizobium и водорастворимый поливинилпирролидон, включающий формирование суспензии бактерий в водном растворе поливинилпирролидона и нанесение суспензии на семена. В частности, семена покрывают казеинатом натрия, мелкоизмельченным известняком и торфом, сушат для удаления излишков влаги и затем смешивают с суспензией культуры Rhizobium на торфяной среде в растворе поливинилпирролидона в воде (ПВП).The patent describes a method for obtaining seeds of legumes with a preliminary outer coating, in which the coating contains a bacterium of the species Rhizobium and water-soluble polyvinylpyrrolidone, including the formation of a suspension of bacteria in an aqueous solution of polyvinylpyrrolidone and applying the suspension to the seeds. In particular, the seeds are coated with sodium caseinate, finely ground limestone and peat, dried to remove excess moisture, and then mixed with a suspension of a Rhizobium culture on a peat medium in a solution of polyvinylpyrrolidone in water (PVP).
Известно также изобретение «Способ получения семян, покрытых оболочкой» по патенту US 5106648А с приоритетом от 16.09.1991 г., зарегистри-рованн на Agricultural Genetics Со (GB), МПК А01С 1/06; A01N 25/00; A01N 63/00, опубликован 21.04.1992 г. Этот патент выбран в качестве прототипа.Also known is the invention "Method of obtaining seeds coated with a shell" according to US patent 5106648A with priority dated September 16, 1991, registered at Agricultural Genetics Co (GB), IPC A01C 1/06; A01N 25/00; A01N 63/00, published 04/21/1992 This patent is selected as a prototype.
Описан способ получения семян, покрытых оболочкой, при котором сначала смешивают семена (1) с композицией инокулянта (2), содержащей среду-носитель, по меньшей мере, один вид микроорганизмов, оказывающих благоприятное воздействие на растения, вырастающие из этих семян, и первый адгезивный полимер, и с водной суспензией второго адгезивного полимера (3), выбранного из группы, состоящей, в частности, из сополимеров винилпирролидона/винилацетата, причем компонент (3), добавляется отдельно до или во время суспендирования; после чего инокулированные семена сушат на воздухе при температуре не выше 30°С.Described is a method for producing coated seeds, in which seeds (1) are first mixed with an inoculant composition (2) containing a carrier medium of at least one type of microorganisms that have a beneficial effect on plants growing from these seeds, and the first adhesive polymer, and with an aqueous suspension of a second adhesive polymer (3) selected from the group consisting in particular of vinylpyrrolidone/vinyl acetate copolymers, component (3) being added separately before or during suspension; after which the inoculated seeds are dried in air at a temperature not exceeding 30°C.
Носителем предпочтительно является торф, но может быть использован вермикулит, глина, ил, графит, тальк и т.д. При этом, в частности, семена являются семенами бобовых культур, в качестве первого и второго адгезивных (клеящих) полимеров используют сополимер винилпирролидона и винилацетата, а в качестве микроорганизмов - бактерии ризобия. Кроме того, в покрытие может быть введен совместимый с бактериями химический фунгицид, например, металаксил, карбатин или тирам.The carrier is preferably peat, but vermiculite, clay, silt, graphite, talc, etc. may be used. In this case, in particular, the seeds are seeds of legumes, as the first and second adhesive (adhesive) polymers, a copolymer of vinylpyrrolidone and vinyl acetate is used, and rhizobium bacteria are used as microorganisms. In addition, a bacteria-compatible chemical fungicide, such as metalaxyl, carbatine, or thiram, can be added to the coating.
То есть, в способе - прототипе инокулянтная композиция содержит среду-носитель (например, торф, глина), полезные микроорганизмы по меньшей мере одного вида (например, бактерии ризобия) и первый адгезивный полимер, а также содержит водную суспензию второго адгезивного полимера (например, в качестве первого и второго адгезивного полимера использован сополимер винилпирролидона и винилацетата).That is, in the prototype method, the inoculant composition contains a carrier medium (for example, peat, clay), beneficial microorganisms of at least one species (for example, rhizobia bacteria) and the first adhesive polymer, and also contains an aqueous suspension of the second adhesive polymer (for example, the copolymer of vinylpyrrolidone and vinyl acetate was used as the first and second adhesive polymer).
Обработка семян (бобовых культур) описанным способом обеспечивает сохранность высокого количества жизнеспособных ризобиальных клеток (титр) на одно семя в течение не менее 3 месяцев.The treatment of seeds (legumes) by the described method ensures the preservation of a high number of viable rhizobial cells (titer) per seed for at least 3 months.
Одним из препятствий для внедрения технологии предварительного инокулирования семян является естественная нестабильность микроорганизмов. Некоторые из них не могут перенести резкого процесса сушки при инокулировании семян или при последующих периодах хранения на открытом воздухе. Поэтому виды бактерий, у которых есть стадия покоя в своем жизненном цикле (например, устойчивые споры), легче применять для инокулирования семен.One of the obstacles to the introduction of seed pre-inoculation technology is the natural instability of microorganisms. Some of them cannot tolerate the drastic drying process when seed is inoculated or during subsequent periods of outdoor storage. Therefore, bacterial species that have a dormant stage in their life cycle (eg resistant spores) are easier to apply for seed inoculation.
При этом такие бактерии, как ризобии, не образуют естественных структур покоя, и обычно не могут выдержать быстрой сушки при температурах выше 30°С без гибели значительной части популяции инокулянта; иногда они продолжают погибать во время последующего хранения на воздухе.At the same time, bacteria such as rhizobia do not form natural dormant structures, and usually cannot withstand rapid drying at temperatures above 30°C without killing a significant part of the inoculant population; sometimes they continue to die during subsequent storage in the air.
Таким образом, из уровня техники не был выявлен способ получения готовых к севу инкрустированных семян бобовых культур со стабильным сроком хранения более 6 месяцев, которые содержат в составе биополимерных оболочек комплекс агрономически ценных микроорганизмов в достаточном количестве для эффективной инокуляции при посеве.Thus, the state of the art has not identified a method for obtaining ready-to-sow encrusted legume seeds with a stable shelf life of more than 6 months, which contain a complex of agronomically valuable microorganisms in sufficient quantities in the composition of biopolymer shells for effective inoculation during sowing.
Задачей изобретения является создание стабильного биополимерного покрытия на поверхности семян бобовых культур с агрономически ценными микроорганизмами в титрах, обеспечивающих долговременное сохранение штаммов, достаточных для эффективной инокуляции (104 КОЕ/семя) по истечению 9 месяцев хранения. Настоящее изобретение позволяет исключить у конечного потребителя необходимость применения жидких инокулянтов и других биопрепаратов при посеве семян, используя уже готовые к севу биологически инкрустированные семена.The objective of the invention is to create a stable biopolymer coating on the surface of seeds of legumes with agronomically valuable microorganisms in titers that ensure long-term preservation of strains sufficient for effective inoculation (10 4 CFU/seed) after 9 months of storage. The present invention eliminates the need for the end user to use liquid inoculants and other biological products when sowing seeds, using biologically encrusted seeds that are ready for sowing.
Указанная задача решается за счет того, что разработан способ инкрустации семян при помощи биополимерных оболочек и микроорганизмов, обеспечивающий сохранность бактерий в титрах, достаточных для эффективной инокуляции при посеве на протяжении не менее 9 месяцев их хранения, заключающийся в закреплении и стабилизации чувствительных к высушиванию микроорганизмов на поверхности семян бобовых при помощи экзополи-сахаридов (ЭПС) и сахаров биологического происхождения и поливинилового спирта, а также в дополнительном покрытии антислипающим агентом.This problem is solved due to the fact that a method has been developed for encrusting seeds with the help of biopolymer shells and microorganisms, which ensures the safety of bacteria in titers sufficient for effective inoculation during sowing for at least 9 months of their storage, which consists in fixing and stabilizing microorganisms sensitive to drying on the surface of legume seeds with exopolysaccharides (EPS) and sugars of biological origin and polyvinyl alcohol, as well as in an additional coating with an anti-caking agent.
При этом в изобретении в составе биополимерной оболочки на поверхности семян используют активные микробиологические компоненты. Так, в качестве инокулянта бобовых культур могут быть использованы агрономически ценные микроорганизмы - клубеньковые бактерии класса Bradyrhizobium japomcum, Rhizobium legummosarum bv, viciae или Mesorhizobium ciceri, а также ростостимулирующие и фунгицидные микроорганизмы класса Bacillus subtilis, Pseudomonas fluorescens или Azotobacter chroococcum, а также микроэлементы.At the same time, in the invention, active microbiological components are used as part of the biopolymer shell on the surface of the seeds. Thus, agronomically valuable microorganisms - nodule bacteria of the class Bradyrhizobium japomcum, Rhizobium legummosarum bv, viciae or Mesorhizobium ciceri, as well as growth-stimulating and fungicidal microorganisms of the class Bacillus subtilis, Pseudomonas fluorescens or Azotobacter chroococcum, as well as trace elements can be used as an inoculant of legumes.
В качестве стабилизатора при высушивании клубеньковых бактерий Bradyrhizobium japonicum, Rhizobium legum inosarum bv. viciae или Mesorhizobium ciceri, могут быть использованы экзополисахариды (ЭПС) микробного происхождения, полученные от другого вида бактерий, например, вида Paenibacillus mucilaginosus.As a stabilizer for drying nodule bacteria Bradyrhizobium japonicum, Rhizobium legum inosarum bv. viciae or Mesorhizobium ciceri, microbial exopolysaccharides (EPS) derived from another bacterial species, such as Paenibacillus mucilaginosus, may be used.
