RU2782598C1 - Рекомбинантная плазмидная ДНК pSp-raPLY, кодирующая синтез рекомбинантного атоксичного белка пневмолизина Streptococcus pneumoniae, штамм Escherichia coli M15/pSp-raPLY - продуцент рекомбинантной атоксичной формы пневмолизина и получение указанного белка для разработки вакцинного препарата для профилактики пневмококковых инфекций - Google Patents
Рекомбинантная плазмидная ДНК pSp-raPLY, кодирующая синтез рекомбинантного атоксичного белка пневмолизина Streptococcus pneumoniae, штамм Escherichia coli M15/pSp-raPLY - продуцент рекомбинантной атоксичной формы пневмолизина и получение указанного белка для разработки вакцинного препарата для профилактики пневмококковых инфекций Download PDFInfo
- Publication number
- RU2782598C1 RU2782598C1 RU2021127953A RU2021127953A RU2782598C1 RU 2782598 C1 RU2782598 C1 RU 2782598C1 RU 2021127953 A RU2021127953 A RU 2021127953A RU 2021127953 A RU2021127953 A RU 2021127953A RU 2782598 C1 RU2782598 C1 RU 2782598C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- recombinant
- raply
- psp
- pneumolysin
- atoxic
- Prior art date
Links
- 108010007006 Streptococcus pneumoniae plY protein Proteins 0.000 title claims abstract description 57
- 229920003013 deoxyribonucleic acid Polymers 0.000 title claims abstract description 30
- 241001596967 Escherichia coli M15 Species 0.000 title claims abstract description 29
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 title claims description 8
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 title claims description 8
- 230000002194 synthesizing Effects 0.000 title claims description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 7
- 229960005486 vaccines Drugs 0.000 title description 28
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title description 23
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title description 23
- 241000193998 Streptococcus pneumoniae Species 0.000 title description 7
- 229940031000 Streptococcus pneumoniae Drugs 0.000 title description 7
- 201000009910 diseases by infectious agent Diseases 0.000 title description 5
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 claims abstract description 10
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 10
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N Ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 claims abstract description 8
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 claims abstract description 8
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims abstract description 7
- GUBGYTABKSRVRQ-UUNJERMWSA-N Lactose Natural products O([C@@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@H](O)O[C@@H]1CO)[C@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1 GUBGYTABKSRVRQ-UUNJERMWSA-N 0.000 claims abstract description 4
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 claims abstract description 4
- 239000008101 lactose Substances 0.000 claims abstract description 4
- 230000000977 initiatory Effects 0.000 claims abstract description 3
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 claims description 9
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 claims description 7
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 claims description 7
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 6
- 230000001580 bacterial Effects 0.000 claims description 6
- 125000003372 histidine group Chemical class [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 claims description 6
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 claims description 6
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M buffer Substances [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 5
- 206010061353 Pneumococcal infection Diseases 0.000 claims description 4
- 239000000539 dimer Substances 0.000 claims description 4
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims description 4
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims description 4
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims description 4
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 claims description 4
- 230000001131 transforming Effects 0.000 claims description 4
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 claims description 3
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 claims description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 3
- 235000014304 histidine Nutrition 0.000 claims description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 3
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 3
- 101700080605 NUC1 Proteins 0.000 claims description 2
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 claims description 2
- 101700006494 nucA Proteins 0.000 claims description 2
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 claims description 2
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 claims description 2
- 230000003000 nontoxic Effects 0.000 claims 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 claims 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N Kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 abstract description 6
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 abstract description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 4
- 241000701988 Escherichia virus T5 Species 0.000 abstract description 3
- 239000001963 growth media Substances 0.000 abstract description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 abstract 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 abstract 1
- 230000036678 protein binding Effects 0.000 abstract 1
- 108010033725 Recombinant Proteins Proteins 0.000 description 24
- 102000007312 Recombinant Proteins Human genes 0.000 description 24
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 22
- 210000004027 cells Anatomy 0.000 description 16
- 239000002609 media Substances 0.000 description 14
- 239000000047 product Substances 0.000 description 11
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 10
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 9
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 8
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 244000052616 bacterial pathogens Species 0.000 description 7
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 108091007172 antigens Proteins 0.000 description 5
- 102000038129 antigens Human genes 0.000 description 5
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 5
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 5
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl β-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 5
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 5
- 101710027788 NPEPPS Proteins 0.000 description 4
- 229960001973 Pneumococcal vaccines Drugs 0.000 description 4
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 4
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 4
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 4
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 4
- 230000000534 elicitor Effects 0.000 description 4
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 4
- 230000016379 mucosal immune response Effects 0.000 description 4
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 4
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 4
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 4
- BZKBCQXYZZXSCO-UHFFFAOYSA-N sodium hydride Inorganic materials [H-].[Na+] BZKBCQXYZZXSCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 4
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 229940079593 drugs Drugs 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 150000004676 glycans Polymers 0.000 description 3
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 3
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 3
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 3
- 150000004804 polysaccharides Polymers 0.000 description 3
- 230000002588 toxic Effects 0.000 description 3
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 3
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- 229940064005 Antibiotic throat preparations Drugs 0.000 description 2
- 229940083879 Antibiotics FOR TREATMENT OF HEMORRHOIDS AND ANAL FISSURES FOR TOPICAL USE Drugs 0.000 description 2
- 229940042052 Antibiotics for systemic use Drugs 0.000 description 2
- 229940042786 Antitubercular Antibiotics Drugs 0.000 description 2
- 101700079760 EFCB Proteins 0.000 description 2
- 101710005090 ERVFC1-1 Proteins 0.000 description 2
- 101710013371 ERVS71-1 Proteins 0.000 description 2
- 229940093922 Gynecological Antibiotics Drugs 0.000 description 2
- 239000006137 Luria-Bertani broth Substances 0.000 description 2
- 108010015078 Pregnancy-Associated alpha 2-Macroglobulins Proteins 0.000 description 2
- 102400000368 Surface protein Human genes 0.000 description 2
- 229940024982 Topical Antifungal Antibiotics Drugs 0.000 description 2
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 2
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 239000003708 ampul Substances 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 229960000070 antineoplastic Monoclonal antibodies Drugs 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal Effects 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 description 2
