RU2762594C2 - Конъюгат "цистеин-модифицированное антитело-лекарственное средство" и способ его получения - Google Patents

Конъюгат "цистеин-модифицированное антитело-лекарственное средство" и способ его получения Download PDF

Info

Publication number
RU2762594C2
RU2762594C2 RU2019113758A RU2019113758A RU2762594C2 RU 2762594 C2 RU2762594 C2 RU 2762594C2 RU 2019113758 A RU2019113758 A RU 2019113758A RU 2019113758 A RU2019113758 A RU 2019113758A RU 2762594 C2 RU2762594 C2 RU 2762594C2
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
antibody
cysteine
pab
mmae
ser
Prior art date
Application number
RU2019113758A
Other languages
English (en)
Other versions
RU2019113758A (ru
RU2019113758A3 (ru
Inventor
И Чжу
Иси ВАН
Ши ЧЖО
Цзе ЛИ
Лань ЧЭНЬ
Вэйли ВАНЬ
Юнго ЮЙ
Original Assignee
Сычуань Байли Фарм Ко., Лтд.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Сычуань Байли Фарм Ко., Лтд. filed Critical Сычуань Байли Фарм Ко., Лтд.
Publication of RU2019113758A publication Critical patent/RU2019113758A/ru
Publication of RU2019113758A3 publication Critical patent/RU2019113758A3/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2762594C2 publication Critical patent/RU2762594C2/ru

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/47—Quinolines; Isoquinolines
    • A61K31/4738—Quinolines; Isoquinolines ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems
    • A61K31/4745—Quinolines; Isoquinolines ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems condensed with ring systems having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. phenantrolines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/55—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having seven-membered rings, e.g. azelastine, pentylenetetrazole
    • A61K31/551—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having seven-membered rings, e.g. azelastine, pentylenetetrazole having two nitrogen atoms, e.g. dilazep
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7028—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages
    • A61K31/7034—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin
    • A61K31/704—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin attached to a condensed carbocyclic ring system, e.g. sennosides, thiocolchicosides, escin, daunorubicin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/07—Tetrapeptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/68031—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being an auristatin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A61K47/6817—Toxins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2863—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/522—CH1 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Nitrogen And Oxygen Or Sulfur-Condensed Heterocyclic Ring Systems (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Nitrogen Condensed Heterocyclic Rings (AREA)

Abstract

Изобретение относится к конъюгату «цистеин-модифицированное антитело-лекарственное средство» с участками встраивания цистеина в положение 205 и/или положение 206 (система нумерации по Kabat) легкой цепи антитела и/или положение 439 (система нумерации по Kabat) тяжелой цепи. Встраивая цистеин (C) в тяжелую цепь и/или легкую цепь целевого антитела в конкретный участок встраивания и осуществляя сайт-специфическую конъюгацию с помощью свободной тиоловой группы (-SH) сайт-специфически встроенного цистеина и линкера, конъюгированного с высокоактивным низкомолекулярным цитотоксином, получают конъюгат «цистеин-модифицированное антитело-лекарственное средство» с хорошей гомогенностью. 2 н. и 7 з.п. ф-лы, 28 ил., 5 табл., 32 пр.

