RU2773533C9

RU2773533C9 - Systems and methods for growing probiotic bacterium biofilm on solid particles for intestine colonization by bacteria

Info

Publication number: RU2773533C9
Application number: RU2017143181A
Authority: RU
Inventors: Давид БАРАМ; Рахель ДИАМАНТ; Давид ДАБУШ
Original assignee: Майбиотикс Фарма Лтд
Priority date: 2015-05-11
Filing date: 2016-05-09
Publication date: 2022-10-12

Abstract

FIELD: biotechnology.

SUBSTANCE: method is proposed for producing biofilm, which is resistant to pH in the range from 2 to 8, which contains a population of at least one bacterial strain, attached to particles. The proposed method includes: (a) provision of a population containing at least one bacterial strain; (b) inoculation of a growth medium, which contains particles, with the specified population containing at least one bacterial strain, wherein the specified particles are selected from a group consisting of seeds, dicalcium phosphate, cellulose and any combination thereof; (c) incubation of the specified particles with the specified population containing at least one bacterial strain for a time sufficient for the specified population of at least one bacterial strain to attach to the specified particles; and (d) cultivation of the specified population containing at least one bacterial strain, attached to the specified particles, in the growth medium for a time sufficient for the formation of biofilm. In this case, the specified cultivation includes cultivation under anaerobic conditions. The specified biofilm is made with the possibility of colonization of the gastrointestinal tract of a subject who needs it during at least five days when taken inside by the specified subject.

EFFECT: invention provides for obtaining bacterial biofilm, bacteria in which are resistant to pH in the range from 2 to 8.

15 cl, 10 dwg, 4 tbl, 8 ex

Description

Перекрестная ссылка на родственные заявкиCross-reference to related applications

[0001] Настоящая заявка испрашивает приоритет на основании предварительной заявки на патент США №62/159,846, поданной 11 мая 2015 года, и предварительной заявки на патент США №62/159,849, поданной 11 мая 2015 года, полное содержание которых включено в настоящую заявку посредством ссылки.[0001] This application claims priority from U.S. Provisional Application No. 62/159,846, filed May 11, 2015, and U.S. Provisional Application No. 62/159,849, filed May 11, 2015, the entire contents of which are incorporated herein by links.

Область техникиTechnical field

[0002] Настоящее изобретение относится к системе и способу выращивания и инкапсуляции по меньшей мере одного штамма бактерий в форме биопленки, выполненной с возможностью рН-зависимого направленного высвобождения бактериальной биопленки в желудочно-кишечном тракте.[0002] The present invention relates to a system and method for growing and encapsulating at least one strain of bacteria in the form of a biofilm, configured to pH-dependent targeted release of the bacterial biofilm in the gastrointestinal tract.

Краткое описание изобретенияBrief description of the invention

[0003] Согласно одному варианту реализации в настоящем изобретении предложен способ,[0003] According to one implementation variant, the present invention provides a method,

причем указанный способ приводит к образованию биопленки,moreover, this method leads to the formation of a biofilm,

причем указанная биопленка содержит популяцию по меньшей мере одного штамма бактерий, прикрепленную к частицам,wherein said biofilm contains a population of at least one bacterial strain attached to the particles,

причем указанная биопленка выполнена с возможность колонизации кишечника субъекта, который нуждается в такой колонизации, в течение по меньшей мере пяти дней при принятии внутрь субъектом, причем указанный способ включает:wherein said biofilm is configured to colonize the intestines of a subject in need of such colonization for at least five days upon ingestion by the subject, said method comprising:

a. обеспечение популяции, содержащей по меньшей мере один штамм бактерий;a. providing a population containing at least one strain of bacteria;

b. инокуляцию среды для роста, которая содержит частицы, популяцией, содержащей по меньшей мере один штамм бактерий;b. inoculating the growth medium, which contains the particles, with a population containing at least one bacterial strain;

c. инкубирование частиц с популяцией, содержащей по меньшей мере один штамм бактерий, в течение времени, достаточного для того, чтобы популяция по меньшей мере одного штамма бактерий прикрепилась к частицам; иc. incubating the particles with a population containing at least one bacterial strain for a time period sufficient for the population of at least one bacterial strain to attach to the particles; and

d. культивирование популяции, содержащей по меньшей мере один штамм бактерий, прикрепленной к частицам, в среде для роста в течение времени, достаточного для образования биопленки.d. culturing a population containing at least one strain of bacteria attached to the particles in the growth medium for a time sufficient to form a biofilm.

[0004] Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения биопленка, содержащая популяцию по меньшей мере одного штамма бактерий, прикрепленную к частицам, инкапсулирована соединением, приспособленным для высвобождения по меньшей мере одного штамма бактерий при рН, обнаруженном в кишечнике животного.[0004] According to one embodiment of the present invention, a biofilm containing a population of at least one bacterial strain attached to the particles is encapsulated with a compound adapted to release the at least one bacterial strain at the pH found in the animal's gut.

[0005] Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения соединение, приспособленное для высвобождения по меньшей мере одного штамма бактерий при рН, обнаруженном в кишечнике животного, представляет собой альгинат.[0005] In one embodiment of the present invention, a compound adapted to release at least one strain of bacteria at the pH found in the intestine of an animal is an alginate.

[0006] Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения популяцию по меньшей мере одного штамма бактерий, прикрепленную к частицам, культивируют в среде для роста в проточных условиях.[0006] According to one embodiment of the present invention, the population of at least one bacterial strain attached to the particles is cultured in a growth medium under flow conditions.

[0007] Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения популяцию по меньшей мере одного штамма бактерий, прикрепленную к частицам, культивируют в среде для роста в статических условиях.[0007] According to one embodiment of the present invention, the population of at least one bacterial strain attached to the particles is cultured in a growth medium under static conditions.

[0008] Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения популяцию по меньшей мере одного штамма бактерий, прикрепленную к частицам, сначала культивируют в среде для роста в статических условиях, а затем культивируют в среде для роста в проточных условиях.[0008] According to one embodiment of the present invention, the population of at least one strain of bacteria attached to the particles is first cultured in a growth medium under static conditions, and then cultured in a growth medium under flow conditions.

[0009] Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения популяцию по меньшей мере одного штамма бактерий, прикрепленную к частицам, культивируют в анаэробных условиях.[0009] According to one embodiment of the present invention, the population of at least one bacterial strain attached to the particles is cultured under anaerobic conditions.

[0010] Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения популяцию по меньшей мере одного штамма бактерий, прикрепленную к частицам, культивируют в аэробных условиях.[0010] According to one embodiment of the present invention, the population of at least one bacterial strain attached to the particles is cultured under aerobic conditions.

[0011] Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения частицы являются пористыми и выбраны из группы, состоящей из: семян, дикальция фосфата, глины, песка и целлюлозы.[0011] According to one embodiment of the present invention, the particles are porous and are selected from the group consisting of: seeds, dicalcium phosphate, clay, sand, and cellulose.

[0012] Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения популяция, содержащая по меньшей мере один штамм бактерий, получена из микрофлоры кишечника.[0012] According to one implementation variant of the present invention, the population containing at least one strain of bacteria obtained from the intestinal microflora.

[0013] Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения популяция, содержащая по меньшей мере один штамм бактерий, представляет собой Lactobacillus plantarum.[0013] According to one embodiment of the present invention, the population containing at least one bacterial strain is Lactobacillus plantarum.

[0014] Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения популяция, содержащая по меньшей мере один штамм бактерий, представляет собой Acetobacter pomorum.[0014] According to one embodiment of the present invention, the population containing at least one bacterial strain is Acetobacter pomorum.

[0015] Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения биопленка, образованная в результате способа, выполнена с возможностью рН-зависимого направленного высвобождения бактериальной биопленки в желудочно-кишечном тракте.[0015] According to one embodiment of the present invention, the biofilm formed as a result of the method is configured to pH-dependent targeted release of the bacterial biofilm in the gastrointestinal tract.

[0016] Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения биопленка содержит два или более штаммов бактерий.[0016] According to one embodiment of the present invention, the biofilm contains two or more bacterial strains.

Краткое описание чертежейBrief description of the drawings

[0017] На Фиг. 1 представлен пример иллюстративного варианта реализации настоящего изобретения, который демонстрирует проточную систему, использованную в соответствии со способами согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения.[0017] In FIG. 1 is an example of an illustrative embodiment of the present invention that demonstrates a flow system used in accordance with methods according to some embodiments of the present invention.

[0018] На Фиг. 2А-2С представлены изображения некоторых иллюстративных вариантов реализации биопленок, полученных посредством способов согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения.[0018] In FIG. 2A-2C are images of some illustrative embodiments of biofilms obtained by methods according to some embodiments of the present invention.

[0019] Фиг. 3 демонстрирует устойчивость биопленки согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения к кислоте.[0019] FIG. 3 shows acid resistance of a biofilm according to some embodiments of the present invention.

[0020] Фиг. 4 демонстрирует устойчивость другой биопленки согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения к кислоте.[0020] FIG. 4 shows acid resistance of another biofilm according to some embodiments of the present invention.

[0021] Фиг. 5 демонстрирует устойчивость биопленки согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения к лиофилизации.[0021] FIG. 5 demonstrates the resistance of a biofilm according to some embodiments of the present invention to lyophilization.

[0022] Фиг. 6 демонстрирует устойчивость другой биопленки согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения к кислоте.[0022] FIG. 6 shows acid resistance of another biofilm according to some embodiments of the present invention.

[0023] Фиг. 7 демонстрирует способность биопленки согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения колонизировать кишку на модели на животных с использованием указанных композиций.[0023] FIG. 7 demonstrates the ability of a biofilm according to some embodiments of the present invention to colonize the gut in an animal model using the indicated compositions.

[0024] Фиг. 8 демонстрирует рН-зависимое высвобождение бактерий из биопленок согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения.[0024] FIG. 8 shows the pH dependent release of bacteria from biofilms according to some embodiments of the present invention.