- 238000007374 clinical diagnostic method Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 229940079866 intestinal antibiotics Drugs 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 238000000034 method Methods 0.000 description 2
- 101700023501 mntA Proteins 0.000 description 2
- 229960000060 monoclonal antibodies Drugs 0.000 description 2
- 102000005614 monoclonal antibodies Human genes 0.000 description 2
- 108010045030 monoclonal antibodies Proteins 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 229940005935 ophthalmologic Antibiotics Drugs 0.000 description 2
- 230000003287 optical Effects 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic Effects 0.000 description 2
- 244000052769 pathogens Species 0.000 description 2
- 101700016463 pls Proteins 0.000 description 2
- 229920002704 polyhistidine Polymers 0.000 description 2
- 230000001681 protective Effects 0.000 description 2
- 101700032180 psaA Proteins 0.000 description 2
- 101700072755 pstS2 Proteins 0.000 description 2
- 108091007521 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 101710033952 sloC Proteins 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 2
- 230000017613 viral reproduction Effects 0.000 description 2
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 2
- 101700019761 ydjF Proteins 0.000 description 2
- ABDKAPXRBAPSQN-UHFFFAOYSA-N 1,2-Dimethoxybenzene Chemical compound COC1=CC=CC=C1OC ABDKAPXRBAPSQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XRZWVSXEDRYQGC-UHFFFAOYSA-N 4-cyclohexylpyrrolidin-1-ium-2-carboxylate Chemical compound C1NC(C(=O)O)CC1C1CCCCC1 XRZWVSXEDRYQGC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 102200067143 BRCA1 L22S Human genes 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000024969 Bacterial Proteins Human genes 0.000 description 1
- 210000000621 Bronchi Anatomy 0.000 description 1
- 210000003123 Bronchioles Anatomy 0.000 description 1
- 229940041514 Candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N D-Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000001974 Hyaluronidase Human genes 0.000 description 1
- 108010074224 Hyaluronoglucosaminidase Proteins 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 1
- 206010027253 Meningitis pneumococcal Diseases 0.000 description 1
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L MgCl2 Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 210000004400 Mucous Membrane Anatomy 0.000 description 1
- 210000002850 Nasal Mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 210000001989 Nasopharynx Anatomy 0.000 description 1
- 108010006232 Neuraminidase Proteins 0.000 description 1
- 102000005348 Neuraminidase Human genes 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 206010034133 Pathogen resistance Diseases 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 208000004593 Pneumococcal Meningitis Diseases 0.000 description 1
- 208000009362 Pneumococcal Pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 206010054047 Pneumococcal sepsis Diseases 0.000 description 1
- 206010035728 Pneumonia pneumococcal Diseases 0.000 description 1
- 229960000856 Protein C Drugs 0.000 description 1
- 229960005202 Streptokinase Drugs 0.000 description 1
- 108010023197 Streptokinase Proteins 0.000 description 1
- 231100000765 Toxin Toxicity 0.000 description 1
- 210000003437 Trachea Anatomy 0.000 description 1
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 1
- 102000037016 Zinc-dependent proteases Human genes 0.000 description 1
- 108091006889 Zinc-dependent proteases Proteins 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 1
- 235000021053 average weight gain Nutrition 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001413 cellular Effects 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement Effects 0.000 description 1
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 230000029578 entry into host Effects 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037240 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- 101710031453 groL2 Proteins 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 229960002773 hyaluronidase Drugs 0.000 description 1
- 238000002318 immunoblotting Methods 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory Effects 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 201000005296 lung carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000000813 microbial Effects 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic Effects 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic Effects 0.000 description 1
- 210000004877 mucosa Anatomy 0.000 description 1
- NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N nitrate group Chemical group [N+](=O)([O-])[O-] NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 231100000956 nontoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 244000039328 opportunistic pathogens Species 0.000 description 1
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 238000009520 phase I clinical trial Methods 0.000 description 1
- 238000009521 phase II clinical trial Methods 0.000 description 1
- 238000009522 phase III clinical trial Methods 0.000 description 1
- 108010040473 pneumococcal surface protein A Proteins 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000001376 precipitating Effects 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 210000004215 spores Anatomy 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic Effects 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- 238000005429 turbidity Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 235000019786 weight gain Nutrition 0.000 description 1
- 230000004584 weight gain Effects 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Images
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой рекомбинантную плазмидную ДНК pSp-raPLY, содержащую ген для экспрессии рекомбинантного атоксичного пневмолизина S. pneumoniae, экспрессия которого находится под контролем промотора фага Т5, двух лактозных оперонов, лямбда t0 региона остановки транскрипции, терминатора транскрипции rrnBT1. Плазмида pSp-raPLY содержит ген устойчивости к ампициллину, участок инициации репликации плазмиды ColE1. Данной плазмидой трансформируют клетки реципиентного штамма Escherichia coli M15. Реципиентный штамм Е. coli M15 содержит плазмиду pREP4, которая включает ген lac белка, способного связываться с lac-оперонами, и ген устойчивости к канамицину. В своем геноме штамм Е. coli M15 содержит высокоэкспрессируемый ген РНК-полимеразы бактериофага Т5. В результате получен штамм Е. coli M15/pSp-raPLY с продуктивностью не менее 5 мг рекомбинантной атоксичной формы пневмолизина S. pneumoniae на 1 л культуральной среды или 5-10 г влажной биомассы клеток штамма. 3 н.п. ф-лы, 4 ил., 1 табл., 4 пр.
Description
Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к получению рекомбинантного белка, который представляет собой рекомбинантную атоксичную форму пневмолизина Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae) для медицинских целей, а также к рекомбинантному штамму Escherichia coli (Е. coli) M15/pSp-raPLY, который нами зарегистрирован в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ-Оболенск», регистрационный номер 122 и плазмиде для его получения.
Активная иммунизация может быть одним из эффективных средств защиты против условно патогенных микроорганизмов и, в частности, S. pneumoniae. Для профилактики пневмококковой инфекции разработаны полисахаридная и конъюгированные полисахаридные вакцины: Pneumo 23, Prevenar 13, Synflorix (Feldman С., Anderson R. Review: Current and new generation pneumococcal vaccines. Journal of Infection, 2014, 69, 309-325). Эти вакцины успешно себя зарекомендовали, так как их внедрение в практику позволило снизить число пневмококковых заболеваний за счет развития серотипспецифического иммунного ответа на полисахаридные антигены (Lu J., Hou Н., Wang D. et al. Systemic and mucosal immune responses elicited by intranasal immunization with a pneumococcal bacterium-like particle-based vaccine displaying pneumolysin mutant Plym2. Immunology Letters, 2017, 187, 41-46; Wijmenga-Monsuur A.J., van Westen E., Knol M.J. et al. Direct comparison of immunogenicity induced by 10- or 13-valent pneumococcal conjugate vaccine around the 11-month booster in dutch infants. PLoS One, 2015, 10(12): e0144739).
Однако, несмотря на эффективность существующих вакцин, есть ряд нерешенных вопросов, которые остаются актуальными на сегодняшний день. В частности, явление замещения серотипов возбудителя и рост антибиотико-устойчивых штаммов пневмококка (Wijmenga-Monsuur A.J., van Westen Е., Knol M.J. et al. Direct comparison of immunogenicity induced by 10- or 13-valent pneumococcal conjugate vaccine around the 11-month booster in dutch infants. PLoS One, 2015, 10(12): e0144739). По разным причинам в настоящее время для использования в клинической практике не зарегистрировано ни одной серотипнезависимой вакцины на основе белковых антигенов пневмококка.
