RU2763663C2 - Способ лечения перевивной соединительнотканной саркомы м-1 крыс при комбинированном воздействии фотодинамической терапии и лучевой терапии - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к экспериментальной медицине, к онкологии, в частности к комбинированной терапии: фотодинамической терапии (ФДТ) и лучевой терапии (ЛТ) при лечении перевивной поверхностной солидной соединительнотканной опухоли саркома М-1 крыс. Проводят комбинированное воздействие фотодинамической терапии и лучевой терапии по схеме: ФДТ + ЛТ или ЛТ + ФДТ, с интервалом времени 24 часа, причем сеанс ФДТ проводят с ФС липосомальным амидоаминхлорином е6 (ЛААХ), который вводят интраперитонеально в дозе 0,75 мг/кг массы животного, что при экстраполяции на дозу человека составляет 0,13 мг/кг, лекарственно-световой интервал 2,5-3,0 часа, параметры лазерного излучения: плотность энергии Е = 100 Дж/см², плотность мощности Ps = 0,34 Вт/см², лучевую терапию проводят с дозой γ-излучения 20 Гр. Способ позволяет добиться ликвидации новообразования без опасных побочных эффектов за счет определения оптимальных условий проведения комбинированной терапии в различной последовательности ее проведения, при разных временных интервалах, с применением минимальной эффективной дозы фотосенсибилизатора и невысокими параметрами γ-излучения. 2 табл., 3 ил.

Description

Изобретение относится к экспериментальной медицине, к онкологии, в частности к комбинированной терапии: фотодинамической терапии (ФДТ) и лучевой терапии (ЛТ) при лечении перевивной поверхностной солидной соединительнотканной опухоли саркома М-1 крыс.

На протяжении многих лет борьбы с онкологическими заболеваниями происходит совершенствование уже хорошо изученных методов лечения и активная разработка новых методов противоопухолевой терапии. Все методы лечения направлены на максимальное уничтожение опухолевых узлов. Для каждого метода характерны различные механизмы воздействия на опухолевые клетки, вызывающие их гибель. Эффективность лечебного воздействия определяется длительностью задержки роста опухоли от начала воздействия и ее полной эрадикацией.

ФДТ имеет преимущества перед лучевой и химиотерапией. Это локальная форма терапии, которая обладает отсутствием тяжелых местных и системных осложнений. Основными преимуществами ФДТ перед общепринятыми методами лечения злокачественных опухолей являются избирательность поражения, отсутствие риска хирургического вмешательства и тяжелых системных осложнений, низкая стоимость лечения. При ФДТ в клетках происходит очень сложный комплекс изменений. Мишенями фотохимических воздействий являются многие клеточные структуры: клеточные мембраны, митохондрии, ДНК и микротрубочки. По мере прогрессирования повреждения мембран могут наблюдаться и другие электролитные нарушения. Сублетальное повреждение клеток посредством вовлечения многих сигнальных систем может вызывать апоптоз. Тем не менее, in vivo важными могут быть и непрямые эффекты, такие как ишемический некроз вследствие повреждения сосудов. ФДТ, кроме того, является «пусковым» механизмом в активации противоопухолевого иммунного ответа, связанного с усилением процесса гибели опухолевых клеток, а также развития острого воспалительного процесса. Таким образом, механизм действия ФДТ включает целый комплекс прямых и непрямых реакций взаимодействия различных компонентов, в конечном итоге приводящих к цитотоксическим эффектам. В то же время ФДТ нельзя назвать панацеей от рака, метод имеет свои пределы. Это, прежде всего, ограниченная глубина повреждения опухолевой ткани (до 1,0 см).

Во многих странах мира сегодня ученые и клинические специалисты ведут исследования, направленные на создание новых более эффективных и безопасных лекарственных средств – фотосенсибилизаторов (ФС). В настоящее время большой интерес в ФДТ злокачественных новообразований в качестве ФС вызывают производные ряда хлорофилла, одним из которых является ФС амидоаминхлорин (Фиг. 1), который разработан профессором Пономаревым Г.В. в Институте биомедицинской химии РАМН.

Липосомальный амидоаминхлорин – другая лекарственная форма на основе амидоаминхлорина разработан на взаимодействии метилфеофорбида а с различными первичными аминами и является химической модификацией периферических заместителей хлорина е6. Характерной особенностью хлорина е6 является тот факт, что в зависимости от растворителя его спектральные характеристики сильно варьируют. Так, известно, что в водных средах его максимум поглощения смещается в коротковолновую область от 662 нм. Для экспериментальных исследований может применяться раствор в водном димексиде для внутрибрюшинного введения. Один из пиков поглощения находится на волне 662 нм, что коррелирует с высоким квантовым выходом синглетного кислорода. Амидоаминхлорин может быть переведен в другую лекарственную форму - липосомальную. Компоненты липосомальной мембраны: яичный фосфатидилхолин (ЯФХ), 1,2-дистеароил-глицеро-3-фосфоэтаноламин - [метокси(полиэтиленгликоль)-2000] аммониевая соль, холестерин (ХОЛ) и а-токоферола ацетата. Характеризуется однородностью липосомальной дисперсии, размером частиц не более 200 нм, эффективностью включения препарата в липосомы (не менее 85 %). В липосомальной форме в воде имеет максимум поглощения 665 нм.

