RU2762291C1 - Рекомбинантная химерная обратная транскриптаза, обладающая повышенной процессивностью и устойчивостью к ингибиторам амплификации, и способ ее получения - Google Patents
Рекомбинантная химерная обратная транскриптаза, обладающая повышенной процессивностью и устойчивостью к ингибиторам амплификации, и способ ее получения Download PDFInfo
- Publication number
- RU2762291C1 RU2762291C1 RU2020143359A RU2020143359A RU2762291C1 RU 2762291 C1 RU2762291 C1 RU 2762291C1 RU 2020143359 A RU2020143359 A RU 2020143359A RU 2020143359 A RU2020143359 A RU 2020143359A RU 2762291 C1 RU2762291 C1 RU 2762291C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- reverse transcriptase
- sto
- protein
- seq
- sto7d
- Prior art date
Links
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 title claims abstract description 57
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 title claims abstract description 56
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 title claims abstract description 29
- 230000003321 amplification Effects 0.000 title claims abstract description 12
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 12
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 title claims abstract description 12
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 title abstract 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 21
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 19
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 18
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 17
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 16
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 16
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 14
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 14
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims description 12
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 11
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 11
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims description 10
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 claims description 9
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 8
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 claims description 7
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 claims description 7
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 7
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 7
- 102000052510 DNA-Binding Proteins Human genes 0.000 claims description 6
- 101710096438 DNA-binding protein Proteins 0.000 claims description 6
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 claims description 6
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 6
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 4
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 claims description 4
- 239000012536 storage buffer Substances 0.000 claims description 4
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 claims description 3
- 239000013522 chelant Substances 0.000 claims description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 3
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 claims description 2
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 claims description 2
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 claims description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 claims 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 claims 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 claims 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 15
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 31
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 17
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 14
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 14
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 9
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 9
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 8
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 8
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 8
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 8
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 8
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 8
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 7
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 6
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 6
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 241000714230 Avian leukemia virus Species 0.000 description 5
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 5
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 5
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 4
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 4
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000160715 Sulfolobus tokodaii Species 0.000 description 4
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 4
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 4
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 3
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 3
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 3
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 3
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 3
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 3
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 3
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 3
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 2
- 108091029499 Group II intron Proteins 0.000 description 2
- 101000686031 Homo sapiens Proto-oncogene tyrosine-protein kinase ROS Proteins 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 241000713869 Moloney murine leukemia virus Species 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 102100023347 Proto-oncogene tyrosine-protein kinase ROS Human genes 0.000 description 2
- 101710137500 T7 RNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 108010020713 Tth polymerase Proteins 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 238000003936 denaturing gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 2
- YQOKLYTXVFAUCW-UHFFFAOYSA-N guanidine;isothiocyanic acid Chemical compound N=C=S.NC(N)=N YQOKLYTXVFAUCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 2
- 238000007480 sanger sequencing Methods 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- XSYUPRQVAHJETO-WPMUBMLPSA-N (2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-amino-3-(1h-imidazol-5-yl)propanoyl]amino]-3-(1h-imidazol-5-yl)propanoyl]amino]-3-(1h-imidazol-5-yl)propanoyl]amino]-3-(1h-imidazol-5-yl)propanoyl]amino]-3-(1h-imidazol-5-yl)propanoyl]amino]-3-(1h-imidaz Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(O)=O)C1=CN=CN1 XSYUPRQVAHJETO-WPMUBMLPSA-N 0.000 description 1
- 101710159080 Aconitate hydratase A Proteins 0.000 description 1
- 101710159078 Aconitate hydratase B Proteins 0.000 description 1
- 206010069754 Acquired gene mutation Diseases 0.000 description 1
- 241000713838 Avian myeloblastosis virus Species 0.000 description 1
- 238000009010 Bradford assay Methods 0.000 description 1
- 102100021935 C-C motif chemokine 26 Human genes 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 1
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 1
- 108010008286 DNA nucleotidylexotransferase Proteins 0.000 description 1
- 102100029764 DNA-directed DNA/RNA polymerase mu Human genes 0.000 description 1
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000897493 Homo sapiens C-C motif chemokine 26 Proteins 0.000 description 1
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700011259 MicroRNAs Proteins 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 108010002747 Pfu DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108700020978 Proto-Oncogene Proteins 0.000 description 1
- 102000052575 Proto-Oncogene Human genes 0.000 description 1
- 230000006819 RNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 102000044126 RNA-Binding Proteins Human genes 0.000 description 1
- 101710105008 RNA-binding protein Proteins 0.000 description 1
- 238000003559 RNA-seq method Methods 0.000 description 1
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 1
- 101800000893 Reverse transcriptase alpha-subunit Proteins 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 241000589499 Thermus thermophilus Species 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 238000011319 anticancer therapy Methods 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000001818 capillary gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 1
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 208000037797 influenza A Diseases 0.000 description 1
- 208000037798 influenza B Diseases 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 239000002198 insoluble material Substances 0.000 description 1
- 230000006525 intracellular process Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 229910001437 manganese ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 1
- 230000003990 molecular pathway Effects 0.000 description 1
- 150000004712 monophosphates Chemical class 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 108020001580 protein domains Proteins 0.000 description 1
- 238000003762 quantitative reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 238000002708 random mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 102200070544 rs202198133 Human genes 0.000 description 1
- 230000037439 somatic mutation Effects 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
- B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
- B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
- B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
- B01D15/36—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving ionic interaction, e.g. ion-exchange, ion-pair, ion-suppression or ion-exclusion
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Группа изобретений относится к области генетической инженерии, конкретно к биотехнологии. В изобретении раскрыта рекомбинантная химерная обратная транскриптаза, обладающая повышенной процессивностью и устойчивостью к ингибиторам амплификации. Также раскрыт способ получения данной химерной обратной транскриптазы. 2 н.п. ф-лы, 3 ил., 1 табл., 5 пр.