Streptococcus pneumoniae является одним из основных возбудителей внебольничной пневмонии (Wijmenga-Monsuur A.J., van Westen Е., Knol M.J. et al. Direct comparison of immunogenicity induced by 10- or 13-valent pneumococcal conjugate vaccine around the 11-month booster in dutch infants. PLoS One, 2015, 10(12): e0144739; Steel H.C., Cockeran R., Anderson R., Feldman C. Overview of community-acquired pneumonia and the role of inflammatory mechanisms in the immunopathogenesis of severe pneumococcal disease. Mediators of Inflammation, 2013, Volume 2013, 1-18). Широкое распространение пневмококковая инфекция получила благодаря колонизации микроба на слизистых оболочках верхних дыхательных путей человека, а также возрастающей резистентности невакцинных серотипов пневмококка к химиотерапевтическим средствам и антибиотикам (Brooks L.R.K., Mias G.I. Streptococcus pneumoniae's virulence and host immunity: aging, diagnostics, and prevention. Front. Immunol., 2018, 9: 1366; Brooks L.R.K., Mias G.I. Streptococcus pneumoniae's virulence and host immunity: aging, diagnostics, and prevention. Front. Immunol., 2018, 9: 1366; Weiser J.N., Ferreira D.M., Paton J.C.. Streptococcus pneumoniae: transmission, colonization and invasion. Nat Rev Microbiol., 2018, 16(6): 355-367. doi:10.1038/s41579-018-0001-8). В связи с тем, что белки пневмококка обладают высокой внутривидовой гомологией, они являются перспективными антигенами для разработки вакцин с серотипнезависимой активностью. Существует более 100 пневмококковых белков, однако исследователи сосредоточили свое внимание примерно на 20-30 белках. Наибольший интерес представляют такие белки S. pneumoniae как: пневмолизин, пневмококковый поверхностный белок А, пневмококковый поверхностный белок С, пневмококковый поверхностный антиген А, белки полигистидиновой триады, белки ворсинок пневмококка, белки-ферменты гиалуронидаза, нейраминидаза, стрептокиназа, цинк-зависимая протеаза, белки теплового шока пневмококка (Feldman С, Anderson R. Review: Current and new generation pneumococcal vaccines. Journal of Infection, 2014, 69, 309-325; Feldman C., Anderson R. Review: Current and new generation pneumococcal vaccines. Journal of Infection, 2014, 69, 309-325; Morais V., Texeira E., Suarez N. Next-generation whole-cell pneumococcal vaccine. Vaccines, 2019, 7, 151).
При создании современных вакцинных препаратов все большое внимание уделяется использованию генно-инженерных методов, суть которых заключается во встраивании генов, отвечающих за синтез отдельных протективных антигенов возбудителя, в геном непатогенного микроорганизма (например, Escherichia coli). Во время культивирования полученных продуцентов в большом количестве синтезируются целевые продукты (рекомбинантные белки), которые подвергаются простой очистке и могут быть использованы для приготовления вакцины. Такая стратегия позволяет определить наиболее иммуногенные белковые антигены бактерии. При этом процесс производства вакцин исключает контакт с культурами патогенных микроорганизмов, что является существенным технологическим преимуществом, обеспечивающим безопасность персонала. В нашей стране разработан экспериментальный препарат на основе гибридного (слитного) рекомбинантного белка, включающего аминокислотные последовательности: pspA, spr1895, psaA, защищенный Патентом РФ на изобретение №2012126328/15. Вакцина против пневмонии, вызываемой Streptococcus pneumoniae, на основе гибридного белка. // Суворов А.Н., Духовлинов И.В., Орлов А.И., Байгузин Е.Я. - Заявл. 22.06.2012; опубл. 27.03.2014 // Бюл. №9. - 2012.
Данный препарат является вакциной против пневмонии, вызываемой S. pneumoniae, на основе гибридного (слитного) белка, состоящего из комплекса трех белков: pspA, spr1895, psaA. Получаемый гибридный (слитный) белок обладает высокой молекулярной массой и способен вызывать достаточный иммунный ответ, однако белки, входящие в этот комплекс, ответственны только за колонизацию пневмококком верхних дыхательных путей (слизистая носа, носоглотка) и не принимают участия в патогенезе инвазивной пневмококковой инфекции, характерной для нижних дыхательных путей (трахея, бронхи и бронхиолы). Таким образом, защитный иммунный ответ на введение этой вакцины в основном направлен против первичной колонизации пневмококком слизистых верхних дыхательных путей, но не препятствует в дальнейшем развитию более серьезных осложнений, таких как инвазивная пневмония, пневмококковый менингит и сепсис, вызываемых S. pneumoniae.
Известно, что большое значение в развитии пневмококковой пневмонии играет белок микроба пневмолизин, который является токсином (Feldman С., Anderson R. Review: Current and new generation pneumococcal vaccines. Journal of Infection, 2014, 69, 309-32; Nishimoto A.T., Rosch J.W., Tuomanen E.I. Pneumolysin: pathogenesis and therapeutic target. Front. Microbiol., 2020, 11: 1543). Поэтому разрабатываются экспериментальные вакцины на основе детоксицированного пневмолизина (Lu J., Hou Н., Wang D. et al. Systemic and mucosal immune responses elicited by intranasal immunization with a pneumococcal bacterium-like particle-based vaccine displaying pneumolysin mutant Plym2. Immunology Letters, 2017, 187, 41-46). К настоящему времени имеются успешные данные об использовании экспериментальных вакцинных препаратов в разных фазах клинических испытаний.
С. Goulart et al. в 2013 году изучали в доклинических испытаниях действие разных вакцинных препаратов на основе белков пневмококка. Исследователи показали, что смесь белков, состоящая из поверхностного белка А и различных детоксицированых вариантов пневмолизина, работает не хуже, чем слитный белок pspA-dPly, однако отдельно детоксицированный вариант пневмолизина (dPly) работал слабо или полностью не работал (Lu J., Hou Н., Wang D. et al. Systemic and mucosal immune responses elicited by intranasal immunization with a pneumococcal bacterium-like particle-based vaccine displaying pneumolysin mutant Plym2. Immunology Letters, 2017, 187, 41-46. G).
Leroux-Roels et al. в 2014 году участвовали в проведении I и II фазы клинических испытаний с разными вариантами белковых препаратов пневмококка. Исследователи изучали действие dPly и белка полигистидиновой триады D (PhtD) по отдельности и в комбинации. Несмотря на достигнутые положительные результаты в этой работе, следует отметить, что III фаза клинических испытаний так и не была проведена (Lu J., Hou Н., Wang D. et al. Systemic and mucosal immune responses elicited by intranasal immunization with a pneumococcal bacteriumlike particle-based vaccine displaying pneumolysin mutant Plym2. Immunology Letters, 2017, 187, 41-46).