Согласно изобретению способ инкрустации семян при помощи биополимерных оболочек и микроорганизмов заключается в закреплении и стабилизации чувствительных к высушиванию микроорганизмов на поверхности семян при помощи поливинилового спирта, Сахаров биологического происхождения и экзополисахаридов (ЭПС) микробного происхождения, а также в дополнительном покрытии антислипающим агентом, причем в качестве анти-слипающего агента могут быть использованы, например: цеолит, бентонит» активированный уголь, каолин, глауконит, тальк, диатомит, микрокремнезем,, вермикулит, волластонит, шунгит, декстрин» крахмал. Указанная обработка обеспечивает в нанесенной оболочке сохранность полезных бактерий в титрах, достаточных для эффективной их инокуляции на протяжении не менее 9 месяцев хранения семян.According to the invention, the method of incrustation of seeds using biopolymer shells and microorganisms consists in fixing and stabilizing microorganisms sensitive to drying on the surface of seeds using polyvinyl alcohol, sugars of biological origin and exopolysaccharides (EPS) of microbial origin, as well as in an additional coating with an anti-caking agent, moreover, as anti-caking agent can be used, for example: zeolite, bentonite, activated carbon, kaolin, glauconite, talc, diatomite, microsilica, vermiculite, wollastonite, shungite, dextrin, starch. This treatment ensures the safety of beneficial bacteria in the applied shell in titers sufficient for their effective inoculation for at least 9 months of seed storage.
Кроме того, следует отметить, что процесс сушки семян, обработанных заявленным способом, значительно короче по сравнению с прототипом, где используется сушка при температуре не более 30°С в течение 8-и суток.In addition, it should be noted that the drying process of seeds treated by the claimed method is much shorter compared to the prototype, which uses drying at a temperature not exceeding 30°C for 8 days.
То есть новизна изобретения заключается в одновременном включении в состав биополимерной оболочки семян одного или более активных микробиологических компонентов; инокулянта бобовых культур (клубеньковых бактерий класса Bradyrhizobium japonicum, Rhizobium legummosarum bv, viciae или Mesorhizobium ciceri), стабилизированных с помощью ЭПС, полученных от другого вида бактерий (класса Paenibacillus mucilaginosus).That is, the novelty of the invention lies in the simultaneous inclusion of one or more active microbiological components in the composition of the biopolymer seed coat; a legume inoculant (nodule bacteria of the class Bradyrhizobium japonicum, Rhizobium legummosarum bv, viciae or Mesorhizobium ciceri) stabilized with EPS obtained from another bacterial species (class Paenibacillus mucilaginosus).
В частных случаях, при необходимости, в состав оболочки могут быть добавлены ростостимулирующие и/или фунгицидные микроорганизмы класса Bacillus subtilis, Pseudomonas fluorescens, Azotobacter chroococcum, а также микроэлементы.In particular cases, if necessary, growth-promoting and/or fungicidal microorganisms of the class Bacillus subtilis, Pseudomonas fluorescens, Azotobacter chroococcum, as well as microelements can be added to the composition of the shell.
Заявленный способ инкрустации семян бобовых культур при помощи биополимерных оболочек и микроорганизмов включает в себя несколько этапов осуществления.The claimed method of incrustation of seeds of legumes using biopolymer shells and microorganisms includes several stages of implementation.
Сначала, на первом этапе осуществляют раздельное культивирование клубеньковых бактерий Bradyrhizobium japonicum, Rhizobium legummosarum bv. viciae или Mesorhizobium ciceri, на оптимальных для их роста и накопления биомассы средах до достижения титра не менее 109 КОЕ/мл, а также осуществляют культивирование штамма-продуцента внеклеточных полисахаридов класса Paenibacillus mucilaginosus на среде и в условиях, оптимальных для накопления бактериальных экзополисахаридов (ЭПС) и достижения вяз- кости полученной культуры не менее 40,0 мПа⋅с.First, at the first stage, separate cultivation of nodule bacteria Bradyrhizobium japonicum, Rhizobium legummosarum bv. viciae or Mesorhizobium ciceri, on optimal media for their growth and accumulation of biomass until a titer of at least 10 9 CFU / ml is reached, and the cultivation of the strain-producer of extracellular polysaccharides of the Paenibacillus mucilaginosus class is carried out on the medium and under conditions optimal for the accumulation of bacterial exopolysaccharides (EPS ) and achieve a viscosity of the resulting culture of at least 40.0 mPa⋅s.
Затем, на втором этапе осуществляют стабилизацию клубеньковых бактерий с помощью раствора трегалозы. Для этого в жидкую культуру бактерий Bradyrhizobium japonicum, Rhizobium leguminosarum bv. viciae или Mesorhizobium ciceri вносят 5-25% стерильного раствора трегалозы, полученную суспензию выдерживают в течение 1-3 ч при температуре 20-25°С, а затем охлаждают при +4°С в течение 1-6 ч.Then, at the second stage, nodule bacteria are stabilized with a trehalose solution. To do this, in a liquid culture of the bacteria Bradyrhizobium japonicum, Rhizobium leguminosarum bv. viciae or Mesorhizobium ciceri add 5-25% sterile trehalose solution, the resulting suspension is kept for 1-3 hours at a temperature of 20-25°C, and then cooled at +4°C for 1-6 hours.
Затем, на третьем этапе проводят стерилизацию культуры штамма-продуцента внеклеточных полисахаридов Paenibacillus mucilaginosus путем автоклавирования полученной на первом этапе культуры с бактериальными экзополисахаридами при 110-125°С в течение 15-25 мин до получения беззародышевой культуры, т.е. иноктивированной культуральной жидкости (ИКЖ), содержащей погибшие клетки микроорганизмов и растворенные ЭПС, а также продукты обмена веществ и остатки питательной среды.Then, at the third stage, the culture of the strain-producer of extracellular polysaccharides Paenibacillus mucilaginosus is sterilized by autoclaving the culture obtained at the first stage with bacterial exopolysaccharides at 110-125°C for 15-25 min until a germ-free culture is obtained, i.e. inoculated culture liquid (ICL) containing dead microorganism cells and dissolved EPS, as well as metabolic products and nutrient medium residues.
Далее, на четвертом этапе готовят жидкий биополимерный стабилизатор, для чего в стерильный 0,85% раствор хлористого натрия добавляют не менее 60% инактивированной культуральной жидкости (ИКЖ) с продуктами метаболизма - ЭПС Paenibacillus mucilaginosus, компоненты перемешивают.Further, at the fourth stage, a liquid biopolymer stabilizer is prepared, for which at least 60% of inactivated culture liquid (ICL) with metabolic products - Paenibacillus mucilaginosus EPS is added to a sterile 0.85% sodium chloride solution, the components are mixed.
Далее, на пятом этапе получают готовую стабилизированную форму биологического инкрустатора (сокращенно - биоинкрустатора). Для этого суспензию стабилизированной культуры клубеньковых бактерий, полученную как указано на 2-м этапе, смешивают с биополимерным стабилизатором, полученным как указано на 4-м этапе, и 10% раствором поливинилового спирта (ЛВС) в соотношении 1:1:1 с допустимым отклонением ±10% и выдерживают в течение 1 ч при температуре 20-25°С.Further, at the fifth stage, a finished stabilized form of a biological incrustator (abbreviated as a bioencrustator) is obtained. To do this, a suspension of a stabilized nodule bacteria culture, obtained as indicated in the 2nd stage, is mixed with a biopolymer stabilizer obtained as indicated in the 4th stage, and a 10% solution of polyvinyl alcohol (PVA) in a ratio of 1:1:1 with a tolerance ±10% and incubated for 1 hour at a temperature of 20-25°C.
После этого, на шестом этапе навески семян бобовых (например, соя, горох, нут) смешивают с 2-5% готового жидкого биологического инкрустатора (биоинкрустатора) к массе семян, после чего для создания плотной оболочки и придания товарного вида, обработанные семена покрывают (обволакивают) антислеживающим агентом в количестве 2-5% к массе семян в зависимости от их размера. При этом в качестве антислеживающего агента может быть использован, например, аморфный диоксид кремния, цеолит, бентонит, активированный уголь, каолин, глауконит, тальк, диатомит, микрокремнезем, вермикулит, волластонит, шунгит, декстрин, крахмал.After that, at the sixth stage, legume seeds (for example, soybeans, peas, chickpeas) are mixed with 2-5% of the finished liquid biological incrustator (bioincrustator) to the mass of seeds, after which, to create a dense shell and give a marketable appearance, the treated seeds are covered ( envelop) with an anti-caking agent in the amount of 2-5% by weight of the seeds, depending on their size. In this case, for example, amorphous silicon dioxide, zeolite, bentonite, activated carbon, kaolin, glauconite, talc, diatomite, microsilica, vermiculite, wollastonite, shungite, dextrin, starch can be used as an anti-caking agent.
В заключении, на седьмом этапе осуществляют мягкую сушку биоинкрустированных семян при температуре 40-42°С в течение 120-180 мин и постоянном перемешивании до влажности 12-15%.Finally, at the seventh stage, soft drying of the bioencrusted seeds is carried out at a temperature of 40-42°C for 120-180 minutes and constant stirring to a moisture content of 12-15%.