Description

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
Настоящая заявка представляет собой заявку на национальном этапе по международной заявке № PCT/CN2017/104706, поданной 30 сентября 2017 года, по которой испрашивают приоритетное преимущество по патентной заявке Китая № 201610876568.9, поданной 8 октября 2016 года, полное описание которых включено в настоящее описание в качестве ссылки.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Настоящее изобретение относится к терапевтическим соединениям и способам их получения, и, в частности, к конъюгатам «цистеин-модифицированное антитело-цитотоксин» и способам их получения.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Конъюгаты «антитело-лекарственное средство» (ADC) представляют большой интерес в области таргетной терапии. Два лекарственных средства, адцетрис и кадсила, одобрены для продажи в США и продемонстрировали хорошую клиническую эффективность. Более 50 лекарственных средств на основе ADC проходят стадию клинических испытаний.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к конъюгатам «цистеин-модифицированное антитело-цитотоксин» (TDC), способам получения конъюгатов «антитело-цитотоксин» и способам их применения.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к конъюгатам «цистеин-модифицированное антитело-цитотоксин». В одном из вариантов осуществления участок встраивания цистеина включает один или более из следующих трех участков встраивания или положений встраивания в целевых антителах: положение 205 легкой цепи (система нумерации по Kabat, где окружающая аминокислотная последовательность содержит GLSSPCVTKSF, при этом C представляет собой встроенный цистеин), положение 206 легкой цепи (система нумерации по Kabat, где окружающая аминокислотная последовательность содержит GLSSPVCTKSF, при этом C представляет собой встроенный цистеин) и положение 439 тяжелой цепи (система нумерации по Kabat, где окружающая аминокислотная последовательность содержит YTQKSLSCLSPGK, при этом C представляет собой встроенный цистеин).
Антитело, содержащее одну или более из указанных выше мутаций с инсерцией цистеина, сохраняет способность к связыванию с антигеном, присущую родительскому антителу (аффинность). В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к сайт-специфическому соединению конъюгата «антитело-цитотоксин «(TDC) по тиоловой группе цистеина с использованием конъюгата «линкер-лекарственное средство» (т.е. линкер-цитотоксин), где тиоловая группа принадлежит цистеину, встроенному в положение 205 или/и положение 206 легкой цепи или/и положение 439 тяжелой цепи.
В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к конъюгату «цистеин-модифицированное антитело-цитотоксин», содержащему антитело, включаеющее сайт-специфически встроенный цистеин, где участок встраивания цистеина содержит один или более участков, выбранных из следующих трех участков встраивания: положение 205 константной области каппа/лямбда-легкой цепи (система нумерации по Kabat), положение 206 константной области каппа/лямбда-легкой цепи (система нумерации по Kabat) или положение 439 константной области тяжелой цепи антитела IgG (система нумерации по Kabat).
Аминокислотная последовательность, окружающая участок встраивания цистеина, включает одну или более из следующих трех последовательностей: LC-205ins: GLSSPCVTKS; LC-206ins: GLSSPVCTKSF или HC-439ins: TQKSLSCLSPGK.
В одном из вариантов осуществления высокоактивный цитотоксин конъюгируют с помощью линкера со свободной тиоловой группой из модифицированного цистеина, встроенного в конкретные участки встраивания цистеина антитела, где легкая цепь антитела содержит аминокислотную последовательность GLSSPCVTKSF или GLSSPVCTKSF, и тяжелая цепь антитела содержит аминокислотную последовательность TQKSLSCLSPGK, и где C является цистеином, встроенным в положение 205 легкой цепи, положение 206 легкой цепи или положение 439 тяжелой цепи антитела.
В одном из вариантов осуществления легкая цепь антитела имеет изотип каппа (κ) или лямбда (λ). В одном из вариантов осуществления тяжелая цепь антитела имеет изотип IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4. В одном из вариантов осуществления встроенный цистеин содержит тиоловую группу (-SH). В одном из вариантов осуществления тиоловая группа (-SH) способна к химической конъюгации.
В одном из вариантов осуществления низкомолекулярный, высокоактивный цитотоксин сайт-специфически соединяют со свободной тиоловой группой встроенного цистеина с помощью линкера; низкомолекулярный высокоактивный цитотоксин может включать, в качестве неограничивающих примеров, MMAE, MMAF, PBD, SN-38, Dox и их производные. Формулы примеров цитотоксинов, MMAE, MMAF, PBD, SN-38, Dox, представлены ниже:
Figure 00000001
Figure 00000002
Figure 00000003
Figure 00000004
Figure 00000005
В дополнительном аспекте настоящее изобретение относится к способам получения конъюгатов «цистеин-модифицированное антитело-цитотоксин». В одном из вариантов осуществления способ включает стадии: восстановления антитела с помощью восстановителя (такого как DTT, TCEP и т.п.) для получения восстановленного антитела, удаления защитной группы из встроенного цистеина антитела для получения свободной тиоловой группы; удаления восстановителя и защитной группы посредством катионообменной хроматографии или ультрафильтрации; окисления восстановленного антитела с помощью окислителя (такого как DHAA, CuSO4) для повторного образования межцепочечных дисульфидных связей антитела; добавления конъюгата «линкер-лекарственное средство» (т.е. линкер-цитотоксин) для конъюгации со свободной тиоловой группой модифицированного цистеина и удаления неконъюгированного конъюгата «линкер-лекарственное средство» посредством катионообменной хроматографии или ультрафильтрации.
Список аминокислот:
Название Символ и аббревиатура
Аланин A и Ala
Аргинин R и Arg
Аспарагин N и Asn
Аспарагиновая кислота D и Asp
Цистеин C и Cys
Глутамин Q и Gln
Глутаминовая кислота E и Glu
Глицин G и Gly
Гистидин H и His
Изолейцин I и Ile
Лейцин L и Leu
Лизин K и Lys
Метионин M и Met
Фенилаланин F и Phe
Пролин P и Pro
Серин S и Ser
Треонин T и Thr
Триптофан W и Trp
Тирозин Y и Tyr
Валин V и Val
SEQ ID NO: 6 Аминокислотная последовательность константной области легкой цепи (каппа)LC-Cys205insc
>LC-Cys205ins-каппа
TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSP C VTKSFNRGEC
где C в GLSSPVCTKSFN является положением сайт-специфической конъюгации. В одном из вариантов осуществления цистеин сайт-специфически конъюгируют с mc-vc-PAB-нагрузкой.
SEQ ID NO: 8 Аминокислотная последовательность константной области легкой цепи (каппа) LC-Cys206insc
>LC-Cys206ins-каппа
TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPV C TKSFNRGEC
где C в GLSSPVCTKSFN является положением сайт-специфической конъюгации. В одном из вариантов осуществления цистеин сайт-специфически конъюгируют с mc-vc-PAB-нагрузкой.
SEQ ID NO: 10 Аминокислотная последовательность константной области тяжелой цепи (Fc) IgG1-Fc-Cys439ins
>IgG1-Fc-Cys439ins
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLS C LSPGK
где C в TQKSLSCLSPGK является положением сайт-специфической конъюгации. В одном из вариантов осуществления цистеин сайт-специфически конъюгируют с mc-vc-PAB-нагрузка.
SEQ ID NO: 12 Аминокислотная последовательность константной области легкой цепи (каппа) LC-V205C
>LC-V205C-Каппа
TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPCTKSFNRGEC
где C в GLSSPCTKSFN является положением сайт-специфической конъюгации. В одном из вариантов осуществления цистеин сайт-специфически конъюгируют с mc-vc-PAB-нагрузкой.
В настоящем описании представлен новый конъюгат «цистеин-модифицированное антитело-цитотоксин» (TDC), который обладает значительными преимуществами по сравнению с не-сайт-специфически конъюгированным ADC, включая, в качестве неограничивающих примеров, хорошую гомогенность и низкую частоту побочных эффектов. Доклинические исследования подтверждали, что эти новые конъюгаты антител значительно превосходят не-сайт-специфически конъюгированные ADC.
Цели и преимущества настоящего изобретения будут очевидны из следующего подробного описания предпочтительных вариантов осуществления и сопутствующих чертежей.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Изложенные выше и другие признаки настоящего изобретения будут более очевидными из следующего описания и формулы изобретения вместе с сопутствующими чертежами. На представленных чертежах изображены лишь некоторые варианты осуществления, приведенные в соответствии с описанием, и, таким образом, не следует истолковывать их как ограничение объема настоящего изобретения, изобретение будет описано более подробно с помощью сопутствующих чертежей, на которых:
Фигура 1 является иллюстрацией, на которой показаны результаты теста по детекции и измерению 2A1-LC-Cys205ins-mc-vc-PAB-MMAEby способом HIC-ВЭЖХ, как описано в примере 25;
Фигура 2 является иллюстрацией, на которой показаны результаты теста по детекции и измерению 2A1-LC-Cys206ins-mc-vc-PAB-MMAE способом HIC-ВЭЖХ, как описано в примере 25;
Фигура 3 является иллюстрацией, на которой показаны результаты теста по детекции и измерению 2A1-HC-Cys439ins-mc-vc-PAB-MMAE способом HIC-ВЭЖХ, как описано в примере 25;
Фигура 4 является иллюстрацией, на которой показаны результаты теста по детекции и измерению 4E1-LC-Cys205ins-mc-vc-PAB-MMAE способом HIC-ВЭЖХ, как описано в примере 25;
Фигура 5 является иллюстрацией, на которой показаны результаты теста по детекции и измерению 4E1-LC-Cys206ins-mc-vc-PAB-MMAE способом HIC-ВЭЖХ, как описано в примере 25;
Фигура 6 является иллюстрацией, на которой показаны результаты теста по детекции и измерению 4E1-HC-Cys439ins-mc-vc-PAB-MMAE способом HIC-ВЭЖХ, как описано в примере 25;
Фигура 7 является иллюстрацией, на которой показаны результаты теста по детекции и измерению 4D3-LC-Cys205ins-mc-vc-PAB-MMAE способом HIC-ВЭЖХ, как описано в примере 25;
Фигура 8 является иллюстрацией, на которой показаны результаты теста по детекции и измерению 4D3-LC-Cys206ins-mc-vc-PAB-MMAE способом HIC-ВЭЖХ, как описано в примере 25;
Фигура 9 является иллюстрацией, на которой показаны результаты теста по детекции и измерению соотношения токсин/антитело для 4D3-HC-Cys439ins-mc-vc-PAB-MMAE способом RP-ВЭЖХ, как описано в примере 26.
Фигура 10 является иллюстрацией, на которой показаны результаты теста по детекции и измерению агрегации антитела-основы TDC 4D3 способом SEC-ВЭЖХ, как описано в примере 27;
Фигура 11 является иллюстрацией, на которой показаны результаты теста по детекции и измерению агрегации антитела-основы TDC 4D3-LC-Cys205ins способом SEC-ВЭЖХ, как описано в примере 27;
Фигура 12 является иллюстрацией, на которой показаны результаты теста по детекции и измерению агрегации антитела-основы TDC 4D3-LC-Cys206ins способом SEC-ВЭЖХ, как описано в примере 27;
Фигура 13 является иллюстрацией, на которой показаны результаты теста по детекции и измерению агрегации антитела-основы TDC 4D3-HC-Cys439ins способа SEC-ВЭЖХ, как описано в примере 27;
Фигура 14 является иллюстрацией, на которой показаны результаты теста из примера 28;
Фигура 15 является иллюстрацией, на которой показаны результаты теста из примера 29, где показано измерение аффинности антигена c-met и антитела 4E1 и TDC 4E1-LC-Cys205ins-MVPM, 4E1-LC-Cys206ins-MVPM и 4E1-HC-Cys439ins-MVPM;
Фигура 16 является иллюстрацией, на которой показаны результаты теста из примера 29, где показано измерение аффинности антигена Trop2 и антитела 4D3 и TDC 4D3-LC-Cys205ins-MVPM, 4D3-LC-Cys206ins-MVPM и 4D3-HC-Cys439ins-MVPM;
На фигуре 17 показана IC50 для цитотоксичности ADC против злокачественных клеток, где ADC представляют собой 2A1-LC-V205C-mc-vc-PAB-MMAE, 2A1-LC-Cys205ins-mc-vc-PAB-MMAE, 2A1-LC-Cys206ins-mc-vc-PAB-MMAE и 2A1-HC-Cys439ins-mc-vc-PAB-MMA, и злокачественные клетки представляют собой EGFRwt-гиперэкспрессирующие клетки плоскоклеточной карциномы человека A431;
На фигуре 18 показана IC50 для цитотоксичности ADC против злокачественных клеток, где ADC представляют собой 2A1-LC-V205C-mc-vc-PAB-MMAE, 2A1-LC-Cys205ins-mc-vc-PAB-MMAE, 2A1-LC-Cys206ins-mc-vc-PAB-MMAE и 2A1-HC-Cys439ins-mc-vc-PAB-MMAE, и злокачественные клетки представляют собой EGFRvIII-гиперэкспрессирующую линию клеток глиомы человека U87-EGFRvIII;
На фигуре 19 показана IC50 для цитотоксичности ADC против злокачественных клеток, где ADC представляют собой 4E1-LC-Cys205ins-mc-vc-PAB-MMAE, 4E1-LC-Cys206ins-mc-vc-PAB-MMAE, 4E1-HC-Cys439ins-mc-vc-PAB-MMAE и 4E1, и злокачественные клетки представляют собой C-met-высокоэкспрессирующую линию клеток глиомы U87-MG;
На фигуре 20 показана IC50 для цитотоксичности ADC против злокачественных клеток, где ADC представляют собой D3-LC-Cys205ins-mc-vc-PAB-MMAE, 4D3-LC-Cys206ins-mc-vc-PAB-MMAE, 4D3-HC-Cys439ins-mc-vc-PAB-MMAE и 4D3, и злокачественные клетки представляют собой trop2-высокоэкспрессирующую линию клеток рака поджелудочной железы BXPC-3;
Фигура 21 является иллюстрацией, на которой показаны результаты теста по измерению стабильности в плазме человека в случае 4D3-LC-Cys205ins-mc-vc-PAB-MMAE;
Фигура 22 является иллюстрацией, на которой показаны результаты теста по измерению стабильности в плазме человека в случае 4D3-LC-Cys206ins-mc-vc-PAB-MMAE;
Фигура 23 является иллюстрацией, на которой показаны результаты теста по измерению стабильности в плазме человека в случае 4D3-HC-Cys439ins-mc-vc-PAB-MMAE;
Фигура 24 является иллюстрацией, на которой показаны результаты теста по измерению стабильности в плазме человека в случае 4E1-LC-Cys205ins-mc-vc-PAB-MMAE;
Фигура 25 является иллюстрацией, на которой показаны результаты теста по измерению стабильности в плазме человека в случае 4E1-LC-Cys206ins-mc-vc-PAB-MMAE;
Фигура 26 является иллюстрацией, на которой показаны результаты теста по измерению стабильности в плазме человека в случае 4E1-HC-Cys439ins-mc-vc-PAB-MMAE;
Фигура 27 является иллюстрацией, на которой показаны результаты теста по измерению фармакодинамического эффекта в случае 4D3-LC-Cys205ins-mc-vc-PAB-MMAE, 4D3-LC-Cys206ins-mc-vc-PAB-MMAE, 4D3-HC-Cys439ins-mc-vc-PAB-MMAE и родительского антитела 4D3 у несущих опухоль мышей; и