T. Kamtchoua et al. в 2013 году была проведена I фаза клинических испытаний с пневмококковой вакциной, разработанной на основе монопрепарата dPly, который был получен с помощью направленного мутагенеза с заменой 3-х аминокислотных остатков в позициях Т65С, G293C и С428А. Исследователи изучали иммуногенность, используя три дозы белка: 10 мкг, 25 мкг и 50 мкг. Несмотря на успешное выполнение работы, открытые сведения о проведении II и III фазах клинических испытаний в доступной нам литературе отсутствуют (Kamtchoua Т., Bologa М., Hopfer R. et al. Safety and immunogenicity of the pneumococcal pneumolysin derivative PlyD1 in a single-antigen protein vaccine candidate in adults. Vaccine, 2013, 31, 327-333). Вероятно, при проведении II фазы клинических испытаний не была доказана иммуногенность данного препарата, что может быть связано с большим количеством замен аминокислотных остатков в диком штамме пневмолизина.
Таким образом, технический результат нашей заявки на изобретение заключается в получении рекомбинантной плазмидной ДНК pSp-raPLY, кодирующей синтез рекомбинантного атоксичного белка пневмолизина S. pneumoniae и штамма-продуцента рекомбинантной атоксичной формы пневмолизина S. pneumoniae, с использованием штамма Е. coli M15.
Сущность предлагаемой заявки на изобретение:
1. Рекомбинантная плазмидная ДНК pSp-raPLY, кодирующая синтез рекомбинантного атоксичного белка пневмолизина S. pneumoniae, размером 4861 пар оснований, расщепляющаяся в результате гидролиза специфическими нуклеазами рестрикции: XbaI-EcoRI фрагмент ДНК размером 87 пар оснований, содержащего последовательность модифицированного промотора бактериофага Т5 и двух лактозных оперонов; EcoRI-BamHI фрагмент ДНК размером 57 пар оснований, содержащего сайт посадки рибосомы, стартовый ATG-кодон и последовательность, кодирующую шесть гистидинов (Arg-Gly-Ser-His-His-His-His-His-His-Gly-Ser); BamHI-SmaI фрагмент ДНК размером 1413 пар оснований, содержащего последовательность мутантного гена ply S. pneumoniae, полученного с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР); EcoRI-SmaI фрагмент ДНК размером 1470 пар оснований, содержащего сайт посадки рибосомы и последовательность, кодирующую атоксичный рекомбинантный белок пневмолизин S. pneumoniae, (состоит из гистидиновой последовательности и атоксичной формы пневмолизина); HindIII-NhEI фрагмент ДНК размером 120 пар оснований, содержащего лямбда t0 регион остановки транскрипции. Плазмида pSp-raPLY также включает в своем составе регион остановки транскрипции rrnBT1, сайт инициации репликации плазмиды ColE1 и ген, кодирующий устойчивость к ампициллину. В результате экспрессии рекомбинантной плазмиды pSp-raPLY происходит синтез рекомбинантного продукта с молекулярной массой около 53 кДа и его димера с молекулярной массой ~ 106 кДа.
2. Штамм бактерии Е. coli M15/pSp-raPLY - продуцент рекомбинантной атоксичной формы пневмолизина S. pneumoniae, полученный путем трансформации родительского штамма бактерий Е. coli M15 рекомбинантной плазмидной ДНК pSp-raPLY по п. 1.
3. Получение рекомбинантного атоксичного белка пневмолизина S. pneumoniae с использованием штамма Е. coli M15/pSp-raPLY по п. 2, включающий его культивирование в питательной среде, разрушение клеток микроорганизма и очистку полученного продукта с использованием аффинной хроматографии на никель-активированных сорбентах и растворением с ренатурацией очищенного препарата в нативных условиях при помощи диализа.
Нами была создана рекомбинантная плазмидная ДНК pSp-raPLY и штамм Е. coli M15/pSp-raPLY.
Плазмида pSp-raPLY имеет 4861 пар оснований и характеризуется наличием следующих фрагментов:
XbaI - EcoRI фрагмент ДНК размером 87 пар оснований, содержащего последовательность модифицированного промотора бактериофага Т5 и двух лактозных оперонов.
EcoRI - BamHI фрагмент ДНК размером 57 пар оснований, содержащего сайт посадки рибосомы, стартовый ATG-кодон и последовательность, кодирующую шесть гистидинов (Arg-Gly-Ser-His-His-His-His-His-His-Gly-Ser).
BamHI - SmaI фрагмент ДНК размером 1413 пар оснований, последовательность мутантного гена ply S. pneumoniae, полученного с помощью полимеразной цепной реакции (ПНР).
EcoRI - SmaI фрагмент ДНК размером 1470 пар оснований, содержащего сайт посадки рибосомы и последовательность, кодирующую атоксичный рекомбинантный белок пневмолизин S. pneumoniae, (состоит из гистидиновой последовательности и атоксичной формы пневмолизина).
HindIII - NhEI фрагмент ДНК размером 120 пар оснований, содержащего лямбда t0 регион остановки транскрипции.
На фиг. 1 представлена схема плазмиды pSp-raPLY для получения атоксичного рекомбинантного белка пневмолизина.
Заявленный рекомбинантный белок, представляющий собой атоксичную форму пневмолизина S. pneumoniae имеет аминокислотную последовательность, представленную на фиг. 2.
На фиг. 3 представлен анализ белковых продуктов, полученных в результате экспрессии в клетках Е. coli последовательности рекомбинантного гена ply, встроенного в плазмиду pSp-raPLY.
На фиг. 3А - ПААГ окрашенный Кумасси R-250, Фиг. 3Б - нитроцеллюлозная мембрана после иммуноблоттинга с моноклональными антителами к пневмолизину.
На фиг. 3А треки: 1 и 2 - продукты неиндуцированного продуцента рекомбинантного белка (слабая полоса); 3 - маркер молекулярной массы (#26614; тяжелые фрагменты 250, 150 и 100 кДа); 4, 5, 6 и 7 - продукты индуцированного продуцента рекомбинантного белка;
На фиг. 3Б треки: 1, 2, 3 и 4 - продукты индуцированного продуцента рекомбинантного белка; 5 - маркер молекулярной массы.
В таблице представлены данные по анализу токсичности полученной рекомбинантной формы пневмолизина S. pneumoniae.
На фиг. 4 приведены результаты опыта по анализу токсичности полученной рекомбинантной формы пневмолизина S. pneumoniae в культуре клеток А-549 in vitro.
Штамм Е. coli M15/pSp-raPLY получен трансформацией клеток родительского штамма Е. coli M15, с использованием традиционной генно-инженерной технологии.