Description
Группа изобретений относится к области генетической инженерии, конкретно к биотехнологии, и может быть использована для выявления РНК-содержащих вирусов.
Методы ферментативного анализа нуклеиновых кислот являются неотъемлемой частью современных фундаментальных исследований и прикладных дисциплин, включая медицинскую и ветеринарную диагностику. Среди них важное место занимает ферментативный синтез РНК по матрице ДНК, т.е. обратная транскрипция, позволяющая анализировать тотальный набор РНК или отдельные молекулы РНК в разных клеточных образцах. С точки зрения фундаментальных исследований обратная транскрипция даёт возможность перевести РНК в более удобную для анализа и более стабильную форму нуклеиновой кислоты - комплементарную ДНК, кДНК [1]. Анализ кДНК предоставляет информацию о внутриклеточных процессах на уровне транскрипции отдельных генов или генома в целом, а также позволяет детектировать присутствие отдельных молекул РНК. Последнее обстоятельство послужило причиной широкого использования обратной транскрипции в сочетании с различными методами детекции и анализа молекул ДНК, например, ПЦР и секвенирования, в диагностических целях для выявления патогенов, в первую очередь, РНК-содержащих вирусов, по наличию специфических молекул РНК [2,3].
Ключевым компонентом обратной транскрипции являются ферменты, а именно РНК-зависимые ДНК-полимеразы или обратные транскриптазы, способные по матрице РНК синтезировать ДНК. В контексте практического использования обратных транскриптаз большое значение приобретает ряд их ферментативных характеристик, таких как термостабильность, специфический оптимум рабочей температуры, точность, процессивность и устойчивость к ингибиторам. Улучшение этих свойств повышает количество и качество синтезируемой комплементарной ДНК, что облегчает, в свою очередь, последующий анализ кДНК. Так, термостабильность в сочетании с высокой рабочей температурой позволяет проводить обратную транскрипцию в условиях, когда денатурирована вторичная структура РНК, в результате чего увеличивается эффективность обратной транскрипции [4]. Таким образом, удаётся преодолеть проблему анализа РНК со сложной вторичной структурой (в аспекте медицинской диагностики – геномной РНК вирусов), которая с трудом поддаётся конвертации в комплементарную ДНК. Высокие процессивность и точность позволят получать протяжённые фрагменты кДНК с нуклеотидной последовательностью, максимально приближенной к нуклеотидной последовательности анализируемой РНК [5]. Последнее обстоятельство особенно важно в контексте поиска соматических мутаций, в том числе перестроек, затрагивающих протоонкогены, такие как ALK, ROS1 [6,7]. Анализируемые препараты РНК могут содержать ингибирующие примеси, представляющие собой компоненты биоматериала, из которого препарат РНК был выделен, либо реагенты, использовавшиеся при очистке. Устойчивость к ингибиторам позволит повысить надёжность диагностических тестов с использованием обратной транскриптазы за счёт уменьшения вероятности ложноотрицательных результатов, спровоцированных наличием ингибиторов [8].
В настоящее время наиболее часто используются обратные транскриптазы вируса лейкемии птиц (AMV) и вируса лейкемии мышей Молони (M-MuLV). Однако оба эти фермента не полностью отвечают требованиям, выдвигаемым практическими приложениями, а именно высокой термостабильностью, оптимальной рабочей температурой, устойчивостью к ингибиторам, точностью синтеза ДНК, процессивностью [9,10].
Позднее Yasukawa K. с соавторами [11–13] были обнаружены другие аминокислотные замены, которые также приводили к увеличению оптимальной рабочей температуры и термостабильности M-MulV и AMV. Однако и в этом случае эффект также зависел от наличия в реакционной смеси праймированной РНК-матрицы. Аналогичные результаты были получены и с другим набором мутаций в работе Baranauskas A. с соавторами в 2012 г [14]. Основываясь на этих наблюдениях, можно предположить, что одним из основных факторов, влияющих на термостабильность обратной транскриптазы M-MulV, является аффинность фермента к праймированной РНК-матрице.
Увеличение аффинности ферментов к нуклеиновым кислотам можно достичь присоединением дополнительных ДНК- или РНК-связывающих белковых доменов. Ранее этот подход был успешно применён для получения процессивных химерных ДНК-полимераз на основе Pfu-полимеразы, Taq-полимеразы, Bst-полимеразы [15,16]. Кроме того, присоединение дополнительных белковых доменов увеличивает диапазон концентраций моно- и дивалетных катинов, необходимых для реализации ДНК-полимеразной активности [15], и увеличивает устойчивость ДНК-полимераз к действию ингибиторов [16].
Альтернативный подход к созданию обратных транскриптаз с повышенными процессивностью и термостабильностью заключается в использовании мутантных форм термостабильных ДНК-полимераз, способных использовать РНК в качестве матрицы при синтезе ДНК.