Лучевая терапия (ЛТ) (радиотерапия) метод лечения злокачественных новообразований. Она является наиболее доступной и одной из самых распространенных методов лечения рака. Опухолевые клетки оказались наиболее ранимыми, потому что интенсивное деление клеток делает их особенно чувствительными к воздействию радиации. В ходе такой терапии оказывается разрушительное воздействие на раковые клетки, останавливается процесс их деления и роста. Задержка клеточного деления, может быть временной, преходящей и не сказывается на жизнеспособности облученной клетки. К реакциям такого типа — обратимым реакциям — относятся также различные нарушения метаболизма, в т.ч. угнетение обмена нуклеиновых кислот и окислительного фосфорилирования, слипание хромосом и др. Обратимость этого типа лучевых реакций объясняется тем, что они являются следствием повреждения части множественных структур, утрата которой очень быстро восполняется или просто остается незамеченной. Существенно иную природу имеют эффекты, приводящие облученную клетку к гибели, — летальные лучевые реакции. Под клеточной гибелью в радиобиологии понимают утрату клеткой способности к делению. Сравнительно невысокие показатели местного лечения и побочные реакции после ЛТ диктуют необходимость поиска новых подходов к этому методу лечения.

С целью усиления противоопухолевого воздействия, а также с целью расширения сферы применения ФДТ, как эффективного противоопухолевого, но щадящего органосохраняющего метода лечения, была разработана схема комбинированной терапии, совмещающая ФДТ и ЛТ саркомы М-1.

Использование ФДТ для улучшения результатов комбинированного лечения ставит задачу поиска ее оптимального места в терапевтических схемах. Необходимо определить практическую возможность комбинирования методов, наилучшую временную последовательность их проведения, а также безопасность их совместного использования.

Известен способ комбинированного органосохраняющего лечения злокачественных опухолей орбиты (RU 2286187 C1). Облучение орбиты проводят с помощью дистанционной гамма-терапии. Целью лучевой терапии является постлучевая регрессия остаточной опухоли (радикальная программа облучения) или предотвращение рецидива. При этом суммарная доза дистанционной гамма-терапии зависит от стадии неопластического процесса и колеблется от 40 до 60 Гр (1,5-1,8 Гр за фракцию). Технический результат достигается благодаря комбинации трех способов: орбитотомии с иссечением опухоли ad maximum, фотодинамической терапии с использованием дозы фотосенсибилизатора Фотосенса 10 мг/кг и при равномерном распределении световой энергии в полости орбиты после иссечения опухоли и при выбранном режиме лазерного воздействия, а также химиотерапии. облучение лазерным излучением с длиной волны 670 нм, находящейся в максимуме спектра поглощения применяемого фотосенсибилизатора с суммарной плотностью мощности 120-800 мВт/см².

Известна работа «Сочетанная ФДТ и ЛТ в лечении рака легкого» (Рагулин Юрий Александрович, Каплан М. А., Медведев В. Н., Афанасова Н. В., Капинус В. Н. Российский биотерапевтический журнал. 2011. Т. 10. № 2. С. 33-36). Цель работы - оценка возможности комбинирования фотодинамической и лучевой терапии у больных раком легкого для улучшения непосредственных результатов лечения. В исследование включено 57 больных, имевших обтурационные вентиляционные нарушения, обусловленные опухолевым стенозом главного или долевого бронха, которые получили лучевое и химиолучевое лечение. Всем больным проводилась лучевая терапия по методике дробления дневной дозы 2,5 Гр на две фракции 1 Гр и 1,5 Гр с интервалом 4–5 ч. ФДТ с фотосенсибилизаторами хлоринового ряда (фотолон, фотодитазин) проводили за 10–14 дней до начала лучевой терапии. По 10 больных из каждой группы получали одновременную химиотерапипо схеме цисплатин+этопозид или карбоплатин+паклитаксел. 28 больным перед лучевой (или химиолучевой) терапией проводилась ФДТ с целью реканализации бронха и восстановления пневматизации легочной ткани, 29 больных составили контрольную группу. В исследовании показана высокая клиническая эффективность ФДТ и безопасность ее использования. Проведение ФДТ перед лучевой терапией у больных с опухолевым стенозом крупных бронхов позволяет добиться выраженного положительного эффекта, заключающегося в ликвидации ателектаза и устранении гиповентиляции (у 85,7 больных против 62,1 % положительного эффекта у пациентов, получающих только лучевую терапию). Всем больным проводилась лучевая терапия по методике дробления дневной дозы 2,5 Гр на две фракции 1 Гр и 1,5 Гр с интервалом 4–5 ч. ФДТ с фотосенсибилизаторами хлоринового ряда (фотолон, фотодитазин) проводили за 10–14 дней до начала лучевой терапии. По 10 больных из каждой группы получали одновременную химиотерапипо схеме цисплатин+этопозид или карбоплатин+паклитаксел.