Штамм Е. coli M15/pSp-raPLY характеризуется следующими признаками.
Культурально-морфологические признаки: клетки мелкие, прямые, утолщенной палочковидной формы, грамотрицательные, неспороносные. Микроб хорошо растет на простых питательных средах. При росте на агаре «Дифко» колонии круглые, гладкие, выпуклые, мутные, блестящие, светло-бежевые, края ровные. При росте в жидких средах (на минимальной среде с глюкозой или LB-бульоне) образуют интенсивную ровную муть.
Физико-биологические признаки: факультативный анаэроб, температурный диапазон роста 35-37°С при оптимуме рН в пределах 6,5-7,5.
В качестве источника азота пневмококк использует минеральные соли в аммонийной и нитратной формах и органические соединения в виде аминокислот, пептона, триптона, дрожжевого экстракта и т.д.
В качестве источника углерода микроб использует аминокислоты, глицерин, углеводы.
Клетки проявляют устойчивость к ампициллину (до 200 мкг/мл) и канамицину (до 70 мкг/мл).
Штамм Е. coli M15/pSp-raPLY - продуцент атоксичной формы пневмолизина S. pneumoniae.
Способ, условия и состав среды для хранения штамма:
LB-бульон с 10% глицерином и антибиотиками при минус 70°С в ампулах или в лиофилизированном состоянии в ампулах при 4°С.
Штамм Е. coli M15/pSp-raPLY идентифицирован по «определителю Берги» (1974) как штамм вида Е. coli.
Особенностью заявляемого штамма Е. coli M15/pSp-raPLY является получение высокоочищенного рекомбинантного белка пневмолизина S. pneumoniae сравнительно более простым способом и в более короткие сроки, по сравнению с традиционными методами получения бактериальных белков. При этом в получаемом белковом препарате отсутствует токсичность, что позволяет его характеризовать как перспективный вакцинный кандидат.
Получение рекомбинантного белка включает следующие этапы:
культивирование в питательной среде штамма Е. coli M15/pSp-raPLY;
осаждение биомассы центрифугированием;
разрушение клеток микроорганизма при растворении их в денатурирующем буфере, содержащем 8 М мочевину;
очистка с помощью аффинной хроматографии на никель-активированных сорбентах;
ренатурация очищенного рекомбинантного белка (атоксичной формы пневмолизина S. pneumoniae) выполнена с помощью диализа.
Оптимальными условиями проведения отдельных стадий получения рекомбинантного белка (атоксичной формы пневмолизина S. pneumoniae):
разрушение клеток осуществляют в результате растворения биомассы в 8 М буферном растворе мочевины;
удаление нерастворимых компонентов клетки осуществляют центрифугированием;
ренатурацию проводят при температуре 4°С путем диализа против 50 мМ буферного раствора Tris-HCl (рН=9,0).
Выход рекомбинантного белка (атоксичной формы пневмолизина S. pneumoniae) в результате применения способа в оптимальном режиме составляет не менее 120 мг рекомбинантного белка с 16 л культуральной среды, уровень синтеза рекомбинантного белка - не менее 7,5 мг с 1 л культуральной среды.
Сущность и преимущества заявляемой группы изобретений иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1. Получение рекомбинантной плазмиды pSp-raPLY.
Технология получения плазмиды pSp-raPLY включает следующие этапы:
выделение геномной ДНК S. pneumoniae;
амплификация гена ply S. pneumoniae с помощью ПЦР;
встраивание амплифицированной последовательности в плазмидный вектор.
Для выделения геномной ДНК использовали штамм, полученный из коллекции центра коллективного пользования НИИВС им. И.И. Мечникова S. pneumoniae серотипа 19F, депонированный в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов III-IV групп патогенности ФГБУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Минздрава России под регистрационным номером 298.
Культуру клеток S. pneumoniae хранили в лиофилизированном состоянии. Для восстановления жизнеспособности культуры ампулу с лиофилизированным штаммом S. pneumoniae вскрывали стерильно над лотком в боксе биологической безопасности. После вскрытия ампулы, лиофилизат растворяли путем добавления 0,3 мл сердечно-мозгового бульона. Содержимое ампулы переносили пастеровской пипеткой в пробирку с 2 мл сердечно-мозгового бульона и инкубировали при 37°С в 5,5% CO2 среде в течение 2 ч. После этапа подращивания, культуру высевали на питательный агар с 5% содержанием лошадиной крови, из расчета 100 мкл на одну чашку и инкубировали при 37°С в 5,5% CO2 среде в течение 18-24 ч. В работе использовали культуру S. pneumoniae после двух восстановительных пассажей. Чистоту выросшей культуры определяли визуально и микроскопически в мазках, окрашенных по Граму.
Полученную биомассу аккуратно снимали микробиологической петлей с поверхности агаризованной среды и переносили в микроцентрифужную пробирку. Осажденную бактериальную биомассу S. pneumoniae растворяли в 200 мкл ТЕ-буфера, рН=8,0. После этого в пробирку добавляли 10 мкл протеиназы К (10 мг/мл) и 200 мкл лизирующего раствора. Смесь инкубировали при температуре 65°С в течение 15 мин, периодически перемешивая содержимое пробирки. Затем прибавляли 200 мкл осаждающего раствора и переносили весь объем пробирки на колонку «К-сорб-100» (Синтол) и проводили выделение геномной ДНК согласно протоколу производителя. Полученные растворы ДНК хранили при минус 20°С.
При ПЦР использовали пару праймеров, один из которых соответствовал началу (прямой), а второй (обратный) был комплементарен концу гена ply S. pneumoniae. Прямой праймер содержал на 5'-конце сайт рестрикции BamHI, а обратный сайт рестрикции SmaI.
Прямой праймер имел следующую структуру (5'-3'): GGATCACTTAGTCCAACCAC, а обратный: GCAAACATTCTTCTCTCCTA.
ПЦР проводили при следующих реакционных условиях: буфер х5 для Phu-полимеразы, содержащий 1,5 mM MgCl2, 0,2 mM dNTP, праймеры Forward и Reverse по 0,01 mM каждый. На 50 мкл реакционной смеси использовали 1 ед. Phu-полимеразы (Fermentas) и 1 мкг геномной ДНК.
Реакцию проводили в амплификаторе "Biometra". Процесс амплификации состоял из следующих стадий: прогревания при 98°С в течении 1 мин, и 30-ти циклов ПЦР (98°С - 15 сек., 55-65°С - 20 сек, 72°С - 50 сек, финальная элонгация - 5 мин) и инкубации при 72°С в течении 2 мин.