Известно, что некоторые природные ДНК-полимеразы, в частности, ДНК-полимераза I из термофильной бактерии Thermus thermophilus (Tth-полимераза), способны синтезировать ДНК по матрице РНК в присутствии ионов марганца [17]. Однако в качестве обратной транскриптазы Tth-полимераза синтезирует сравнительно короткие фрагменты ДНК и поэтому не может быть использована для получения протяженной комплементарной ДНК. С помощью сайт-ненаправленного введения аминокислотных замен на основе ДНК-полимеразы семейства А термофильной бактерии Thermotoga petrophila K4 (K4polL329A, [18]) и ДНК-полимеразы семейства В термофильной археи Thermococcus kodakaraensis (RTX, [19]) были созданы ферменты, способные синтезировать достаточно длинную ДНК по матрице РНК при проведении ОТ-ПЦР (обратной транскрипции с последующей ПЦР) без использования дополнительных ферментов. Тем не менее, нет данных об устойчивости созданных мутантных ферментов к ингибиторам, точности их синтеза. Кроме того, сравнения биохимических характеристик обратных транскриптаз K4polL329A и RTX с наиболее часто используемыми M-MulV и AMV не проводилось.
В настоящее время продолжается поиск новых ферментов, в том числе и из ранее неисследованных в этом отношении таксонов. Так, за последние несколько лет был изучен целый ряд обратных транскриптаз из метагеномов и интронов группы II [20,21]. Вновь открытые ферменты проявляют большую термостабильность, процессивность и точность по сравнению с M-MulV и AMV [20,21]. В частности, обратные транскриптазы, описанные в работах Mohr C. с соавторами и Zhao C. с соавторами, сохраняют ферментативную активность до 81℃ [20] или 50-60℃ [21], обладают высокой точностью и пригодны для анализа микроРНК и приготовления библиотек для секвенирования РНК. Тем не менее, устойчивость этих ферментов к ингибиторам остается неизвестной, равно как и другие их ферментативные характеристики, в том числе наличие терминалтрансферазной активности. Следует отметить, что проведение обратной транскрипции при температуре выше 60-65℃ представляется нецелесообразным, поскольку выигрыш в эффективности синтеза ДНК за счёт разрушения вторичной структуры РНК-матрицы будет нивелирован деградацией РНК-матрицы под действием высокой температуры.
Наиболее близкой к заявляемой группе изобретений – прототипом, является рекомбинантная обратная транскриптаза (РОТ) M-MuLV с пятью аминокислотными заменами, отличающаяся повышенной термостабильностью, и способ её получения, включающий следующие стадии. С помощью ПЦР нарабатывали нуклеотидную последовательность, кодирующую обратную транскриптазу M-MuLV без РНКазного домена с аминокислотной заменой D542N, после чего вносили в неё случайные нуклеотидные замены с помощью набора GeneMorph® Random Mutagenesis Kit. Полученную библиотеку нуклеотидных последовательностей клонировали в плазмиду для наработки белков в клетках E. coli и нарабатывали мутантные обратные транскриптазы, которые скринировали на наличие специфической активности при 55°С. Варианты мутантных обратных транскриптаз, показавших наибольшую термостабильность, секвенировали и вносили в них нуклеотидные замены по специческим позициям. Полученную библиотеку нуклеотидных последовательностей клонировали в плазмиду для наработки белков в клетках E. coli, нарабатывали мутантные обратные транскриптазы, которые скринировали на наличие специфической активности при 55°С. Варианты мутантных обратных транскриптаз, показавших наибольшую термостабильность, секвенировали. Аминокислотные замены, обеспечивавшие наибольшую термостабильность, объединяли в одной последовательности, используя QuikChange® Multi Site-Directed Mutagenesis Kit [22]. Полученная РОТ M-MuLV с аминокислотными заменами E69K, E302R, W313F, L435G, N454K обладала повышенной аффинностью к РНК-матрице, оптимумом рабочей температуры и устойчивостью к ингибиторам.
Недостатками известной мутантной обратной транскриптазы M-MuLV являются недостаточная процессивность и устойчивость к ингибиторам амплификации. Кроме этого, увеличение термостабильности последней было отмечено только в присутствии праймированной РНК-матрицы.
Недостатками способа получения M-MuLV являются трудоемкость и длительность стадий, связанных с необходимостью скрининга множества аминокислотных замен в M-MuLV на предмет их влияния на эффективность обратной транскрипции и устойчивость фермента к ингибиторам.
Задачей изобретения является разработка нового способа получения химерной обратной транкриптазы, обладающей повышенной процессивностю и устойчивостью к ингибиторам амплификации.
Технический результат: повышение процессивности и устойчивости химерной обратной транскриптазы к ингибиторам амплификации, а также уменьшение трудоемкости и длительности способа ее получения.
Поставленная задача достигается заявляемой химерной обратной транкриптазой, имеющей молекулярную массу 66,1 кДа, содержащей кодирующую последовательность ДНК-связывающего белка Sto7d термофильной археи Sulfolobus tokodaii, аминокислотную замену K12L в Sto7d.
Поставленная задача достигается также предлагаемым способом получения химерной обратной транкриптазы путём присоединения к С-концу обратной транкриптазы вируса лейкемии мышей Молони ДНК-связывающего белка Sto7d из археи Sulfolobus tokodaii, заключающегося в следующем.
С помощью ПЦР в кодирующую последовательность ДНК-связывающего белка Sto7d термофильной археи Sulfolobus tokodaii вводят мутацию AA>ТТ для замены остатка лизина-12 на лейцин, в результате чего в белке Sto7d инактивируется РНКазная активность. К 3’-концу кодирующей последовательности обратной транскриптазы M-MuLV присоединяют посредством перекрывающейся ПЦР кодирующую последовательность белка Sto7d. Между кодирующими последовательностями белков помещают нуклеотидную последовательность (SEQ ID NO: 1), кодирующую гибкий пептидный линкер Гли-Тре-Гли-Гли-Гли-Гли.