[0025] Фиг. 9 демонстрирует способность другой биопленки согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения колонизировать кишку на модели на животных.[0025] FIG. 9 demonstrates the ability of another biofilm according to some embodiments of the present invention to colonize the gut in an animal model.

[0026] Фиг. 10 демонстрирует способность другой биопленки согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения колонизировать кишку на модели на животных по сравнению с другими биопленками, образованными с применением других способов.[0026] FIG. 10 demonstrates the ability of another biofilm according to some embodiments of the present invention to colonize the gut in an animal model, compared to other biofilms formed using other methods.

Подробное описание изобретенияDetailed description of the invention

[0027] Для ясности описания, а не в качестве ограничения подробное описание изобретения разделено на следующие подразделы, в которых описаны или проиллюстрированы определенные свойства, варианты реализации или варианты применения настоящего изобретения.[0027] For clarity of description, and not as a limitation, the detailed description of the invention is divided into the following subsections, which describe or illustrate certain features, implementations, or uses of the present invention.

[0028] По всему тексту описания и формулы изобретения следующие термины имеют значения, однозначно связанные с указанными терминами, если контекст однозначно не диктует обратное. Фразы «согласно одному варианту реализации настоящего изобретения» и «согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения» в настоящей заявке не обязательно относятся, хотя и могут относиться, к одному варианту или к одним и тем же вариантам реализации. Более того, фразы «согласно другому варианту реализации настоящего изобретения» и «согласно некоторым другим вариантам реализации настоящего изобретения» в настоящей заявке не обязательно относятся, хотя и могут относиться, к различным вариантам реализации. Таким образом, как описано ниже, различные варианты реализации настоящего изобретения можно с легкостью объединить, оставаясь в пределах объема или духа настоящего изобретения.[0028] Throughout the text of the description and the claims, the following terms have meanings that are uniquely associated with the specified terms, unless the context clearly dictates otherwise. The phrases "according to one embodiment of the present invention" and "according to some embodiments of the present invention" in this application do not necessarily refer, although they may refer to the same embodiment or to the same implementation options. Moreover, the phrases "according to another embodiment of the present invention" and "according to some other embodiments of the present invention" in this application do not necessarily refer, although they may refer to different implementation options. Thus, as described below, the various embodiments of the present invention can be easily combined while remaining within the scope or spirit of the present invention.

[0029] Кроме того, в настоящей заявке термин «или» представляет собой включающий оператор «или» и эквивалентен термину «и/или», если контекст однозначно не диктует обратное. Термин «на основе» не является исключающим и включает варианты на основе дополнительных не описанных факторов, если контекст однозначно не диктует обратное. Кроме того, по всему настоящему описанию объекты в единственном числе включают упоминания объектов во множественном числе. Значение «в» включает «в» и «на».[0029] In addition, in this application, the term "or" is an inclusive "or" operator and is equivalent to the term "and/or" unless the context clearly dictates otherwise. The term "based on" is not exclusive and includes options based on additional factors not described unless the context clearly dictates otherwise. In addition, throughout the present description, objects in the singular include references to objects in the plural. The meaning of "in" includes "in" and "on".

[0030] Согласно некоторым вариантам реализации настоящее изобретение относится к системе и способу для выращивания и инкапсуляции по меньшей мере одного штамма бактерий в форме биопленки, выполненной с возможностью рН-зависимого направленного высвобождения бактериальной биопленки в желудочно-кишечном тракте.[0030] In some embodiments, the present invention relates to a system and method for growing and encapsulating at least one strain of bacteria in the form of a biofilm, configured to pH-dependent targeted release of the bacterial biofilm in the gastrointestinal tract.

[0031] Согласно одному варианту реализации в настоящем изобретении предложен способ,[0031] According to one implementation variant, the present invention provides a method,

причем указанная биопленка выполнена с возможностью колонизации кишечника субъекта, который нуждается в такой колонизации, в течение по меньшей мере пяти дней при принятии внутрь субъектом, причем указанный способ включает:wherein said biofilm is configured to colonize the intestines of a subject in need of such colonization for at least five days upon ingestion by the subject, said method comprising:

[0032] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения время, достаточное для прикрепления популяции по меньшей мере одного штамма бактерий к частицам, составляет от 2 часов до 12 часов. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения время, достаточное для прикрепления популяции по меньшей мере одного штамма бактерий к частицам, составляет 2 часа. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения время, достаточное для прикрепления популяции по меньшей мере одного штамма бактерий к частицам, составляет 4 часа. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения время, достаточное для прикрепления популяции по меньшей мере одного штамма бактерий к частицам, составляет 6 часов. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения время, достаточное для прикрепления популяции по меньшей мере одного штамма бактерий к частицам, составляет 8 часов. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения время, достаточное для прикрепления популяции по меньшей мере одного штамма бактерий к частицам, составляет 10 часов. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения время, достаточное для прикрепления популяции по меньшей мере одного штамма бактерий к частицам, составляет 12 часов.[0032] According to some variants of implementation of the present invention, the time sufficient for the attachment of a population of at least one strain of bacteria to the particles is from 2 hours to 12 hours. According to some variants of implementation of the present invention, the time sufficient for the attachment of a population of at least one strain of bacteria to the particles is 2 hours. According to some variants of implementation of the present invention, the time sufficient for the attachment of a population of at least one strain of bacteria to the particles is 4 hours. According to some variants of implementation of the present invention, the time sufficient for the attachment of a population of at least one strain of bacteria to the particles is 6 hours. According to some variants of implementation of the present invention, the time sufficient for the attachment of a population of at least one strain of bacteria to the particles is 8 hours. According to some variants of implementation of the present invention, the time sufficient for the attachment of a population of at least one strain of bacteria to the particles is 10 hours. According to some variants of implementation of the present invention, the time sufficient for the attachment of a population of at least one strain of bacteria to the particles is 12 hours.

[0033] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения время, достаточное для образования биопленки, составляет от 12 часов до 48 часов. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения время, достаточное для образования биопленки, составляет 12 часов. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения время, достаточное для образования биопленки, составляет 14 часов. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения время, достаточное для образования биопленки, составляет 16 часов. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения время, достаточное для образования биопленки, составляет 18 часов. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения время, достаточное для образования биопленки, составляет 20 часов. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения время, достаточное для образования биопленки, составляет 22 часа. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения время, достаточное для образования биопленки, составляет 24 часа. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения время, достаточное для образования биопленки, составляет 26 часов Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения время, достаточное для образования биопленки, составляет 28 часов Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения время, достаточное для образования биопленки, составляет 30 часов. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения время, достаточное для образования биопленки, составляет 32 часа. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения время, достаточное для образования биопленки, составляет 34 часа. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения время, достаточное для образования биопленки, составляет 36 часов. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения время, достаточное для образования биопленки, составляет 38 часов. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения время, достаточное для образования биопленки, составляет 40 часов. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения время, достаточное для образования биопленки, составляет 42 часа. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения время, достаточное для образования биопленки, составляет 44 часа. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения время, достаточное для образования биопленки, составляет 46 часов. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения время, достаточное для образования биопленки, составляет 48 часов.[0033] According to some embodiments of the present invention, the time sufficient for the formation of a biofilm is from 12 hours to 48 hours. According to some embodiments of the present invention, the time sufficient for the formation of a biofilm is 12 hours. According to some variants of implementation of the present invention, the time sufficient for the formation of a biofilm is 14 hours. According to some embodiments of the present invention, the time sufficient for the formation of a biofilm is 16 hours. According to some variants of implementation of the present invention, the time sufficient for the formation of a biofilm is 18 hours. According to some embodiments of the present invention, the time sufficient for the formation of a biofilm is 20 hours. According to some embodiments of the present invention, the time sufficient for the formation of a biofilm is 22 hours. According to some variants of implementation of the present invention, the time sufficient for the formation of a biofilm is 24 hours. According to some embodiments of the present invention, the time sufficient for the formation of a biofilm is 26 hours. In some embodiments of the present invention, the time sufficient for the formation of a biofilm is 28 hours. According to some embodiments of the present invention, the time sufficient for the formation of a biofilm is 30 hours. According to some embodiments of the present invention, the time sufficient for the formation of a biofilm is 32 hours. According to some variants of implementation of the present invention, the time sufficient for the formation of a biofilm is 34 hours. According to some embodiments of the present invention, the time sufficient for the formation of a biofilm is 36 hours. According to some embodiments of the present invention, the time sufficient for the formation of a biofilm is 38 hours. According to some variants of implementation of the present invention, the time sufficient for the formation of a biofilm is 40 hours. According to some embodiments of the present invention, the time sufficient for the formation of a biofilm is 42 hours. According to some embodiments of the present invention, the time sufficient for the formation of a biofilm is 44 hours. According to some embodiments of the present invention, the time sufficient for the formation of a biofilm is 46 hours. According to some embodiments of the present invention, the time sufficient for the formation of a biofilm is 48 hours.

[0034] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения популяцию по меньшей мере одного штамма бактерий, прикрепленную к частицам, культивируют в среде для роста в проточных условиях. В настоящей заявке термин «проточные условия» означает движение культуральной среды относительно бактерий, прикрепленных к поверхности, причем движение культуральной среды оказывает на бактерии усилие сдвига.[0034] According to some embodiments of the present invention, the population of at least one bacterial strain attached to the particles is cultured in a growth medium under flow conditions. In this application, the term "flow conditions" means the movement of the culture medium relative to bacteria attached to the surface, and the movement of the culture medium exerts a shear force on the bacteria.

[0035] Не ограничиваясь какой-либо конкретной теорией, считают, что культивирование популяции по меньшей мере одного штамма бактерий, прикрепленной к частицам, в проточных условиях создает даже слабые усилия сдвига в отношении растущей биопленки и усиливает быстрое образование биопленки (например, в течение более короткого периода времени по сравнению с типичными способами стационарного роста). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения проточная система обеспечивает введение свежей культуральной среды в растущую биопленку и удаление отходов бактерий.[0035] Without wishing to be bound by any particular theory, it is believed that culturing a population of at least one bacterial strain attached to particles under flow conditions creates even low shear forces on the growing biofilm and enhances rapid biofilm formation (e.g., for more than a short period of time compared to typical steady-state growth methods). In some embodiments of the present invention, the flow system provides for the introduction of fresh culture medium into the growing biofilm and removal of bacterial waste.