В частном случае выполнения способа инкрустации семян бобовых культур на четвертом этапе, при получении жидкого биополимерного стабилизатора в его состав могут быть дополнительно введены как по отдельности, так и в любом сочетании компоненты: раствор 20% панкреатического гидролизата казеина, водный 20% раствор арабинозы, водный 20% раствор маннита при следующем соотношении всех компонентов жидкого биополимерного стабилизатора:In a particular case of performing the method of incrustation of seeds of legumes at the fourth stage, upon receipt of a liquid biopolymer stabilizer, components can be additionally introduced into its composition both individually and in any combination: a solution of 20% casein pancreatic hydrolyzate, an aqueous 20% solution of arabinose, an aqueous 20% mannitol solution with the following ratio of all components of the liquid biopolymer stabilizer:
- инактивированная культуральная жидкость Paenibacillus Mucilaginosus, содержащая ЭПС - не менее 60%- inactivated culture fluid Paenibacillus Mucilaginosus containing EPS - not less than 60%
- водный раствор 20% панкреатического гидролизата казеина - 0,5-4,0%- an aqueous solution of 20% pancreatic hydrolyzate of casein - 0.5-4.0%
- и/или водный 20% раствор арабинозы - 0,5-4,0%- and / or aqueous 20% solution of arabinose - 0.5-4.0%
- и/или водный 20% раствор маннита - 0,5- 4,0%- and / or aqueous 20% mannitol solution - 0.5-4.0%
- стерильный 0,85% раствор хлористого натрия - до 100%.- sterile 0.85% sodium chloride solution - up to 100%.
В частном случае способа инкрустации семян бобовых культур при необходимости усиления его ростостимулирующего и/или фунгицидного эффекта, в состав биологического инкрустатора дополнительно вводят соответствующие микроорганизмы. Для этого в способе осуществляют следующее.In a particular case of the method of incrustation of seeds of legumes, if it is necessary to enhance its growth-stimulating and/or fungicidal effect, appropriate microorganisms are additionally introduced into the composition of the biological encrust. To do this, the following is carried out in the method.
На первом этапе осуществляют раздельное культивирование соответственно ростостимулирующих и/или фунгицидных микроорганизмов Bacillus subtilis, Pseudomonas fluorescens, или Azotobacter chroococcum на среде оптимального состава до достижении титра не менее 109 КОЕ/мл.At the first stage, separate cultivation of growth-stimulating and/or fungicidal microorganisms Bacillus subtilis, Pseudomonas fluorescens, or Azotobacter chroococcum, respectively, is carried out on an optimal composition medium until a titer of at least 10 9 CFU/ml is reached.
На пятом этапе, при получении биологического инкрустатора, вносят вы- ращенные на первом этапе бактерии Bacillus subtilis, Pseudomonas fluorescens, или Azotobacter chroococcum, для обеспечения их содержания в биологическом инкрустаторе в количестве 0,01-0,1%, после чего полученную смесь выдерживают в течение 1 ч при температуре 20-25°С.At the fifth stage, upon receipt of the biological incruster, the bacteria Bacillus subtilis, Pseudomonas fluorescens, or Azotobacter chroococcum grown at the first stage are introduced to ensure their content in the biological incruster in the amount of 0.01-0.1%, after which the resulting mixture is kept for 1 hour at a temperature of 20-25°C.
В другом частном случае выполнения способа инкрустации семян бобовых культур, для усиления питания будущих растений, особенно при посеве на «бедных» почвах, на пятом этапе способа в жидкий биологический инкрустатор дополнительно вводят в любом сочетании указанные ниже микроэлементы в солевой или хелатной форме для обеспечения содержании ионов металла в биологическом инкрустаторе:In another particular case of performing the method of encrusting seeds of legumes, to enhance the nutrition of future plants, especially when sown on "poor" soils, at the fifth stage of the method, the following microelements in salt or chelate form are additionally introduced into the liquid biological encruster in any combination to ensure the content metal ions in a biological encrustator:
- железо (Fe) - 0,1-0,005%;- iron (Fe) - 0.1-0.005%;
- магний (Mg)- 0,2-0,0001%- magnesium (Mg) - 0.2-0.0001%
- цинк (Zn) - 0,04-0,00001%;- zinc (Zn) - 0.04-0.00001%;
- бор (В) - 0,15-0,00001%;- boron (B) - 0.15-0.00001%;
- медь (Cu) - 0,001-0,000001%;- copper (Cu) - 0.001-0.000001%;
- марганец (Mn) - 0,15-0,00001%- manganese (Mn) - 0.15-0.00001%
- молибден (Мо) - 0,2-0,0001%- molybdenum (Mo) - 0.2-0.0001%
- кобальт (Со) - 0,05-0,000001%- cobalt (Co) - 0.05-0.000001%
В частности, в жидкий биологический инкрустатор могут быть добавлены: хелат цинка Zn(ЭДТА) - 0,028% и аммоний молибденовокислый (NH4)2MoO4 - 0,16%In particular, the following can be added to the liquid biological encruster: zinc chelate Zn (EDTA) - 0.028% and ammonium molybdate (NH 4 ) 2 MoO 4 - 0.16%
с допустимым отклонением ±10%.with a tolerance of ±10%.
Ниже приведены примеры осуществления заявляемого способа инкрустации семян бобовых культур при помощи биополимерных оболочек и микроорганизмов.Below are examples of the implementation of the proposed method of incrustation of seeds of legumes using biopolymer shells and microorganisms.
Пример 1.Example 1
В качестве агрономически полезного микроорганизма взяли штамм клубеньковых бактерий Bradyrhizobium japonicum ПКК, который выращивали, на жидкой среде следующего состава; глицерин - 10,0 г/л; глутамат натрия - 1,0 г/л; дрожжевой экстракт - 0,05 г/л; калий фосфорнокислый даузамещенный - 0,2 г/л; натрий хлористый - 0,2 г/л, магний сернокислый - 0,1 г/лAs an agronomically useful microorganism, a strain of nodule bacteria Bradyrhizobium japonicum PKC was taken, which was grown on a liquid medium of the following composition; glycerol - 10.0 g/l; monosodium glutamate - 1.0 g/l; yeast extract - 0.05 g/l; potassium phosphate dau-substituted - 0.2 g/l; sodium chloride - 0.2 g / l, magnesium sulfate - 0.1 g / l
и культивировали в течение 5 суток при температуре 28°С при перемешивании в устройстве орбитального типа - качалке со скоростью 280 об/мин до достижения титра 10° КОЕ/мл (культура клубеньковых бактерий).and cultivated for 5 days at a temperature of 28°C with stirring in an orbital type device - a rocking chair at a speed of 280 rpm until a titer of 10° CFU/ml was reached (culture of nodule bacteria).
Затем в жидкую культуру Bradyrhizobium. japonicum ПКК для стабилизации ввели 5% стерильного раствора трегалозы; суспензию выдерживали в течение 1 ч при температуре 20°С, а затем охлаждали при 4°С в течение 1 ч.Then into a liquid culture of Bradyrhizobium. japonicum PCC for stabilization introduced 5% sterile trehalose solution; the suspension was kept for 1 hour at 20°C and then cooled at 4°C for 1 hour.
В качестве штамма-продуцената ЭПС взяли штамм Paenibacillus mucilaginosus 17-2, который культивировали, в течение 5 суток на жидкой, среде следующего состава: сахароза - 15,0 г/л; калий фосфорнокислый - 0,1 г/л, магний сернокислый - 0,1 г/л; натрий хлористый - 0,1 г/л; калий сернокислый - 0,1 г/л, кальций углекислый - 2,0 г/л, до получения культуры (КЖ) с наработкой внеклеточных полисахаридов и достижения ее вязкости 42,0 мПа⋅c.As a strain-producer of EPS took a strain of Paenibacillus mucilaginosus 17-2, which was cultivated for 5 days in a liquid medium of the following composition: sucrose - 15.0 g/l; potassium phosphate - 0.1 g/l, magnesium sulfate - 0.1 g/l; sodium chloride - 0.1 g / l; potassium sulphate - 0.1 g/l, calcium carbonate - 2.0 g/l, until a culture (QOL) is obtained with the production of extracellular polysaccharides and its viscosity reaches 42.0 mPa⋅s.
Полученную КЖ с живыми клетками Paenibacillus mucilaginosus 17-2 и наработанными бактериальными полисахаридами стерилизовали путем авто-клавирования при 110°С в течение 15 мин, в результате чего была получена беззародышевая культура, т.е. инактивированная культуральная жидкость (ИКЖ), содержащая погибшие клетки микроорганизмов и. растворенные ЭПС, а также продукты обмена веществ и остатки питательной среды.The resulting CL with living cells of Paenibacillus mucilaginosus 17-2 and the accumulated bacterial polysaccharides was sterilized by autoclaving at 110°C for 15 min, as a result of which a germ-free culture was obtained, i.e. inactivated culture liquid (ICL) containing dead cells of microorganisms and. dissolved EPS, as well as metabolic products and nutrient medium residues.
Биополимерный стабилизатор получали, добавив в стерильный 0,85% раствор хлористого натрия 75% массы ИКЖ, компоненты перемешали.A biopolymer stabilizer was obtained by adding 75% of the mass of ICL to a sterile 0.85% sodium chloride solution, the components were mixed.
Затем получали готовый жидкий биоинкрустатор, для чего в коническую колбу объемом 100 мл внесли 33 мл биополимерного стабилизатора (суспензию с ИКЖ. Paenibacillus mucilaginosus 17-2), смешивали с 33 мл стабилизированной культуры клубеньковых бактерий Bradyrhizobium japonicum ГОЖ, и 33 мл 10% раствора поливинилового спирта (ЛВС), т.е. смешали в соотношении 1:1:1, и смесь выдерживали 1 ч при температуре 20°С.Then a ready-made liquid bioincrustator was obtained, for which 33 ml of a biopolymer stabilizer (suspension with ICL. Paenibacillus mucilaginosus 17-2) was added to a 100 ml conical flask, mixed with 33 ml of a stabilized culture of nodule bacteria Bradyrhizobium japonicum GOJ, and 33 ml of a 10% solution of polyvinyl alcohol (LAN), i.e. mixed in a ratio of 1:1:1, and the mixture was kept for 1 hour at a temperature of 20°C.