Полученный фрагмент ДНК размером 1413 пар оснований обработали рестриктазами BamHI и SmaI. Параллельно этими же рестриктазами был обработан вектор pQE-30 (QIAGEN). Оба рестрикта очищали в агарозном геле и объединили в одну конструкцию при реакции лигирования. В результате была получена рекомбинантная плазмида pSp-raPLY размером 4861 пар оснований, в которой ДНК гена ply была фланкирована сайтами рестрикции BamHI и SmaI (фиг. 1). По результатам секвенирования расшифрована аминокислотная последовательность полученного рекомбинантного белка пневмолизина (фиг. 2).
Пример 2. Получение штамма Е. coli M15/pSp-raPLY - продуцента атоксичной формы пневмолизина S. pneumoniae.
Штамм-продуцент Е. coli M15/pSp-raPLY получали путем трансформации клеток родительского штамма Е. coli M15, содержащего плазмиду pREP4, рекомбинантной плазмидой pSp-raPLY с последующим отбором рекомбинантных клонов, выращенных при температуре 37°С на среде LB, содержащей ампициллин и канамицин.
Первичный отбор рекомбинантных плазмид проводили с использованием рестриктного анализа и секвенирования.
Далее отбор продуцентов проводился по способности контролируемого синтеза рекомбинантного белка в клетках штамма-продуцента. Для этого добавляли бактериальной петлей одну колонию в 1 мл среды LB, содержащей ампициллин и канамицин в концентрациях 200 и 70 мкг в мл соответственно. Выращивали в термостатированном шейкере со скоростью орбитального вращения 200 об/мин в течение 12-16 ч при температуре 37°С. Затем в 5 мл свежей среды вносили 100 мкл выросшей культуры и инкубировали в прежних условиях в течение 2-3 ч до достижения культурой активной фазы роста (0,6 оптических единиц при длине волны 600 нм). Добавляли 5 мкл 1 М водного раствора химического индуктора изопропил-β-d-тиогалактопиранозид (ИПТГ). Инкубацию продолжали в прежних условиях 4 ч, отбирая пробы для электрофореза в течение каждого часа, после завершения культивирования осаждали полученную биомассу.
В качестве контроля использовали бактериальную культуру продуцента, инкубированную при тех же условиях, но без добавления ИПТГ. Белковые продукты анализировали электрофорезом в полиакриламидном геле (ПААГ) по методу Лэммли (фиг. 3А).
При анализе биомассы, полученной после индукции экспрессии рекомбинантного гена, выявлено наличие специфичного продукта, который отсутствовал или очень слабо экспрессировался в клетках продуцента, выращенного без добавления ИПТГ. Молекулярная масса синтезированного рекомбинантного продукта составила примерно 53 кДа и 106 кДа. Расчетная масса для рекомбинантной атоксичной формы пневмолизина S. pneumoniae составила 53 кДа, а для его димера - 106 кДа. По результатам электрофореза установлено, что количество рекомбинантного белка составляло не менее одной пятой относительно всех клеточных белков.
Рекомбинантные белки проявили высокую специфичность при взаимодействии с коммерческими моноклональными антителами к пневмолизину (фиг. 3Б).
Пример 3. Получение рекомбинантного атоксичного белка пневмолизина S. pneumoniae из штамма Е. coli M15/pSp-raPLY.
Получение рекомбинантного атоксичного белка пневмолизина S. pneumoniae проводили в 4 этапа.
1 этап: культивирование штамма Е. coli M15/pSp-raPLY с индукцией экспрессии рекомбинантного гена ply.
2 этап: получение клеточного лизата штамма Е. coli M15/pSp-raPLY после экспрессии рекомбинантного гена ply.
3 этап: хроматографическая очистка рекомбинантного атоксичного белка пневмолизина S. pneumoniae.
4 этап: растворение и ренатурация рекомбинантного атоксичного белка пневмолизина S. pneumoniae.
Культивирование штамма Е. coli M15/pSp-raPLY с индукцией экспрессии рекомбинантного гена ply.
Выращивали посевной материал штамма Е. coli M15/pSp-raPLY в 200 мл среды LB содержащей ампициллин и канамицин в концентрациях 200 и 70 мкг в мл соответственно. Культивирование проводили в течение 12 ч при температуре 37°С в термостатированном шейкере со скоростью орбитального вращения 200 об/мин.
Полученную культуру асептически вносили в колбы суммарным объемом 4 л стерильной среды LB, содержащей ампициллин и канамицин в концентрациях 200 и 70 мкг в мл соответственно. Проводили культивирование в тех же условиях 1,5-2 ч.
При достижении плотности культуры 0,6 оптических единиц при длине волны 600 нм в термостатированном шейкере вносили 4 мл 1 М водного раствора ИПТГ. Инкубацию продолжали в прежних условиях 4 ч.
Получение клеточного лизата штамма Е. coli M15/pSp-raPLY после экспрессии рекомбинантного гена ply.
Биомассу осаждали в центрифуге Beckman J2-21 (ротор JA-14) со скоростью вращения 3000 об/мин в течение 30 мин, замораживали и хранили при минус 20°С. Осадок, собранный с 16 л. культуры растворяли в 500 мл следующего раствора: 8 М мочевина; 0,1 М NaH2PO4; 0,01 М Tris-HCl; рН=8,0. Растворение биомассы проводили в орбитальном шейкере при вращении 100 об/мин в течение 12 ч при комнатной температуре.
Затем лизат освобождали от нерастворенных фрагментов клетки в центрифуге Eppendorf 5804 R со скоростью вращения 10000 об/мин при комнатной температуре в течение 1 ч. Супернатант переносили в чистую стерильную колбу.
Хроматографическая очистка рекомбинантного атоксичного белка пневмолизина S. pneumoniae.
К осветленному лизату добавляли 25 мл суспензии Ni-агарозы (QIAGEN), и инкубировали 1 ч при комнатной температуре в орбитальном шейкере при легком покачивании (60 об/мин).
Полученную суспензию пропускали через колонку для хроматографии (Bio-Rad) объемом 250 мл и диаметром 5 см. В результате из колонки удалялась жидкая фаза лизата и оставался сорбент со связанным рекомбинантным белком.
Далее через колонку пропускали 1 л первого промывочного раствора следующего состава: 8 М мочевина; 0,1 М NaH2PO4; 0,01 М Tris-HCl; рН=6,3. Затем через колонку пропускали 0,5 л второго промывочного раствора следующего состава: 8 М мочевина; 0,1 М NaH2PO4; 0,01 М Tris-HCl; рН=5,9.
Для элюции рекомбинантного белка использовали раствор следующего состава: следующего состава: 8 М мочевина; 0,1 М NaH2PO4; 0,01 М Tris-HCl; рН=4,5. С полученным элюатом проводили оценочный электрофорез в ПААГ.
Растворение и ренатурация рекомбинантного атоксичного белка пневмолизина S. pneumoniae.