У каждого из основных, применяемых при лечении рака легкого методов, есть свои достоинства и недостатки. Обычно комбинирование двух или трех методов ведет к увеличению вероятности излечения опухоли. При этом удается потенцировать преимущества обоих методов и минимизировать их недостатки. Так, ФДТ обладает высокоэффективным местным действием, но недостаточно воздействует на микрометастазы в нормальной ткани и региональных коллекторах. Лучевая терапия, наоборот, достаточно эффективно воздействует на микрометастазы, но в то же время, в ряде случаев, не достигает полного эффекта при воздействии на саму опухоль. Учитывая все вышеизложенное, представляется возможным и весьма перспективным сочетание лучевой терапии и ФДТ.

Известен способ X-Ray Induced Photodynamic Therapy: A Combination of Radiotherapy and Photodynamic Therapy. PNAS. August 20, 2019. vol. 116. no. 34. 16823–16828. Рентгеновская индуцированная фотодинамическая терапия: сочетание лучевой терапии и фотодинамической терапии. Клиническое применение традиционной фотодинамической терапии (ФДТ или PDT) ограничено глубиной проникновения света. Чтобы решить эту проблему, разработали рентгеновскую фотодинамическую терапию (X-PDT), которая использует рентгеновское излучение в качестве источника энергии для активации процесса PDT. Однако механизмы цитотоксичности не были выяснены. Исследовались механизмы действия X-PDT на раковые клетки. Результаты показывают, что X-PDT больше, чем просто производная PDT, но по существу является комбинацией PDT и RT. Эти две модальности нацелены на различные клеточные компоненты (клеточная мембрана и ДНК соответственно), что приводит к усиленным терапевтическим эффектам. В результате X-PDT не только снижает краткосрочную жизнеспособность раковых клеток, но и их клоногенность в долгосрочной перспективе. С этой точки зрения, X-PDT можно также рассматривать как уникальный метод радиочувствительности, и как таковой он дает явные преимущества перед RT в терапии опухолей, особенно для радиорезистентных клеток. Это продемонстрировано не только in vitro, но и in vivo с опухолями H1299, которые либо подкожно инокулируются, либо имплантируются в легкие мышей. Эти результаты и достижения имеют большое значение для развития X-PDT как нового метода лечения против рака.

Известен cравнительный анализ рентгенологических результатов самостоятельной лучевой терапии и лучевой терапии с предшествующей фотодинамической терапией (Рагулин Ю.А., Каплан М.А., Медведев В.Н., Афанасова Н.В., Кудрявцев Д.В., Капинус. Радиация и риск/ Бюллетень Национального радиационно-эпидемиологического регистра). 2015. Т. 24, №4. С. 53-61). Проводилась лучевая терапия по методике дробления дневной дозы 2,5 Гр на две фракции 1 Гр и 1,5 Гр с интервалом 4-5 часов. 24 больным за 2-4 недели до начала курса лучевой терапии проводили эндоскопическую ФДТ. Контрольное рентгенологическое исследование выполнялось при достижении СОД-45-50 Гр. Группы больных были сопоставимы по полу, возрасту, морфологическому строению опухолей. Положительная рентгенологическая динамика была достигнута у 17 (65,4%) больных группы ЛТ и у 20 (83,3%) группы ЛТ+ФДТ. Разрешение ателектаза с полным восстановлением пневматизации наблюдалось у 4-х больных из 10-ти (40%) группы ФДТ+ЛТ, в то время как в контрольной группе данное событие отмечено лишь в 2-х случаях из 10-ти (20%). Отсутствие эффекта и отрицательная динамика были зафиксированы у 9 (34,6%) больных группы №1, в группе №2 нарастания вентиляционных расстройств не наблюдалось, отсутствие динамики отмечено у 4-х (16,7%). Осложнения (пневмонии) наблюдались у 3-х (15%) больных в группе ЛТ+ФДТ и у 2-х (7,7%) в группе ЛТ.

Однако, при анализе частоты осложнений в группе ЛТ+ФДТ отмечено, что у 14 пациентов, которые сразу после ФДТ получали антибактериальную терапию, пневмония развилась только в одном случае (7,1%). Использование ФДТ перед лучевой терапией у пациентов с опухолевыми стенозами крупных бронхов, обуславливающими расстройства вентиляции, позволяет добиться лучших непосредственных результатов лечения, заключающихся в устранении ателектаза и гиповентиляции.