Фигура 28 является иллюстрацией, на которой показаны результаты теста по измерению фармакодинамического эффекта в случае 4D3-LC-Cys205ins-mc-vc-PAB-MMAE, 4D3-LC-Cys206ins-mc-vc-PAB-MMAE, 4D3-HC-Cys439ins-mc-vc-PAB-MMAE, 4D3-HC-Cys439ins-mc-vc-PAB-MMAE и родительского антитела 4D3 у несущих опухоль мышей.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ
В следующем подробном описании приведены ссылки на сопутствующие чертежи, являющиеся его частью. На чертежах схожими символами, как правило, указаны схожие компоненты, если контекст не указывает на иное. Иллюстративные варианты осуществления, представленные в подробном описании, чертежах и формуле изобретения, не являются ограничивающими. Можно использовать другие варианты осуществления и можно осуществлять изменения без отклонения от сущности или объема изобретения, описанного в настоящей заявке. Следует понимать, что аспекты настоящего изобретения, в целом, описываемые в настоящей заявке и проиллюстрированные на фигурах, можно размещать, заменять, комбинировать, разделять и планировать в различных конфигурациях, все из которых конкретно предусмотрены в настоящем описании.
Пример 1: Синтез и получение mc
Figure 00000006
6-аминокапроновую кислоту (3,9 г, 0,03 моль) и малеиновый ангидрид(3,5 г, 0,036 моль) добавляли к ледяной уксусной кислоте (30 мл). После перемешивания при 120°C в течение 4-6 ч. реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры. Большую часть уксусной кислоты удаляли посредством концентрирования в вакууме при 60°C. Полученную коричневато-желтую вязкую жидкость наливали в воду, а затем экстрагировали этилацетатом (20 мл × 3) и объединяли органические слои. Органические слои промывали водой и солевым раствором, сушили безводным сульфатом натрия, фильтровали и выпаривали в вакууме для получения коричнево-желтого маслянистого вещества, которое перемешивали в 50 мл воды, и белых твердых веществ, осаждающихся из раствора, белые твердые вещества фильтровали и сушили продукт при пониженном давлении и 50°C, 5,08 г, выход 80%. Mp: 89-92°C. m/z: 212,2 [M+H]+. 1H ЯМР (400Mz, DMSO): 13,21 (ш.с., 1H, COOH), 6,75 (с, 2H, COCH=CHCO), 3,63 (т, 2H, J=7,2 Гц, NCH2CH2), 2,42 (т, 2H, J=7,4 Гц, CH2COOH), 1,52-1,68 (м, 4H, NCH2CH2CH2CH2), 1,30-1,42 (м, 2H, NCH2CH2CH2CH2).
Пример 2: Синтез и получение Mc-OSu
Figure 00000007
В атмосфере азота к раствору смеси MC (4,7 г, 22 ммоль) и HOSu (25 г, 22 ммоль) в ацетонитриле (50 мл) при 0°C медленно добавляли DCC (4,5 г, 22 ммоль), растворенный в 25 мл ацетонитрила. Реакционный раствор реагировал при 0°C в течение 2 часов, а затем ему позволяли реагировать при комнатной температуре в течение ночи. После фильтрования фильтрационный осадок промывали ацетонитрилом (10 мл×3). Фильтрат концентрировали до высушивания при пониженном давлении. Полученное маслянистое вещество сушили при пониженном давлении и комнатной температуре в течение 6 ч. для получения 6,4 г светло-коричневого твердого вещества, выход 95% (для использования непосредственно на следующей стадии без очистки). m/z: 309,2 [M+H]+ 1HNMR (400Mz, CDCl3): 1~2 (м, 6H, CCH2CH2CH2C), 2,68 (т, 2H, CH2CO), 2,95 (с, 4H, COCH2CH2CO), 3,68 (т, 2H, CH2N), 6,81 (с, 2H, CH=CH).
Пример 3: Синтез и получение Fmoc-Val-OSu
Figure 00000008
К раствору смеси Fmoc-Val (10 г) и HOSu (3,4 г) в THF (100 мл) при 0°C медленно добавляли DCC (6 г), растворенный в 50 мл ацетонитрила. Реакционный раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 24 часов. Осуществляли фильтрацию и промывали фильтрационный осадок THF. Прозрачное маслянистое вещество получали посредством концентрирования фильтратов при пониженном давлении. Маслянистое вещество использовали непосредственно на следующей стадии без дальнейшей очистки. m/z:437,4 [M+H]+.
Пример 4: Синтез и получение Fmoc-vc
Figure 00000009
К раствору Cit (4,0 г) в THF (20 мл) добавляли 60 мл водного раствора гидрокарбоната натрия (содержащего NaHCO3, 2 г, 1,05 экв.). В смесь добавляли раствор Fmoc-Val-OSu (22,35 ммоль) в DME (60 мл). После перемешивания при комнатной температуре в течение 24 часов в реакционную смесь добавляли 15% водный раствор лимонной кислоты (110 мл), а затем дважды экстрагировали с помощью EtOAc. Объединенные органические фазы концентрировали в вакууме для получения белого твердого вещества. К белому материалу добавляли 100 мл метил-трет-бутилового эфира, смесь перемешивали, фильтровали и сушили фильтрационный осадок при пониженном давлении и 40°C в течение 4 ч. для получения 4,83 г продукта, выход 65%. m/z: 497,6 (M+H)+ 1HNMR (400Mz, DMSO): 0,92 (6H, м), 1,35 ~ 1,65 (4H, м), 2,10 (1H, м), 3,01(2H, к), 3,99 (1H, т), 4,01 -4,45 (2H, м), 4,45 (2H, т), 5,46 (2H, ш.с.), 6,03(1H, т), 7,20-8,02 (8H, м), 8,25 (1H, д).
Пример 5: Синтез и получение Fmoc-vc-PABOH
Figure 00000010
К раствору Fmoc-vc (2 г, 4,2 ммоль) и PABOH(1,04 г, 2 экв.) в DCM/MeOH (2/1) (60 мл) добавляли EEDQ (2,0 г, 2 экв.) при 0°C. После перемешивания в течение 10 мин к смеси после частичного растворения медленно добавляли раствор (S)-1-фенилэтанамина (17,5 г, 144,2 ммоль) в MeOH (200 мл). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 дней в темноте. После завершения реакции смесь концентрировали в вакууме при 40°C для получения белого твердого вещества. Белое твердое вещество собирали, промывали метил-трет-бутиловым эфиром (100 мл) и фильтровали. Фильтрационный осадок промывали метил-трет-бутиловым эфиром и полученное белое твердое вещество сушили при пониженном давлении и 40°C для получения 2,2 г белого твердого вещества, и выход 88%. m/z: 602,6 (M+H)+. 1HNMR (400Mz, DMSO): 0,95 (6H, м), 1,45~1,69 (4H, м), 2,10 (1H, м), 3,11(2H, м), 3,99 (1H, м), 4,30 (2H, д), 4,05~-4,66 (2H, м), 4,55 (2H, д), 5,21 (1H, т), 5,51 (2H, ш.с.), 6,11(1H, т), 7,09 -8,10 (12H, м), 8,21 (1H, д), 10,51(1H, ш.с.).
Пример 6: Синтез и получение vc-PABOH
Figure 00000011
К раствору Fmoc-vc-PABOH (490 мг, 0,815 ммоль) в THF (10 мл) добавляли диэтиламин (2 мл). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 24 ч. К полученному продукту добавляли 20 мл DCM, смесь перемешивали и из реакционного раствора осаждали кристаллическое вещество. Кристаллическое вещество фильтровали и промывали фильтрационный осадок DCM, полученное твердое вещество сушили при пониженном давлении для получения 277 мг. Выход составлял 90%. m/z: 380,2 (M+H)+ 1HNMR (400Mz, DMSO): 0,89 (6H, м), 1,31~1,61 (4H, м), 1,82 (1H, м), 2,86 (1H, м), 2,89(2H, д), 4,38 (2H, д), 4,44 (1H, м), 5,01 (1H, ш.с.), 5,35 (2H, ш.с.), 5,84 (1H, ш.с.), 7,14 (2H, д), 7,42 (2H, д), 8,08 (1H, ш.с.), 9,88 (1H, ш.с.).
Пример 7: Синтез и получение mc-vc-PABOH
Figure 00000012
VP-PABOH(205 мг, 0,54 ммоль) и MC-OSu (184 мг, 1,1 экв.) добавляли к 10 мл NMP и перемешивали реакционную смесь при комнатной температуре в течение 24 ч. После завершения реакции смесь концентрировали в вакууме при 40°C. К полученному маслянистому веществу добавляли метил-трет-бутиловый эфир (20 мл) и перемешивали для кристаллизации. После фильтрования кристаллического вещества и промывки фильтрационного осадка метил-трет-бутиловым эфиром получали 310 мг продукта. Выход составляет 100%. m/z: 573,3 (M+H)+ 1HNMR (400Mz, DMSO): 0,89 (6H, м), 1,15-1,99 (10H, м), 2,11(1H, м), 2,31 (2H, т), 3,21(2H, м), 3,53 (2H, т), 4,32 (1H, т), 4,51 (1H, м), 4,59 (2H, ш.с.), 5,24 (1H, ш.с.), 5,56 (2H, ш.с.), 6,20(1H, ш.с.), 7,12(2H, с), 7,23(2H, д),7,58 (2H, д), 7,94 (1H, д), 8,1 7 (1H, д), 10,21 (1H, ш.с.)
Пример 8: Синтез и получение mc-vc-PAB-PNP
Figure 00000013
В атмосфере азота к раствору mc-vc-PABOH (166,0 мг, 0,294 ммоль) в безводном пиридине (5 мл) медленно добавляли PNP (179 мг, 3 экв.), растворенный в DCM (5 мл), при 0°C. После перемешивания при приблизительно 0°C в течение 10 мин убирали ледяную баню и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 3 ч. После завершения реакции добавляли EA (70 мл) и 15% водный раствор лимонной кислоты (100 мл) и разделяли и выделяли органический слой. Органический слой последовательно промывали лимонной кислотой, водой, солевым раствором, сушили безводным сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали фильтрат при пониженном давлении для получения светлого желтоватого маслянистого продукта. Добавление метил-трет-бутилового эфира для кристаллизации приводило к получению белого твердого вещества (86 мг). Выход составлял 40%. m/z: 738(M+H)+ 1HNMR (400Mz, CDCl3/CD3OD): 0,84 (6H, м), 1,11-1,84 (10H, м), 2,05 (1H, м), 2,15 (2H, т), 3,09 (2H, м), 3,32 (2H, т), 4,12 (1H, м), 4,38 (1H, м), 5,15 (2H, с), 6,61 (2H, с), 6,84 (1H, д),7,61 (1H, д), 7,21 (2H, д), 7,50 (2H, д), 7,61 (2H, д), 8,18 (2H, д), 9,59 (1H, ш.с.)
Пример 9: Синтез и получение mc-vc-PAB-MMAE
Figure 00000014
20 мг mc-vc-PAB-PNP (1,5 экв.) и 3 мг HOBT добавляли к 2 мл DMF. После перемешивания при комнатной температуре в течение минуты добавляли 13 мг MMAE, 0,5 мл пиридина и 25 мкл DIEA. Реакционный раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 2 дней. После завершения реакции реакционный раствор очищали с помощью препаративной колонки и желаемые компоненты собирали, концентрировали и лиофилизировали для получения приблизительно 10 мг продукта, выход составлял приблизительно 42%. m/z: 1317,1 (M+H)+.
Пример 10: Синтез и получение mc-vc-PAB-MMAF
Figure 00000015
Осуществляли стадии из примера 9, получали приблизительно 12,5 мг mc-vc-PAB-MMAF, выход составлял 45,2%.
Пример 11: Синтез и получение mc-vc-PAB-PBD
Figure 00000016
Осуществляли стадии из примера 9, получали приблизительно 9,5 мг mc-vc-PAB-PBD. Выход составлял 32,5%. m/z: 1325,4 (M+H)+.
Пример 12: Синтез и получение mc-vc-PAB-DOX
Figure 00000017
Осуществляли стадии из примера 9, получали приблизительно 11,2 мг mc-vc-PAB-DOX. Выход составлял 38,9%. m/z: 1143,2 (M+H)+.
Пример 14: Синтез и получение mc-vc-PAB-SN-38
Figure 00000018
100 мг 10-O-Boc-SN-38 растворяли в 10 мл сухого дихлорметана, к растворителю добавляли 25,6 мг (1 экв.) DMAP, по каплям добавляли раствор трифосгена в дихлорметане при 0°C (62 мг трифосгена растворяли в 2 мл дихлорметана) и продолжали реакцию при 0°C в течение 12 ч. Дихлорметан удаляли при пониженном давлении. Неочищенные продукты растворяли в 10 мл сухого DMF, затем добавляли 144 мг mc-vc-PABOH и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 24 ч. 41 мг mc-vc-PAB-SN-38 выделяли посредством отделения жидкой фазы препарата, и общий выход в двух стадиях составлял 19,7%. m/z: 1063,2(M+H)+.
Пример 15: Экспрессия и очистка целевого антитела
Целевое антитело экспрессировали с использованием клеток Freestyle™ 293-F (Invitrogen) в суспензионной культуре. За день до трансфекции клетки высевали при плотности 6×105 клетки/мл во встряхиваемой колбе емкостью 1 л, содержащей 300 мл полной среды F17 (экспрессионной среды Freestyle™ F17, Gibco), выращивали в течение ночи при встряхивании при 37°C, 5% CO2, 120 об/мин в клеточном инкубаторе. На следующий день осуществляли трансфекцию плазмиды для экспрессии антитела с использованием PEI, где соотношение плазмида:PEI составляло 2:1. Через день после трансфекции добавляли питательную среду TN1 в количестве 2,5% (об./об.), продолжали культивирование в течение 4 дней и собирали супернатант посредством центрифугирования.
Собранный супернатант экспрессирующих клеток элюировали с помощью колонки для аффинной хроматографии белков (Mabselect Sure LX, GE) и 0,1 M лимонной кислоты (pH 3,0), захваченное антитело обрабатывали 1 M Трис-HCl (pH 9,0) и доводили до pH 7,0 при 1/10 (об./об.). Удаляли примеси, такие как мультимеры и эндотоксин, с помощью колонки для гель-фильтрации SEC (Superdex 200, GE) и одновременно буфер для антитела заменяли PBS (pH 7,4), образец с целевым пиком поглощения УФ при 280 нм собирали и концентрировали до 2 мг/мл с помощью центрифужной пробирки для ультрафильтрация (30 KD, Pall Corporation). Целевой мономер антитела (POI%), полученный этим способом, составлял более 90%, и его хранили для последующих экспериментов.
Пример 16: Синтез и получение TDC 2A1-HC-Cys439ins-mc-vc-PAB-MMAE посредством конъюгации/соединения антитела 2A1-HC-Cys439ins и mc-vc-PAB-MMAE
Антитело 2A1-HC-Cys439ins, экспрессируемое клетками, очищали с помощью смолы с протеином A, такой как Mabselect Sure, элюировали раствором с низким pH и нейтрализовали посредством добавления раствора Трис непосредственно после элюции при низком pH, раствор заменяли буфером Трис-HCl с pH 7,5. Соединение mc-vc-PAB-MMAE, представляющее собой белый порошок, растворяли в DMA для последующего использования. Для удаления защитной группы на мутантном остатке цистеина сначала восстанавливали антитело. 1 M водный раствор DTT добавляли к раствору антитела 2A1-HC-Cys439ins при молекулярном соотношении 1:40, смесь равномерно смешивали и проводили реакцию при 20°C в течение 2 часов. По истечении времени реакции pH образца доводили до 5,0, и DTT и защитную группу в смеси удаляли посредством катионообменной хроматографии, например, с помощью смолы SP Sepharose F.F. Затем к образцу добавляли раствор DHAA при молекулярном соотношении 1:20 и проводили реакцию при 25°C в течение 4 часов в темноте для повторного образования межцепочечных дисульфидных связей. Затем добавляли раствор mc-vc-PAB-MMAE для соединения mc-vc-PAB-MMAE с встроенным или мутантным цистеином в антителе, смесь тщательно смешивали и проводили реакцию при 25°C в течение 2 часов. После завершения реакции mc-vc-PAB-MMAE, к которому не было присоединено антитело, удаляли посредством катионообменной хроматографии, например, с помощью SP Sepharose F.F., для получения образца TDC 2A1-HC-Cys439ins-mc-vc-PAB-MMAE.
Пример 17: Синтез и получение образца TDC 2A1-LC-Cys205ins-mc-vc-PAB-MMAE посредством конъюгации/соединения антитела 2A1-LC-Cys205ins и mc-vc-PAB-MMAE