Очищенный рекомбинантный белок растворяли в 50 мМ Tris-HCl (рН=9,0) с помощью диализа при температуре 4°С и перемешивании буфера на магнитной мешалке. Для этого препарат очищенного рекомбинантного белка переносили в диализный мешок.
Завязанный диализный мешок помещали в емкость, содержащую 1 л следующего раствора: 50 мМ Tris-HCl; рН=9,0. Через 4 ч проводили смену буферного раствора. Процедуру повторяли пять раз.
Содержание белка в препарате определяли спектрофотометрически при длине волны 280 нм. При расчете концентрации рекомбинантных белков использовали коэффициент экстинкции 0,7, рассчитанный в программе Vector NTI Advance 11.0.
Препараты очищенного рекомбинантного белка (атоксичная форма пневмолизина S. pneumoniae) хранили в аликвотах по 10 мл в стерильных пробирках при минус 70°С.
Пример 4. Оценка токсичности рекомбинантного белка пневмолизина S. pneumoniae.
Препараты очищенного рекомбинантного белка пневмолизина вводили однократно внутрибрюшинно животным в дозах 12,5 мкг/мышь, 25 мкг/мышь, 50 мкг/мышь и 100 мкг/мышь. Число животных в каждой группе было десять (n=10). Наблюдение за мышами проводили в течение 7 дней. Учитывали среднюю прибавку веса мышей в каждой группе на протяжении всего эксперимента по сравнению с контрольной группой мышей, которым однократно вводили стерильный физ. раствор. Значимой разницы (р<0,05) в изменении прибавки веса животных по сравнению с контролем не было выявлено (таблица).
В следующем опыте изучали токсичность очищенного рекомбинантного белка пневмолизина в культуре клеток А-549 in vitro. Рекомбинантный белок добавляли в концентрациях от 0,5 мкг/мл до 10 мкг/мл. Ни одна из взятых концентраций пневмолизина не оказывала токсичного эффекта на жизнеспособность клеток карциномы легкого человека (А-549) по сравнению с контролем, который принимали условно за 100% жизнеспособных клеток (фиг. 4).
Claims (3)
1. Рекомбинантная плазмидная ДНК pSp-raPLY, кодирующая синтез рекомбинантного атоксичного белка пневмолизина S. pneumoniae, размером 4861 пар оснований, расщепляющаяся в результате гидролиза специфическими нуклеазами рестрикции: XbaI-EcoRI фрагмент ДНК размером 87 пар оснований, содержащего последовательность модифицированного промотора бактериофага Т5 и двух лактозных оперонов; EcoRI-ВатHI фрагмент ДНК размером 57 пар оснований, содержащего сайт посадки рибосомы, стартовый ATG-кодон и последовательность, кодирующую шесть гистидинов Arg-Gly-Ser-His-His-His-His-His-His-Gly-Ser, BamHl-Smal фрагмент ДНК размером 1413 пар оснований, содержащего последовательность мутантного гена ply S. pneumoniae, полученного с помощью полимеразной цепной реакции, EcoRI-SmaI фрагмент ДНК размером 1470 пар оснований, содержащего сайт посадки рибосомы и последовательность, кодирующую атоксичную форму пневмолизина S. Pneumonia, состоящий из гистидиновой последовательности и атоксичной формы пневмолизина, HindIII-NhEI фрагмент ДНК размером 120 пар оснований, содержащего лямбда t0 регион остановки транскрипции; плазмида pSp-raPLY также включает в своем составе регион остановки транскрипции rrnBT1, сайт инициации репликации плазмиды ColE1 и ген, кодирующий устойчивость к ампициллину; в результате экспрессии рекомбинантной плазмиды pSp-raPLY происходит синтез рекомбинантного продукта с молекулярной массой 50 кДа и его димера с молекулярной массой 100 кДа.
2. Штамм бактерии Е. coli M15/pSp-raPLY - продуцент рекомбинантной атоксичной формы пневмолизина S. pneumoniae, полученный путем трансформации родительского штамма бактерий Е. coli Ml5 рекомбинантной плазмидной ДНК pSp-raPLY по п. 1.
3. Способ получения рекомбинантного атоксичного белка пневмолизина S. pneumoniae с использованием штамма Е. coli M15/pSp-raPLY по п. 2, являющегося нетоксичным димером с молекулярной массой от 50 до 100 кДа, формирующего иммунный ответ для профилактики пневмококковых инфекций, включающий следующие этапы: культивирование в питательной среде штамма Е. coli M15/pSp-raPLY; осаждение биомассы центрифугированием; разрушение клеток микроорганизма при растворении их в денатурирующем буфере, содержащем 8М мочевину; очистка с помощью аффинной хроматографии на никель-активированных сорбентах; ренатурация очищенной атоксичной формы пневмолизина S. pneumoniae, выполненная с помощью диализа.
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2782598C1 true RU2782598C1 (ru) | 2022-10-31 |
Family
ID=
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2121481C1 (ru) * | 1988-12-16 | 1998-11-10 | Де Стат Дер Недерланден Вертегенвордигд Дор де Министр Ван Велзейн, Волксгезондхейд эн Кюлтюр | Модифицированный пневмолизин, рекомбинантная плазмида, способ получения модифицированного пневмолизина, вакцина |
RU2510281C2 (ru) * | 2012-06-22 | 2014-03-27 | Общество с ограниченной ответственностью "Эпитоп" (ООО "Эпитоп") | ВАКЦИНА ПРОТИВ ПНЕВМОНИИ, ВЫЗЫВАЕМОЙ Streptococcus pneumoniae, НА ОСНОВЕ ГИБРИДНОГО БЕЛКА |
RU2671099C1 (ru) * | 2017-08-01 | 2018-10-29 | Федеральное казенное учреждение здравоохранения "Ростовский-на-Дону ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский противочумный институт" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | Рекомбинантная плазмида, экспрессирующая клонированный ген гемолизина Vibrio cholerae, и штамм Escherichia coli - суперпродуцент прогемолизина Vibrio cholerae |