Полученный посредством ПЦР сборный фрагмент ДНК, имеющий нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 2, кодирующую химерную обратную транскриптазу, далее именуемую химерная RT-Sto, клонируют рестриктазно-лигазным методом в вектор для экспрессии в E. coli pET23b с использованием рестриктаз NdeI, NotI. Соответствие клонированной нуклеотидной последовательности плазмиды pET23b-RT-Sto теоретически ожидаемой было подтверждено секвенированием по Сэнгеру. Карта генетической конструкции pET23b-RT-Sto представлена на фиг.1, где:
T7 – промотор РНК-полимеразы фага Т7
RT-Sto – нуклеотидная последовательность, кодирующая белок RT-Sto
Linker - нуклеотидная последовательность, кодирующая гибкий пептидный линкер Гли-Тре-Гли-Гли-Гли-Гли
Sto7d - нуклеотидная последовательность, кодирующая белок Sto7d
AA -> TT Lys ->Leu – нуклеотидная замена, приводящая к аминокислотной замене Lys на Leu
His tag – нуклеотидная последовательность, кодирующая гистидиновый гексапептид
T7 terminator - терминатор РНК-полимеразы фага Т7
f1 origin – ориджин фага F1
bla (Ap) sequence - ген бета-лактамазы
ColE1 pBR322 origin – ориджин плазмиды pBR322
Химерную обратную транскриптазу RT-Sto нарабатывали в клетках E. coli штамма BL21 (DE3) pLysS. Синтез рекомбинантного белка индуцировали с помощью изопропил-β-D-тиогалактозида, наработку рекомбинантного белка проводили в течение 4 часов при 37°С. Рекомбинантную химерную RT-Sto очищали с помощью последовательных хроматографий: металл-хелатной на Ni-NTA-сорбенте и ионообменной на сорбенте HighQ, после чего химерную RT-Sto переводили в буфер для хранения с помощью диализа.
Химерная обратная транскриптаза RT-Sto имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, кодирующая последовательность SEQ ID NO: 2 которой находится в плазмиде pET23b-RT-Sto, имеющей нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 4, представленную в перечне последовательностей.
Для лучшего понимания сущности предлагаемых изобретений, они иллюстрируются следующими примерами осуществления.
Пример 1
Конструирование плазмиды pET23b-RT-Sto.
С помощью ПЦР синтезировали кодирующую последовательность обратной транскриптазы M-MuLV без РНКазного домена, используя праймеры (RT-F 5’-TATGGCTAGCCTAAATATAGAAGATGAGCATCGGC-3’ и RT-R 5’- ACCGCCACCGCCGGTACCATCAAGGCAGTTGTGTTGC-3’) и комплементарную ДНК вируса M-MuLV в качестве матрицы. Далее с помощью ПЦР синтезировали кодирующую последовательность белка Sto7d с нуклеотидными заменами AA>ТТ (Sto-F 5’- GGTACCGGCGGTGGCGGTGTAACAGTAAAGTTCAAGTATAA -3’ и Sto-R 5’-GATGATGCGGCCGCTTTTTCTAACATTTGTAGTAATTCTT-3’). В качестве матрицы для наработки мутантной кодирующей последовательности Sto7d использовали ранее полученную плазмиду pET-Sto-Gss [16]. Наработанные кодирующие фрагменты ДНК были соединены с помощью ПЦР с праймерами RT-F, Sto-R. Объединённый фрагмент и вектор pET23b (Novagen, США) гидролизовали эндонуклеазами рестрикции FauNDI и CciNI (Сибэнзим, Россия). Гидролизованные фрагмент и вектор лигировали с помощью ДНК-лигазы фага Т4 (Биосан, Россия), трансформировали реакционной смесью после лигирования компетентные клетки E. coli штамма BL21 (DE3) pLysS и распределяли клетки по чашке Петри со средой LB, содержавшей ампициллин (100 мкг/мл). Колонии-трансформанты скрининровали на предмет наличия вставки с помощью праймеров RT-F, Sto-R, соответствие нуклеотидной последовательности вставки теоретически ожидаемой оценивали с помощью секвенирования по Сенгеру (ЦКП «Геномика» ИХБФМ СО РАН). Плазмиду со вставкой, соответствующей теоретически ожидаемой (pET23b-RT-Sto), очищали с помощью щелочного лизиса и хранили при -20 °С до момента использования. Физическая карта плазмиды pET23b-RT-Sto, имеющей нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 4, приведена на фиг. 1.
Пример 2
Получение штамма E. coli - продуцента рекомбинантной химерной обратной транскриптазы RT-Sto.