Антитело 2A1-LC-Cys205ins, экспрессируемое клетками, очищали с помощью смолы с протеином A, такой как Mabselect Sure, элюировали раствором с низким pH и нейтрализовали посредством добавления раствора Трис непосредственно после элюции при низком pH, раствор заменяли буфером Трис-HCl с pH 7,5. Соединение mc-vc-PAB-MMAE, представляющее собой белый порошок, растворяли в DMA для последующего использования. Для удаления защитной группы на мутантном остатке цистеина сначала восстанавливали антитело. 1 M водный раствор DTT добавляли к раствору антитела 2A1-LC-Cys205ins при молекулярном соотношении 1:40, смесь равномерно смешивали и проводили реакцию при 20°C в течение 2 часов. По истечении времени реакции pH образца доводили до 5,0 и DTT и защитную группу в смеси удаляли посредством катионообменной хроматографии, например, с помощью смолы SP Sepharose F.F. Затем к образцу добавляли раствор DHAA при молекулярном соотношении 1:20 и проводили реакцию при 25°C в течение 4 часов в темноте для повторного образования межцепочечных дисульфидных связей. Затем добавляли раствор mc-vc-PAB-MMAE для соединения mc-vc-PAB-MMAE с встроенным или мутантным цистеином в антителе, смесь тщательно смешивали и проводили реакцию при 25°C в течение 2 часов. После завершения реакции mc-vc-PAB-MMAE, к которому не было присоединено антитело, удаляли посредством катионообменной хроматографии, например, с помощью SP Sepharose F.F., для получения образца TDC 2A1-LC-Cys205ins-mc-vc-PAB-MMAE.
Пример 18: Синтез и получение образца TDC 2A1-LC-Cys206ins-mc-vc-PAB-MMAE посредством конъюгации/соединения антитела 2A1-LC-Cys206ins и mc-vc-PAB-MMAE
Антитело 2A1-LC-Cys206ins, экспрессируемое клетками, очищали с помощью смолы с протеином A, такой как Mabselect Sure, элюировали раствором с низким pH и нейтрализовали посредством добавления раствора Трис непосредственно после элюции при низком pH, раствор заменяли буфером Трис-HCl с pH 7,5. Соединение mc-vc-PAB-MMAE, представляющее собой белый порошок, растворяли в DMA для последующего использования. Для удаления защитной группы на мутантном остатке цистеина сначала восстанавливали антитело. 1 M водный раствор DTT добавляли к раствору антитела 2A1-LC-Cys206ins при молекулярном соотношении 1:40, смесь равномерно смешивали и проводили реакцию при 20°C в течение 2 часов. По истечении времени реакции pH образца доводили до 5,0, и DTT и защитную группу в смеси удаляли посредством катионообменной хроматографии, например, с помощью смолы SP Sepharose F.F. Затем к образцу добавляли раствор DHAA при молекулярном соотношении 1:20 и проводили реакцию при 25°C в течение 4 часов в темноте для повторного образования межцепочечных дисульфидных связей. Затем добавляли раствор mc-vc-PAB-MMAE для соединения mc-vc-PAB-MMAE с встроенным или мутантным цистеином в антителе, смесь тщательно смешивали и проводили реакцию при 25°C в течение 2 часов. После завершения реакции mc-vc-PAB-MMAE, к которому не было присоединено антитело, удаляли посредством катионообменной хроматографии, например, с помощью SP Sepharose F.F., для получения образца TDC 2A1-LC-Cys206ins-mc-vc-PAB-MMAE.
Пример 19: Синтез и получение образца TDC 4D3-HC-Cys439ins-mc-vc-PAB-MMAE посредством конъюгации/соединения антитела 4D3-HC-Cys439ins и mc-vc-PAB-MMAE
Антитело 4D3-HC-Cys439ins, экспрессируемое клетками, очищали с помощью смолы с протеином A, такой как Mabselect Sure, элюировали раствором с низким pH и нейтрализовали посредством добавления раствора Трис непосредственно после элюции при низком pH, раствор заменяли буфером Трис-HCl с pH 7,5. Соединение mc-vc-PAB-MMAE, представляющее собой белый порошок, растворяли в DMA для последующего использования. Для удаления защитной группы на мутантном остатке цистеина сначала восстанавливали антитело. 1 M водный раствор DTT добавляли к раствору антитела 4D3-HC-Cys439ins при молекулярном соотношении 1:40, смесь равномерно смешивали и проводили реакцию при 20°C в течение 2 часов. По истечении времени реакции pH образца доводили до 5,0 и DTT и защитную группу в смеси удаляли посредством катионообменной хроматографии, например, с помощью смолы SP Sepharose F.F.
Затем к образцу добавляли раствор DHAA при молекулярном соотношении 1:20 и проводили реакцию при 25°C в течение 4 часов в темноте для повторного образования межцепочечных дисульфидных связей. Затем добавляли раствор mc-vc-PAB-MMAE для соединения mc-vc-PAB-MMAE с встроенным или мутантным цистеином в антителе, смесь тщательно смешивали и проводили реакцию при 25°C в течение 2 часов. После завершения реакции mc-vc-PAB-MMAE, к которому не было присоединено антитело, удаляли посредством катионообменной хроматографии, например, с помощью SP Sepharose F.F., для получения образца TDC 4D3-HC-Cys439ins-mc-vc-PAB-MMAE.
Пример 20: Синтез и получение образца TDC 4D3-LC-Cys205ins-mc-vc-PAB-MMAE посредством конъюгации/соединения антитела 4D3-LC-Cys205ins и mc-vc-PAB-MMAE
Антитело 4D3-LC-Cys205ins, экспрессируемое клетками, очищали с помощью смолы с протеином A, такой как Mabselect Sure, элюировали раствором с низким pH и нейтрализовали посредством добавления раствора Трис непосредственно после элюции при низком pH, раствор заменяли буфером Трис-HCl с pH 7,5. Соединение mc-vc-PAB-MMAE, представляющее собой белый порошок, растворяли в DMA для последующего использования. Для удаления защитной группы на мутантном остатке цистеина сначала восстанавливали антитело. 1 M водный раствор DTT добавляли к раствору антитела 4D3-LC-Cys205ins при молекулярном соотношении 1:40, смесь равномерно смешивали и проводили реакцию при 20°C в течение 2 часов. По истечении времени реакции pH образца доводили до 5,0 и DTT и защитную группу в смеси удаляли посредством катионообменной хроматографии, например, с помощью смолы SP Sepharose F.F. Затем к образцу добавляли раствор DHAA при молекулярном соотношении 1:20 и проводили реакцию при 25°C в течение 4 часов в темноте для повторного образования межцепочечных дисульфидных связей. Затем добавляли раствор mc-vc-PAB-MMAE для соединения mc-vc-PAB-MMAE с встроенным или мутантным цистеином в антителе, смесь тщательно смешивали и проводили реакцию при 25°C в течение 2 часов. После завершения реакции mc-vc-PAB-MMAE, к которому не было присоединено антитело, удаляли посредством катионообменной хроматографии, например, с помощью SP Sepharose F.F., для получения образца TDC 4D3-LC-Cys205ins-mc-vc-PAB-MMAE.
Пример 21: Синтез и получение образца TDC 4D3-LC-Cys206ins-mc-vc-PAB-MMAE посредством конъюгации/соединения антитела 4D3-LC-Cys206ins и mc-vc-PAB-MMAE
Антитело 4D3-LC-Cys206ins, экспрессируемое клетками, очищали с помощью смолы с протеином A, такой как Mabselect Sure, элюировали раствором с низким pH и нейтрализовали посредством добавления раствора Трис непосредственно после элюции при низком pH, раствор заменяли буфером Трис-HCl с pH 7,5. Соединение mc-vc-PAB-MMAE, представляющее собой белый порошок, растворяли в DMA для последующего использования. Для удаления защитной группы на мутантном остатке цистеина сначала восстанавливали антитело. 1 M водный раствор DTT добавляли к раствору антитела 4D3-LC-Cys206ins при молекулярном соотношении 1:40, смесь равномерно смешивали и проводили реакцию при 20°C в течение 2 часов. По истечении времени реакции pH образца доводили до 5,0 и DTT и защитную группу в смеси удаляли посредством катионообменной хроматографии, например, с помощью смолы SP Sepharose F.F. Затем к образцу добавляли раствор DHAA при молекулярном соотношении 1:20 и проводили реакцию при 25°C в течение 4 часов в темноте для повторного образования межцепочечных дисульфидных связей. Затем добавляли раствор mc-vc-PAB-MMAE для соединения mc-vc-PAB-MMAE с встроенным или мутантным цистеином в антителе, смесь тщательно смешивали и проводили реакцию при 25°C в течение 2 часов. После завершения реакции mc-vc-PAB-MMAE, к которому не было присоединено антитело, удаляли посредством катионообменной хроматографии, например, с помощью SP Sepharose F.F., для получения образца TDC 4D3-LC-Cys206ins-mc-vc-PAB-MMAE.
Пример 22: Синтез и получение образца TDC 4E1-HC-Cys439ins-mc-vc-PAB-MMAE посредством конъюгации/соединения антитела 4E1-HC-Cys439ins и mc-vc-PAB-MMAE
Антитело 4E1-HC-Cys439ins, экспрессируемое клетками, очищали с помощью смолы с протеином A, такой как Mabselect Sure, элюировали раствором с низким pH и нейтрализовали посредством добавления раствора Трис непосредственно после элюции при низком pH, раствор заменяли буфером Трис-HCl с pH 7,5. Соединение mc-vc-PAB-MMAE, представляющее собой белый порошок, растворяли в DMA для последующего использования. Для удаления защитной группы на мутантном остатке цистеина сначала восстанавливали антитело. 1 M водный раствор DTT добавляли к раствору антитела 4E1-HC-Cys439ins при молекулярном соотношении 1:40, смесь равномерно смешивали и проводили реакцию при 20°C в течение 2 часов. По истечении времени реакции pH образца доводили до 5,0 и DTT и защитную группу в смеси удаляли посредством катионообменной хроматографии, например, с помощью смолы SP Sepharose F.F. Затем к образцу добавляли раствор DHAA при молекулярном соотношении 1:20 и проводили реакцию при 25°C в течение 4 часов в темноте для повторного образования межцепочечных дисульфидных связей. Затем добавляли раствор mc-vc-PAB-MMAE для соединения mc-vc-PAB-MMAE с встроенным или мутантным цистеином в антителе, смесь тщательно смешивали и проводили реакцию при 25°C в течение 2 часов. После завершения реакции mc-vc-PAB-MMAE, к которому не было присоединено антитело, удаляли посредством катионообменной хроматографии, например, с помощью SP Sepharose F.F., для получения образца TDC 4E1-HC-Cys439ins-mc-vc-PAB-MMAE.
Пример 23: Синтез и получение образца TDC 4E1-LC-Cys205ins-mc-vc-PAB-MMAE посредством конъюгации/соединения антитела 4E1-LC-Cys205ins и mc-vc-PAB-MMAE
Антитело 4E1-LC-Cys205ins, экспрессируемое клетками, очищали с помощью смолы с протеином A, такой как Mabselect Sure, элюировали раствором с низким pH и нейтрализовали посредством добавления раствора Трис непосредственно после элюции при низком pH, раствор заменяли буфером Трис-HCl с pH 7,5. Соединение mc-vc-PAB-MMAE, представляющее собой белый порошок, растворяли в DMA для последующего использования. Для удаления защитной группы на мутантном остатке цистеина сначала восстанавливали антитело. 1 M водный раствор DTT добавляли к раствору антитела 4E1-LC-Cys205ins при молекулярном соотношении 1:40, смесь равномерно смешивали и проводили реакцию при 20°C в течение 2 часов. По истечении времени реакции pH образца доводили до 5,0 и DTT и защитную группу в смеси удаляли посредством катионообменной хроматографии, например, с помощью смолы SP Sepharose F.F. Затем к образцу добавляли раствор DHAA при молекулярном соотношении 1:20 и проводили реакцию при 25°C в течение 4 часов в темноте для повторного образования межцепочечных дисульфидных связей. Затем добавляли раствор mc-vc-PAB-MMAE для соединения mc-vc-PAB-MMAE с встроенным или мутантным цистеином в антителе, смесь тщательно смешивали и проводили реакцию при 25°C в течение 2 часов. После завершения реакции mc-vc-PAB-MMAE, к которому не было присоединено антитело, удаляли посредством катионообменной хроматографии, например, с помощью SP Sepharose F.F., для получения образца TDC 4E1-LC-Cys205ins-mc-vc-PAB-MMAE.
Пример 24: Синтез и получение образца TDC 4E1-LC-Cys206ins-mc-vc-PAB-MMAE посредством конъюгации/соединения антитела 4E1-LC-Cys206ins и mc-vc-PAB-MMAE
Антитело 4E1-LC-Cys206ins, экспрессируемое клетками, очищали с помощью смолы с протеином A, такой как Mabselect Sure, элюировали раствором с низким pH и нейтрализовали посредством добавления раствора Трис непосредственно после элюции при низком pH, раствор заменяли буфером Трис-HCl с pH 7,5. Соединение mc-vc-PAB-MMAE, представляющее собой белый порошок, растворяли в DMA для последующего использования. Для удаления защитной группы на мутантном остатке цистеина сначала восстанавливали антитело. 1 M водный раствор DTT добавляли к раствору антитела 4E1-LC-Cys206ins при молекулярном соотношении 1:40, смесь равномерно смешивали и проводили реакцию при 20°C в течение 2 часов. По истечении времени реакции pH образца доводили до 5,0 и DTT и защитную группу в смеси удаляли посредством катионообменной хроматографии, например, с помощью смолы SP Sepharose F.F. Затем к образцу добавляли раствор DHAA при молекулярном соотношении 1:20 и проводили реакцию при 25°C в течение 4 часов в темноте для повторного образования межцепочечных дисульфидных связей. Затем добавляли раствор mc-vc-PAB-MMAE для соединения mc-vc-PAB-MMAE с встроенным или мутантным цистеином в антителе, смесь тщательно смешивали и проводили реакцию при 25°C в течение 2 часов. После завершения реакции mc-vc-PAB-MMAE, к которому не было присоединено антитело, удаляли посредством катионообменной хроматографии, например, с помощью SP Sepharose F.F., для получения образца TDC 4E1-LC-Cys206ins-mc-vc-PAB-MMAE.
Пример 25: Измерение соотношения токсин:антитело (DAR, соотношение лекарственного средства и антитела) посредством HIC-ВЭЖХ
Образец TDC анализировали посредством высокоэффективной жидкостной хроматографии с гидрофобными взаимодействиями и из соответствующей площади пика вычисляли соотношение лекарственное средство:антитело (DAR, также известное как соотношение токсин:антитело). Один конкретный способ подробно описан далее:
Колонка: Proteomix® HICBu‐NP5 (5 мкм, 4,6×35 мм);
Подвижная фаза: Буфер A: 2 M сульфат аммония, 0,025 M фосфатный буфер, pH 7; буфер B: 0,025 M фосфатный буфер, pH 7; буфер C: 100% изопропанол;
Буфер A использовали для уравновешивания, буфер B и буфер C использовали для градиентной элюции, детекцию осуществляли при 25°C и длинах волн 214 нм и 280 нм. Учитывая данные, представленные на фигурах 1-3, вычисленное DAR для сайт-специфического присоединения составляло от 1,6 до 1,7, что свидетельствует об исключительной однородности или гомогенности соединения. Учитывая данные, представленные на фигурах 4-6, вычисленное DAR для сайт-специфического присоединения составляло от 1,6 до 1,95, что свидетельствует об исключительной однородности или гомогенности соединения. Учитывая данные, представленные на фигурах 7-8, вычисленное DAR для сайт-специфического присоединения составляло от 1,6 до 1,9, что свидетельствует об исключительной однородности или гомогенности соединения.
Пример 26: Измерение соотношения токсин:антитело (DAR, соотношение лекарственного средства и антитела) посредством RP-ВЭЖХ
Соотношение токсина и антитела измеряли посредством RP-ВЭЖХ. Образцы, обработанные DTT, анализировали посредством обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии с гидрофобными взаимодействиями, и из соответствующей площади пика вычисляли DAR. Один конкретный способ подробно описан далее:
Колонка: Proteomix RP-1000 (5 мкм, 4,6×100 мм)
Подвижная фаза: Буфер A: 0,1% водный раствор TFA; буфер B: 0,1% раствор ацетонитрила.
Подвижную фазу A и подвижную фазу B использовали для элюции в пропорциональном градиенте при 80°C, измерение осуществляли при длинах волн 214 нм и 280 нм. Учитывая данные, представленные на фигуре 9, вычисленное DAR для сайт-специфического присоединения составляло 1,82, что свидетельствует об исключительной однородности или гомогенности соединения.
Таблица I: Эффективность присоединения в соответствии с DAR в случае ADR TDC 2A1-LC-V205C-mc-vc-PAB-MMAE, TDC 2A1-LC-Cys205ins-mc-vc-PAB-MMAE, TDC 2A1-LC-Cys206ins--mc-vc-PAB-MMAE, 2A1-HC-Cys439ins-mc-vc-PAB-MMAE, 4E1-LC-Cys205ins-mc-vc-PAB-MMAE, 4E1-LC-Cys206ins-mc-vc-PAB-MMAE, 4E1-HC-Cys439ins-mc-vc-PAB-MMAE TDC, 4D3-LC-Cys205ins-mc-vc-PAB-MMAE, 4D3-LC-Cys206ins-mc-vc-PAB-MMAE, 4D3-HC-Cys439ins-mc-vc-PAB-MMAE
Figure 00000019
В таблице I показано, что эффективность присоединения для сайт-специфических соединений TDC при модификации в виде мутации с инсерцией цистеина является однородно высокой (теоретический максимум составляет 2,0) с DAR≥1,6.
Пример 27: Измерение агрегации антитела-основы TDC посредством SEC-ВЭЖХ
Образцы антитела-основы TDC хранили при 37°C и их агрегацию анализировали посредством SEC-ВЭЖХ в дни 0, 7, 21 и 29, соответственно. Один конкретный способ подробно описан далее:
Хроматографические колонки: TSKgel SuperSW mAb HR (7,8 мм×30cm),
Подвижная фаза: 0,1 M сульфат натрия, 0,1 M фосфатный буфер, pH 6,7,
Измерения осуществляли при 25°C, 280 нм.
Как показано на фигурах 10-13, SEC-ВЭЖХ использовали для детекции и измерения агрегации антитела-основы TDC 4D3, 4D3-LC-Cys205ins, 4D3-LC-Cys206ins и 4D3-HC-Cys439ins. Образцы хранили при 37°C в течение 4 недель, и содержание агрегатов оставалось, по существу, неизменным.
Используя тот же способ детекции и измерения, измеряли агрегацию следующих TDC: TDC 2A1-LC-V205C-mc-vc-PAB-MMAE, TDC 2A1-LC-Cys205ins-mc-vc-PAB-MMAE, TDC 2A1-LC-Cys206ins--mc-vc-PAB-MMAE, 2A1-HC-Cys439ins-mc-vc-PAB-MMAE, 4E1-LC-Cys205ins-mc-vc-PAB-MMAE, 4E1-LC-Cys206ins-mc-vc-PAB-MMAE 4E1-HC-Cys439ins-mc-vc-PAB-MMAE TDC, 4D3-LC-Cys205ins-mc-vc-PAB-MMAE, 4D3-LC-Cys206ins-mc-vc-PAB-MMAE, 4D3-HC-Cys439ins-mc-vc-PAB-MMAE TDC. Результаты представлены в таблице II
Таблица II: содержание целевого мономера TDC в случае TDC 2A1-LC-V205C-mc-vc-PAB-MMAE, TDC 2A1-LC-Cys205ins-mc-vc-PAB-MMAE, TDC 2A1-LC-Cys206ins--mc-vc-PAB-MMAE и 2A1-HC-Cys439ins-mc-vc-PAB-MMAE, 4E1-LC-Cys205ins-mc-vc-PAB-MMAE, 4E1-LC-Cys206ins-mc-vc-PAB-MMAE, 4E1-HC-Cys439ins-mc-vc-PAB-MMAE TDC, 4D3-LC-Cys205ins-mc-vc-PAB-MMAE, 4D3-LC-Cys206ins-mc-vc-PAB-MMAE, 4D3-HC-Cys439ins-mc-vc-PAB-MMAE
Figure 00000020
Как показано в таблице II, содержание целевого мономера соединения TDC, соединенного посредством встроенного цистеина, составляет более 90%.
Пример 28: Измерение аффинностей антител-основ, подвергнутых сайт-специфическому мутагенезу и инсерционному мутагенезу для встраивания цистеина, и родительских антител к EGFRvIII, аффинностей антител 4E1 к c-met, аффинностей антител 4D3 к Trop2
Относительные аффинности 2A1-LC-V205C, 2A1-LC-Cys205ins, 2A1-LC-Cys206ins, 2A1-HC-Cys439ins и 2A1 к EGFRvIII сравнивали посредством непрямого ELISA. Конкретные стадии являлись следующими:
Покрытый рекомбинантным антигеном EGFRvIII-His*6 планшет блокировали желатином из рыбьей кожи; антитела 2A1, 2A1-LC-V205C, 2A1-LC-Cys205ins, 2A1-LC-Cys206ins и 2A1-HC-Cys439ins соответствующим образом разводили с использованием 4-кратного градиента всего с 11 концентрациями, при этом наибольшая концентрация составляла 10 мкг/мл; осуществляли инкубацию с HRP-меченым вторичным антителом; после окрашивания TMB определяли и измеряли поглощение при 450 нм. Строили график результатов измерения поглощения при A450 относительно концентрации. Мутантные антитела 2A1-LC-V205C, 2A1-LC-Cys205ins, 2A1-LC-Cys206ins и 2A1-HC-Cys439ins, подвергнутые сайт-специфическому мутагенезу или инсерции цистеина, сохраняли аффинности к EGFRvIII, схожие с 2A1, о чем свидетельствуют близкие значения EC50; эти результаты свидетельствуют о том, что сайт-специфический мутагенез V205C легкой цепи антитела 2A1, инсерционная мутация в положении 205 легкой цепи антитела, инсерционная мутация в положении 206 легкой цепи антитела или инсерционная мутация в положении 439 тяжелой цепи антитела не влияют на аффинность к антигену EGFRvIII.
Как показано на фигуре 14, антитела 2A1-LC-V205C, 2A1-LC-Cys205ins, 2A1-LC-Cys206ins, 2A1-HC-Cys439ins сохраняют аффинность 2A1 к антигену EGFRvIII.
Пример 29: Измерение аффинностей антител-основ, подвергнутых сайт-специфическому мутагенезу и инсерционному мутагенезу для встраивания цистеина и соединенных с токсином/лекарственным средством, против когнатных антигенов, аффинностей антител 4E1 к c-met, аффинностей антител 4D3 к Trop2
Относительные аффинности 4E1-LC-Cys205ins-MVPM, 4E1-LC-Cys206ins-MVPM, 4E1-HC-Cys439ins-MVPM и 4E1 к C-met сравнивали посредством непрямого ELISA. Конкретные стадии являлись следующими:
Покрытый рекомбинантным антигеном C-met-His*6 планшет блокировали желатином из рыбьей кожи; TDC 4E1-LC-Cys205ins-MVPM, 4E1-LC-Cys206ins-MVPM, 4E1-HC-Cys439ins-MVPM и антитело 4E1 соответствующим образом разводили с использованием 4-кратного градиента всего с 11 концентрациями, при этом наибольшая концентрация составляла 10 мкг/мл; осуществляли инкубацию с HRP-меченым вторичным антителом; после окрашивания TMB определяли и измеряли поглощение при 450 нм. Строили график результатов измерения поглощения при A450 относительно концентрации, и результаты свидетельствовали о том, что антитела, имеющие сайт-специфическую мутацию с инсерцией цистеина, TDC4E1-LC-Cys205ins-MVPM, 4E1-LC-Cys206ins-MVPM и 4E1-HC-Cys439ins-MVPM, сохраняли свои аффинности связывания с C-met, схожую с 4E1, на что указывают близкие значения EC50; это свидетельствует о том, что инсерционная мутация в положении 205 или 206 легкой цепи 4E1 или в положении 439 тяжелой цепи 4E1 не влияет на аффинность связывания соответствующего TDC с антигеном c-met.
Относительные аффинности 4D3-LC-Cys205ins-MVPM, 4D3-LC-Cys206ins-MVPM, 4D3-HC-Cys439ins-MVPM и 4D3 к Trop2 сравнивали посредством непрямого ELISA. Конкретные стадии являлись следующими:
Покрытый рекомбинантным антигеном Trop2-His*6 планшет блокировали желатином из рыбьей кожи; TDC 4D3-LC-Cys205ins-MVPM, 4D3-LC-Cys206ins-MVPM, 4D3-HC-Cys439ins-MVPM и антитело 4D3 соответствующим образом разводили с использованием 4-кратного градиента всего с 11 концентрациями, при этом наибольшая концентрация составляла 10 мкг/мл; осуществляли инкубацию с HRP-меченым вторичным антителом; после окрашивания TMB определяли и измеряли поглощение при 450 нм. Строили график результатов измерения поглощения при A450 относительно концентрации. TDC4D3-LC-Cys205ins-MVPM, 4D3-LC-Cys206ins-MVPM и 4D3-HC-Cys439ins-MVPM сохраняли свои аффинности связывания с Trop2, схожие с 4D3, на что указывают близкие значения EC50; что свидетельствует о том, что инсерционная мутация в положении 205 или 206 легкой цепи 4D3 или в положении 439 тяжелой цепи 4D3 не влияет на аффинность связывания соответствующего TDC с антигеном Trop2.
Как показано на фигуре 15, антитела 4E1-LC-Cys205ins-MVPM, 4E1-LC-Cys206ins-MVPM, 4E1-HC-Cys439ins-MVPM сохраняли аффинность 4E1 к антигену c-met.
Как показано на фигуре 16, антитела 4D3-LC-Cys205ins-MVPM, 4D3-LC-Cys206ins-MVPM, 4D3-HC-Cys439ins-MVPM сохраняли аффинность 4D3 к антигену Trop2.
Пример 30: Тестирование цитотоксичности и фармацевтической эффективности
Цитотоксическую активность TDC определяли с помощью следующего эксперимента: TDC раздельно добавляли в среды для культивирования опухолевых клеток человека, в которых гиперэкспрессировался EGFR или экспрессировался EGFRVIII, и измеряли жизнеспособность клеток через 72 часа культивирования клеток. В настоящем описании клеточные анализы in vitro использовали для определения жизнеспособности клеток, цитотоксичности и TDC-индуцированного апоптоза.
Эффективность in vitro конъюгата «антитело-цитотоксин» определяли посредством анализа пролиферации клеток. В одном из вариантов осуществления анализ пролиферации клеток CellTiter 96® AQueous One Solution является коммерчески доступным (Promega Corp., Madison, WI). Анализ пролиферации клеток (a) представляет собой детекцию реагента, в которой колориметрию используют для определения количества жизнеспособных клеток в экспериментах, касающихся пролиферации клеток и цитотоксичности. Этот реагент содержит новое соединение тетразолия [3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-5-(3-карбоксиметоксифенил)-2-(4-сульфофенил)-2H-тетразолий, внутренняя соль; MTS] и связующее вещество для электронного взаимодействия (этосульфат феназина; PES). PES имеет повышенную химическую стабильность, что позволяет смешивать его с MTS с получением стабильного раствора. Этот удобный режим "одного раствора" основан на первом поколении анализа CellTiter 96® AQueous, в котором связующее вещество для электронного взаимодействия PMS и раствор MTS поставляют раздельно. MTS (реагент Оуэна) биологически восстанавливается клетками до окрашенного формазанового продукта, растворимого непосредственно в среде (фигура 1). Это преобразование, вероятнее всего, происходит под действием NADPH или NADH, продуцируемых под действием дегидрогеназы в метаболически активных клетках. Для детекции небольшое количество реагента CellTiter 96® AQueous One Solution просто добавляют в лунку со средой для культивирования, инкубируют в течение 1-4 часов, а затем считывают поглощение при 490 нм с помощью микроспектрофотометра для чтения планшетов.
Figure 00000021
Количество формазанового продукта, определяемого при 490 нм, прямо пропорционально количеству жизнеспособных клеток в культуре. Т.к. гипертиреоидный продукт MTS растворим в средах для культивирования тканей, анализ CellTiter 96® AQueous One Solution включает меньше стадий, чем способ MTT или INT.
В настоящем описании A431 (EGFR-гиперэкспрессирующие клетки), U87-EGFRVIII (стабильную линию клеток с мутантным EGFR), U87-MG (линию клеток глиобластомы с высокоэкспрессируемым c-Met) и BXPC-3 (линию клеток рака поджелудочной железы с высокой экспрессией Trop2) используют в качестве исследовательских систем для тестирования эффективности лекарственного средства in vitro. В 96-луночный планшет высевали клетки при концентрации 6000 клеток/лунку и через 24 часа добавляли антитело. Исходная концентрация различных TDC, соответствующих линиям клеток A431 и U87-EGFRVIII, составляла 10 мкМ, которые последовательно разводили в соответствии с 5-кратным градиентом. Исходные концентрации различных TDC, соответствующих линиям клеток U87-MG и BXPC-3, составляли 1 мкМ, который последовательно разводили в соответствии с 5-кратным градиентом. Анализ MTS на жизнеспособность клеток осуществляли через 72 часа обработки
Таблица III: Определение IC50 для цитотоксичности TDC, ADC в отношении EGFRwt-гиперэкспрессирующей линии клеток A431 и стабильной линии клеток, экспрессирующей EGFRvIII, U87-EGFRVIII
Соединения MTS
A431 U87MG-EGFRvIII U87-MG BXPC-3
Антитело 2A1 2A1 >10 мкМ >10 мкМ / /
2A1-LC-V205C >10 мкМ >10 мкМ / /
2A1-LC-Cys205ins >10 мкМ >10 мкМ / /
2A1-LC-Cys206ins >10 мкМ >10 мкМ / /
2A1-HC-Cys439ins >10 мкМ >10 мкМ / /
Сайт-специфическое присоединение (TDC) 2A1-LC-V205C-mc-vc-PAB-MMAE 92,16 нМ 296,11 нМ / /
2A1-LC-Cys205ins-mc-vc-PAB-MMAE 133,67 нМ 492,14 нМ / /
2A1-LC-Cys206ins-mc-vc-PAB-MMAE 179,26 нМ 457,48 нМ / /
2A1-HC-Cys439ins-mc-vc-PAB-MMAE 26,62 нМ 118,52 нМ / /
Антитело 4E1 4E1 / / >1 мкМ /
Сайт-специфическое присоединение (TDC) 4E1-LC-Cys205ins-mc-vc-PAB-MMAE / / 120,50nM /
4E1-LC-Cys206ins-mc-vc-PAB-MMAE / / 79,57nM /
4E1-HC-Cys439ins-mc-vc-PAB-MMAE / / 7,41nM /
Антитело 4D3 4D3 / / / >1 мкМ
Сайт-специфическое присоединение (TDC) 4D3-LC-Cys205ins-mc-vc-PAB-MMAE / / / 0,38 нМ
4D3-LC-Cys206ins-mc-vc-PAB-MMAE / / / 0,45 нМ
4D3-HC-Cys439ins-mc-vc-PAB-MMAE / / / 0,23 нМ
Данные из таблицы III свидетельствуют о том, что TDC 2A1-LC-V205C-mc-vc-PAB-MMAE, TDC 2A1-LC-Cys205Cins-mc-vc-PAB-MMAE, TDC 2A1-LC-Cys206ins-mc-vc-PAB-MMAE и TDC 2A1-HC-Cys439ins-mc-vc-PAB-MMAE имеют сравнимую цитотоксическую активность в отношении EGFRwt-гиперэкспрессирующей линии клеток A431 и стабильной линии клеток, экспрессирующей EGFRvIII, U87-EGFRVIII, и активность TDC с инсерцией в положении 439 немного выше, чем у TDC с инсерцией в положении 205 и 206.
Наблюдали некоторую корреляцию между цитотоксической активностью и положением присоединения в случае TDC 4E1-LC-Cys205ins-mc-vc-PAB-MMAE, TDC 4E1-LC-Cys206ins-mc-vc-PAB-MMAE и TDC 4E1-HC-Cys439ins-mc-vc-PAB-MMAE в клетках U87-MG. Активность TDC с инсерцией в положении 439 была немного лучше, чем у мутантов с инсерцией в положении 205 и 206. Активность TDC была значимо лучше, чем у родительского антитела.
Цитотоксические активности TDC 4D3-LC-Cys205ins-mc-vc-PAB-MMAE, TDC 4D3-LC-Cys206ins-mc-vc-PAB-MMAE и TDC 4D3-HC-Cys439ins-mc-vc-PAB-MMAE в отношении линии клеток рака поджелудочной железы BXPC-3 были сравнимыми или схожими друг с другом, и активность TDC мутанта с инсерцией в положении 439 была немного лучше, чем у TDC с инсерцией в положении 205 и 206, и активность TDC была значимо лучше, чем у родительского антитела.
Пример 31: Тестирование стабильности в плазме
Брали некоторое количество образца ADC, добавляли к плазме человека, из которой удаляли IgG человека, использовали 2 пробирки для каждого ADC, инкубировали на водяной бане при 37°C, инкубировали в течение 0 ч, 72 ч, брали образцы ADC, добавляли 100 мкл протеина A (MabSelect SuReTM LX, кат. № 10221479 GE, промытого PBS), встряхивали в течение 2 ч с помощью вертикальной мешалки и подвергали стадиям промывки и элюции для получения ADC после инкубации. Образцы, подвергнутые инкубации в течение некоторого времени, подвергали HIC-ВЭЖХ и RP-ВЭЖХ для определения стабильности образцов в плазме.
На фигурах 21-23 показаны результаты тестирования стабильности в плазме человека для TDC 4D3-LC-Cys205ins-mc-vc-PAB-MMAE, TDC 4D3-LC-Cys206ins-mc-vc-PAB-MMAE и TDC 4D3-HC-Cys439ins-mc-vc-PAB-MMAE. Способом детекции 4D3-HC-Cys439ins-mc-vc-PAB-MMAE являлась RP-ВЭЖХ; способом детекции TDC 4D3-LC-Cys205ins-mc-vc-PAB-MMAE и 4D3-LC-Cys206ins-mc-vc являлась HIC-ВЭЖХ.