Навеску очищенных семян сои {Glycine max L, сорт. Алена, 1 репр.) массой 100 г вносили в стерильный полиэтиленовый пакет, туда же добавили 5 мл готового биологического инкрустатора. Пакет тщательно встряхивали несколько минут, добиваясь равномерного покрытия семян биологическим инкрустатором. Затем в пакет добавили 5 г антислеживающего агента - аморфного диоксида кремния; пакет тщательно встряхивали до образования у семян плотной оболочки.A weight of peeled soybean seeds {Glycine max L, cultivar. Alena, 1 rep.) weighing 100 g was introduced into a sterile plastic bag, 5 ml of the finished biological encrust was added there. The package was thoroughly shaken for several minutes, achieving uniform coverage of the seeds with a biological encruster. Then, 5 g of an anti-caking agent, amorphous silicon dioxide, was added to the bag; the package was thoroughly shaken until a dense shell formed in the seeds.
Обработанные семена выкладывали на плоский лоток и сушили в сушильном шкафу при периодическом перемешивании при температуре 40°С в течение 120 мин до влажности 15%. После чего 0,1 кг биоинкрустированных семян сои поместили в бумажный пакет.The treated seeds were laid out on a flat tray and dried in an oven with occasional stirring at a temperature of 40°C for 120 min to a moisture content of 15%. After that, 0.1 kg of bioencrusted soybean seeds were placed in a paper bag.
Пример 2,Example 2
В качестве агрономически полезного микроорганизма взяли штамм клубеньковых бактерий Rhizobium legummosarum bv. viciae Щ028Г, который выращивали на жидкой среде следующего состава; глицерин - 20,0 г/л; глутамат натрия - 3,0 г/л; дрожжевой экстракт - 0,1 г/л; калий фосфорнокислый двузамещенный - 0,4 г/л; натрий хлористый - 0,4 г/л, магний сернокислый - 0,2 г/лAs an agronomically useful microorganism, a strain of nodule bacteria Rhizobium legummosarum bv. viciae Shch028G, which was grown on a liquid medium of the following composition; glycerol - 20.0 g/l; monosodium glutamate - 3.0 g/l; yeast extract - 0.1 g/l; disubstituted potassium phosphate - 0.4 g/l; sodium chloride - 0.4 g / l, magnesium sulfate - 0.2 g / l
и культивировали в течение 6 суток при температуре 32°С при перемешивании в устройстве орбитального типа - качалке со скоростью 280 об/мин до достижения титра 1010 КОЕ/мл.and cultivated for 6 days at a temperature of 32°C with stirring in an orbital type device - a rocking chair at a speed of 280 rpm until a titer of 10 10 CFU/ml was reached.
Для стабилизации в жидкую культуру бактерий Rhizobium legummosarum bv. viciae Щ028Г ввели 25% стерильного раствора трегалозы. Полученную суспензию выдерживали в течение 3 ч при температуре 25°С, а затем охлаждали при 4°С в течение 6 ч,For stabilization in a liquid culture of the bacteria Rhizobium legummosarum bv. viciae W028G was injected with 25% sterile trehalose solution. The resulting suspension was kept for 3 hours at a temperature of 25°C, and then cooled at 4°C for 6 hours,
В качестве штамма-продуцента ЭПС взяли штамм Paenibacillus mucilaginosus 17-2, который выращивали на жидкой среде следующего состава: сахароза - 25,0 г/л; калий фосфорнокислый - 0,5 г/л, магний сернокислый - 0,2 г/л; натрий хлористый - 0,2 г/л; калий сернокислый - 0,2 г/л, кальций углекислый - 5,0 г/л,Paenibacillus mucilaginosus 17-2 was taken as the EPS producer strain, which was grown on a liquid medium of the following composition: sucrose - 25.0 g/l; potassium phosphate - 0.5 g/l, magnesium sulfate - 0.2 g/l; sodium chloride - 0.2 g / l; potassium sulfate - 0.2 g / l, calcium carbonate - 5.0 g / l,
и культивировали 6 суток до получения культуры (КЖ) с наработкой внеклеточных полисахаридов и достижения ее вязкости 45,0 мПа⋅с,and cultivated for 6 days until obtaining a culture (QOL) with the production of extracellular polysaccharides and reaching its viscosity of 45.0 mPa⋅s,
Полученную КЖ с живыми клетками Paenibacillus mucilaginosus 17-2 и наработанными бактериальными полисахаридами стерилизовали путем авто-клавирования при 125°С в течение 25 мин, в результате чего была получена беззародышевая культура, т.е. инактивированная культуральная жидкость (ИКЖ), содержащая погибшие клетки микроорганизмов и растворенные ЭПС, а также продукты обмена веществ и остатки питательной среды.The resulting CL with living cells of Paenibacillus mucilaginosus 17-2 and the accumulated bacterial polysaccharides was sterilized by autoclaving at 125°C for 25 min. inactivated culture liquid (ICL) containing dead microorganism cells and dissolved EPS, as well as metabolic products and nutrient medium residues.
Биополимерный стабилизатор получили, добавив в инактивированную культуральную жидкость (ИКЖ) с продуктами метаболизма Paenibacillus mucilaginosus 17-2 стерильный 0,85% раствор хлористого натрия в количестве, при котором масса ИКЖ составляет 60% общей массы, а также добавив следующие стабилизирующие добавки в количестве к массе ИКЖ;A biopolymer stabilizer was obtained by adding a sterile 0.85% solution of sodium chloride to the inactivated culture liquid (ICL) with metabolic products of Paenibacillus mucilaginosus 17-2 in an amount at which the mass of the ICL is 60% of the total mass, and also by adding the following stabilizing additives in an amount of mass of IKZh;
- водный 20% раствор панкреатического гидролизата казеина - 4,0%;- water 20% solution of pancreatic hydrolyzate of casein - 4.0%;
- водный 20% раствор арабинозы - 4,0%;- water 20% solution of arabinose - 4.0%;
- водный 20% раствор маннита - 4,0%.- water 20% mannitol solution - 4.0%.
Затем получили готовый жидкий биоинкрустатор, для чего в коническую колбу объемом 100 мл внесли 33 мл биополимерного стабилизатора (суспензию с ИКЖ Paenibacillus mucilaginosus 17-2) с добавками, смешали с 33 мл стабилизированной культуры бактерий Rhizobium legummosarum bv. viciae Щ028Г и 33 мл 10% раствора поливинилового спирта (ПВС), т.е. смешали в соотношении 1:1:1, и выдерживали 1 ч при температуре 25°С,Then, a ready-made liquid bioencrustator was obtained, for which 33 ml of a biopolymer stabilizer (suspension with ICL Paenibacillus mucilaginosus 17-2) with additives was added to a 100 ml conical flask, mixed with 33 ml of a stabilized culture of bacteria Rhizobium legummosarum bv. viciae Shch028G and 33 ml of a 10% solution of polyvinyl alcohol (PVA), i.e. mixed in a ratio of 1:1:1, and kept for 1 hour at a temperature of 25°C,
Навеску очищенных семян гороха (Pisum sativum L, сорт Самариус, I репр.) массой 100 г внесли в стерильный полиэтиленовый пакет, туда же добавили 2 мл готового биологического инкрустатора. Пакет тщательно встряхивали несколько минут, добиваясь равномерного покрытия семян биологическим инкрустатором. Затем в пакет добавили 2 г антислеживающего агентаA weight of 100 g of peeled pea seeds (Pisum sativum L, cultivar Samarius, repr. I) was placed in a sterile plastic bag, and 2 ml of the finished biological encrust was added there. The package was thoroughly shaken for several minutes, achieving uniform coverage of the seeds with a biological encruster. Then 2 g of anti-caking agent was added to the bag
- микрокремнезема; пакет тщательно встряхивали до образования у семян плотной оболочки.- microsilica; the package was thoroughly shaken until a dense shell formed in the seeds.
Затем обработанные семена выкладывали на плоский лоток и сушили в сушильном шкафу при периодическом перемешивании при температуре 42°С в течение 180 мин до влажности 12%. После чего 0,1 кг биоинкрустированных семян гороха поместили в бумажный пакет.Then the treated seeds were laid out on a flat tray and dried in an oven with occasional stirring at a temperature of 42°C for 180 min to a moisture content of 12%. After that, 0.1 kg of bioencrusted pea seeds were placed in a paper bag.
Для определения эффективности сохранения титра жизнеспособных агрономически полезных штаммов микроорганизмов на биоинкрустированных. заявленным способом семенах были проведены лабораторные опыты.To determine the effectiveness of maintaining the titer of viable agronomically useful strains of microorganisms on bioencrusted. according to the claimed method, the seeds were carried out laboratory experiments.
Опыт 1.Experience 1.
Определяли эффективность биоинкрустированных заявленным способом семян сои штаммом бактерий Bradyrhizobium japonicum ПКК, по сравнению с другими инокулянтами в период их хранения до I мес.The effectiveness of soybean seeds bioencrusted by the claimed method with the bacterial strain Bradyrhizobium japonicum PKK was determined in comparison with other inoculants during their storage period up to 1 month.
В качестве агрономически полезного микроорганизма был взят штамм бактерий Bradyrhizobium japonicum ПКК, Биоинкрустатор получали как описано в примере 1,A bacterial strain of Bradyrhizobium japonicum PKK was taken as an agronomically useful microorganism. The bioincrustator was obtained as described in example 1,
1-й контрольный инокулянт получали следующим образом; 1 мл культуры Bradyrhizobium japonicum ПКК смешивали с 1 мл 10% водного раствора поливинилового спирта и 1 мл стерильного физиологического раствора.The 1st control inoculant was obtained as follows; 1 ml of a culture of Bradyrhizobium japonicum PCC was mixed with 1 ml of a 10% aqueous solution of polyvinyl alcohol and 1 ml of sterile saline.