Известен сравнительный анализ эффективности лучевого фотодинамического лечения экспериментальной опухоли (Н.М. Ростовцев, Н. А. Котляров. Педиатрический вестник Южного Урала. 2015. № 1. С. 29-32). Для опытов использовали 258 мышей беспородных и линий СВА, С57В1, СЗНА, гибриды Р (СВА* С57В1). Средняя масса тела опытного животного была около 25 ± 2,5 г. Животные-опухоленосители выводились из эксперимента на 7-е, 14-е, 21-е, 28-е сутки от момента перевивки карциномы Эрлиха, полученную от мышей-доноров. В работе использовали фотосенсибилизатор 2-го поколения — производное хлорина Е 6 — Радахлорин (производства Россия), который вводили внутрибрюшинно. Для близкофокусной лучевой терапии животных однократным рентгеновским облучением в дозе 5 Гр использовалась рентгеновская установка. Также включалась резекции опухоли. Лечение животных начинали на 7-е сутки от момента перевивки опухоли. Все опытные животные были разделены на 6 групп, включая контрольную группу. В 1-Ш группах животным-опухоленосителям проводили ФДТ, применяя дозу лазерного облучения 100 Дж/см², 200 Дж/см², 400 Дж/см² соответственно. Для близкофокусной лучевой терапии в IV группе животных однократным рентгеновским облучением в дозе 5 Гр использовалась рентгеновская установка. Эффективность проведенного лечения определяли по торможению роста опухоли (ТРО%) и частичной регрессии опухоли (ЧР%) в установленные сроки. По сравнению с данными группами значительно меньший объем опухоли на всех сроках эксперимента регистрировался после рентгенотерапии (Р < 0,05). Наиболее выраженное и сохраняющееся на протяжении всего периода наблюдения подавление темпов роста опухоли отмечалось при ФДТ в дозе 400 Дж/см². В результате проведенных экспериментальных исследований на перевиваемой асцитной карциноме Эрлиха установлено, что оптимальная доза лазерного облучения соответствует 400 Дж/см². Полная регрессия опухоли была достигнута при комбинации резекции опухоли и интраоперационной ФДТ в данной дозе на остаточную опухоль.

Однако, в данном исследовании не указана плотность мощности лазерного излучения, что не позволяет сравнить с нашим исследованием, кроме того, использовалась большая доза ФС – 5,0 мг/кг и высокая плотность энергии – до 400 Дж/см².

Техническим решением является определение оптимальных условий проведения комбинированной терапии в различной последовательности ее проведения (ФДТ + ЛТ или ЛТ + ФДТ), при разных временных интервалах, с различными малыми дозами фотосенсибилизатора и невысокими параметрами γ-излучения для достижения выраженного положительного эффекта, заключающегося в ликвидации новообразования без опасных побочных эффектов.

Технический результат решается тем, что так же, как и в известном способе для лечения экспериментальной опухоли проводят лучевую и фотодинамическую терапию (ФДТ).

Особенностью заявляемого способа является то, что проводят комбинированное воздействие фотодинамической терапии и лучевой терапии по схеме: ФДТ + ЛТ или ЛТ + ФДТ, с интервалом времени 24 часа, причем сеанс ФДТ проводят с ФС липосомальным амидоаминхлорином е6 (ЛААХ), который вводят интраперитонеально в дозе 0,75 мг/кг массы животного, что при экстраполяции на дозу человека составляет 0,13 мг/кг, лекарственно-световой интервал 2,5-3,0 часа, параметры лазерного излучения: плотность энергии Е = 100 Дж/см², плотность мощности Ps = 0,34 Вт/см², лучевую терапию проводят с дозой γ-излучения 20 Гр.

Изобретение поясняется подробным описанием, сериями опытов, таблицами и иллюстрациями, на которых изображено:

Фиг.1 – Формула фотосенсибилизатора амидоаминхлорин.

Фиг.2 – Динамика накопления ЛААХ в опухоли и здоровой ткани бедра крыс после интраперитонеального введения в дозе 2,5 мг/кг. По оси абсцисс – срок после интраперитонеального введения ФС; по оси ординат: слева интенсивность флуоресценции, справа – индекс контрастности (красные линии на графиках).