На фигурах 24-26 показаны результаты тестирования стабильности в плазме человека для TDC 4E1-LC-Cys205ins-mc-vc-PAB-MMAE, TDC 4E1-LC-Cys206ins-mc-vc-PAB-MMAE и TDC 4E1-HC-Cys439ins-mc-vc-PAB-MMAE. Способом детекции являлась HIC-ВЭЖХ
Таблица IV: Результаты тестирования стабильности TDC в плазме (вычисленной по изменению DAR)
Сайт-специфическое присоединение (TDC) Соединение DAR
37°C, 0 ч. 37°C, 72 ч.
TDC 4E1-LC-Cys205ins-mc-vc-PAB-MMAE 1,89 1,77
TDC 4E1-LC-Cys206ins-mc-vc-PAB-MMAE 1,81 1,62
TDC 4E1-HC-Cys439ins-mc-vc-PAB-MMAE 1,85 1,83
TDC 4D3-LC-Cys205ins-mc-vc-PAB-MMAE 1,86 1,71
TDC 4D3-LC-Cys206ins-mc-vc-PAB-MMAE 1,76 1,52
TDC 4D3-HC-Cys439ins-mc-vc-PAB-MMAE 1,81 1,80
Указанные выше TDC были стабильными после инкубации при 37°C в течение 72 часов в образцах плазмы человека и имели хорошие свойства, касающиеся образования лекарственного средства. Для сравнения, TDC с инсерционными мутациями в положении 439 имели лучшую стабильность, после них следовали TDC с инсерционными мутациями в положениях 205 и 206.
Пример 32: Тестирования фармацевтической эффективности у несущих опухоль мышей
Как представлено в настоящем описании, разрабатывали модель несущих опухоль BXPC-3 мышей для оценки эффективности TDC и родительских антител in vivo. В одном из вариантов осуществления 3×106 клеток BXPC-3 подкожно инъецировали в спину безтимусным мышам BALB/c Nude возрастом 4-8 недель и, когда средний размер опухоли у мышей достигал 400-500 мм3, их случайным образом распределяли по группам, по 5 мышей в каждую группу. В день 0 и день 7 TDC 4D3-LC-Cys205ins-mc-vc-PAB-MMAE, TDC 4D3-LC-Cys206ins-mc-vc-PAB-MMAE и TDC 4D3-HC-Cys439ins-mc-vc-PAB-MMAE вводили в однократной внутривенной дозе 5 мг/кг, а родительское антитело 4D3 вводили в дозе 5 мг/кг. Данные A включают средний объем опухоли ± SE во время измерения, и данные B включают среднюю массу тела мыши во время измерения ± SE.
На фигуре 27 показаны результаты тестирования эффективности у несущих опухоль мышей в случае TDC 4D3-LC-Cys205ins-mc-vc-PAB-MMAE, TDC 4D3-LC-Cys206ins-mc-vc-PAB-MMAE, TDC 4D3-HC-Cys439ins-mc-vc-PAB-MMAE и 4D3. TDC демонстрировали значительный противоопухолевый эффект in vivo по сравнению с родительскими антителами.
На фигуре 28 показаны результаты тестирования эффективности у несущих опухоль мышей в случае TDC 4D3-LC-Cys205ins-mc-vc-PAB-MMAE TDC, 4D3-LC-Cys206ins-mc-vc-PAB-MMAE, TDC 4D3-HC-Cys439ins-mc-vc-PAB-MMAE и родительского антитела 4D3. Не наблюдали значимого изменения массы тела мышей, что подтвердило, что TDC не имеют токсичности или имеют незначительную активность in vivo.
Изобретение не ограничено объемом конкретных вариантов осуществления, представленных в описании вариантов осуществления, предназначенных для иллюстрирования нескольких аспектов изобретения, и любые варианты осуществления, являющиеся функциональными эквивалентами, входят в объем изобретения. Фактически, различные модификации изобретения очевидны специалистам в этой области и входят в объем формулы изобретения.
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
Таблица V: аминокислоты
Название Символ или аббревиатура
Аланин A или Ala
Аргинин R или Arg
Аспарагин N или Asn
Аспарагиновая кислота D или Asp
Цистеин C или Cys
Глутамин Q или Gln
Глутаминовая кислота E или Glu
Глицин G или Gly
Гистидин H или His
Изолейцин I или Ile
Лейцин L или Leu
Лизин K или Lys
Метионин M или Met
Фенилаланин F или Phe
Пролин P или Pro
Серин S или Ser
Треонин T или Thr
Триптофан W или Trp
Тирозин Y или Tyr
Валин V или Val
SEQ ID NO: 1 Последовательность ДНК константной области тяжелой цепи (Fc)
>IgG1-Fc
GCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA
SEQ ID NO: 2 Аминокислотная последовательность константной области тяжелой цепи (Fc)
>IgG1-Fc
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO: 3 Последовательность ДНК константной области легкой цепи (каппа)
>LC-каппа
ACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG
SEQ ID NO: 4 Аминокислотная последовательность константной области легкой цепи (каппа)
>LC-каппа
TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO: 5 Последовательность ДНК константной области легкой цепи 2A1-LC-Cys205ins (каппа)
>LC-Cys205ins-каппа
ACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCC TGC GTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG
SEQ ID NO: 6 Аминокислотная последовательность константная область легкой цепи (каппа) LC-Cys205ins
>LC-Cys205ins-каппа
TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSP C VTKSFNRGEC
где C в GLSSP C VTKSFN является положением сайт-специфической конъюгации. В одном из вариантов осуществления цистеин сайт-специфически конъюгируют с mc-vc-PAB-нагрузкой.
SEQ ID NO: 7 Последовательность ДНК константной области легкой цепи (каппа) LC-Cys206ins
>LC-Cys206ins-каппа
ACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTC TGC ACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG
SEQ ID NO: 8 Аминокислотная последовательность константной области легкой цепи (каппа) LC-Cys206ins
>LC-Cys206ins-каппа
TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPV C TKSFNRGEC
где C в GLSSPV C TKSFN является положением сайт-специфической конъюгации. В одном из вариантов осуществления цистеин сайт-специфически конъюгируют с mc-vc-PAB-нагрузкой.
SEQ ID NO: 9 Последовательность ДНК константной области тяжелой цепи (Fc) IgG1-Fc-Cys439ins
>IgG1-Fc-Cys439ins
GCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCC TGC CTGTCTCCGGGTAAA
SEQ ID NO: 10 Аминокислотная последовательность константной области тяжелой цепи (Fc) IgG1-Fc-Cys439ins
>IgG1-Fc-Cys439ins
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLS C LSPGK
где C в последовательности TQKSLS C LSPGK является положением сайт-специфической конъюгации/присоединения, и его подвергают сайт-специфической конъюгации с mc-vc-PAB-нагрузкой.
SEQ ID NO: 11 Последовательность ДНК константной области легкой цепи (каппа) LC-V205C
>LC-V205C-каппа
ACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCC TGC ACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG
SEQ ID NO: 12 Аминокислотная последовательность константной области легкой цепи (каппа) LC-V205C
>LC-V205C-каппа
TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSP C TKSFNRGEC
где C в последовательности GLSSP C TKSFN является положением сайт-специфической конъюгации/присоединения, и его подвергают сайт-специфической конъюгации с mc-vc-PAB-нагрузкой.
SEQ ID NO: 13 Аминокислотная последовательность константной области легкой цепи (каппа) LC-V205C
GLSSPCVTKSF
SEQ ID NO: 14 Аминокислотная последовательность константной области легкой цепи (каппа) LC-V206C
GLSSPVCTKS
SEQ ID NO: 15 Аминокислотная последовательность тяжелой цепи
TQKSLSCLSPGK
--->
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> SICHUAN BALI PHARM CO., LTD.
<120> КОНЪЮГАТ «ЦИСТЕИН-МОДИФИЦИРОВАННОЕ АНТИТЕЛО-ЛЕКАРСТВЕННОЕ СРЕДСТВО»
И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ
<130> SIBA1001US
<150> PCT/CN2017/104706
<151> 2017-09-30
<160> 15
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 990
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтезированная
<400> 1
gctagcacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 60
ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120
tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180
ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 240
tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagag agttgagccc 300
aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 360
ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 420
gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 480
tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 540
agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 600
gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 660
aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 720
ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 780
gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 840
ctggactccg acggctcctt cttcctctat agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 900
cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 960
cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa 990
<210> 2
<211> 330
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтезированная
<400> 2
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 3
<211> 321
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтезированная
<400> 3
acggtggctg caccatctgt cttcatcttc ccgccatctg atgagcagtt gaaatctgga 60
actgcctctg ttgtgtgcct gctgaataac ttctatccca gagaggccaa agtacagtgg 120
aaggtggata acgccctcca atcgggtaac tcccaggaga gtgtcacaga gcaggacagc 180
aaggacagca cctacagcct cagcagcacc ctgacgctga gcaaagcaga ctacgagaaa 240
cacaaagtct acgcctgcga agtcacccat cagggcctga gctcgcccgt cacaaagagc 300
ttcaacaggg gagagtgtta g 321
<210> 4
<211> 106
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтезированная
<400> 4
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
1 5 10 15
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
20 25 30
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
35 40 45
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
50 55 60
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
65 70 75 80
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
85 90 95
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 5
<211> 324
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтезированная
<400> 5
acggtggctg caccatctgt cttcatcttc ccgccatctg atgagcagtt gaaatctgga 60
actgcctctg ttgtgtgcct gctgaataac ttctatccca gagaggccaa agtacagtgg 120
aaggtggata acgccctcca atcgggtaac tcccaggaga gtgtcacaga gcaggacagc 180
aaggacagca cctacagcct cagcagcacc ctgacgctga gcaaagcaga ctacgagaaa 240
cacaaagtct acgcctgcga agtcacccat cagggcctga gctcgccctg cgtcacaaag 300
agcttcaaca ggggagagtg ttag 324
<210> 6
<211> 107
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтезированная
<400> 6
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
1 5 10 15
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
20 25 30
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
35 40 45
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
50 55 60
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
65 70 75 80
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
85 90 95
Cys Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 7
<211> 324
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтезированная
<400> 7
acggtggctg caccatctgt cttcatcttc ccgccatctg atgagcagtt gaaatctgga 60
actgcctctg ttgtgtgcct gctgaataac ttctatccca gagaggccaa agtacagtgg 120
aaggtggata acgccctcca atcgggtaac tcccaggaga gtgtcacaga gcaggacagc 180
aaggacagca cctacagcct cagcagcacc ctgacgctga gcaaagcaga ctacgagaaa 240
cacaaagtct acgcctgcga agtcacccat cagggcctga gctcgcccgt ctgcacaaag 300
agcttcaaca ggggagagtg ttag 324
<210> 8
<211> 107
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтезированная
<400> 8
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
1 5 10 15
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
20 25 30
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
35 40 45
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
50 55 60
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
65 70 75 80
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
85 90 95
Val Cys Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 9
<211> 993
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтезированная
<400> 9
gctagcacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 60
ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120
tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180
ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 240
tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagag agttgagccc 300
aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 360
ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 420
gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 480
tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 540
agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 600
gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 660
aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 720
ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 780
gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 840
ctggactccg acggctcctt cttcctctat agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 900
cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 960
cagaagagcc tctcctgcct gtctccgggt aaa 993
<210> 10
<211> 331
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтезированная
<400> 10
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Cys Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 11
<211> 321
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтезированная
<400> 11
acggtggctg caccatctgt cttcatcttc ccgccatctg atgagcagtt gaaatctgga 60
actgcctctg ttgtgtgcct gctgaataac ttctatccca gagaggccaa agtacagtgg 120
aaggtggata acgccctcca atcgggtaac tcccaggaga gtgtcacaga gcaggacagc 180
aaggacagca cctacagcct cagcagcacc ctgacgctga gcaaagcaga ctacgagaaa 240
cacaaagtct acgcctgcga agtcacccat cagggcctga gctcgccctg cacaaagagc 300
ttcaacaggg gagagtgtta g 321
<210> 12
<211> 106
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтезированная
<400> 12
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
1 5 10 15
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
20 25 30
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
35 40 45
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
50 55 60
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
65 70 75 80
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
85 90 95
Cys Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 13
<211> 11
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтезированная
<400> 13
Gly Leu Ser Ser Pro Cys Val Thr Lys Ser Phe
1 5 10
<210> 14
<211> 10
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтезированная
<400> 14
Gly Leu Ser Ser Pro Val Cys Thr Lys Ser
1 5 10
<210> 15
<211> 12
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтезированная
<400> 15
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Cys Leu Ser Pro Gly Lys
1 5 10
<---