Рекомбинантную химерную обратную транскриптазу RT-Sto нарабатывали в клетках E. coli штамма BL21 (DE3) pLysS. Для этого трансформировали плазмидой pET23b-RT-Sto компетентные клетки E. coli штамма BL21 (DE3) pLysS и распределяли клетки по чашке Петри со средой LB, содержавшей ампициллин (100 мкг/мл) и хлорамфеникол (34,5 мкг/мл). Инкубировали чашки Петри при 37°С в течение ночи. На следующий день готовили стартовую культуру. Для этого инокулировали одной колонией пробирку с 2 мл среды LB, содержавшей ампициллин (100 мкг/мл) и хлорамфеникол (34,5 мкг/мл), инкубировали пробирку в течение 5 часов при 37°С и помешивании со скоростью 200 об/мин до достижения оптической плотности при 600 нМ 1,0. Переносили стартовую культуру в колбу на 1 л с 200 мл среды LB, содержавшей ампициллин (100 мкг/мл) и хлорамфеникол (34,5 мкг/мл), инкубировали колбу в течение 4 часов при 37°С и помешивании со скоростью 200 об/мин до достижения оптической плотности при 600 нМ 1,0. По достижению указанной оптической плотности индуцировали синтез RT-Sto с помощью изопропил-β-D-тиогалактозида, добавляя к 200 мл культуры 2 мл 1 М изопропил-β-D-тиогалактозида. После добавления изопропил-β-D-тиогалактозида продолжали инкубацию в течение 4 часов в тех же условиях. По завершению времени инкубации собирали клетки центрифугированием при 4°С и 6000×g в течение 15 мин, клеточный осадок хранили при -70 °С до моемента выделения RT-Sto.
Пример 3
Выделение и очистка рекомбинантной химерной обратной транскриптазы RT-Sto из клеток-продуцентов E. coli.
Рекомбинантную химерную RT-Sto очищали с помощью последовательных хроматографий: металл-хелатной на Ni-NTA-сорбенте и ионообменной на сорбенте HighQ, после чего химерную RT-Sto переводили в буфер для хранения с помощью диализа. Хроматографию проводили на хроматографе BioLogic LP (Bio-Rad Laboratories, Inc, США), снабженном оптической и кондуктометрической ячейками. Оптическую плотность и электропроводность в элюате визуализировали при помощи программы BioLogicTM LP Data ViewTM Software (Bio-Rad Laboratories, Inc, США). Все растворы подавали на колонку со скоростью 1 мл/мин.
Аффинную хроматографию проводили на колонке, заполненной 5 мл сорбента Profinity IMAC Resin (Bio-Rad Laboratories, Inc, США), которую перед использованием уравновешивали 25 мл буфера А (50 мМ Tris-HCl pH 7,5, 50 мМ NaCl). После уравновешивания колонки подготавливали белковый препарат для очистки. Биомассу после препаративной экспрессии рекомбинантного белка ресуспендировали в буфере А для хроматографии (в соотношении 10 мл буфера на 1 г биомассы) и лизировали клетки обработкой ультразвуком. Растворимую белковую фракцию отделяли центрифугированием в течение 15 мин при 14000×g.
Подготовленный к очистке белковый препарат наносили на колонку, после чего колонку промывали 25 мл буфера А для хроматографии. Рекомбинантные белки элюировали буфером B (50 мМ Tris-HCl pH 7,5, 50 мМ NaCl, 0,5 М имидазол) для хроматографии. Элюат собирали фракциями, время сбора фракции – 1 мин, объем фракции – 1 мл. Все фракции, полученные в ходе очистки, анализировали с помощью гель-электрофореза в денатурирующих условиях по Лэммли.
Ионообменную хроматографию проводили на колонке, заполненной 5 мл сорбента 2 мл сорбента HighQ (Bio-Rad Laboratories, Inc, США), перед использованием уравновешивали 50 мл буфера E для хроматографии.
На подготовленную колонку наносили препарат химерной RT-Sto, очищенный с помощью аффинной хроматографии, и промывали колонку 20 мл буфера С (50 мМ Tris-HCl pH 7,5, 50 мМ NaCl). Рекомбинантные белки элюировали буфером D (50 мМ Tris-HCl pH 7,5, 1 М NaCl) для хроматографии. Элюат собирали фракциями, время сбора фракции - 1 мин, объем фракции - 1 мл. Все фракции анализировали с помощью гель-электрофореза в денатурирующих условиях по Лэммли.
Фракции, содержавшие химерную RT-Sto, объединяли и переносили в диализный мешок (Sigma-Aldrich, США), после чего помещали в 1 литр буфера для хранения (100 мМ Трис-HCl рН 7,5, 300 мМ NaCl, 0,2 мМ ЭДТА, 1 мМ ДТТ, 55% глицерин) и оставляли на 12-14 часов при +4℃ и постоянном помешивании. По окончании диализа препараты белков из диализного мешка анализировали с помощью гель-электрофореза в денатурирующих условиях по Лэммли и оценивали их концентрацию по методу Брэдфорд. Далее препараты белков делили на аликвоты по 500 мкл каждая и хранили при -20℃.
Пример 4
Оценка специфической активности и процессивности химерной обратной транскриптазы RT-Sto.
Специфическую активность препарата химерной RT-Sto оценивали по включению дезокситимидин трифосфата, меченного 32P, в полирибоаденозин монофосфат. За одну единицу специфической активности принимали количество ферменте, необходимое для включения 1 наномоля дезокситимидин трифосфата в кислотонерастворимый материал за 10 минут при 37°С. Активность очищенной химерной RT-Sto составила 1,18*104 е.а. на мг белка.
Процессивность химерной RT-Sto оценивали по элонгации праймера, меченного на 5’-конце флуорофором. Праймер был комплементарен геномной ДНК фага лямбда, в качестве матрицы использовали геномную ДНК фага лямбда либо искусственно наработанную РНК, идентичную по последовательности соответствующей цепи ДНК фага лямбда. Длину продуктов элонгации оценивали с помощью капиллярного гель-элетрофореза. Процессивность определяли согласно формуле: П = [[(1×И(1)]+[(2×(И(2)]+…+[(н)×(И(н))])/[И(1)+И(2)+…+И(н)]], где П - процессивность, И − площадь под пиком, н − количество включённых в праймер нуклеотидов. Процессивность обратной транскриптазы M-MuLV RT (прототип) и химерной RT-Sto представлена в таблице 1.