2-й контрольный инокулянт (Прототип) получали таким образом; 1 мл культуры Bradyrhizobium japonicum ПКК смешивали с 1 мл 15% водного раствора сополимера поливинилпирролидон/винилацетат 60:40 (молекулярная масса 700000) и 1 мл стерильного физиологического раствора.2nd control inoculant (Prototype) was obtained in this way; 1 ml of Bradyrhizobium japonicum PAC culture was mixed with 1 ml of a 15% aqueous solution of polyvinylpyrrolidone/vinyl acetate 60:40 copolymer (molecular weight 700,000) and 1 ml of sterile saline.
Обработанные указанными инокулянтами и биоинкрустратором группы семян сои (Glycine max L., сорт Алена, 1 репр.) в количестве по 50 г выкладывали на плоский лоток и сушили в сушильном шкафу при температуре 41°С в течение 160 мин и периодическом перемешивании до влажности 14%.Groups of soybean seeds (Glycine max L., cultivar Alena, 1 repr.) treated with the indicated inoculants and a bioincrustator in an amount of 50 g were laid out on a flat tray and dried in an oven at a temperature of 41°C for 160 min with occasional stirring to a moisture content of 14 %.
Высушенные семена сои хранили в вентилируемых лотках при 22°С в темноте на протяжении 1 мес.В процессе хранения периодически из каждой группы отбирали навески семян сои массой 5 г и определяли численность жизнеспособных бактерий на их поверхности следующим образом. Семена сои в количестве 10 шт. суспендировали в 10 мл физиологического раствора периодически встряхивая на шейкере в течение 10 мин.Dried soybean seeds were stored in ventilated trays at 22°C in the dark for 1 month. During storage, 5 g of soybean seeds were periodically selected from each group and the number of viable bacteria on their surface was determined as follows. Soybean seeds in the amount of 10 pcs. suspended in 10 ml of physiological saline, periodically shaking on a shaker for 10 minutes.
Суспензию, полученную методом серийных разведений (Теппер В.З, Шилъникова В.К. Переверзева Г.И. Практикум по микробиологии: учеб. пособие для ВУЗ, М.: Дрофа, 2004, 256 с.), высевали на поверхность маннитио-дрожжевого агара (маннит - 10,0 г, дрожжевой экстракт - 2,0 г, калий фосфорнокислый двузамещенный -0,5; магний сернокислый - 0,2; натрий хлористый - 0,1, агар-агар - 18,0 г, вода - 1000 г). Подсчет выросших колоний после инкубирования ори температуре 28°С проведали на 5-е сутки, Результаты представлены в Таблице 1.The suspension obtained by the method of serial dilutions (Tepper V.Z., Shilnikova V.K. Pereverzeva G.I. Workshop on microbiology: textbook for high school, M.: Drofa, 2004, 256 p.), was sown on the surface of the mannitio-yeast agar (mannitol - 10.0 g, yeast extract - 2.0 g, dibasic potassium phosphate - 0.5; magnesium sulfate - 0.2; sodium chloride - 0.1; agar-agar - 18.0 g; water - 1000 g). The calculation of the grown colonies after incubation at 28°C was carried out on the 5th day, the results are presented in Table 1.
Из данных, приведенных в Таблице 1 видно, что инокулянт в виде композиция биоинкрустратора, полученного заявленным способом (поливиниловый спирт + биостабилизатор) значительно лучше способствует сохранению численности жизнеспособных клеток Bradyrhizobium japonicum ПКК на семенах сои в течение 1 мес.From the data given in Table 1, it can be seen that the inoculant in the form of a bioencrustator composition obtained by the claimed method (polyvinyl alcohol + biostabilizer) contributes much better to maintaining the number of viable Bradyrhizobium japonicum PCC cells on soybean seeds for 1 month.
Опыт 2.Experience 2.
Для определения влияния различных добавок на продолжительность сохранения титра жизнеспособных штаммов клубеньковых микроорганизмов в течение длительного срока хранения был проведен опыт на биоинкрустированных заявленным способом семенах сои с различными стабилизирующими добавками по определению титра Bradyrhizobium japonicum ПКК на семенах сои при их хранении на протяжении 12 месяцев.To determine the effect of various additives on the duration of preservation of the titer of viable strains of nodule microorganisms for a long period of storage, an experiment was conducted on soybean seeds bioencrusted by the claimed method with various stabilizing additives to determine the titer of Bradyrhizobium japonicum PKC on soybean seeds during their storage for 12 months.
При этом:Wherein:
В качестве агрономически полезного микроорганизма был взят штамм клубеньковых бактерий Bradyrhizobium japonicum ПКК, а в качестве штамма-продуцента ЭПС - штамм Paenibacillm mucilaginosus 17-2, которые выращивали как описано в примере 1.A strain of nodule bacteria Bradyrhizobium japonicum PKK was taken as an agronomically useful microorganism, and Paenibacillm mucilaginosus 17-2 strain was taken as an EPS-producing strain, which were grown as described in example 1.
Для повышения стабильности бактерий Bradyrhizobium japonicum ПКК, в жидкую культуру вносили стерильный раствор трегалозы в концентрации 15%, выдерживали 3 ч при температуре 20°С, затем охлаждали при 4°С в течение 4 ч.To improve the stability of Bradyrhizobium japonicum PKC bacteria, a sterile solution of trehalose at a concentration of 15% was introduced into the liquid culture, kept for 3 h at a temperature of 20°C, then cooled at 4°C for 4 h.
Биостабилизатор готовили в базовом варианте - как описано в примере 1, в других вариантах - с внесением как по отдельности, так и в сочетаниях следующих дополнительных стабилизирующих, компонентов: водный 20% раствор панкреатического гидролизата казеина - 2,0%, водные 20% растворы арабинозы и маннита - по 2,0%.The biostabilizer was prepared in the basic version - as described in example 1, in other versions - with the addition of the following additional stabilizing components, both individually and in combinations: aqueous 20% solution of pancreatic casein hydrolyzate - 2.0%, aqueous 20% solutions of arabinose and mannitol - 2.0% each.
Для обозначения вариантов опыта использованы следующие обозначения: «ПВС» - поливиниловый спирт;The following designations were used to designate the variants of the experiment: "PVA" - polyvinyl alcohol;
«ПВС+БС» -поливиниловый спирт + биостабилизатор, - т.е. Биоинкрустатор (с ТРЕ-трегалозой), полученный как описано в примере 1; ГК- гидролизат казеина; МАН- маннит; АР-арабиноза,"PVA + BS" - polyvinyl alcohol + biostabilizer, - i.e. Bioencrustator (with TPE-trehalose), obtained as described in example 1; HA - casein hydrolyzate; MAN- mannitol; AR-arabinose,
Для получения вариантов биоинкрустатора стабилизированную с трегалозой культуру клубеньковых бактерий Bradyrhizobium japonicum ПКК смешивали с указанными в таблице вариантами биополимерного стабилизатора и раствором 10% поливинилового спирта в соотношении 1:1:1, выдерживали 1 ч при 22°С,To obtain variants of the bioincruster, a culture of nodule bacteria Bradyrhizobium japonicum PKK stabilized with trehalose was mixed with the variants of the biopolymer stabilizer indicated in the table and a solution of 10% polyvinyl alcohol in a ratio of 1:1:1, kept for 1 h at 22°C,
Навески семян сои массой по 100 г вносили в стерильные полиэтиленовые пакеты, туда же добавляли по 3 мл вариантов готового биоинкрустатора. Пакеты встряхивали несколько минут, добиваясь равномерного покрытия семян биологическим инкрустатором.Samples of soybean seeds weighing 100 g each were placed in sterile polyethylene bags, and 3 ml of variants of the finished bioencrust were added there. The packages were shaken for several minutes, achieving uniform coverage of the seeds with a biological encruster.
Далее в каждый в пакет вносили по 3 г аморфного диоксида кремния. Пакеты встряхивали несколько минут, добиваясь равномерного покрытия семян антислеживающим агентом для создания плотной видимой оболочки.Next, 3 g of amorphous silicon dioxide was added to each bag. The bags were shaken for several minutes to evenly coat the seeds with the anti-caking agent to create a dense, visible shell.
Обработанные по разным вариантам семена сои выкладывали на плоский лоток и сушили в сушильном шкафу при температуре 42°С в течение 140 мин и периодическом перемешивании до влажности 12%.The soybean seeds treated in different ways were laid out on a flat tray and dried in an oven at a temperature of 42°C for 140 min with occasional stirring to a moisture content of 12%.
Высушенные семена, обработанные по разным вариантам, хранили в вентилируемых лотках при 20°С в темноте на протяжении 12 мес.Dried seeds treated according to different variants were stored in ventilated trays at 20°C in the dark for 12 months.
В процессе хранения проводили отбор навесок семян по всем вариантам обработки массой по 5 г с интервалом 1 мес.Численность жизнеспособных бактерий на поверхности семян определяли следующим образом. Семена в каждом варианте обработки в количестве 10 шт суспендировали в 10 мл физиологического раствора периодически встряхивая на шейкере в течение 10 мин.During storage, seed samples were selected for all treatment options, weighing 5 g with an interval of 1 month. The number of viable bacteria on the surface of the seeds was determined as follows. Seeds in each treatment option in the amount of 10 pcs were suspended in 10 ml of physiological solution, periodically shaking on a shaker for 10 minutes.