Claims (16)

1. Конъюгат «цистеин-модифицированное антитело-цитотоксин», содержащий антитело и цитотоксин,
где антитело содержит встроенный цистеин в участке встраивания цистеина, где участок встраивания цистеина представляет собой положение 205 константной области легкой цепи каппа/λ по системе нумерации по Kabat, положение 206 константной области легкой цепи по системе нумерации по Kabat или положение 439 константной области тяжелой цепи IgG по системе нумерации по Kabat,
где встроенный цистеин содержит свободную тиоловую группу, где цитотоксин конъюгируют со свободной тиоловой группой посредством линкера.
2. Конъюгат «цистеин-модифицированное антитело-цитотоксин» по п.1, где участок встраивания цистеина содержит аминокислотную последовательность, выбранную из LC-205ins: GLSSPCVTKSF, LC-206ins: GLSSPVCTKSF, и HC-439ins: TQKSLSCLSPGK, и где "C" является встроенным цистеином в положении 205 константной области легкой цепи, положении 206 константной области легкой цепи или положении 439 константной области тяжелой цепи.
3. Конъюгат «цистеин-модифицированное антитело-цитотоксин» по п.1, где антитело содержит легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность, выбранную из GLSSPCVTKSF и GLSSPVCTKSF, где антитело содержит тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность TQKSLSCLSPGK, и где C является встроенным цистеином в положении 205 легкой цепи, положении 206 легкой цепи или положении 439 тяжелой цепи антитела.
4. Конъюгат «цистеин-модифицированное антитело-цитотоксин» по п.1, где антитело содержит легкую цепь, где легкая цепь имеет изотип каппа (κ) или лямбда (λ).
5. Конъюгат «цистеин-модифицированное антитело-цитотоксин» по п.1, где антитело содержит тяжелую цепь, где тяжелая цепь имеет изотип IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4.
6. Конъюгат «цистеин-модифицированное антитело-цитотоксин» по п.1, где встроенный цистеин содержит тиоловую группу (-SH).
7. Конъюгат «цистеин-модифицированное антитело-цитотоксин» по п.6, где тиоловая группа сконфигурирована для химической конъюгации.
8. Конъюгат «цистеин-модифицированное антитело-цитотоксин» по п.1, где цитотоксин выбран из MMAE, MMAF, PBD, SN-38, Dox или их производного.
9. Способ получения конъюгата «цистеин-модифицированное антитело-цитотоксин» по п.1, включающий
восстановление антитела с помощью восстановителя для получения восстановленного антитела, где антитело содержит встроенный цистеин, содержащий тиоловую группу, экранированную защитной группой, и где восстановленное антитело содержит встроенный цистеин, из которого защитная группа удалена для получения свободной тиоловой группы,
удаление защитной группы и восстановителя посредством катионообменной хроматографии или ультрафильтрации,
окисление восстановленного антитела для получения окисленного антитела, содержащего межцепочечную дисульфидную связь,
конъюгацию линкера-цитотоксина со свободной тиоловой группой на встроенном цистеине для получения конъюгата «цистеин-модифицированное антитело-цитотоксин», и
удаление неконъюгированного линкера-цитотоксина посредством катионообменной хроматографии или ультрафильтрации.
RU2019113758A 2016-10-08 2017-09-30 Конъюгат "цистеин-модифицированное антитело-лекарственное средство" и способ его получения RU2762594C2 (ru)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610876568 2016-10-08
CN201610876568.9 2016-10-08
PCT/CN2017/104706 WO2018064964A1 (zh) 2016-10-08 2017-09-30 半胱氨酸改造的抗体-毒素偶联物及其制备方法