Фиг. 3 – Диаграмма: Процент животных с полной регрессией саркомы М-1 на 21 сутки после комбинированной терапии в различной последовательности ее проведения (ФДТ +ЛТ или ЛТ + ФДТ), при разных временных интервалах (24 ч или 48 ч) и дозах фотосенсибилизатора; ФС липосомальный амидоаминхлорин в дозах 0,50 или 0,75 мг/кг, доза γ-излучение 20 Гр:

- I серия опытов (ФДТ + ЛТ) - Сеанс ФДТ с разными дозами фотосенсибилизатора, параметры лазерного излучения (E=100 Дж/см², Ps = 0,34 Вт/см²) и через разные интервалы времени проведение ЛТ;

- II серия опытов (ЛТ + ФДТ) - Проведение ЛТ и через разные интервалы времени сеанс ФДТ с разными дозами фотосенсибилизатора, параметры лазерного излучения (E = 100 Дж/см², Ps = 0,34 Вт/см²);

- Монотерапия - три группы животных. Две группы животных с проведением ФДТ с разными дозами фотосенсибилизатора, параметры лазерного воздействия одинаковые (E = 100 Дж/см², Ps = 0,34 Вт/см²) и одна группа с проведением ЛТ.

Способ осуществляют следующим образом.

В эксперименте in vivo нами использовались белые инбредные лабораторные крысы, в качестве экспериментальной модели опухоли использовали саркому М-1. Работа выполнена с соблюдением международных рекомендаций по проведению исследований с использованием лабораторных животных, изложенных в «Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых в экспериментальных и других научных целях» (Страсбург, 1987).

Источником лазерного излучения служил полупроводниковый лазерный аппарат «Аткус – 2» производства ЗАО «Полупроводниковые приборы» (Санкт-Петербург) с длиной волны излучения 662 ± 1 нм. Диаметр светового пятна составлял 1,5 см. Животные при облучении находились под общим тиопенталовым наркозом (внутрибрюшинно 2,5 % раствор в объеме 0,2 мл/100г массы животного).

Источником γ – излучения являлась установка «Луч – 1» (гамма-терапевтическая установка с источником Со⁶⁰).

Половозрелым самкам крыс массой тела 165–190 г на 7-9 сутки после перевивки при достижении наибольшего диаметра опухолевых узлов 0,8-1,0 см проводят комбинированное воздействие фотодинамической терапии и лучевой терапии по схеме: ФДТ + ЛТ или ЛТ + ФДТ, с интервалом времени 24 часа. ФС липосомальный амидоаминхлорин (ЛААХ) вводят в дозе 0,75 мг/кг массы животного, что при экстраполяции на дозу человека составляет 0,13 мг/кг, лекарственно-световой интервал составляет 2,5-3,0 часа, с параметрами лазерного излучения Е = 100 Дж/см², плотность мощности Ps = 0,34 Вт/см², с дозой γ-излучения 20 Гр.

Экспериментальная часть, доказывающая эффективность предложенного способа.

Работа выполнена на 64 половозрелых самках крыс массой тела 165–190 г с имплантированной подкожно с внешней стороны бедра саркомой М-1. На 7-9 сутки после перевивки при достижении наибольшего диаметра опухолевых узлов 0,8-1,0 см животных методом рандомизации распределяли на опытные и контрольную группы.

Комбинированную терапию проводили в различной последовательности (ФДТ +ЛТ или ЛТ + ФДТ), при различных временных интервалах (через 24 или 48 часов) и с разными дозами ФС (0,50 и 0,75 мг/кг).

Параметрах лазерного облучения (плотность энергии (Е) 100 Дж/см² и плотность мощности (Ps) 0,34 Вт/см²и доза гамма-излучения 20 Гр была одинаковой при всех проведенных исследованиях:

ФДТ проводили локально однократно, в качестве ФС использовали ФС липосомальный амидоаминхлорин (ЛААХ), который вводили интраперитонеально в небольших дозах 0,50 и 0,75 мг/кг массы животного.

ЛТ проводили дистанционно (ДЛТ), расстояние по шкале 65 см, локально однократно с малой дозой облучения 20 Гр.

Проведено две серии опытов (I и II) комбинированного воздействия - 4 группы животных:

I серия опытов и ЛТ - две группы животных с разными дозами ФС и с различными интервалами времени:

1. группа - ФДТ (0,50 мг/кг ФС) и через 48 ч. ЛТ;

2. группа - ФДТ (0,75 мг/кг ФС) и через 24 ч. ЛТ.

II серия опытов ЛТ и ФДТ - две группы животных с разными дозами ФС и с различными интервалами времени:

1. группа - ЛТ и через 48 ч. ФДТ (0,50 мг/кг ФС);

2. группа - ЛТ и через 24 ч. ФДТ (0,75 мг/кг ФС).

Для сравнения лечебного эффекта комбинированной терапии также были представлены результаты исследований каждой монотерапии.

Монотерапия:

1. группа - ФДТ (доза ФС 0,50 мг/кг);

2. группа - ФДТ (доза ФС 0,75 мг/кг);

3. группа - ЛТ (локально, дистанционно, в дозе 20 Гр).