Суспензии, полученные во всех вариантах опыта, методом серийных разведений (Теппер В.З, Шильникова В.К., Переверзева Г.И. Практикум по микробиологии: учеб. пособие для ВУЗ, М.: Дрофа, 2004, 256 с. ), высевали на поверхность маннитно-дрожжевого агара (маниит - 10,0 г, дрожжевой экстракт - 2,0 г, калий фосфорнокислый двузамещенный - 0,5; магний сернокислый - 0,2; натрий хлористый - 0,1, агар-агар - 18,0 г, вода - 1000 г).Suspensions obtained in all variants of the experiment, by the method of serial dilutions (Tepper V.Z., Shilnikova V.K., Pereverzeva G.I. Workshop on microbiology: textbook for high school, M .: Bustard, 2004, 256 p.), were sown on the surface of mannitol-yeast agar (maniite - 10.0 g, yeast extract - 2.0 g, dibasic potassium phosphate - 0.5; magnesium sulfate - 0.2; sodium chloride - 0.1, agar-agar - 18 .0 g, water - 1000 g).
Подсчет выросших колоний после инкубирования при температуре 28°С проводили на 5-е сутки. Результаты представлены в Таблице 2.The count of grown colonies after incubation at a temperature of 28°C was performed on the 5th day. The results are presented in Table 2.
Таким образом, из данных Таблицы 2, можно сделать вывод, что наиболее эффективная композиция, обеспечивающая сохранность тира клубеньковых бактерий не менее 104 КОЕ/семя на протяжении 12 мес, включает сочетание ПВС, биостабилизатора на основе стабилизированной трегалозой культуры бактерий Bradyrhizobium japonicum ПКК, ЭПС Paenibacillus mucilaginosus 17-2 и добавок гидролизата казеина, маннита и арабинозы, то есть биоинкрустатора, полученного, заявленным способом с тремя добавками.Thus, from the data of Table 2, we can conclude that the most effective composition that ensures the preservation of the tyre of nodule bacteria of at least 104 CFU/seed for 12 months includes a combination of PVA, a biostabilizer based on a trehalose-stabilized bacterial culture of Bradyrhizobium japonicum PKK, EPS Paenibacillus mucilaginosus 17-2 and additives of casein hydrolyzate, mannitol and arabinose, i.e. bioencrust, obtained by the claimed method with three additives.
Опыт 3Experience 3
Исследовали стабильность штамма бактерий Mesorhizobium ciceri ST282 на поверхности семян нута (Cicer arietinum L.) в течение 12 мес хранения.The stability of the bacterial strain Mesorhizobium ciceri ST282 on the surface of chickpea seeds (Cicer arietinum L.) during 12 months of storage was studied.
Штамм бактерий Mesorhizobium ciceri ST282 выращивали на среде, описанной в Примере 2.The bacterial strain Mesorhizobium ciceri ST282 was grown on the medium described in Example 2.
Для повышения стабильности в жидкую культуру бактерий Mesorhizobium ciceri ST282, внесли стерильный раствор трегалозы в концентрации 20% и выдерживали 3 ч при температуре 23°С, затем охлаждали 5 ч при 4°С.To increase stability, a sterile solution of trehalose at a concentration of 20% was added to the liquid culture of Mesorhizobium ciceri ST282 bacteria and kept for 3 hours at a temperature of 23°C, then cooled for 5 hours at 4°C.
Штамм-продуцент внеклеточных полисахаридов - Paenibacillus mucilaginosus 17-2 выращивали и культивировали как описано в примере 2.The strain-producer of extracellular polysaccharides - Paenibacillus mucilaginosus 17-2 was grown and cultivated as described in example 2.
Биостабилизатор готовили в базовом варианте - как описано в примере 2, в других вариантах - с внесением дополнительно стабилизирующих компонентов: водного 20% раствора панкреатического гидролизата казеина - 3,0%, водных 20% растворов арабинозы и маннита - по 3,0%.The biostabilizer was prepared in the basic version - as described in example 2, in other versions - with the addition of additional stabilizing components: an aqueous 20% solution of pancreatic casein hydrolyzate - 3.0%, aqueous 20% solutions of arabinose and mannitol - 3.0% each.
Для получения готового биоинкрустатора стабилизированную трегалозой культуру бактерий Mesorhizobium ciceri ST282 смешивали с вариантами биополимерного стабилизатора и 10% водным раствором поливинилового спирта в соотношении 1:1:1 и выдерживали 1 ч при температуре 21°С.To obtain a finished bioincrustator, a culture of bacteria Mesorhizobium ciceri ST282 stabilized with trehalose was mixed with variants of a biopolymer stabilizer and a 10% aqueous solution of polyvinyl alcohol in a ratio of 1:1:1 and kept for 1 h at a temperature of 21°C.
Затем в жидкий биоинкрустатор добавили микроэлементы в хелатной и солевой форме: хелат цинка Zn(ЭДТА) - 0,028% и аммоний молибденово-кислый (NH4)2MoO4 - 0,16%, смесь тщательно перемешали.Then, microelements in chelate and salt form were added to the liquid bioincruster: zinc chelate Zn (EDTA) - 0.028% and ammonium molybdic acid (NH 4 ) 2 MoO 4 - 0.16%, the mixture was thoroughly mixed.
Навески семян нута (сорт Краснокутский, 1 репр.) массой по 100 г вносили в стерильные полиэтиленовые пакеты по вариантам, туда же добавляли по 2 мл готового биологического инкрустатора. Пакеты встряхивали несколько минут, добиваясь равномерного покрытия семян биоинкрустатором.Samples of chickpea seeds (variety Krasnokutsky, 1 repr.) weighing 100 g were added to sterile plastic bags according to the options, 2 ml of the finished biological incrust was added there. The bags were shaken for several minutes, achieving a uniform coating of the seeds with the bioincruster.
Далее в каждый пакет вносили по 4 г антислеживающего агента - аморфного диоксида кремния. Пакеты встряхивали до образования на семенах плотной видимой оболочки.Next, 4 g of an anti-caking agent, amorphous silicon dioxide, was added to each package. The bags were shaken until a dense visible shell formed on the seeds.
Варианты опыта: Контроль 1 - ПВС (поливиниовый спирт); Контроль 2 - (ПВС+БС) - (поливиниловый спирт + биостабилизатор) = Биоинкрустатор, как описано в примере 2.Experience options: Control 1 - PVA (polyvinyl alcohol); Control 2 - (PVA + BS) - (polyvinyl alcohol + biostabilizer) = Bioencrustator as described in example 2.
Обработанные семена по всем вариантам опыта выкладывали на плоский лоток и сушили в сушильном шкафу при температуре 40°С в течение 180 мин и периодическом перемешивании до влажности 13%. Высушенные семена хранили в вентилируемых лотках при 20°С в темноте на протяжении 12 мес.The treated seeds for all variants of the experiment were laid out on a flat tray and dried in an oven at a temperature of 40°C for 180 min with occasional stirring to a moisture content of 13%. Dried seeds were stored in ventilated trays at 20°C in the dark for 12 months.
В процессе хранения проводили отбор навесок семян нута массой по 5 г с интервалом в 1 мес.During storage, samples of chickpea seeds weighing 5 g were selected with an interval of 1 month.
Численность жизнеспособных бактерий на поверхности семян определяли следующим образом. Семена в количестве 10 шт суспендировали в 10 мл физиологического раствора периодически встряхивая на шейкере в течение 10 мин. Полученную суспензию методом серийных разведений (Теппер В.З, Шильникова В.К. Переверзева Г.И. Практикум по микробиологии: учеб. пособие для ВУЗ, М.: Дрофа, 2004, 256 с.), высевали на поверхность маннитно-дрожжевого агара (маннит - 10,0 г, дрожжевой экстракт - 2,0 г, калий фосфорнокислый двузамещенный - 0,5; магний сернокислый - 0,2; натрий хлористый - 0,1, агар-агар - 18,0 г, вода - 1000 г).The number of viable bacteria on the surface of the seeds was determined as follows. Seeds in the amount of 10 pieces were suspended in 10 ml of physiological solution, periodically shaking on a shaker for 10 minutes. The resulting suspension by the method of serial dilutions (Tepper V.Z., Shilnikova V.K. Pereverzeva G.I. Workshop on microbiology: textbook for high school, M.: Drofa, 2004, 256 pp.) was sown on the surface of mannitol-yeast agar (mannitol - 10.0 g, yeast extract - 2.0 g, dibasic potassium phosphate - 0.5; magnesium sulfate - 0.2; sodium chloride - 0.1, agar-agar - 18.0 g, water - 1000 G).
Подсчет выросших колоний после инкубирования при 28°С проводили на 5 сутки. Результаты опыта приведены в Таблице 3.The calculation of grown colonies after incubation at 28°C was performed on the 5th day. The results of the experiment are shown in Table 3.
Из данных в Таблице 3 следует, что наиболее эффективная композиция инокулята, обеспечивающая сохранность титра Mesorhizobium ciceri ST282 на семенах нута не менее 104 КОЕ/семя в течение 12 мес, включает ПВС, стабилизированную треголазой культуру бактерий, биостабилизатор на основе ЭПС Paenibacillus mucilaginosus 17-2 (т.е. биоинкрустатор, полученный заявленным способом) с тремя стабилизирующими добавками: ГК, МАЛ, АР.It follows from the data in Table 3 that the most effective inoculum composition, which ensures the preservation of the Mesorhizobium ciceri ST282 titer on chickpea seeds of at least 104 CFU/seed for 12 months, includes PVA, a tregolase-stabilized bacterial culture, and a biostabilizer based on EPS Paenibacillus mucilaginosus 17- 2 (ie bioencrustator obtained by the claimed method) with three stabilizing additives: GK, MAL, AR.
Опыт 4.Experience 4.
Исследовали совместное нанесение нескольких штаммов агрономически ценных бактерий и микроэлементов на поверхность семян сои и их жизнеспособность на различных сроках хранения.We studied the joint application of several strains of agronomically valuable bacteria and microelements on the surface of soybean seeds and their viability at different storage periods.