Publications (3)

Publication Number Publication Date
RU2019113758A RU2019113758A (ru) 2020-11-09
RU2019113758A3 RU2019113758A3 (ru) 2020-12-25
RU2762594C2 true RU2762594C2 (ru) 2021-12-21

Family

ID=61533952

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2019113758A RU2762594C2 (ru) 2016-10-08 2017-09-30 Конъюгат "цистеин-модифицированное антитело-лекарственное средство" и способ его получения

Country Status (11)

Country Link
US (1) US11484605B2 (ru)
EP (1) EP3524273A4 (ru)
JP (1) JP6998386B2 (ru)
KR (2) KR102579211B1 (ru)
CN (2) CN117398475A (ru)
AU (1) AU2017340314B2 (ru)
CA (1) CA3039559A1 (ru)
IL (1) IL265838B2 (ru)
RU (1) RU2762594C2 (ru)
SG (1) SG11201903084UA (ru)
WO (1) WO2018064964A1 (ru)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20210393794A1 (en) * 2017-06-20 2021-12-23 Sichuan Baili Pharm Co.Ltd Screening of fixed-point coupling sites of cysteine-modified antibody-toxin conjugate (tdc)
CN110872339A (zh) * 2018-08-30 2020-03-10 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 含有芳硝基的连接子、含连接子的抗体偶联药物及连接子的用途
EP3760233B1 (en) * 2019-05-20 2023-07-12 MabPlex International Co., Ltd. One-pot preparation process for antibody drug conjugate intermediate
WO2024088283A1 (zh) * 2022-10-26 2024-05-02 同润生物医药(上海)有限公司 人源化的l1cam抗体药物偶联物

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2553566C2 (ru) * 2008-01-31 2015-06-20 Дженентек, Инк. АНТИ-CD79b АНТИТЕЛА И ИММУНОКОНЪЮГАТЫ И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ
RU2557319C2 (ru) * 2007-07-16 2015-07-20 Дженентек, Инк. ГУМАНИЗИРОВАННЫЕ АНТИТЕЛА ПРОТИВ CD79b И ИММУНОКОНЪЮГАТЫ И СПОСОБЫ ПРИМЕНЕНИЯ
WO2015157595A1 (en) * 2014-04-11 2015-10-15 Medimmune, Llc Conjugated compounds comprising cysteine-engineered antibodies
US20160067351A1 (en) * 2013-02-08 2016-03-10 Novartis Ag Specific sites for modifying antibodies to make immunoconjugates
RU2580038C2 (ru) * 2009-12-04 2016-04-10 Дженентек, Инк. Мультиспецифические антитела, аналоги антител, композиции и способы
WO2016131769A2 (en) * 2015-02-16 2016-08-25 Lonza Ltd Antibodies

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NZ553500A (en) 2004-09-23 2009-11-27 Genentech Inc Genentech Inc Cysteine engineered antibodies and conjugates withCysteine engineered antibodies and conjugates with a free cysteine amino acid in the heavy chain a free cysteine amino acid in the heavy chain
WO2008141044A2 (en) * 2007-05-08 2008-11-20 Genentech, Inc. Cysteine engineered anti-muc16 antibodies and antibody drug conjugates
US8937161B2 (en) * 2007-10-19 2015-01-20 Genentech, Inc. Cysteine engineered anti-TENB2 antibodies and antibody drug conjugates
CN106467575B (zh) 2015-08-18 2020-07-31 四川百利药业有限责任公司 半胱氨酸改造的抗体-毒素偶联物
TWI812873B (zh) 2015-11-30 2023-08-21 美商輝瑞股份有限公司 用於部位專一性接合之抗體和抗體片段
CN106866822A (zh) 2016-12-25 2017-06-20 四川百利药业有限责任公司 半胱氨酸改造的抗体‑毒素偶联物

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2557319C2 (ru) * 2007-07-16 2015-07-20 Дженентек, Инк. ГУМАНИЗИРОВАННЫЕ АНТИТЕЛА ПРОТИВ CD79b И ИММУНОКОНЪЮГАТЫ И СПОСОБЫ ПРИМЕНЕНИЯ
RU2553566C2 (ru) * 2008-01-31 2015-06-20 Дженентек, Инк. АНТИ-CD79b АНТИТЕЛА И ИММУНОКОНЪЮГАТЫ И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ
RU2580038C2 (ru) * 2009-12-04 2016-04-10 Дженентек, Инк. Мультиспецифические антитела, аналоги антител, композиции и способы
US20160067351A1 (en) * 2013-02-08 2016-03-10 Novartis Ag Specific sites for modifying antibodies to make immunoconjugates
WO2015157595A1 (en) * 2014-04-11 2015-10-15 Medimmune, Llc Conjugated compounds comprising cysteine-engineered antibodies
WO2016131769A2 (en) * 2015-02-16 2016-08-25 Lonza Ltd Antibodies

Also Published As

Publication number Publication date
KR102579211B1 (ko) 2023-09-15
RU2019113758A (ru) 2020-11-09
IL265838A (en) 2019-06-30
EP3524273A1 (en) 2019-08-14
US20200129635A1 (en) 2020-04-30
KR20230003663A (ko) 2023-01-06
JP2019533017A (ja) 2019-11-14
JP6998386B2 (ja) 2022-02-10
CN107789630A (zh) 2018-03-13
US11484605B2 (en) 2022-11-01
KR20190065374A (ko) 2019-06-11
AU2017340314B2 (en) 2021-04-29
AU2017340314A1 (en) 2019-05-02
IL265838B2 (en) 2024-03-01
RU2019113758A3 (ru) 2020-12-25
KR102480873B1 (ko) 2022-12-26
CN117398475A (zh) 2024-01-16
IL265838B1 (en) 2023-11-01
EP3524273A4 (en) 2020-07-15
CA3039559A1 (en) 2018-04-12
SG11201903084UA (en) 2019-05-30
WO2018064964A1 (zh) 2018-04-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2762594C2 (ru) Конъюгат &#34;цистеин-модифицированное антитело-лекарственное средство&#34; и способ его получения
ES2686618T3 (es) Anticuerpos anti-CD33 y uso de los mismos para tratar cáncer
KR102332435B1 (ko) 항cd70 항체 약물 컨쥬게이트
KR101463098B1 (ko) ｃ-Ｍｅｔ에 대한 인간항체에 약물이 접합된 약물 복합체 및 이의 용도
JP6951441B2 (ja) Ｍｅｔ抗体薬物複合体
JP2023011567A (ja) システイン改変抗体－毒素複合体（ｔｄｃ）の部位特異的結合サイトのスクリーニング
CN102030826A (zh) 一种高亲和力的抗cd20单克隆抗体
CN102030827B (zh) 一种高亲和力的抗her2单克隆抗体
CN112552406B (zh) 抗人cd73抗体
CN112574313B (zh) 抗cd73抗体及其用途
RU2816510C2 (ru) Скрининг участков присоединения с фиксированной точкой в конъюгате цистеин-модифицированное антитело-токсин (tdc)
CN108721641B (zh) 抗cd30抗体与力达霉素的抗体药物偶联物、制备方法及其用途
KR101061016B1 (ko) 암세포의 성장 억제 및 염증 질환의 예방 또는 치료활성을 갖는 폴리펩타이드 또는 그의 융합 단백질
CN107987163A (zh) 单克隆抗体9a及其应用
KR100941678B1 (ko) 암세포의 전이 억제 활성을 갖는 폴리펩타이드 또는 그의융합 단백질
CN102219855A (zh) 一种高亲和力的抗egfr单克隆抗体
KR20230109854A (ko) 항-vegfr2(kdr) 개량 항체를 포함하는 융합단백질 및 이의 용도
KR20230109853A (ko) 항-vegfr2(kdr) 개량 항체를 포함하는 융합단백질 및 이의 용도
CN111499684B (zh) 抗cd70抗体药物结合物