Контролем служили крысы-опухоленосители без какого-либо воздействия.

Объём опухоли измеряли: до проведения лечения (V₀), и на 3, 7, 10, 14, и 21 сутки после терапии. Конечный срок исследования был выбран исходя из необходимости сравнения динамики роста опухоли у крыс с продолженным ростом после терапии с контрольными животными, так как на данный срок исследования уже начинается гибель контрольных животных.

В качестве критериев определения противоопухолевой эффективности использовали:

1. Коэффициент абсолютного прироста опухоли (К). Для этого сначала вычисляли объёмы опухолей по формуле:

(1)

где: d_1, d₂ ,d_3, - три взаимно перпендикулярные диаметры опухоли,

V - объем опухоли в см³.

Коэффициент абсолютного прироста опухоли (К) рассчитываем по формуле:

(2)

где: V₀ -объем опухоли до воздействия,

V_t – объем опухоли на определенный срок наблюдения;

2. Процент частичной регрессии опухоли (ЧР %). За ЧР принимали уменьшение роста опухоли от первоначального объема (-1,00 < К <0). Значимая ЧР ≥50%.

3. Процент животных в группе с полной регрессией (ПР) опухоли (К = -1,00). За полную регрессию опухоли принимали отсутствие видимой и пальпируемой опухоли.

4. Фотодинамическая активность фотосенсибилизаторов и сохранность окружающих тканей реализуются за счет селективного накопления фотосенсибилизаторов в опухолевой ткани. Поэтому их регистрация с целью определения концентрации и динамики содержания в тканях in vivo необходима для определения оптимального времени от момента введения ФС до лазерного воздействия – лекарственно световой интервал (ЛСВИ). Кинетику накопления ФС в опухоли и здоровой ткани бедра изучали методом лазерной спектрометрии с помощью установки ЛЭСА-01-Биоспек. Уровень концентрации ФС оценивали по интенсивности флуоресценции, селективность определяли по индексу контрастности (опухоль/здоровая ткань). ФС ААХ вводили крысам внутрибрюшинно в дозе 1,25 мг/кг. Первое измерение проводили до введения препарата (0 часа), а затем через 20 минут; 1,0; 1,5; 3,0 часа и 4,0 и 5,5 часа.

Статистическую обработку результатов для независимых групп выполняли с использованием программ Statistica 6.0. Описательная статистика представлена в виде среднего арифметического и стандартной ошибки среднего (M±m). Для оценки уровня значимости межгрупповых различий использовали U-критерий Манна–Уитни при p<0,05.

I. Изучение динамики накопления ФС в опухоли и здоровой ткани.

Уровень и селективность накопления ФС в опухоли, а также скорость его выведения из нормальной ткани являются важнейшими характеристиками для ФДТ. Они влияют как на эффективность метода, так и на вероятность снижения побочных эффектов (Фиг. 2).

Из данных, представленных на Фиг. 2 видно, что в течение 4 часов после внутрибрюшинного введения липосомального амидоаминхлорина в дозе 1,25 мг/кг происходит постепенное увеличение уровня накопления его, как в опухоли, так и в здоровой ткани бедра. Максимальный уровень накопления ФС в опухоли наблюдался через 4,0 часа после введения ФС. Что касается индекса контрастности, то самый высокий (1,3) мы наблюдали также через 4 часа.

Таким образом, оптимальное время проведения лазерного облучения после введения ФС наступает через 4 часа – т.е. в это время ФС имеет высокое накопление в опухолевой ткани и минимальное содержание его в здоровых тканях.

II. Изучение противоопухолевой эффективности.

Комбинированная терапия.

Первая серия опытов ФДТ + ЛТ (Табл. 1, Фиг. 3).

Группа 1 - При проведении ФДТ с дозой ФС 0,50 мг/кг и через 48 часов ЛТ до 14 суток после лечения ПР опухоли наблюдалась у всех животных в группе. На конец наблюдения (21 сутки после лечения) отмечался рецидив опухоли у 25 % животных, процент ПР опухоли составлял 75 %. Коэффициент абсолютного прироста у крыс с ростом опухоли достоверно ниже по сравнению с контролем ((p < 0,050).

Группа 2 - При проведении ФДТ с увеличенной дозой ФС до 0,75 мг/кг и через 24 часа ЛТ ПР опухоли у 100 % животных наблюдалась до 14 суток. На 21 сутки после терапии лишь у одного животного (12,5 %) возобновился рост опухоли. ПР опухоли отмечалась у 87,5 % животных.

Таким образом, при проведении лечения в I серии опытов (ФДТ и ХТ) более значительный противоопухолевой эффект наблюдался с дозой ФС 0,75 мг/кг и интервалом времени 24 часа с последующей ЛТ. Полная регрессия опухоли отмечалась у 87,5 % животных на 21 сутки после лечения.