[0036] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения проточные условия включают скорость потока, составляющую от 10 мл/час до 100 мл/час. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения проточные условия включают скорость потока, составляющую 20 мл/час. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения проточные условия включают скорость потока, составляющую 30 мл/час. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения проточные условия включают скорость потока, составляющую 40 мл/час. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения проточные условия включают скорость потока, составляющую 50 мл/час. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения проточные условия включают скорость потока, составляющую 60 мл/час. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения проточные условия включают скорость потока, составляющую 70 мл/час. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения проточные условия включают скорость потока, составляющую 80 мл/час. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения проточные условия включают скорость потока, составляющую 90 мл/час. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения проточные условия включают скорость потока, составляющую 100 мл/час. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения проточные условия включают скорость потока, составляющую 10 мл/час.[0036] According to some embodiments of the present invention, flow conditions include a flow rate of 10 ml/hour to 100 ml/hour. In some embodiments of the present invention, flow conditions include a flow rate of 20 ml/hr. In some embodiments of the present invention, flow conditions include a flow rate of 30 ml/hr. In some embodiments of the present invention, flow conditions include a flow rate of 40 ml/hr. In some embodiments of the present invention, flow conditions include a flow rate of 50 ml/hr. In some embodiments of the present invention, flow conditions include a flow rate of 60 ml/hr. In some embodiments of the present invention, flow conditions include a flow rate of 70 ml/hr. In some embodiments of the present invention, flow conditions include a flow rate of 80 ml/hour. In some embodiments of the present invention, flow conditions include a flow rate of 90 ml/hr. In some embodiments of the present invention, flow conditions include a flow rate of 100 ml/hr. In some embodiments of the present invention, flow conditions include a flow rate of 10 ml/hr.

[0037] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения проточные условия включают встряхивание культуры бактерий при от 90 до 150 об./мин. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения проточные условия включают встряхивание культуры бактерий при 100 об./мин. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения проточные условия включают встряхивание культуры бактерий при 110 об./мин. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения проточные условия включают встряхивание культуры бактерий при 120 об./мин. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения проточные условия включают встряхивание культуры бактерий при 130 об./мин. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения проточные условия включают встряхивание культуры бактерий при 140 об./мин. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения проточные условия включают встряхивание культуры бактерий при 150 об./мин.[0037] According to some embodiments of the present invention, flow conditions include shaking the bacterial culture at 90 to 150 rpm. In some embodiments of the present invention, flow conditions include shaking the bacterial culture at 100 rpm. In some embodiments of the present invention, flow conditions include shaking the bacterial culture at 110 rpm. In some embodiments of the present invention, flow conditions include shaking the bacteria culture at 120 rpm. In some embodiments of the present invention, the flow conditions include shaking the bacterial culture at 130 rpm. In some embodiments of the present invention, flow conditions include shaking the bacterial culture at 140 rpm. In some embodiments of the present invention, flow conditions include shaking the bacterial culture at 150 rpm.

[0038] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения культивирование популяции по меньшей мере одного штамма бактерий, прикрепленной к частицам, в проточных условиях приводит к получению прочной и здоровой биопленки в течение более короткого периода времени по сравнению с типичными способами (например, но не ограничиваясь указанными, в течение периода времени, меньшего на 5, 10, 20, 25, 50%). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полученная в результате биопленка характеризуется увеличенной устойчивостью к жестким условиям по сравнению с другими способами культивирования и более подробно описана ниже.[0038] According to some embodiments of the present invention, culturing a population of at least one bacterial strain attached to the particles under flow conditions results in a strong and healthy biofilm in a shorter period of time compared to typical methods (for example, but not limited to these , for a period of time less than 5, 10, 20, 25, 50%). In some embodiments of the present invention, the resulting biofilm has increased resistance to harsh conditions compared to other culture methods and is described in more detail below.

[0039] На Фиг. 1 представлен пример иллюстративного варианта реализации настоящего изобретения, который демонстрирует проточную систему согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения. На Фиг. 1 система содержит контейнер, содержащий твердые частицы для культивирования биопленки, источник среды для роста, трубки, по которым среда для роста поступает в контейнер и из контейнера, и насос, который перемещает среду по трубкам. Жидкость, которая выходит из контейнера, может возвращаться в резервуар со средой для повторного использования либо может вытекать. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения данная проточная система может являться закрытой, открытой или полузакрытой. Стрелки, направленные по часовой стрелке на Фиг. 1, представляют направление потока и предназначены исключительно для целей иллюстрации.[0039] In FIG. 1 is an example of an illustrative embodiment of the present invention that demonstrates a flow system according to some embodiments of the present invention. On FIG. 1, the system includes a container containing biofilm culturing solids, a source of growth medium, tubes that carry the growth medium into and out of the container, and a pump that moves the medium through the tubes. Fluid that exits the container may be returned to the medium reservoir for reuse, or may leak out. According to some variants of implementation of the present invention, this flow system may be closed, open or semi-closed. Arrows pointing clockwise in Fig. 1 represent the direction of flow and are for illustration purposes only.

[0040] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения популяцию по меньшей мере одного штамма бактерий, прикрепленную к частицам, культивируют в среде для роста в статических условиях. В настоящей заявке термин «статические условия» означает условия культивирования, в которых в отношении бактерий не оказывается усилие сдвига.[0040] According to some embodiments of the present invention, the population of at least one bacterial strain attached to the particles is cultured in a growth medium under static conditions. In the present application, the term "static conditions" means culture conditions in which no shear force is applied to the bacteria.

[0041] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения популяцию по меньшей мере одного штамма бактерий, прикрепленную к частицам, сначала культивируют в среде для роста в статических условиях, а затем культивируют в среде для роста в проточных условиях.[0041] According to some embodiments of the present invention, the population of at least one bacterial strain attached to the particles is first cultured in a growth medium under static conditions, and then cultured in a growth medium under flow conditions.

[0042] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения популяцию по меньшей мере одного штамма бактерий, прикрепленную к частицам, культивируют в анаэробных условиях. В настоящей заявке термин «анаэробные условия» означает условия культивирования, включающие отсутствие свободного или связанного кислорода.[0042] According to some embodiments of the present invention, the population of at least one bacterial strain attached to the particles is cultured under anaerobic conditions. In this application, the term "anaerobic conditions" means cultivation conditions, including the absence of free or bound oxygen.

[0043] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения популяцию по меньшей мере одного штамма бактерий, прикрепленную к частицам, культивируют в аэробных условиях. В настоящей заявке термин «аэробные условия» означает условия культивирования, включающие присутствие свободного или связанного кислорода.[0043] According to some embodiments of the present invention, the population of at least one bacterial strain attached to the particles is cultured under aerobic conditions. In this application, the term "aerobic conditions" means cultivation conditions, including the presence of free or bound oxygen.

ЧастицыParticles

[0044] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения частицы являются пористыми и выбраны из группы, состоящей из: семян, дикальция фосфата, глины, песка и целлюлозы.[0044] According to some embodiments of the present invention, the particles are porous and are selected from the group consisting of: seeds, dicalcium phosphate, clay, sand, and cellulose.

[0045] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения семена выбирают из группы, состоящей из: семян граната и семян страстоцвета съедобного. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения семена являются измельченными.[0045] According to some embodiments of the present invention, the seeds are selected from the group consisting of: pomegranate seeds and edible passion flower seeds. According to some variants of implementation of the present invention, the seeds are crushed.

[0046] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения частицы целлюлозы включают целлюлозу, продаваемую под торговой маркой AVICEL®. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения частицы целлюлозы включают целлюлозу, продаваемую под торговой маркой SOLKA®.[0046] According to some embodiments of the present invention, the cellulose particles include cellulose sold under the brand name AVICEL®. In some embodiments of the present invention, the cellulose particles include cellulose sold under the trademark SOLKA®.

[0047] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения в способе для образования биопленки согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения используют множество частиц. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения диаметр частиц варьирует от 5 микрон до 1 см. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения диаметр частиц составляет 5 микрон. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения диаметр частиц составляет 10 микрон. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения диаметр частиц составляет 15 микрон. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения диаметр частиц составляет 20 микрон. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения диаметр частиц составляет 30 микрон. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения диаметр частиц составляет 40 микрон. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения диаметр частиц составляет 50 микрон. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения диаметр частиц составляет 60 микрон. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения диаметр частиц составляет 70 микрон. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения диаметр частиц составляет 80 микрон. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения диаметр частиц составляет 90 микрон. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения диаметр частиц составляет 100 микрон. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения диаметр частиц составляет 200 микрон. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения диаметр частиц составляет 300 микрон. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения диаметр частиц составляет 400 микрон. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения диаметр частиц составляет 500 микрон. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения диаметр частиц составляет 600 микрон. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения диаметр частиц составляет 700 микрон. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения диаметр частиц составляет 800 микрон. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения диаметр частиц составляет 900 микрон. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения диаметр частиц составляет 1 см.[0047] According to some embodiments of the present invention, the method for forming a biofilm according to some embodiments of the present invention uses a plurality of particles. In some embodiments of the present invention, the particle diameter ranges from 5 microns to 1 cm. In some embodiments of the present invention, the particle diameter is 5 microns. In some embodiments of the present invention, the particle diameter is 10 microns. In some embodiments of the present invention, the particle diameter is 15 microns. In some embodiments of the present invention, the particle diameter is 20 microns. In some embodiments of the present invention, the particle diameter is 30 microns. In some embodiments of the present invention, the particle diameter is 40 microns. In some embodiments of the present invention, the particle diameter is 50 microns. In some embodiments of the present invention, the particle diameter is 60 microns. In some embodiments of the present invention, the particle diameter is 70 microns. In some embodiments of the present invention, the particle diameter is 80 microns. In some embodiments of the present invention, the particle diameter is 90 microns. In some embodiments of the present invention, the particle diameter is 100 microns. In some embodiments of the present invention, the particle diameter is 200 microns. In some embodiments of the present invention, the particle diameter is 300 microns. In some embodiments of the present invention, the particle diameter is 400 microns. In some embodiments of the present invention, the particle diameter is 500 microns. In some embodiments of the present invention, the particle diameter is 600 microns. In some embodiments of the present invention, the particle diameter is 700 microns. In some embodiments of the present invention, the particle diameter is 800 microns. In some embodiments of the present invention, the particle diameter is 900 microns. According to some embodiments of the present invention, the particle diameter is 1 cm.