Штамм бактерий Bradyrhizobium japonicum ПКК выращивали и стабилизировали, как описано в примере 1.The bacterial strain Bradyrhizobium japonicum PKC was grown and stabilized as described in Example 1.
Для повышения стабильности Bradyrhizobium japonicum ПКК, в жидкую культуру вносили стерильный раствор трегалозы в концентрации 20% и выдерживали 3 ч при температуре 20°С, затем охлаждали при 4°С в течение 2 ч.To improve the stability of Bradyrhizobium japonicum PCC, a sterile solution of trehalose at a concentration of 20% was introduced into the liquid culture and kept for 3 h at a temperature of 20°C, then cooled at 4°C for 2 h.
Штамм-продуцент ЭПС - Paenibacillus mucilaginosus 17-2 выращивали, как описано в примере 1.EPS producing strain Paenibacillus mucilaginosus 17-2 was grown as described in example 1.
Полученную КЖ с живыми клетками Paenibacillus mucilaginosus 17-2 и наработанными бактериальными полисахаридами стерилизовали путем авто-клавирования, как описано в примере 1.The resulting CL with living cells of Paenibacillus mucilaginosus 17-2 and the accumulated bacterial polysaccharides was sterilized by autoclaving, as described in example 1.
Биостабилизатор готовили как описано в примере 1 с дополнительным внесением стабилизирующих компонентов: водный 20% раствор панкреатического гидролизата казеина в концентрации 2,0%; водные 20% растворы арабинозы и маннита в концентрации по 2,0%.The biostabilizer was prepared as described in example 1 with the additional addition of stabilizing components: an aqueous 20% solution of pancreatic casein hydrolyzate at a concentration of 2.0%; aqueous 20% solutions of arabinose and mannitol at a concentration of 2.0% each.
Ростостимулирующий и фунгицидный штамм бактерий Bacillus subtilis АМ7 выращивали на жидкой среде следующего состава:Growth-stimulating and fungicidal bacterial strain Bacillus subtilis AM7 was grown on a liquid medium of the following composition:
изолят соевого белка - 3,0 г/л;soy protein isolate - 3.0 g/l;
мука из картофельных хлопьев - 7,0 г/л;flour from potato flakes - 7.0 g/l;
калий сернокислый двузамещенный - 1,0 г/л;potassium sulfate disubstituted - 1.0 g/l;
магний сернокислый - 0,5 г/л;magnesium sulfate - 0.5 g / l;
кальций хлористый - 0,2 г/л;calcium chloride - 0.2 g / l;
натрий хлористый - 0,2 г/л;sodium chloride - 0.2 g / l;
марганец сернокислый - 0,02 г/л и культивировали в течение 85 ч при 32°С до получения титра спор не менее 109 КОЕ/мл.manganese sulfate - 0.02 g/l and cultivated for 85 hours at 32°C until a spore titer of at least 109 CFU/ml was obtained.
Для получения готового биоинкрустатора в базовом варианте культуру клубеньковых бактерий Bradyrhizobium japonicum ПКК смешивали с биополимерным стабилизатором и 10% раствором поливинилового спирта в соотношении 1:1:1, и выдерживали 1 ч при температуре 22°С.To obtain a ready-made bioincrustator in the basic variant, the culture of nodule bacteria Bradyrhizobium japonicum PAC was mixed with a biopolymer stabilizer and a 10% solution of polyvinyl alcohol in a ratio of 1:1:1, and kept for 1 h at a temperature of 22°C.
В другом варианте опыта после смешивания стабилизированных трегалозой бактерий Bradyrhizobium japonicum ПКК с биополимерным стабилизатором и раствором поливинилового спирта, в полученную смесь вносили 0,1% жидкой культуры Bacillus subtilis АМ7 и выдерживали 1 ч при 22°С.In another experiment, after mixing trehalose-stabilized bacteria Bradyrhizobium japonicum PCC with a biopolymer stabilizer and a solution of polyvinyl alcohol, 0.1% of a liquid culture of Bacillus subtilis AM7 was added to the resulting mixture and kept for 1 h at 22°C.
Навески семян сои массой по 100 г вносили в стерильные полиэтиленовые пакеты, туда же добавляли по 3 мл вариантов готового биоинкрустатора. Пакеты тщательно встряхивали несколько минут, добиваясь равномерного покрытия семян биологическим инкрустатором.Samples of soybean seeds weighing 100 g each were placed in sterile polyethylene bags, and 3 ml of variants of the finished bioencrust were added there. The bags were thoroughly shaken for several minutes, achieving uniform coverage of the seeds with a biological encruster.
Далее в каждый в пакет вносили по 3 г аморфного диоксида кремния. Пакеты тщательно встряхивали несколько минут, добиваясь равномерного покрытия семян антислеживающим агентом для создания плотной оболочки.Next, 3 g of amorphous silicon dioxide was added to each bag. The bags were thoroughly shaken for several minutes, achieving a uniform coating of the seeds with an anti-caking agent to create a dense shell.
Обработанные по разным вариантам семена сои выкладывали на плоский лоток и сушили в сушильном шкафу при температуре 42°С в течение 140 мин и периодическом перемешивании до влажности 12%.The soybean seeds treated in different ways were laid out on a flat tray and dried in an oven at a temperature of 42°C for 140 min with occasional stirring to a moisture content of 12%.
Высушенные семена, обработанные по разным вариантам, хранили в вентилируемых лотках при 20°С в темноте на протяжении 12 мес. В процессе хранения проводили отбор навесок семян массой по 5 г с интервалом в 1 мес.Dried seeds treated according to different variants were stored in ventilated trays at 20°C in the dark for 12 months. During storage, samples of seeds weighing 5 g were selected with an interval of 1 month.
Численность жизнеспособных бактерий на семенах определяли следующим образом. Семена в количестве 10 шт суспендировали в 10 мл физиологического раствора периодически встряхивая на шейкере в течение 10 мин. Полученную суспензию методом серийных разведений (Теппер В.З, Шильникова В.К. Переверзева Г.И. Практикум по микробиологии: учеб. пособие для ВУЗ, М.: Дрофа, 2004, 256 с), высевали на поверхность маннитно-дрожжевого агара (маннит - 10 г, дрожжевой экстракт - 2 г, калий фосфорнокислый двузамещенный - 0,5; магний сернокислый - 0,2; натрий хлористый - 0,1, агар-агар - 18 г, вода -1000 г). Подсчет колоний после инкубирования - при 28°С на 5 сутки.The number of viable bacteria on the seeds was determined as follows. Seeds in the amount of 10 pieces were suspended in 10 ml of physiological solution, periodically shaking on a shaker for 10 minutes. The resulting suspension by the method of serial dilutions (Tepper V.Z., Shilnikova V.K. Pereverzeva G.I. Workshop on microbiology: textbook for high school, M.: Drofa, 2004, 256 s) was sown on the surface of mannitol-yeast agar ( mannitol - 10 g, yeast extract - 2 g, dibasic potassium phosphate - 0.5; magnesium sulfate - 0.2; sodium chloride - 0.1; agar-agar - 18 g; water - 1000 g). Colony count after incubation - at 28°C for 5 days.
В качестве контроля приведены результаты Опыта 2 с использованием одной клубеньковой бактерией Bradyrhizobium japonicum ПКК и биоинкрустатором аналогичного состава. Результаты опыта приведены в Таблице 4.As a control, the results of Experiment 2 are given using one nodule bacterium Bradyrhizobium japonicum PKK and a bioencruster of the same composition. The results of the experiment are shown in Table 4.
Как видно из данных Таблицы 4, титр бактерий Bacillus subtilis АМ7 падает незначительно на протяжении 12 месяцев хранения с 9⋅105 до 7⋅105 КОЕ/семя при применении биологического стабилизатора. В то же время титр бактерий Bradyrhizobium japonicum ПКК падает гораздо значительнее до 104 КОЕ/семя. Однако данная концентрация жизнеспособных клеток (КОЕ/мл) достаточна для формирования эффективного симбиоза клеток бактерий на семенах.As can be seen from the data of Table 4, the titer of Bacillus subtilis AM7 bacteria falls slightly during 12 months of storage from 9⋅10 5 to 7⋅10 5 CFU/seed when using a biological stabilizer. At the same time, the titer of Bradyrhizobium japonicum PAC bacteria drops much more significantly to 104 CFU/seed. However, this concentration of viable cells (CFU/ml) is sufficient for the formation of an effective symbiosis of bacterial cells on seeds.
Опыт 5.Experience 5.
Был проведен полевой мелкоделяночный опыт, в котором исследовали влияние вариантов обработки семян сои на количество образуемых клубеньков и морфометрические показатели растений.A field small-plot experiment was conducted, in which the effect of soybean seed treatment options on the number of nodules formed and morphometric parameters of plants was investigated.
Обработанные и необработанные семена сои (сорт Алена, 1 репр.) после 9 месяцев хранения высевали в полевых условиях в делянки 1,5×10 м с расчетной нормой высева 120 кг/га. При этом исследовали следующие варианты: вариант 1 - контроль - без обработки семян; вариант 2 - обработка семян непосредственно перед посевом жидким биопрепаратом на основе штамма бактерий Bradyrhizobium japonicum ПКК с расчетным титром 105 КОЕ на семя; вариант 3 - семена, биоинкрустированные заявленным способом со стабилизирующими добавками в виде растворов панкреатического гидролизата казеина, арабинозы и маннита, как описано в опыте 2; вариант 4 - семена, биоинкрустированные заявленным способом двумя бак териями совместно Bradyrhizobium japonicum ПКК и Bacillus subtilis АМ7 с использованием стабилизирующих добавок, как описано в опыте 4. Из семян сои, обработанных по указанным вариантам, выращивали растения сои до достижения фазы начала цветения.Treated and untreated soybean seeds (variety Alena, 1 repr.) after 9 months of storage were sown in the field in plots of 1.5 × 10 m with an estimated seeding rate of 120 kg/ha. At the same time, the following options were investigated: option 1 - control - without seed treatment; option 2 - treatment of seeds immediately before sowing with a liquid biological product based on the strain of bacteria Bradyrhizobium japonicum PCC with a calculated titer of 10 5 CFU per seed; option 3 - seeds, bioencrusted by the claimed method with stabilizing additives in the form of solutions of pancreatic hydrolyzate of casein, arabinose and mannitol, as described in experiment 2; option 4 - seeds bioencrusted by the claimed method with two bacteria jointly Bradyrhizobium japonicum PKK and Bacillus subtilis AM7 using stabilizing additives, as described in experiment 4. From soybean seeds treated according to the indicated options, soybean plants were grown until the flowering phase was reached.