Таблица 1
| Фермент | Процессивность, нт | |
| РНК-матрица | ДНК-матрица | |
| M-MuLV RT | 78±2 | 17±3 |
| RT-Sto mut | 677±6 | 287±6 |
Из данных, представленных в таблице 1, следует, что заявляемая химерная RT-Sto обладает повышенной в 8 раз процессивностью по матрице РНК, и в 17 раз - по матрице ДНК, по сравнению с исходным ферментом.
Пример 5
Оценка устойчивости к ингибиторам амплификации рекомбинантной обратной транскриптазы M-MuLV RT (прототип) и химерной обратной транскриптазы RT-Sto.
Устойчивость ферментов к ингибиторам синтеза ДНК оценивали по способности проводить обратную транскрипцию в присутствии различных субстанций: цельной крови и плазмы крови человека, NaCl, формамида, фенола, гуанидина изотиоцианата и гуанидина хлорида. Для этого проводили обратную транскрипцию по матрице тотальной РНК из ядерных клеток крови человека, полученной от 5 здоровых доноров. В реакционную смесь обратной транскрипции добавляли разное количество ингибитора, после чего проводили реакцию и оценивали количество наработанной кДНК с помощью ПЦР в режимер реального времени. В качестве меры степени ингибирования использовали показатель IC50 (концентрацию полумаксимального ингибирования), который рассчитывался как количество ингибитора, необходимое для снижения количества продукта напловину от уровня пробы без ингибитора.
Результаты проведения обратной траскрипции с помощью обратной транскриптазы M-MuLV и химерной RT-Sto в присутствии ингибиторов амплификации представлены на фиг. 2. На фиг. 2 приведены показатели IC50 разных ингибиторов синтеза РНК, полученные при добавлении ингибиторов в реакционные смеси обратной транскрипции с исходной обратной транскриптазой M-MuLV и химерной RT-Sto. На фиг. 2 приведены показатели IC50 инигибиторов амплификации в обратной транкрипции с обратными транкриптазами M-MuLV и RT-Sto, выраженные в объемных процентах, а на фиг. 3 – показатели IC50 инигибиторов амплификации в обратной транкрипции с обратными транкриптазами M-MuLV и RT-Sto, выраженные в мМ.
Из данных, представленных на фиг. 2 и фиг. 3 следует, что устойчивость химерной RT-Sto возросла ко всем ингибиторам: цельной крови и плазмы крови человека, NaCl, формамида, фенола, гуанидина изотиоцианата и гуанидина хлорида.
Таким образом, предлагаемая химерная обратная транскриптаза RT-Sto, полученная путём присоединения ДНК-связывающего белка Sto7d из археи Sulfolobus tokodaii обладает повышенной процессивностью и устойчивостью к ингибиторам амплификации и может с успехом использоваться в медицинских диагностических тестах, основанных на использовании обратных транскриптаз.
Источники информации
1. Bayega A. et al. Current and future methods for mRNA analysis: A drive toward single molecule sequencing // Methods in Molecular Biology. Humana Press Inc., 2018. Vol. 1783. P. 209–241.
2. Zhou B. et al. Multiplex reverse transcription-PCR for simultaneous surveillance of influenza A and B viruses // J. Clin. Microbiol. American Society for Microbiology, 2017. Vol. 55, № 12. P. 3492–3501.
3. Burchard P.R. et al. A rapid RT-PCR assay for the detection of HIV-1 in human plasma specimens // Exp. Mol. Pathol. Academic Press Inc., 2014. Vol. 97, № 1. P. 111–115.
4. Malboeuf C.M. et al. Thermal Effects on Reverse Transcription: Improvement of Accuracy and Processivity in cDNA Synthesis // Biotechniques. 2001. Vol. 30, № 5. P. 1074–1084.
5. Zhao C., Liu F., Pyle A.M. An ultraprocessive, accurate reverse transcriptase encoded by a metazoan group II intron // RNA. 2018. Vol. 24, № 2. P. 183–195.
6. Davies K.D., Doebele R.C. Molecular pathways: ROS1 fusion proteins in cancer // Clin. Cancer Res. American Association for Cancer Research Inc., 2013. Vol. 19, № 15. P. 4040–4045.
7. Kozuma Y., Toyokawa G., Seto T. ALK testing methods: is there a winner or loser? // Expert Review of Anticancer Therapy. Taylor and Francis Ltd, 2019. Vol. 19, № 3. P. 237–244.
8. Arezi B., McCarthy M., Hogrefe H. Mutant of Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase exhibits higher resistance to common RT-qPCR inhibitors // Anal. Biochem. 2010. Vol. 400, № 2. P. 301–303.
9. Gerard G.F. et al. The role of template-primer in protection of reverse transcriptase from thermal inactivation // Nucleic Acids Res. Oxford University Press, 2002. Vol. 30, № 14. P. 3118.
10. Harrison G.P. et al. Pausing of reverse transcriptase on retroviral RNA templates is influenced by secondary structures both 5’ and 3’ of the catalytic site // Nucleic Acids Res. 1998. Vol. 26, № 14. P. 3433–3442.