Штаммы бактерийBacteria strains

[0048] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения популяция, содержащая по меньшей мере один штамм бактерий, получена из флоры кишечника.[0048] According to some variants of implementation of the present invention, the population containing at least one strain of bacteria obtained from the intestinal flora.

[0049] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения популяция, содержащая по меньшей мере один штамм бактерий, представляет собой пробиотический штамм. В настоящей заявке термин «пробиотический» означает штамм бактерий, который стимулирует рост микроорганизмов, в особенности таковых с полезными свойствами (таких как таковые флоры кишечника).[0049] According to some embodiments of the present invention, the population containing at least one bacterial strain is a probiotic strain. In this application, the term "probiotic" means a strain of bacteria that stimulates the growth of microorganisms, especially those with beneficial properties (such as those of the intestinal flora).

[0050] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения популяция, содержащая по меньшей мере один штамм бактерий, представляет собой Lactobacillus plantarum.[0050] According to some embodiments of the present invention, the population containing at least one bacterial strain is Lactobacillus plantarum.

[0051] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения популяция, содержащая по меньшей мере один штамм бактерий, представляет собой Acetobacter pomorum.[0051] According to some embodiments of the present invention, the population containing at least one bacterial strain is Acetobacter pomorum.

[0052] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения биопленка, образованная в результате способа, выполнена с возможностью рН-зависимого направленного высвобождения бактериальной биопленки в желудочно-кишечном тракте.[0052] According to some embodiments of the present invention, the biofilm formed as a result of the method is configured to pH-dependent targeted release of the bacterial biofilm in the gastrointestinal tract.

[0053] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения биопленка содержит два или более штаммов бактерий.[0053] According to some embodiments of the present invention, the biofilm contains two or more strains of bacteria.

[0054] На Фиг. 2А представлены изображения некоторых иллюстративных вариантов реализации биопленок, полученных посредством способов согласно настоящему изобретению. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения были исследованы несколько типов твердых частиц, подходящих для выращивания пробиотических бактерий, и результаты представлены в настоящей заявке. На Фиг. 2А представлены электронно-микроскопические изображения биопленки Lactobacillus plantarum, выращенной на различных твердых частицах, таких как, например, семена страстоцвета съедобного, измельченные семена граната, бентонитовая глина, частицы песка, белая глина, волокна SOLKA, дикальция фосфат (ДКФ), AVICEL. За исключением белой глины, бактерии росли на всех типах частиц.[0054] In FIG. 2A depicts some illustrative embodiments of biofilms obtained by the methods of the present invention. In some embodiments of the present invention, several types of solid particles suitable for growing probiotic bacteria have been investigated and the results are presented in this application. On FIG. 2A shows electron microscopic images of a Lactobacillus plantarum biofilm grown on various particulate matter such as, for example, passion flower seeds, crushed pomegranate seeds, bentonite clay, sand particles, white clay, SOLKA fibres, dicalcium phosphate (DCP), AVICEL. With the exception of white clay, bacteria grew on all types of particles.

[0055] На Фиг. 2В представлены изображения некоторых иллюстративных вариантов реализации биопленок, полученных посредством способов согласно настоящему изобретению, демонстрирующие рост биопленки Acetobacter pomorum на измельченных семенах страстоцвета съедобного, измельченных семенах граната и песке. Acetobacter pomorum рос и образовывал биопленку на семенах граната. Однако на песке наблюдался весьма незначительный рост. Acetobacter pomorum не рос на семенах страстоцвета съедобного. Другие исследованные виды бактерий, например, Pseudomonas spp, не росли на исследованных твердых частицах, как показано на Фиг. 2С.[0055] In FIG. 2B are images of some illustrative embodiments of biofilms produced by the methods of the present invention, showing the growth of an Acetobacter pomorum biofilm on crushed passion flower seeds, crushed pomegranate seeds, and sand. Acetobacter pomorum grew and formed a biofilm on pomegranate seeds. However, very little growth was observed on the sand. Acetobacter pomorum did not grow on the seeds of the edible passion flower. Other bacterial species tested, such as Pseudomonas spp, did not grow on the tested particulate matter, as shown in FIG. 2C.

[0056] Не опираясь на какую-либо теорию, считают, что различные частицы обеспечивают различимые варианты микроокружения для бактерий, растущих на данных частицах, такие как размер пор, неровность поверхности, питательные вещества, доступные в частицах, вязкость, заряд поверхности и т.д., которые могут оказывать влияние на способность различных бактерий прикрепляться и расти на различных видах частиц.[0056] Without being bound by any theory, it is believed that different particles provide distinct microenvironments for bacteria growing on these particles, such as pore size, surface roughness, nutrients available in the particles, viscosity, surface charge, etc. which can affect the ability of different bacteria to attach and grow on different kinds of particles.

[0057] Согласно некоторым вариантам реализации способов согласно настоящему изобретению способ[0057] In some embodiments of the methods of the present invention, the method

[0058] позволяет получить биопленку, содержащую по меньшей мере два штамма пробиотических бактерий (например, но не ограничиваясь указанными, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 и т.д.), причем биопленку получают с применением комбинации по меньшей мере двух различных частиц (например, но не ограничиваясь указанными, семян страстоцвета съедобного, измельченных семян граната и т.д.). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения для получения таких комбинаций условия роста (и, например, но не ограничиваясь указанными, тип частицы или частиц) выбирают в соответствии со штаммом (штаммами), применяемыми при получении биопленки. Согласно иллюстративному варианту реализации настоящего изобретения, если два штамма бактерий будут в конечном итоге объединены для получения биопленки, каждый из штаммов бактерий будут выращивать с применением частицы, наилучшим образом подходящей для роста каждого штамма. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, когда два или более штаммов бактерий растут отдельно, штаммы бактерий объединяют в ходе процесса инкапсуляции.[0058] allows to obtain a biofilm containing at least two strains of probiotic bacteria (for example, but not limited to, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, etc.), and the biofilm is obtained using a combination of at least two different particles (for example, but not limited to, passion flower seeds, crushed pomegranate seeds, etc.). According to some embodiments of the present invention, to obtain such combinations, the growth conditions (and, for example, but not limited to, the type of particle or particles) are selected in accordance with the strain (s) used in obtaining the biofilm. According to an exemplary embodiment of the present invention, if two bacterial strains are eventually combined to form a biofilm, each of the bacterial strains will be grown using the particle best suited for the growth of each strain. In some embodiments of the present invention, when two or more bacterial strains grow separately, the bacterial strains are combined during the encapsulation process.

ЛечениеTreatment

[0059] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения биопленку вводят животному, которое нуждается в таком введении, чтобы биопленка колонизировала кишку животного.[0059] According to some embodiments of the present invention, the biofilm is administered to an animal in need of such an administration for the biofilm to colonize the gut of the animal.

[0060] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения биопленка, содержащая популяцию по меньшей мере одного штамма бактерий, прикрепленную к частицам, инкапсулирована соединением, приспособленным для высвобождения по меньшей мере одного штамма бактерий при рН, обнаруженном в кишечнике животного.[0060] According to some embodiments of the present invention, a biofilm containing a population of at least one bacterial strain attached to the particles is encapsulated with a compound adapted to release the at least one bacterial strain at the pH found in the intestine of the animal.

[0061] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения соединение, приспособленное для высвобождения по меньшей мере одного штамма бактерий при рН, обнаруженном в кишечнике животного, представляет собой альгинат.[0061] According to some embodiments of the present invention, a compound adapted to release at least one bacterial strain at the pH found in the intestine of an animal is an alginate.

[0062] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения значение рН, обнаруженное в кишечнике животного, составляет рН 8.[0062] According to some embodiments of the present invention, the pH value found in the intestine of the animal is pH 8.

[0063] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения биопленку вводят животному, которое нуждается в таком введении, в количестве, достаточном для колонизации кишечника. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения колонизацию подтверждают на основании наличия по меньшей мере одной популяции бактерий, присутствующей в фекалиях животного в течение по меньшей мере 5 дней после введения.[0063] According to some embodiments of the present invention, the biofilm is administered to an animal in need of such administration in an amount sufficient to colonize the intestine. In some embodiments of the present invention, colonization is confirmed based on the presence of at least one bacterial population present in the animal's faeces for at least 5 days after administration.

[0064] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения колонизирующие бактерии, полученные из биопленки, могут населять кишку млекопитающего в течение по меньшей мере одной недели (например, но не ограничиваясь указанными, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 и т.д. недель). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения колонизирующие бактерии, полученные из биопленки, являются устойчивыми в кишечнике млекопитающего, т.е. не гибнут через 3 дня.[0064] According to some embodiments of the present invention, biofilm-derived colonizing bacteria can inhabit the gut of a mammal for at least one week (for example, but not limited to, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 , 10, etc. weeks). In some embodiments of the present invention, biofilm-derived colonizing bacteria are persistent in the mammalian gut, i.e. do not die after 3 days.