Вторая серия опытов ЛТ + ФДТ (Табл. 1, Фиг. 3).

Группа 1 - При проведении ЛТ и через 48 часов ФДТ с дозой ФС 0,50 мг/кг процент ПР опухоли увеличивался с увеличением срока после комбинированного воздействия и на 21 сутки после лечения составил 77,8% и практически не отличался от I серии опытов. Коэффициент абсолютного прироста опухоли был достоверно ниже по сравнению с контролем и также не отличался от такового, как и в I серии опытов.

Группа 2 - При проведении ЛТ и через 24 часа ФДТ с дозой ФС 0,75 мг/кг также с увеличением срока после лечения увеличивался процент животных с полной регрессией опухоли и уже на 10 сутки ПР наблюдалась у 100 % животных, что сохранялось до 14 суток после лечения. На 21 сутки наблюдался рецидив опухоли у 15 %, а процент полной регрессии опухоли составил 85%. Это чуть ниже, хотя и незначительно, чем в I серии опытов.

Таким образом, при проведении лечения во II серии опытов (ФДТ и ХТ) также более значительный противоопухолевой эффект наблюдался с дозой ФС 0,75 мг/кг и интервалом времени 24 часа с последующей ЛТ. Полная регрессия опухоли отмечалась у 85 % животных на 21 сутки после лечения, хотя, преимущество от группы 1 с дозой ФС 0,50 мг/кг и с интервалом времени 48 часов незначительное.

Таким образом, на 21 сутки после комбинированной терапии в последовательности ФДТ + ЛТ или ЛТ + ФДТ противоопухолевый эффект был практически одинаковым с небольшим преимуществом в последовательности терапий ЛТ + ФДТ при дозе ФС 0,75 мг/кг, что позволяет добиться положительного эффекта, заключающегося в полной регрессии злокачественных образований у 85% - 87,5% животных.

Монотерапия (Табл. 2, Фиг. 3).

Группа 1 - При проведении ФДТ с дозой ФС 0,50 мг/кг на 21 сутки после лечения только у 55,6% животных наблюдалась полная регрессия опухоли. У животных с продолженным ростом опухоли, хотя наблюдалось снижение коэффициента абсолютного прироста опухоли, но это снижение не достоверно по сравнению с контролем.

Группа 2 - При проведении ФДТ с дозой ФС 0,75 мг/кг на 21 сутки после лечения также у 55,6% животных наблюдалась полная регрессия опухоли и коэффициент абсолютного прироста опухоли (p < 0,050) по сравнению с контролем.

Группа 3 - При проведении ЛТ с дозой γ-излучение – 20 Гр на 21 сутки после лечения только у 30% животных наблюдалась полная регрессия опухоли. У животных с продолженным ростом опухоли, но коэффициент абсолютного прироста опухоли (p < 0,050) по сравнению с контролем.

При проведении монотерапии противоопухолевая эффективность выражалась в полной регрессии опухоли после ФДТ с дозами ФС 0,50 и 0,75 мг/кг - 55,6% и 30% после ЛТ и не во всех группах отмечалось достоверное снижение коэффициента абсолютного прироста опухоли или отмечалось с меньшей достоверной значимостью, чем при проведении комбинированной терапии.

При проведении комбинированной терапии получили увеличение ингибирующего эффекта по сравнению с каждой из монотерапий.

В контрольной группе по всем срокам исследования наблюдался прогрессирующий рост опухоли.

Таблица 1

Динамика саркомы М-1 крыс после комбинированной терапии в различной последовательности

ее проведения ФДТ и ЛТ или ЛТ и ФДТ, с различными временными интервалами

и при разных дозах ФС ФДТ (Е = 100 Дж/см², Ps = 0,34 Вт/см²); ЛТ (20 Гр)

№	Доза ФС	Интервал времени	Коэффициент абсолютного прироста опухоли (К) (М±m) у крыс с ростом опухоли
			Полная регрессия опухоли (ПР %)
			Частичная регрессия опухоли (ЧР %)
			3 сутки	7 сутки	10 сутки	14 сутки	21 сутки
ФДТ + ЛТ
1.	0,50 мг/кг	48 часов	2,23 88,9 % 0 %	- 100 % 0 %	- 100 % 0 %	- 100 % 0 %	7,08 ± 0,26* 75 % 0 %
2.	0,75 мг/кг	24 часа	- 100 % 0 %	- 100 % 0 %	- 100 % 0 %	- 100 % 0 %	1,62 * 87,5 % 0 %
ЛТ + ФДТ
1.	0,50 мг/кг	48 часов	1,03 ± 0,29* 44,4 % 0 %	0,66 ± 0,25* 66,7 % 0 %	2,43 ± 0,14* 66,7 % 11,1 %	3,31 ± 0,96* 66,7 % 0 %	6,18 ± 3,22* 77,8 % 0 %
2.	0,75 мг/кг	24 часа	3,74 ± 1,14 75 % 0 %	3,51 ± 0,90* 75 % 0 %	- 100 % 0 %	- 100 % 0 %	4,58 ± 2,82* 85 % 0 %
Контроль (K)			2,11 ± 0,25	8,08 ± 0,95	17,49 ± 2,54	43,78 ± 10,23	81,94±22,56