11. Yasukawa K. et al. Increase in thermal stability of Moloney murine leukaemia virus reverse transcriptase by site-directed mutagenesis // J. Biotechnol. 2010. Vol. 150, № 3. P. 299–306.
12. Konishi A., Yasukawa K., Inouye K. Improving the thermal stability of avian myeloblastosis virus reverse transcriptase α-subunit by site-directed mutagenesis // Biotechnol. Lett. 2012. Vol. 34, № 7. P. 1209–1215.
13. Okano H. et al. High sensitive RNA detection by one-step RT-PCR using the genetically engineered variant of DNA polymerase with reverse transcriptase activity from hyperthermophilies // J. Biosci. Bioeng. 2018. Vol. 125, № 3. P. 275–281.
14. Baranauskas A. et al. Generation and characterization of new highly thermostable and processive M-MuLV reverse transcriptase variants // Protein Eng. Des. Sel. 2012. Vol. 25, № 10. P. 657–668.
15. Wang Y. et al. A novel strategy to engineer DNA polymerases for enhanced processivity and improved performance in vitro. // Nucleic Acids Res. 2004. Vol. 32, № 3. P. 1197–1207.
16. Oscorbin I.P. et al. Derivatives of Bst-like Gss-polymerase with improved processivity and inhibitor tolerance // Nucleic Acids Res. 2017. Vol. 45, № 16.
17. Katcher H.L., Schwartz I. A distinctive property of Tth DNA polymerase: Enzymatic amplification in the presence of phenol // Biotechniques. 1994. Vol. 16, № 1. P. 84–92.
18. Sano S. et al. Mutations to create thermostable reverse transcriptase with bacterial family A DNA polymerase from Thermotoga petrophila K4 // J. Biosci. Bioeng. 2012. Vol. 113, № 3. P. 315–321.
19. Ellefson J.W. et al. Synthetic evolutionary origin of a proofreading reverse transcriptase // Science (80-. ). 2016. Vol. 352, № 6293.
20. Mohr S. et al. Thermostable group II intron reverse transcriptase fusion proteins and their use in cDNA synthesis and next-generation RNA sequencing // RNA. 2013. Vol. 19, № 7. P. 958–970.
21. Zhao C., Liu F., Pyle A.M. An ultraprocessive, accurate reverse transcriptase encoded by a metazoan group II intron // RNA. 2018. Vol. 24, № 2. P. 183–195.
22. Arezi B., Hogrefe H. Novel mutations in Moloney Murine Leukemia Virus reverse transcriptase increase thermostability through tighter binding to template-primer. // Nucleic Acids Res. 2009. Vol. 37, № 2. P. 473–481.
Claims (2)
1. Рекомбинантная химерная обратная транскриптаза, обладающая повышенной процессивностью и устойчивостью к ингибиторам амплификации, имеющая молекулярную массу 66,1 кДа, содержащая кодирующую последовательность ДНК-связывающего белка Sto7d термофильной археи Sulfolobus tokodaii, аминокислотную замену K12L в Sto7d, имеющая аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, кодируемую нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 2, представленные в перечне последовательностей.
2. Способ получения рекомбинантной химерной обратной транскриптазы по п.1, включающий направленный мутагенез с помощью ПЦР, клонирование с помощью рестриктазно-лигазного метода, наработку рекомбинантного белка в клетках E. coli с последующей очисткой рекомбинантного белка с помощью хроматографических методов, отличающийся тем, что в кодирующую последовательность белка Sto7d вводят нуклеотидную замену AA>ТТ, присоединяют кодирующую последовательность белка Sto7d к 3’-концу кодирующей последовательности обратной транскриптазы вируса M-MuLV, затем между кодирующими последовательностями белков помещают нуклеотидную последовательность с SEQ ID NO: 1, кодирующую гибкий пептидный линкер Гли-Тре-Гли-Гли-Гли-Гли, полученный сборный фрагмент ДНК, представленный в SEQ ID NO: 2, клонируют в вектор для экспрессии pET23b, сконструированной плазмидой pET23b-RT-Sto, представленной в SEQ ID NO: 4, трансформируют клетки E. coli штамма BL21 (DE3) pLysS, наработанную рекомбинантную химерную обратную транскриптазу очищают сначала с помощью металл-хелатной хроматографии на Ni-NTA-сорбенте, а затем с помощью ионообменной хроматографии на сорбенте HighQ, после чего целевой фермент переводят в буфер для хранения с помощью диализа.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2020143359A RU2762291C1 (ru) | 2020-12-28 | 2020-12-28 | Рекомбинантная химерная обратная транскриптаза, обладающая повышенной процессивностью и устойчивостью к ингибиторам амплификации, и способ ее получения |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2020143359A RU2762291C1 (ru) | 2020-12-28 | 2020-12-28 | Рекомбинантная химерная обратная транскриптаза, обладающая повышенной процессивностью и устойчивостью к ингибиторам амплификации, и способ ее получения |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2762291C1 true RU2762291C1 (ru) | 2021-12-17 |