[0065] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения количество, достаточное для колонизации кишечника, составляет от 2×10⁴ до 2×10⁹ бактерий в день в течение от 1 до 5 дней. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения количество, достаточное для колонизации кишечника, составляет от 2×10⁴ до 2×10⁶ бактерий в день в течение от 1 до 5 дней.[0065] According to some variants of implementation of the present invention, the amount sufficient for colonization of the intestine is from 2x10 ⁴ to 2x10 ⁹ bacteria per day for 1 to 5 days. According to some variants of implementation of the present invention, the amount sufficient for colonization of the intestine is from 2×10 ⁴ to 2×10 ⁶ bacteria per day for 1 to 5 days.

[0066] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения количество, достаточное для колонизации кишечника, составляет 2×10⁴ бактерий в день в течение 5 дней.[0066] According to some variants of implementation of the present invention, the amount sufficient for colonization of the intestine is 2×10 ⁴ bacteria per day for 5 days.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения количество, достаточное для колонизации кишечника, составляет 2×10⁵ бактерий в день в течение 5 дней. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения количество, достаточное для колонизации кишечника, составляет 2×10⁶ бактерий в день в течение 5 дней. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения количество, достаточное для колонизации кишечника, составляет 2×10⁷ бактерий в день в течение 5 дней. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения количество, достаточное для колонизации кишечника, составляет 2×10⁸ бактерий в день в течение 5 дней. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения количество, достаточное для колонизации кишечника, составляет 2×10⁹ бактерий в день в течение 5 дней.According to some variants of implementation of the present invention, the amount sufficient for colonization of the intestine is 2×10 ⁵ bacteria per day for 5 days. According to some variants of implementation of the present invention, the amount sufficient for colonization of the intestine is 2×10 ⁶ bacteria per day for 5 days. According to some variants of implementation of the present invention, the amount sufficient for colonization of the intestine is 2×10 ⁷ bacteria per day for 5 days. According to some variants of implementation of the present invention, the amount sufficient for colonization of the intestine is 2×10 ⁸ bacteria per day for 5 days. According to some variants of implementation of the present invention, the amount sufficient for colonization of the intestine is 2×10 ⁹ bacteria per day for 5 days.

[0067] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения количество, достаточное для колонизации кишечника, составляет 2×10⁴ бактерий в день в течение 4 дней. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения количество, достаточное для колонизации кишечника, составляет 2×10⁵ бактерий в день в течение 4 дней. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения количество, достаточное для колонизации кишечника, составляет 2×10⁶ бактерий в день в течение 4 дней. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения количество, достаточное для колонизации кишечника, составляет 2×10⁷ бактерий в день в течение 4 дней. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения количество, достаточное для колонизации кишечника, составляет 2×10⁸ бактерий в день в течение 4 дней. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения количество, достаточное для колонизации кишечника, составляет 2×10⁹ бактерий в день в течение 4 дней.[0067] According to some variants of implementation of the present invention, the amount sufficient for colonization of the intestine is 2×10 ⁴ bacteria per day for 4 days. According to some variants of implementation of the present invention, the amount sufficient for colonization of the intestine is 2×10 ⁵ bacteria per day for 4 days. According to some variants of implementation of the present invention, the amount sufficient for colonization of the intestine is 2×10 ⁶ bacteria per day for 4 days. According to some variants of implementation of the present invention, the amount sufficient for colonization of the intestine is 2×10 ⁷ bacteria per day for 4 days. In some embodiments of the present invention, the amount sufficient to colonize the intestine is 2×10 ⁸ bacteria per day for 4 days. According to some variants of implementation of the present invention, the amount sufficient for colonization of the intestine is 2×10 ⁹ bacteria per day for 4 days.

[0068] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения количество, достаточное для колонизации кишечника, составляет 2×10⁴ бактерий в день в течение 3 дней. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения количество, достаточное для колонизации кишечника, составляет 2×10⁵ бактерий в день в течение 3 дней. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения количество, достаточное для колонизации кишечника, составляет 2×10⁶ бактерий в день в течение 3 дней. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения количество, достаточное для колонизации кишечника, составляет 2×10⁷ бактерий в день в течение 3 дней. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения количество, достаточное для колонизации кишечника, составляет 2×10⁸ бактерий в день в течение 3 дней. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения количество, достаточное для колонизации кишечника, составляет 2×10⁹ бактерий в день в течение 3 дней.[0068] According to some variants of implementation of the present invention, the amount sufficient for colonization of the intestine is 2×10 ⁴ bacteria per day for 3 days. According to some variants of implementation of the present invention, the amount sufficient for colonization of the intestine is 2×10 ⁵ bacteria per day for 3 days. According to some variants of implementation of the present invention, the amount sufficient for colonization of the intestine is 2×10 ⁶ bacteria per day for 3 days. According to some variants of implementation of the present invention, the amount sufficient for colonization of the intestine is 2×10 ⁷ bacteria per day for 3 days. According to some variants of implementation of the present invention, the amount sufficient for colonization of the intestine is 2×10 ⁸ bacteria per day for 3 days. According to some variants of implementation of the present invention, the amount sufficient for colonization of the intestine is 2×10 ⁹ bacteria per day for 3 days.

[0069] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения количество, достаточное для колонизации кишечника, составляет 2×10⁴ бактерий в день в течение 2 дней. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения количество, достаточное для колонизации кишечника, составляет 2×10⁵ бактерий в день в течение 2 дней. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения количество, достаточное для колонизации кишечника, составляет 2×10⁶ бактерий в день в течение 2 дней. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения количество, достаточное для колонизации кишечника, составляет 2×10⁷ бактерий в день в течение 2 дней. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения количество, достаточное для колонизации кишечника, составляет 2×10⁸ бактерий в день в течение 2 дней. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения количество, достаточное для колонизации кишечника, составляет 2×10⁹ бактерий в день в течение 2 дней.[0069] According to some variants of implementation of the present invention, the amount sufficient for colonization of the intestine is 2×10 ⁴ bacteria per day for 2 days. According to some variants of implementation of the present invention, the amount sufficient for colonization of the intestine is 2×10 ⁵ bacteria per day for 2 days. According to some variants of implementation of the present invention, the amount sufficient for colonization of the intestine is 2×10 ⁶ bacteria per day for 2 days. According to some variants of implementation of the present invention, the amount sufficient for colonization of the intestine is 2×10 ⁷ bacteria per day for 2 days. According to some variants of implementation of the present invention, the amount sufficient for colonization of the intestine is 2×10 ⁸ bacteria per day for 2 days. According to some variants of implementation of the present invention, the amount sufficient for colonization of the intestine is 2×10 ⁹ bacteria per day for 2 days.

[0070] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения количество, достаточное для колонизации кишечника, составляет 2×10⁴ бактерий в день в течение 1 дня. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения количество, достаточное для колонизации кишечника, составляет 2×10⁵ бактерий в день в течение 1 дня. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения количество, достаточное для колонизации кишечника, составляет 2×10⁶ бактерий в день в течение 1 дня. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения количество, достаточное для колонизации кишечника, составляет 2×10⁷ бактерий в день в течение 1 дня. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения количество, достаточное для колонизации кишечника, составляет 2×10⁸ бактерий в день в течение 1 дня. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения количество, достаточное для колонизации кишечника, составляет 2×10⁹ бактерий в день в течение 1 дня.[0070] According to some embodiments of the present invention, the amount sufficient to colonize the intestine is 2×10 ⁴ bacteria per day for 1 day. According to some variants of implementation of the present invention, the amount sufficient for colonization of the intestine is 2×10 ⁵ bacteria per day for 1 day. According to some variants of implementation of the present invention, the amount sufficient for colonization of the intestine is 2×10 ⁶ bacteria per day for 1 day. According to some variants of implementation of the present invention, the amount sufficient for colonization of the intestine is 2×10 ⁷ bacteria per day for 1 day. In some embodiments of the present invention, the amount sufficient to colonize the intestine is 2×10 ⁸ bacteria per day for 1 day. According to some variants of implementation of the present invention, the amount sufficient for colonization of the intestine is 2×10 ⁹ bacteria per day for 1 day.

[0071] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения достаточное количество вводят на одной частице. В качестве альтернативы, достаточное количество вводят на множестве частиц.[0071] According to some embodiments of the present invention, a sufficient amount is administered per particle. Alternatively, a sufficient amount is administered on a plurality of particles.

[0072] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения достаточное количество смешивают с пищей и проглатывают.[0072] According to some embodiments of the present invention, a sufficient amount is mixed with food and swallowed.

[0073] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения биопленку вводят животному немедленно после культивирования биопленки. В качестве альтернативы, биопленку можно хранить перед введением. Биопленку можно хранить в замороженном состоянии или, в качестве альтернативы, в лиофилизированной форме.[0073] According to some embodiments of the present invention, the biofilm is administered to the animal immediately after culturing the biofilm. Alternatively, the biofilm may be stored prior to administration. The biofilm can be stored frozen or, alternatively, in lyophilized form.

[0074] Теперь приводится ссылка на следующие примеры, которые вместе с приведенным выше описанием неограничивающим способом иллюстрируют некоторые варианты реализации настоящего изобретения.[0074] Reference is now made to the following examples, which, together with the above description, illustrate some embodiments of the present invention in a non-limiting manner.

ПримерыExamples

Пример 1: Устойчивость биопленки согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения к кислотеExample 1 Biofilm Acid Resistance of Some Embodiments of the Invention

[0075] Исследовали устойчивость биопленки, выросшей на твердых частицах в проточной системе, как описано выше. Более конкретно, первый исследованный параметр представлял собой устойчивость к кислоте; результаты представлены на Фиг. 3.[0075] Studied the stability of the biofilm grown on solid particles in the flow system, as described above. More specifically, the first parameter investigated was acid resistance; the results are presented in Fig. 3.