Примечание: уровень достоверной значимости по сравнению с контролем – * p < 0,050

Таблица 2

Динамика саркомы М-1 крыс после монотерапии:

ФДТ (Е = 100 Дж/см², Ps = 0,34 Вт/см²); ЛТ (20 Гр)

№	Вид моно терапии	Дозы ФС и γ- излуч.	Коэффициент абсолютного прироста опухоли (К) (М±m) у крыс с ростом опухоли
			Полная регрессия опухоли (ПР %)
			Частичная регрессия опухоли (ЧР %)
			3 сутки	7 сутки	10 сутки	14 сутки	21 сутки
1.	ФДТ	0,50 мг/кг	1,35 ± 0,89 77,8 % 11,1 %	1,35 ± 0,51* 66,7 % 11,1 %	3,40 ± 1,71* 66,7 % 11,1 %	10,13± 2,61* 55,6 % 0 %	45,36 ± 9,82 55,6 % 0 %
2.	ФДТ	0,75 мг/кг	- 100 % 0 %	- 100 % 0 %	- 100 % 0 %	2,61 88,9 % 0 %	15,64 ± 6,05* 55,6 % 0 %
3.	ЛТ	20 Гр	0,53 ± 0,12* 0 % 10 %	0,81 ± 0,34* 0 % 40 %	1,76 ± 0,47* 15,0 % 15,0 %	3,20 ± 0,83* 25,0 % 10,0 %	8,81 ± 2,02* 30,0 % 0 %
Контроль (K)			2,97 ± 0,50	14,01 ± 2,05	20,73 ± 2,04	36,00 ± 3,85	65,31 ± 7,70

Примечание: уровень достоверной значимости по сравнению с контролем – * p < 0,050

При проведении монотерапий противоопухолевая эффективность выражалась в полной регрессии опухоли после ФДТ с дозами ФС 0,50 и 0,75 мг/кг - 55,6% и 30% после ЛТ и не во всех группах отмечалось достоверное снижение коэффициента абсолютного прироста опухоли или отмечалось с меньшей достоверной значимостью, чем при проведении комбинированной терапии.

В результате проведенной комбинированной терапии отмечалось усиление ингибирующего эффекта от 75% до 87,5% при малых дозах ФС (0,50 или 0,75 мг/кг), невысоких параметрах лазерного излучения (Е = 100 Дж/см², Ps = 0,34 Вт/см²) по сравнению с монотерапиями.

Так как дозы ФС и параметры лазерного воздействия были невысокими, значительного усиления ингибирующего эффекта от последовательности проведения лечения практически не выявлено. Увеличение ингибирующего эффекта наблюдалось при интервале времени 24 часа с дозой ФС 0,75 мг/кг. Токсического воздействия на животных (ухудшение общего состояния животных, их подвижности, потери веса) не наблюдалось.

В результате проведенной комбинированной терапии наиболее значительный противоопухолевый эффект отмечался при лечении по схемам: ФДТ + ЛТ или ЛТ + ФДТ с ФС ЛААХ в дозе 0,75 мг/кг, с интервалом времени 24 часа (полная регрессия опухоли у 85%-87,5% животных, против 55,6% после ФДТ и 30% после ЛТ – положительного эффекта у крыс, получающих только монотерапию).

Предложенный способ лечения позволил добиться выраженного положительного эффекта, заключающегося в ликвидации новообразования и в целом, имеет большое значение для развития комбинированного воздействия, как нового метода лечения рака.

Claims (1)

1. Способ лечения перевивной соединительнотканной саркомы М-1 крыс при комбинированном воздействии фотодинамической терапии и лучевой терапии, отличающийся тем, что проводят комбинированное воздействие фотодинамической терапии и лучевой терапии по схеме: ФДТ + ЛТ или ЛТ + ФДТ, с интервалом времени 24 часа, причем сеанс ФДТ проводят с ФС липосомальным амидоаминхлорином е6 (ЛААХ), который вводят интраперитонеально в дозе 0,75 мг/кг массы животного, что при экстраполяции на дозу человека составляет 0,13 мг/кг, лекарственно-световой интервал 2,5-3,0 часа, параметры лазерного излучения: плотность энергии Е = 100 Дж/см², плотность мощности Ps = 0,34 Вт/см², лучевую терапию проводят с дозой γ-излучения 20 Гр.

Images