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2121481C1 (ru) * | 1988-12-16 | 1998-11-10 | Де Стат Дер Недерланден Вертегенвордигд Дор де Министр Ван Велзейн, Волксгезондхейд эн Кюлтюр | Модифицированный пневмолизин, рекомбинантная плазмида, способ получения модифицированного пневмолизина, вакцина |
RU2510281C2 (ru) * | 2012-06-22 | 2014-03-27 | Общество с ограниченной ответственностью "Эпитоп" (ООО "Эпитоп") | ВАКЦИНА ПРОТИВ ПНЕВМОНИИ, ВЫЗЫВАЕМОЙ Streptococcus pneumoniae, НА ОСНОВЕ ГИБРИДНОГО БЕЛКА |
RU2671099C1 (ru) * | 2017-08-01 | 2018-10-29 | Федеральное казенное учреждение здравоохранения "Ростовский-на-Дону ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский противочумный институт" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | Рекомбинантная плазмида, экспрессирующая клонированный ген гемолизина Vibrio cholerae, и штамм Escherichia coli - суперпродуцент прогемолизина Vibrio cholerae |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
LU J.et al. Systemic and mucosal immune responses elicited by intranasal immunization with a pneumococcal bacterium-like particle-based vaccine displaying pneumolysin mutant Plym2. Immunology Letters, 2017, 187, 41-46. * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
St. Geme III et al. | A Haemophilus influenzae IgA protease‐like protein promotes intimate interaction with human epithelial cells | |
Koster et al. | Identification and characterization of the pupB gene encoding an inducible ferric‐pseudobactin receptor of Pseudomonas putida WCS358 | |
EP0107509A2 (en) | Protein A material and preparation thereof | |
JP2010011852A (ja) | 細菌フェロモンおよびその使用 | |
Al-Daraghi et al. | Detection of Exotoxin A gene in Pseudomonas aeruginosa from Clinical and Environmental samples | |
RU2782598C1 (ru) | Рекомбинантная плазмидная ДНК pSp-raPLY, кодирующая синтез рекомбинантного атоксичного белка пневмолизина Streptococcus pneumoniae, штамм Escherichia coli M15/pSp-raPLY - продуцент рекомбинантной атоксичной формы пневмолизина и получение указанного белка для разработки вакцинного препарата для профилактики пневмококковых инфекций | |
WO2009113664A1 (ja) | 組換え皮膚壊死トキソイドを含有する豚萎縮性鼻炎用薬剤 | |
JPH09500537A (ja) | B型インフルエンザウイルス由来のタンパク質p2の発現および精製方法 | |
RU2537006C2 (ru) | РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pPA-OPRFI, КОДИРУЮЩАЯ ГИБРИДНЫЙ РЕКОМБИНАНТНЫЙ БЕЛОК F-I НАРУЖНОЙ МЕМБРАНЫ Pseudomonas aeruginosa, ШТАММ Escherichia coli PA-OPRFI-ПРОДУЦЕНТ ГИБРИДНОГО РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА F-I НАРУЖНОЙ МЕМБРАНЫ Pseudomonas aeruginosa И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГИБРИДНОГО РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА F-I НАРУЖНОЙ МЕМБРАНЫ Pseudomonas aeruginosa | |
RU2529359C2 (ru) | РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pPA-OPRF-ETA, КОДИРУЮЩАЯ СИНТЕЗ РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА OPRF-ETA Pseudomonas aeruginosa, ШТАММ Escherichia coli PA-OPRF-ETA - ПРОДУЦЕНТ РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА OPRF-ETA Pseudomonas aeruginosa И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА OPRF-ETA Pseudomonas aeruginosa | |
Vorobyev et al. | Preparation a recombinant form of pneumolysin protein from Streptococcus pneumoniae | |
CN110437328B (zh) | 一种猪干扰素α突变体YNS及其制备方法和应用 | |
RU2486243C1 (ru) | ПОЛИНУКЛЕОТИД, КОДИРУЮЩИЙ МУТАНТНУЮ РЕКОМБИНАНТНУЮ IgA1 ПРОТЕАЗУ Neisseria meningitidis СЕРОГРУППЫ В, РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК, СОДЕРЖАЩАЯ УКАЗАННЫЙ ПОЛИНУКЛЕОТИД, КЛЕТКА-ХОЗЯИН, СОДЕРЖАЩАЯ УКАЗАННУЮ ПЛАЗМИДНУЮ ДНК, РЕКОМБИНАНТНАЯ IgA1 ПРОТЕАЗА Neisseria memingitidis СЕРОГРУППЫ В, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЗРЕЛОЙ ФОРМЫ IgA1 ПРОТЕАЗЫ | |
US6676943B1 (en) | Human complement C3-degrading protein from Streptococcus pneumoniae | |
JP3850557B2 (ja) | 新規遺伝子及びその遺伝子を保有する形質転換細胞 | |
US9132183B2 (en) | Modified live (JMSO strain) Haemophilus parasuis vaccine | |
JP2857886B2 (ja) | バチルス・エス・ピー、l―乳酸脱水素酵素遺伝子を含有するdna断片およびそれを含有する組み換え体プラスミド並びにl―乳酸脱水素酵素遺伝子およびそれを含有する組み換え体プラスミド。 | |
RU2453599C1 (ru) | НУКЛЕИНОВАЯ КИСЛОТА, КОДИРУЮЩАЯ ФУНКЦИОНАЛЬНО АКТИВНУЮ РЕКОМБИНАНТНУЮ IgA1 ПРОТЕАЗУ NEISSERIA MENINGITIDIS СЕРОГРУППЫ B, РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК, СОДЕРЖАЩАЯ НУКЛЕОТИДНУЮ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ, КОДИРУЮЩУЮ АКТИВНУЮ IgA1 ПРОТЕАЗУ, ШТАММ-ПРОДУЦЕНТ, СОДЕРЖАЩИЙ ПЛАЗМИДНУЮ ДНК, ПРОДУЦИРУЮЩИЙ ЗРЕЛУЮ ФОРМУ IgA1 ПРОТЕАЗЫ, РЕКОМБИНАНТНАЯ Ig ПРОТЕАЗА NEISSERIA MENINGITIDIS СЕРОГРУППЫ В, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЗРЕЛОЙ ФОРМЫ IgA1 ПРОТЕАЗЫ, ОБЛАДАЮЩЕЙ ИММУНОГЕННЫМИ И ПРОТЕКТИВНЫМИ СВОЙСТВАМИ | |
JP2850033B2 (ja) | 新規なl―乳酸脱水素酵素及びそれをコードする遺伝子 | |
RU2677790C1 (ru) | Рекомбинантная плазмидная ДНК pPA-OPRF-ATOX-OPRI, кодирующая синтез гибридного рекомбинантного белка, включающего аминокислотные последовательности белков F и I наружной мембраны и атоксического варианта экзотоксина A Pseudomonas aeruginosa, штамм Escherichia coli PA-OPRF-ATOX-OPRI - продуцент гибридного рекомбинантного белка и способ получения указанного белка | |
KR100465347B1 (ko) | 효모에서 악티노바실러스 플루로뉴모니애의 재조합ApxⅡA 독소 단백질을 제조하는 방법 및사료첨가제로서의 이의 용도 | |
AU2003295182B9 (en) | Process for producing streptokinase using genetically modified Escherichia coli | |
US7189557B2 (en) | Process for the intracellular over-production of streptokinase using genetically engineered strain of E. coli | |
JPH10248574A (ja) | 新規な乳酸酸化酵素 | |
RU2333241C2 (ru) | Способ продуцирования стрептокиназы с использованием генетически модифицированного escherichia coli |