[0076] Матрицу граната, вымоченную в 25% среде MRS (чтобы способствовать образованию биопленки, использовали условия голодания (т.е. менее 100% концентрации среды для роста)), инокулировали культурой L. plantarum в течение ночи в контейнере для матрицы и оставляли еще на 2,5 часа (т.е. без перемешивания), а затем инициировали проточную систему. Среду перемещали из резервуара со средой в контейнер для матрицы с применением перистальтического насоса со скоростью 12 мл/час в течение 5 дней. Среду повторно не использовали. Свежая среда поступала в культуру, и из выходного отверстия вытекала использованная среда. В качестве контроля использовали бактерии, выросшие планктонным способом (т.е. не прикрепленные к частицам), что приводило к отсутствию образования биопленки. В случае планктонного контроля 6 мл 100% бульона MRS инокулировали 4-5 колониями L. plantarum и оставляли в инкубаторе при температуре 37°С в течение ночи.[0076] A pomegranate matrix soaked in 25% MRS medium (fasting conditions (i.e., less than 100% growth medium concentration) were used to promote biofilm formation) was inoculated with an L. plantarum culture overnight in the matrix container and left for another 2.5 hours (i.e. no agitation) and then the flow system was initiated. The medium was transferred from the medium reservoir to the matrix container using a peristaltic pump at a rate of 12 ml/hour for 5 days. The medium was not reused. Fresh medium entered the culture and used medium flowed out of the outlet. Bacteria grown planktonically (i.e., not attached to the particles) were used as controls, resulting in no biofilm formation. In the case of plankton control, 6 ml of 100% MRS broth was inoculated with 4-5 colonies of L. plantarum and left in an incubator at 37° C. overnight.

[0077] Для исследования устойчивости к кислоте набор флаконов ФБР (фосфатного буферного раствора) с откорректированными с применением НС1 (исходный раствор 0,5 М) повышающимися значениями рН, приготовленный заранее, для получения рН 1, 2, 3, и 2 грамма частиц, содержащих биопленку, переносили во флаконы и инкубировали в течение 1 ч. Затем бактерии промывали в ФБР, и 5 микролитров высевали, как показано на Фиг. 3.[0077] For acid resistance testing, a set of PBS (phosphate buffer) vials adjusted with HC1 (stock solution 0.5 M) increasing pH values prepared in advance to obtain pH 1, 2, 3, and 2 grams of particles, containing biofilm were transferred to vials and incubated for 1 hour. The bacteria were then washed in PBS and 5 microliters were seeded as shown in FIG. 3.

[0078] В случае планктонного контроля из культуры в течение ночи отбирали по 100 мкл во флаконы с рН и инкубировали в течение 1 ч; затем бактерии промывали в ФБР, и 5 микролитров высевали, как показано на Фиг. 3. Как показано на Фиг. 3, бактерии биопленки продемонстрировали большую устойчивость к кислоте, поскольку хорошо выживали при рН 2, тогда как планктонные бактерии не выжили.[0078] In the case of plankton control, 100 μl were taken from the culture overnight into pH flasks and incubated for 1 hour; then the bacteria were washed in PBS and 5 microliters were seeded as shown in FIG. 3. As shown in FIG. 3, biofilm bacteria showed greater resistance to acid as they survived well at pH 2, while planktonic bacteria did not survive.

[0079] Не ограничиваясь какой-либо конкретной теорией, считают, что рН желудка составляет приблизительно рН 2. Таким образом, после введения биопленки субъекту биопленка выживет в условиях желудка субъекта (т.е. рН 2) и колонизирует субъекта.[0079] Without wishing to be bound by any particular theory, the pH of the stomach is believed to be approximately pH 2. Thus, once the biofilm is administered to a subject, the biofilm will survive in the conditions of the subject's stomach (i.e., pH 2) and colonize the subject.

Пример 2: Устойчивость другой биопленки согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения к кислотеExample 2 Acid Resistance of Another Biofilm According to Some Embodiments of the Invention

[0080] Проводили вторую серию экспериментов, в которых была продемонстрирована устойчивость бактерий к кислоте (т.е. в форме биопленки), как описано на Фиг. 4 и показано в Таблицах 1 и 2 ниже.[0080] A second series of experiments was conducted in which bacteria were demonstrated to be acid resistant (ie, in the form of a biofilm) as described in FIG. 4 and shown in Tables 1 and 2 below.

[0081] 7 грамм частиц семян граната (ГРАН), вымоченных в 25% среде MRS (в условиях голодания), инокулировали культурой L. plantarum в течение ночи и оставляли еще в течение 2,5 часов. Затем устанавливали проточную систему в течение 5 дней с применением перистальтического насоса, который перемещал среду при максимальной скорости (приблизительно 380 мл/час). В данном эксперименте среду использовали повторно для сравнения с непроточным/стационарным контролем. В случае планктонного контроля 6 мл 100% бульона MRS инокулировали 4 колониями L. plantarum и оставляли в инкубаторе при температуре 37°С в течение ночи +5 часов.[0081] 7 grams of pomegranate seed particles (GRAN) soaked in 25% MRS medium (under fasting conditions) were inoculated with L. plantarum culture overnight and left for another 2.5 hours. The flow system was then set up for 5 days using a peristaltic pump that moved the medium at maximum speed (approximately 380 ml/h). In this experiment, the medium was reused for comparison with the non-flowing/stationary control. In the case of plankton control, 6 ml of 100% MRS broth was inoculated with 4 colonies of L. plantarum and left in an incubator at 37° C. overnight +5 hours.

Результаты представлены в Таблицах 1 и 2.The results are presented in Tables 1 and 2.

[0082] Как показано на Фиг. 4, планктонные бактерии продемонстрировали уменьшенную выживаемость после воздействия понижающихся значений рН.[0082] As shown in FIG. 4, planktonic bacteria showed reduced survival after exposure to lowering pH values.

Пример 3: Восстановление биопленки согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретенияExample 3 Biofilm Recovery According to Some Embodiments of the Present Invention

[0083] Биопленка, выращенная и захваченная в альгинат, восстанавливалась после высушивания. L. plantarum выращивали в 25 мл 100% MRS + 2 гр. ГРАН в течение 4 дней при комнатной температуре для образования биопленок. В случае планктонного контроля L. plantarum выращивали в 25 мл 100% MRS в течение 4 дней при комнатной темп. Один образец ГРАН + биопленка и контроль высевали на планшеты с MRS в серийных разведениях. Другой образец каждого варианта быстро центрифугировали, ресуспендировали в 5 мл буфера для лиофилизации, лиофилизировали в течение 24 часов и суспендировали в 25 мл MRS. На данной стадии (после лиофилизации, но перед последующим ростом) образцы высевали посредством серийных разведений. Остаток образца оставляли расти в течение дополнительных 48 часов и снова высевали. Как показано на Фиг. 5, бактерии, которые росли на твердых частицах в виде биопленки, продемонстрировали усиленную устойчивость и выживаемость в отношении лиофилизации (т.е. восстановление после высушивания).[0083] Biofilm grown and trapped in alginate recovered after drying. L. plantarum was grown in 25 ml 100% MRS + 2 g. GRAN for 4 days at room temperature for biofilm formation. In the case of planktonic control, L. plantarum was grown in 25 ml of 100% MRS for 4 days at room temp. One GRAN sample + biofilm and control were plated on MRS plates in serial dilutions. Another sample of each variant was rapidly centrifuged, resuspended in 5 ml lyophilization buffer, lyophilized for 24 hours and suspended in 25 ml MRS. At this stage (after lyophilization, but before subsequent growth), the samples were sown by serial dilutions. The remainder of the sample was left to grow for an additional 48 hours and sown again. As shown in FIG. 5, bacteria that grew on biofilm solids showed enhanced resistance and survival to lyophilization (ie, recovery after drying).

Пример 4: Устойчивость клеток DH5a Е. coli к кислотеExample 4 Acid Resistance of E. coli DH5a Cells

[0084] Устойчивость штамма DH5a Е. coli к кислоте исследовали в трех условиях:[0084] Acid resistance of E. coli strain DH5a was tested under three conditions:

1. Планктонные - Е. coli выращивали в 20 мл стартовой LB на шейкере в течение 5 дней при температуре 23°С.1. Planktonic - E. coli were grown in 20 ml starter LB on a shaker for 5 days at 23°C.

2. Биопленка, статические - Е, coli выращивали в 20 мл LB с 2 гр. различных матриц, выращивали в течение 5 дней в статических условиях при температуре 37°С.2. Biofilm, static - E, coli were grown in 20 ml LB with 2 gr. different matrices were grown for 5 days under static conditions at 37°C.

3. Биопленка, проточные - Е. coli выращивали в колонной проточной системе с ДКФ в течение 5 дней при комнатной температуре со скоростью приблизительно 12 мл/час свежей 25% LB. Образцы отбирали сверху колонны (близко к поверхности воздуха) и снизу колонны.3. Biofilm, flow-through - E. coli was grown in a DCP column flow system for 5 days at room temperature at a rate of approximately 12 ml/hour with fresh 25% LB. Samples were taken from the top of the column (close to the air surface) and from the bottom of the column.

[0085] Закваску штамма DH5a Е. coli выращивали в течение ночи при температуре 37°С на шейкере. 100 мкл из закваски переносили в:[0085] E. coli strain DH5a starter was grown overnight at 37° C. on a shaker. 100 µl from the starter was transferred to:

1. 2 гр. Avicel + 20 мл LB - для статической культуры биопленки.1. 2 gr. Avicel + 20 ml LB - for static biofilm culture.

2. 2 гр. волокна Solka + 20 мл LB - для статической культуры биопленки.2. 2 gr. Solka fiber + 20 ml LB - for static biofilm culture.

3. 3 гр. ДКФ + 20 мл LB - для статической культуры биопленки.3. 3 gr. DKF + 20 ml LB - for static biofilm culture.

4. 20 мл LB - для планктонной культуры.4. 20 ml LB - for plankton culture.

[0086] 2 мл закваски в течение ночи переносили в 20 мл LB и инокулировали в колонну проточной системы. Поток прекращали на 2 часа, чтобы позволить Е. coli прикрепиться к ДКФ. Через 2 часа поток включали на 5 дней при комнатной температуре.[0086] 2 ml of the starter was transferred overnight into 20 ml of LB and inoculated into a flow system column. The flow was stopped for 2 hours to allow E. coli to attach to the DCF. After 2 hours, the flow was turned on for 5 days at room temperature.