Повторность опыта - трехкратная. С каждой повторности отбиралось по 30 растений. Учет опыта велся по следующим показателям: среднее количество клубеньков на 1 растение (СКК), средняя высота растения (СВР), среднее число продуктивных узлов (СЧПУ), среднее число цветков (СЧЦ). Результаты опыта приведены в Таблице 5.The repetition of experience - three times. From each repetition, 30 plants were selected. Accounting for the experience was carried out according to the following indicators: the average number of nodules per 1 plant (AMC), the average plant height (AVR), the average number of productive nodes (ANC), the average number of flowers (ANC). The results of the experiment are shown in Table 5.
Из анализа приведенных в Таблице 5 данных видно, что после 9 месяцев хранения из посеянных семян сои с биологической инкрустацией на основе штамма бактерий Bradyrhizobium japonicum ПКК в разных вариантах, а также семян, обработанных перед посевом жидким биопрепаратом на основе штамма такой же бактерии непосредственно перед посевом, вырастают растения сои с практически одинаковым количеством клубеньков и с очень близкими морфометрическими показателями.From the analysis of the data in Table 5, it can be seen that after 9 months of storage from sowed soybean seeds with biological encrustation based on the bacterial strain Bradyrhizobium japonicum PKK in different variants, as well as seeds treated before sowing with a liquid biological preparation based on a strain of the same bacterium immediately before sowing , soybean plants grow with almost the same number of nodules and with very similar morphometric parameters.
В то же время дополнительное внесение в биоинкрустатор ростостимулирующего и фунгицидного штамма Bacillus subtilis АМ7 положительно сказывается на морфометрических показателях растений сои: увеличении средней высоты растений, увеличения числа продуктивных узлов и среднего числа цветков.At the same time, the additional introduction of a growth-stimulating and fungicidal strain of Bacillus subtilis AM7 into the bioincruster has a positive effect on the morphometric parameters of soybean plants: an increase in the average plant height, an increase in the number of productive nodes and an average number of flowers.
Таким образом, в результате проведенных опытов показано, что биоинкрустирование семян бобовых культур заявленным способом обеспечивает в нанесенной на семена оболочке сохранность в течение не менее 9 месяцев хранения полезных бактерий в титрах ≥104 КОЕ/семя, достаточных для эффективной их инокуляции при посеве.Thus, as a result of the experiments, it was shown that the bioencrustation of legume seeds by the claimed method ensures, in the shell applied to the seeds, the preservation of beneficial bacteria for at least 9 months in titers ≥10 4 CFU/seed, sufficient for their effective inoculation during sowing.
При этом заявленное изобретение позволяет получать готовые биологически инкрустированные семена, несущие как штаммы клубеньковых бактерий, так и дополнительные штаммы ростостимулирующих и/или фитопротекторных бактерий, а также необходимые микроэлементы, что является эффективным средством повышения продуктивности бобовых культур.At the same time, the claimed invention makes it possible to obtain ready-made biologically encrusted seeds that carry both strains of nodule bacteria and additional strains of growth-stimulating and/or phytoprotective bacteria, as well as the necessary microelements, which is an effective means of increasing the productivity of legumes.
Кроме того, настоящее изобретение позволяет исключить у конечного потребителя необходимость применения жидких инокулянтов и других биопрепаратов при посеве семян, используя уже готовые к севу биологически инкрустированные семена даже после их хранения в течение 9 мес.In addition, the present invention eliminates the need for the end user to use liquid inoculants and other biological products when sowing seeds, using biologically encrusted seeds that are ready for sowing even after they have been stored for 9 months.
Claims (16)
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2784970C1 true RU2784970C1 (en) | 2022-12-01 |
Family
ID=
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2806593C1 (en) * | 2023-07-05 | 2023-11-01 | Федеральное Государственное Бюджетно Научное Учреждение "Всероссийский Научно-Исследовательский Институт Сельскохозяйственной Микробиологии" | Method of cultivation of bradyrhizobium japonicum rz300 soybean nodulate bacteria |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB2080669B (en) * | 1980-07-28 | 1985-01-03 | Coated Seed | The use of microorganisms in conjunction with seeds |
| US5106648A (en) * | 1989-01-06 | 1992-04-21 | Agricultural Genetics Company Limited | Method of preparing coated seeds |
| US5113619A (en) * | 1989-01-30 | 1992-05-19 | Leps Walter T | Method of adhering bacteria to seed and composition therefor |
| RU2113794C1 (en) * | 1991-05-23 | 1998-06-27 | Корея Рисерч Инститьют Оф Кемикал Текнолоджи | Method of preparing microbe pesticide with bipolar cover, microbe pesticide with biopolymeric cover, method of preparing microbe pesticide of buoyant type |
| US7604807B2 (en) * | 2000-12-01 | 2009-10-20 | Auburn University | Use of pullulan to isolate and preserve biological material |
| RU2705286C2 (en) * | 2011-07-25 | 2019-11-06 | Монсанто Текнолоджи, Ллс | Mycosphaerella sp. strain, compositions and methods for fusariosis control |
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB2080669B (en) * | 1980-07-28 | 1985-01-03 | Coated Seed | The use of microorganisms in conjunction with seeds |
| US5106648A (en) * | 1989-01-06 | 1992-04-21 | Agricultural Genetics Company Limited | Method of preparing coated seeds |
| US5113619A (en) * | 1989-01-30 | 1992-05-19 | Leps Walter T | Method of adhering bacteria to seed and composition therefor |
| RU2113794C1 (en) * | 1991-05-23 | 1998-06-27 | Корея Рисерч Инститьют Оф Кемикал Текнолоджи | Method of preparing microbe pesticide with bipolar cover, microbe pesticide with biopolymeric cover, method of preparing microbe pesticide of buoyant type |
| US7604807B2 (en) * | 2000-12-01 | 2009-10-20 | Auburn University | Use of pullulan to isolate and preserve biological material |
| RU2705286C2 (en) * | 2011-07-25 | 2019-11-06 | Монсанто Текнолоджи, Ллс | Mycosphaerella sp. strain, compositions and methods for fusariosis control |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2806593C1 (en) * | 2023-07-05 | 2023-11-01 | Федеральное Государственное Бюджетно Научное Учреждение "Всероссийский Научно-Исследовательский Институт Сельскохозяйственной Микробиологии" | Method of cultivation of bradyrhizobium japonicum rz300 soybean nodulate bacteria |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Bashan et al. | Advances in plant growth-promoting bacterial inoculant technology: formulations and practical perspectives (1998–2013) | |
| US5697186A (en) | Flocculated microbial inoculants for delivery of agriculturally beneficial microorganisms | |
| AU2002227228B2 (en) | Bacterial inoculants for enhancing plant growth | |
| Bashan et al. | Superior polymeric formulations and emerging innovative products of bacterial inoculants for sustainable agriculture and the environment | |
| US5695541A (en) | Process for preparation of bacterial agricultural products | |
| AU2007355202B2 (en) | Stable organic-carrier-based microbial inoculants and method for producing the same | |
| US20070212772A1 (en) | Rhizobium leguminosarum strain and use thereof as plant inoculant | |
| CN103435395A (en) | Drip-irrigation type salt stress-alleviating and disease-preventing biological bacterial fertilizer and preparation method thereof | |
| US6606822B2 (en) | Aqueous base inoculant composition for seeds, coated seeds and method for storing the composition | |
| CN106577772A (en) | Novel biological seed coating and application thereof | |
| RU2784970C1 (en) | Method for biological incrustation of legume seeds | |
| CN107365225A (en) | A kind of preparation method of EM bacterial types high activity detritus acid organic fertilizer | |
| JP3132195B2 (en) | New microorganism and plant disease control agent | |
| CN108887145A (en) | A kind of microorganism seedling medium and the preparation method and application thereof | |
| CN111517863B (en) | Bio-organic fertilizer containing bacillus methylotrophicus and preparation method thereof | |
| CN113957011A (en) | Agricultural liquid microbial agent and production method thereof | |
| Rani et al. | Present scenario of plant growth promoting microbes and technologies used for biofertilizer development | |
| JPH09124427A (en) | Control agent for rice plant damping-off using new microorganismic strain and method for controlling the same | |
| CN112574903A (en) | Complex microbial inoculant and application thereof | |
| Hussein et al. | Effects of several effective microorganisms (EM) on the growth of Chinese cabbage (Brassica rapa) | |
| CN104195082B (en) | A kind of travelling germ and its microbial inoculum and preparation and application | |
| CN117431195B (en) | Saline-alkali resistant growth-promoting bacterium, growth-promoting bacterium agent and application thereof | |
| JP2972390B2 (en) | Materials for microbial inoculation | |
| WO1994019924A1 (en) | Flocculated microbial inoculants for delivery of agriculturally beneficial microorganisms | |
| RU2728471C2 (en) | Inoculant for soya seeds |