Family
ID=79175315
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2020143359A RU2762291C1 (ru) | 2020-12-28 | 2020-12-28 | Рекомбинантная химерная обратная транскриптаза, обладающая повышенной процессивностью и устойчивостью к ингибиторам амплификации, и способ ее получения |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2762291C1 (ru) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116004564A (zh) * | 2022-06-01 | 2023-04-25 | 北京擎科生物科技有限公司 | 逆转录突变体及其应用 |
-
2020
- 2020-12-28 RU RU2020143359A patent/RU2762291C1/ru active
Non-Patent Citations (7)
| Title |
|---|
| ARMENTANO D. et al., Effect of internal viral sequences on the utility of retroviral vectors, Journal of Virology, 1987, Vol.61, N5, pp.1647-1650. * |
| MOHR S. et al., Thermostable group II intron reverse transcriptase fusion proteins and their use in cDNA synthesis and next-generation RNA sequencing, RNA, 2013, Vol.19, N7, pp.958-70. * |
| SCHONBRUNNE N.J. et al., Chimeric Thermostable DNA Polymerases with Reverse Transcriptase and Attenuated 3‘−5‘ Exonuclease Activity, Biochemistry, 2006, Vol.45, N42, pp.12786-12795. * |
| SCHONBRUNNE N.J. et al., Chimeric Thermostable DNA Polymerases with Reverse Transcriptase and Attenuated 3‘−5‘ Exonuclease Activity, Biochemistry, 2006, Vol.45, N42, pp.12786-12795. STAMOS J.L et al., Structure of a Thermostable Group II Intron Reverse Transcriptase with Template-Primer and Its Functional and Evolutionary Implications, Mol Cell, 2017, Vol.68, N5, pp.926-939. ZHAO C. et al., An ultraprocessive, accurate reverse transcriptase encoded by a metazoan group II intron, RNA, 2018, Vol.24, N2, 183-195. MOHR S. et al., Thermostable group II intron reverse transcriptase fusion proteins and their use in cDNA synthesis and next-generation RNA sequencing, RNA, 2013, Vol.19, N7, pp.958-70. ЛУКЬЯНОВ К.А. и др., Метод получения нормализованных библиотек кДНК, основанный на эффекте супрессии полимеразной цепной реакции, БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, 1996, т.22, н.9, стр.686-690. ARMENTANO D. et al., Effect of internal viral sequences on the utility of retroviral vectors, Journal of Virology, * |
| STAMOS J.L et al., Structure of a Thermostable Group II Intron Reverse Transcriptase with Template-Primer and Its Functional and Evolutionary Implications, Mol Cell, 2017, Vol.68, N5, pp.926-939. * |
| ZHAO C. et al., An ultraprocessive, accurate reverse transcriptase encoded by a metazoan group II intron, RNA, 2018, Vol.24, N2, 183-195. * |
| ЛУКЬЯНОВ К.А. и др., Метод получения нормализованных библиотек кДНК, основанный на эффекте супрессии полимеразной цепной реакции, БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, 1996, т.22, н.9, стр.686-690. * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116004564A (zh) * | 2022-06-01 | 2023-04-25 | 北京擎科生物科技有限公司 | 逆转录突变体及其应用 |
| CN116004564B (zh) * | 2022-06-01 | 2023-08-18 | 北京擎科生物科技股份有限公司 | 逆转录突变体及其应用 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP6150847B2 (ja) | キメラｄｎａポリメラーゼ | |
| US7488816B2 (en) | Methods for obtaining thermostable enzymes, DNA polymerase I variants from Thermus aquaticus having new catalytic activities, methods for obtaining the same, and applications of the same | |
| JP4689163B2 (ja) | 改良型ポリメラーゼの使用方法 | |
| CN103492559B (zh) | 具有改进活性的dna聚合酶 | |
| JP2015171384A (ja) | 改変ａ型ｄｎａポリメラーゼ | |
| KR102880295B1 (ko) | Rna로부터의 핵산 증폭반응에 적합한 dna 폴리머라아제 돌연변이체 | |
| JP3112148B2 (ja) | 核酸の増幅方法およびその試薬 | |
| JP2019512217A (ja) | エキソヌクレアーゼ欠損ポリメラーゼ | |
| US7803596B2 (en) | Enzyme derived from thermophilic organisms that functions as a chromosomal replicase, and preparation and uses thereof | |
| CN103687943B (zh) | 具有改进活性的dna聚合酶 | |
| WO2017090684A1 (ja) | Ｄｎａポリメラーゼ変異体 | |
| CN116042569A (zh) | Mmlv逆转录酶突变体及其应用 | |
| KR20080031255A (ko) | 변이형 ｐｃｎａ | |
| RU2762291C1 (ru) | Рекомбинантная химерная обратная транскриптаза, обладающая повышенной процессивностью и устойчивостью к ингибиторам амплификации, и способ ее получения | |
| JP6720632B2 (ja) | 融合タンパク質 | |
| SG186325A1 (en) | Dna polymerases with increased 3'-mismatch discrimination | |
| WO2021127848A1 (zh) | 嵌合dna聚合酶及其应用 | |
| WO1998045452A2 (en) | Enzyme derived from thermophilic organisms that functions as a chromosomal replicase, and preparation and uses thereof | |
| WO2019002178A1 (en) | DNA MUTANTS THERMOPHILIC POLYMERASES | |
| JPH07298879A (ja) | 超好熱始原菌由来のｄｎａポリメラーゼ遺伝子およびその用途 | |
| CN120457200A (zh) | Dna聚合酶变体 | |
| JP5707705B2 (ja) | 新規な核酸合成用組成物 | |
| JP6416885B2 (ja) | 高温で活性なｈｉｖタイプ１グループｏ逆転写酵素 | |
| WO2024138419A1 (zh) | 具有dna聚合酶活性的多肽及其应用 | |
| WO2025166644A1 (zh) | 多核苷酸激酶突变体及其应用 |