[0087] Через 5 дней инкубации образец от каждой матрицы для статических экспериментов (ДКФ, Avicel и Solka) и образец от ДКФ сверху колонны и ДКФ снизу колонны отбирали и помещали в пять различных пробирок Eppendorf («эппендорфы»). Образцы аккуратно промывали один раз ФБР.[0087] After 5 days of incubation, a sample from each static matrix (DKP, Avicel and Solka) and a sample from DKP on top of the column and DKP on the bottom of the column were taken and placed in five different Eppendorf tubes (“eppendorfs”). Samples were gently washed once with PBS.

[0088] Из каждого образца в два флакона отбирали следующее количество матрицы:[0088] The following amount of matrix was taken from each sample in two vials:

1. Статические, ДКФ - 0,02 гр.1. Static, DKF - 0.02 gr.

2. Статические, Avicel - 0,03 гр.2. Static, Avicel - 0.03 gr.

3. Статические, Solka - 0,02 гр.3. Static, Solka - 0.02 gr.

4. Проточные, ДКФ, верх - 0,03 гр.4. Flow, DKF, top - 0.03 gr.

5. Проточные, ДКФ, низ - 0,03 гр.5. Flow, DKF, bottom - 0.03 gr.

[0089] Содержимое каждого эппендорфа аккуратно промывали один раз ФБРХ1. Для каждой пары эппендорфов (от каждого образца) добавляли 1 мл ФБРХ1 (рН 7,4) или 1 мл ФБР (рН 2). Эппендорфы инкубировали лежа в течение 1 часа при комнатной темп. Затем эппендорфы центрифугировали при 13000 об./мин в течение 2 мин., супернатант отбрасывали. В каждый эппендорф добавляли 1 мл ФБРХ1, и эппендорфы перемешивали на вортексе при полной мощности в течение 30 сек. для освобождения бактерий от матрицы.[0089] The contents of each eppendorf were gently washed once with PBRH1. For each pair of Eppendorfs (from each sample), 1 ml of PBS1 (pH 7.4) or 1 ml of PBS (pH 2) was added. Eppendorfs were incubated lying down for 1 hour at room temp. The eppendorfs were then centrifuged at 13,000 rpm for 2 minutes, and the supernatant was discarded. 1 ml of PBRH1 was added to each Eppendorf, and the Eppendorfs were vortexed at full power for 30 seconds. to free bacteria from the matrix.

[0090] Обработка планктонной культуры: 1 мл культуры переносили в эппендорф и центрифугировали на полной скорости в течение 2 мин. Супернатант отбрасывали и добавляли 1 мл ФБР. 100 мкл из данной смеси добавляли в:[0090] Treatment of plankton culture: 1 ml of culture was transferred to an eppendorf and centrifuged at full speed for 2 minutes. The supernatant was discarded and 1 ml of PBS was added. 100 µl of this mixture was added to:

1. Эппендорф с 1 мл ФБРХ1 (рН 7,4)1. Eppendorf with 1 ml PBRH1 (pH 7.4)

2. Эппендорф с 1 мл ФБР (рН 2)2. Eppendorf with 1 ml PBS (pH 2)

[0091] Эппендорфы инкубировали в течение 1 часа при комнатной темп.лежа, и после данной инкубации осуществляли центрифугирование при 13000 об./мин. в течение 2 мин. В каждый эппендорф добавляли 100 мкл ФБРХ1.[0091] Eppendorfs were incubated for 1 hour at room temperature lying down, and after this incubation, centrifugation was performed at 13,000 rpm. within 2 min. 100 μl of PBRH1 was added to each Eppendorf.

Определение количества жизнеспособных организмов:Determining the number of viable organisms:

[0092] 10 мкл из каждого эппендорфа переносили в 90 мкл ФБРХ1. Проводили семь серийных разведений в соотношении 1:10. 3 мкл из каждого разведения высевали на планшете с LB и оставляли в инкубаторе в течение ночи.[0092] 10 μl from each eppendorf was transferred into 90 μl of PBRH1. Spent seven serial dilutions in a ratio of 1:10. 3 μl of each dilution was seeded onto an LB plate and left in the incubator overnight.

[0093] Расчеты являлись следующими для сохранения размерности «бактерий/мл» для планктонных бактерий или «бактерий/гр.»:[0093] The calculations were as follows to preserve the dimension "bacteria/mL" for planktonic bacteria or "bacteria/g":

[0094] Для матриц: Количество колоний X 10^{количество разведений}Х333,33Х(1/отобранных гр.)[0094] For matrices: Number of colonies X 10 ^{number of dilutions} X333.33X (1/g selected)

[0095] Для планктонных: Количество колоний X10 ^{количество разведений}X333,3[0095] For planktonic: Number of colonies X10 ^{number of dilutions} X333.3

[0096] В данном эксперименте все материалы автоклавировали для стерилизации. Результаты, представленные в таблицах ниже и на Фиг. 6, демонстрируют, что биопленка увеличивала устойчивость бактерий к кислоте в статических условиях и демонстрировала большее увеличение в проточных условиях.[0096] In this experiment, all materials were autoclaved for sterilization. The results presented in the tables below and in Fig. 6 demonstrate that the biofilm increased bacterial acid resistance under static conditions and showed a greater increase under flow conditions.

Пример 5: Колонизация кишечника мышей с применением композиции согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретенияExample 5: Colonization of the intestines of mice using a composition according to some embodiments of the present invention

[0097] Для исследования того, будут ли бактерии, выросшие в форме биопленки, демонстрировать увеличенную способность колонизировать кишку, получали биопленку, как описано выше, и биопленкой кормили бестимусных мышей. Исследовали присутствие бактерий в фекалиях мышей. Результаты представлены на Фиг. 7. [0097] To investigate whether bacteria grown in the form of a biofilm would show an increased ability to colonize the gut, a biofilm was prepared as described above and the biofilm was fed to nude mice. Investigated the presence of bacteria in the faeces of mice. The results are presented in Fig. 7.

Протокол:Protocol:

1. 6 безмикробных мышей1. 6 germ free mice

2. Биопленка Lactobacillus plantarum, выросшая на матрице.2. Biofilm of Lactobacillus plantarum grown on a matrix.

3. Исключительно измельченная пища для мышей, перемешанная со стерильной матрицей (совместное измельчение).3. Exclusively ground mouse food mixed with a sterile matrix (co-grinding).

4. Измельченная пища для мышей, перемешанная с биопленкой L. plantarum на матрице (совместное измельчение).4. Grinded mouse food mixed with L. plantarum biofilm on a matrix (co-grinding).

5. Измельченная пища для мышей, перемешанная с биопленкой L. plantarum в гранулах альгината.5. Crushed mouse food mixed with L. plantarum biofilm in alginate granules.

6. Набор для окрашивания живых и мертвых клеток (для определения присутствия живых бактерий).6. Kit for staining live and dead cells (to determine the presence of live bacteria).

7. Автоклавированная матрица для контрольных мышей.7. Autoclaved matrix for control mice.

8. Мышей разделяли на 3 группы (по 2 мыши в каждой группе):8. Mice were divided into 3 groups (2 mice in each group):

a. Контроль - мыши, которых кормили исключительно пищей + матрицей.a. Control - mice fed exclusively with food + matrix.

b. Биопленка - мыши, которых кормили пищей + биопленкой на матрице.b. Biofilm - mice fed food + biofilm on a matrix.

c. Биопленка, альгинат - мыши, которых кормили пищей + биопленкой на матрице в гранулах альгината.c. Biofilm, alginate - mice fed food + biofilm on a matrix in alginate granules.

9. Мышей кормили соответствующей пищей в течение 7 дней (Д1 - Д7).9. Mice were fed appropriate food for 7 days (D1 - D7).

10. Отбирали образец фекалий в день 8 (Д8), день 9 (Д9), день 10 (Д10), день 11 (Д11), день 12 (Д12), день 13 (Д13) и день 14 (Д14).10. A fecal sample was taken on day 8 (D8), day 9 (D9), day 10 (D10), day 11 (D11), day 12 (D12), day 13 (D13) and day 14 (D14).

11. Анализировали присутствие L. plantarum в образцах фекалий.11. Analyzed the presence of L. plantarum in fecal samples.

12. Получали срез с внутренней стороны кишечника для визуализации биопленки L. plantarum на кишечнике и окрашивали для определения живых и мертвых клеток с применением указанного набора для окрашивания.12. A section was taken from the inside of the intestine to visualize the L. plantarum biofilm on the intestine and stained to determine live and dead cells using the indicated staining kit.

[0098] Фиг. 7 демонстрирует, что бактерии колонизировали кишку мышей. Кишка мышей была колонизирована бактериями, полученными из биопленки, в течение более 3 дней, и, фактически, в течение более, но не ограничиваясь указанными, 14 дней.[0098] FIG. 7 shows that bacteria have colonized the intestines of mice. The intestines of the mice were colonized with biofilm-derived bacteria for more than 3 days, and in fact for more than, but not limited to, 14 days.

Пример 6: рН-зависимое высвобождение бактерий из композиции согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретенияExample 6 pH Dependent Release of Bacteria from a Composition According to Some Embodiments of the Present Invention

[0099] Биопленку, содержащую Е. coli на ДКФ, инкапсулировали в альгинат посредством смешивания ДКФ с биопленкой в 4% альгинате и нанесения капель с материалом в 2% раствор CaCl₂, и биопленку, содержащую L. plantarum, выращивали на поверхности гранул альгината. Затем полученные в результате композиции обрабатывали согласно примеру 1 выше. Результаты представлены на Фиг. 8.[0099] A biofilm containing E. coli on DCF was encapsulated in alginate by mixing DCF with the biofilm in 4% alginate and dropping the material into 2% CaCl ₂ solution, and the biofilm containing L. plantarum was grown on the surface of the alginate beads. The resulting compositions were then treated according to Example 1 above. The results are presented in Fig. eight.

[00100] Когда гранулы вводили в раствор при рН 2, высвобождались исключительно Lactobacillus plantarum. При рН=8 из гранул высвобождались как Е. coli, так и L. plantarum.[00100] When the granules were introduced into the solution at pH 2, only Lactobacillus plantarum was released. At pH=8, both E. coli and L. plantarum were released from the pellets.

Пример 7: Колонизация кишечника мышей с применением композиции, содержащей С. minuta. согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретенияExample 7: Colonization of the intestines of mice using a composition containing C. minuta. according to some embodiments of the present invention

[00101] Мыши SPF получали перемешанную с пищей биопленку, содержащую С. minuta на семенах граната, один раз в концентрации 2*10⁷ бактерий в день 1 эксперимента. Фекалии анализировали в день 1 (до лечения пробиотиками), 2, 4, 7, 11 и 15 для определения % С. minuta в фекалиях.[00101] SPF mice received a food-mixed biofilm containing C. minuta on pomegranate seeds once at a concentration of 2*10 ⁷ bacteria on day 1 of the experiment. Faeces were analyzed on days 1 (before probiotic treatment), 2, 4, 7, 11 and 15 to determine the % C. minuta in faeces.

[00102] Животные получали лечение следующим образом (по три мыши на группу лечения):[00102] Animals were treated as follows (three mice per treatment group):

1. Контроль - Исключительно пища (6 гр.).1. Control - Exclusively food (6 gr.).

2. Контроль - Исключительно пища (3 гр.), смешанная с зернами граната (3 гр.)2. Control - Exclusively food (3g) mixed with pomegranate seeds (3g)

3. Эксперимент - Пища (3 гр.), смешанная с биопленкой С. minuta на зернах граната (3 гр.)3. Experiment - Food (3g) mixed with C. minuta biofilm on pomegranate seeds (3g)

[00103] Мышам SPF вводили 2*10⁷ клеток С. minuta в биопленке на зернах граната (С. minuta), зерна граната (исключительно ГРАН) или только рацион (HFD, high fat diet, рацион с высоким содержанием жиров) в первый день эксперимента. Образцы фекалий отбирали до лечения пробиотиками (день 1), через 2 дня, 4 дня, 7 дней, 11 дней и 15 дней после лечения пробиотиками и направляли на 16S-секвенирование. Рассчитывали присутствие С. minuta в общей популяции бактерий в каждом образце фекалий. Результаты представлены на Фиг. 9. Полученные данные демонстрируют, что биопленка, содержащая С. minuta, была способна к колонизации кишечника мышей в течение до 15 дней, когда эксперимент был окончен, что подтверждается присутствием С. minuta в образцах фекалий.[00103] SPF mice were injected with 2*10 ⁷ C. minuta cells in biofilm on pomegranate seeds (C. minuta), pomegranate seeds (GRAN only) or diet alone (HFD, high fat diet) on the first day experiment. Fecal samples were collected before probiotic treatment (Day 1), 2 days, 4 days, 7 days, 11 days and 15 days after probiotic treatment and sent for 16S sequencing. The presence of C. minuta in the total bacterial population in each fecal sample was calculated. The results are presented in Fig. 9. The data obtained demonstrate that the biofilm containing C. minuta was able to colonize the intestines of mice for up to 15 days when the experiment was completed, as evidenced by the presence of C. minuta in faecal samples.

Пример 8: Колонизация кишечника мышей с применением композиции согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения - сравнение с другими способамиExample 8: Colonization of the intestines of mice using a composition according to some embodiments of the present invention - comparison with other methods

[00104] Биопленку, содержащую L. plantarum, выращивали согласно условиям, представленным ниже, и давали мышам SPF один раз в день в концентрации 2*10⁹ бактерий в течение 5 дней. После данного периода времени мышей кормили пищей самой по себе в течение еще 5 дней.[00104] A biofilm containing L. plantarum was grown according to the conditions below and given SPF mice once a day at a concentration of 2*10 ⁹ bacteria for 5 days. After this time period, the mice were fed food by itself for another 5 days.

[00105] Животные получали лечение следующим образом (по две мыши на группу лечения):[00105] Animals were treated as follows (two mice per treatment group):

1. Контроль - Исключительно пища1. Control - Exclusively food

2. Контроль - Исключительно пища с частицами (зернами граната ГРАН).2. Control - Exclusively food with particles (GRAN pomegranate seeds).

3. Планктонные. L. plantarum выращивали в течение ночи при встряхивании при температуре 37°С в бульоне MRS.3. Planktonic. L. plantarum was grown overnight with shaking at 37° C. in MRS broth.

4. Биопленка, статические, на зернах граната (ГРАН) - 5 гр. частиц с бактериями (приблизительно 10⁶ бактерий/день) (согласно способам, описанным в публикации DE 202013103204).4. Biofilm, static, on pomegranate seeds (GRAN) - 5 gr. particles with bacteria (approximately 10 ⁶ bacteria/day) (according to the methods described in the publication DE 202013103204).

5. Биопленка, проточные, на зернах граната (ГРАН) - 1,5 гр. частиц с бактериями.5. Biofilm, flowing, on pomegranate seeds (GRAN) - 1.5 gr. particles with bacteria.

6. Биопленка, проточные, на зернах граната (ГРАН) с лиофилизацией - 1,5 гр. частиц с бактериями (согласно способам, описанным в публикации Biomacromolecules 2013, 14, 3214-3222).6. Biofilm, flowing, on pomegranate seeds (GRAN) with lyophilization - 1.5 gr. particles with bacteria (according to the methods described in the publication Biomacromolecules 2013, 14, 3214-3222).

7. Коммерческая пробиотическая добавка - 2 драже в день в течение 5 дней.7. Commercial probiotic supplement - 2 tablets per day for 5 days.

[00106] Количество Lactobacillus определяли с применением подсчета колоний в фекалиях мышей, отобранных в день 5 (последний день приема образца), день 3 и день 5 (через 3 и 5 дней после прекращения приема образца). Результаты представлены на Фиг. 10. Полученные данные демонстрируют, что биопленка, содержащая L. plantarum, образованная в соответствии со способами согласно настоящему изобретению, была способна к колонизации кишечника мышей в течение до 5 дней, когда эксперимент был окончен, что подтверждается присутствием L. plantarum в образцах фекалий. Однако композиции, полученные согласно способам, описанным в публикациях DE 202013103204 или Biomacromolecules 2013, 14, 3214-3222, не были способны к колонизации кишечника мышей в течение до 5 дней.[00106] The number of Lactobacillus was determined using colony count in the faeces of mice collected on day 5 (last day of sample intake), day 3 and day 5 (3 and 5 days after the sample was stopped). The results are presented in Fig. 10. The data obtained demonstrate that the biofilm containing L. plantarum formed in accordance with the methods of the present invention was capable of colonizing the intestines of mice for up to 5 days when the experiment was completed, as evidenced by the presence of L. plantarum in the faecal samples. However, the compositions obtained according to the methods described in publications DE 202013103204 or Biomacromolecules 2013, 14, 3214-3222 were not able to colonize the intestines of mice for up to 5 days.

[00107] Публикации, упомянутые в данном документе, включены в настоящую заявку посредством ссылки. Несмотря на то, что выше были проиллюстрированы различные аспекты настоящего изобретения со ссылкой на примеры и предпочтительные варианты реализации, очевидно, что объем настоящего изобретения определен не представленным выше описанием, а приведенной ниже формулой изобретения, которую следует надлежащим способом истолковывать в соответствии с принципами патентного права.[00107] The publications mentioned in this document are incorporated into this application by reference. Although various aspects of the present invention have been illustrated above with reference to examples and preferred embodiments, it is clear that the scope of the present invention is not defined by the above description, but by the following claims, which should be properly construed in accordance with the principles of patent law. .

Claims

1. A method of obtaining a biofilm that is resistant to a pH in the range of 2 to 8, which contains a population of at least one strain of bacteria attached to the particles, and this method includes: (a) providing a population containing at least one strain of bacteria ; (b) inoculating a growth medium that contains particles with said population containing at least one strain of bacteria, said particles being selected from the group consisting of seeds, dicalcium phosphate, cellulose, and any combination thereof; (c) incubating said particles with said population containing at least one bacterial strain for a time period sufficient for said population of at least one bacterial strain to attach to said particles; and (d) culturing said population comprising at least one strain of bacteria attached to said particles in growth medium for a time sufficient to form a biofilm, said culturing comprising culturing under anaerobic conditions, said biofilm being formed with the possibility of colonization of the gastrointestinal tract of the subject in need of it, for at least five days when ingested by the specified subject, which allows to obtain a biofilm that is resistant to a pH in the range from 2 to 8.

2. The method according to p. 1, characterized in that the specified biofilm is made with the possibility of pH-dependent targeted release of the specified strain of bacteria in the gastrointestinal tract.

3. The method according to claim 1, characterized in that said biofilm attached to said particle is encapsulated using a compound adapted to release said at least one bacterial strain at a pH value that is present in the intestine of the animal.

4. The method according to claim 3, characterized in that said compound is an alginate.

5. The method according to claim 1, characterized in that said particles are porous particles whose diameter varies from 30 to 500 microns.

6. The method according to claim 1, characterized in that said seeds are pomegranate seeds.

7. The method according to claim 1, characterized in that said population containing at least one strain of bacteria is selected from the intestinal microflora.

8. The method according to claim 1, characterized in that said at least one bacterial strain is selected from the group consisting of Lactobacillus, Christensenella and Acetobacter.

9. Method according to claim 1, characterized in that said particles consist of dicalcium phosphate.

10. The method according to claim 1, characterized in that said biofilm is intended to be used to colonize the intestines of an animal in need thereof.

11. The method according to claim 1, characterized in that said biofilm contains at least two bacterial strains.

12. The method according to claim 1, characterized in that said biofilm contains a population of at least one bacterial strain attached to the particle in lyophilized form.

13. The method according to p. 1, characterized in that said at least one bacterial strain is a probiotic strain.

14. The method according to p. 1, characterized in that these seeds are soaked in the medium or broth MRS.

15. The method according to claim 1, characterized in that said seeds are crushed seeds.