RU2747192C1 - Наборы олигонуклеотидов для количественного определения провируса лейкоза крупного рогатого скота - Google Patents
Наборы олигонуклеотидов для количественного определения провируса лейкоза крупного рогатого скота Download PDFInfo
- Publication number
- RU2747192C1 RU2747192C1 RU2020122390A RU2020122390A RU2747192C1 RU 2747192 C1 RU2747192 C1 RU 2747192C1 RU 2020122390 A RU2020122390 A RU 2020122390A RU 2020122390 A RU2020122390 A RU 2020122390A RU 2747192 C1 RU2747192 C1 RU 2747192C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- env
- provirus
- ggc
- quantitative determination
- gga
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой набор олигонуклеотидов для анализа провируса лейкоза крупного рогатого скота методом полимеразной цепной реакции в реальном времени, включает три прямых праймера: env_5400_F ttc-cct-ctg-tca-gat-cat-gg; env_5442_F cac-ggg-cct-tcc-cag-a; env F aag-ggc-ggc-gcc-ggt-tt, один обратный праймер env_5620_R gga-agg-gtg-gtg-cca-tc и две флуоресцентных разрушаемые пробы типа TagMan: env_5441 (ROX) ct-acg-ggc-ctt-ccc-ag (RTQ2); env_5549 (FAM)ct-ccc-gga-cgc-cca-aa (RTQ1), позволяющий количественно определять провирус ВЛКРС с повышенной чувствительностью и высокой специфичностью. Предложенный набор олигонуклеотидов повышает чувствительность, специфичность и точность количественного определения провируса ВЛКРС методом ПЦР-РВ. 3 ил., 3 табл.
Description
Изобретение относится к сельскому хозяйству, к ветеринарной медицине, к способу определения провируса лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС) в образцах крови и спермы КРС, а именно, к разработке олигонуклеотидов для количественного молекулярно-генетического анализа провируса лейкоза крупного рогатого скота методом полимеразной цепной реакции в реальном времени, и может быть использовано для выявления животных - вирусоносителей, в том числе среди новорожденных телят сразу после отела, с целью формирования безвирусного ремонтного поголовья крупного рогатого скота и выращивания ремонтного молодняка, свободного от ВЖРС.
Известны способы определения провируса лейкоза КРС, основанные на иммунологических и молекулярно-генетических методах.
В настоящее время чаще всего для выявления вирусоносителей используют иммунологические методы РИД (радиальной иммунодиффузии) и ИФА (иммуноферментный анализ), для которых выпускаются соответствующие коммерческие диагностические наборы. У зараженных животных в крови циркулируют антитела против gp51 (белки оболочки) и р24 (к белкам gag). Антитела к др51 появляются раньше и в более высоком титре, чем антитела к р24 и, серологические реакции, направленные на выявление антител против др51, по своей чувствительности превосходят реакции, в которых используется в качестве антигена белок р24. В целом, чувствительность метода достаточно низкая.
Метод ПЦР (полимеразной цепной реакции) разработан для диагностики провируса лейкоза КРС и применяется в нескольких регионах России для массового скрининга животных, но этот метод требует проведения анализа амплифицированного фрагмента с помощью электрофореза в агарозном геле, при этом возможна контаминации проб, что приводит в ложноположительным реакциям и к последующей ошибочной выбраковке животных.
ПЦР-РВ (ПЦР в реальном времени) основана на количественной детекции флуоресцентного сигнала, который увеличивается пропорционально количеству ПЦР-продукта. Следовательно, результат ПЦР в реальном времени можно регистрировать в процессе реакции, в каждый момент времени. Современная тест-система ПЦР в реальном времени содержит пару праймеров и дополнительный TagMan зонд, комплементарный внутреннему участку фрагмента. К зонду ковалентно пришиты две молекулы: на 5-конце флуоресцентная метка («reporter»), она испускает флуоресценцию, на 3'- конце гаситель флуоресценции («quencher»), который гасит флуоресценцию флуоресцирующей молекулы. В ходе реакции Tag-полимераза, продвигаясь по матрице, достигает зонда и расщепляет его. При этом расстояние между флуоресцентной меткой и гасителем флуоресценции увеличивается, флуоресценция больше не гасится (рисунок 1).
Недостатком иммунологических способов выявления вирусоносительства является то, что их использование возможно при достижении телятами возраста 6 месяцев, когда из крови исчезают колостральные антитела.
Недостатком ПЦР является возможность получения ложноположительных результатов, поэтому для устранения этого недостатка в лабораториях необходимо организовать 2 рабочие зоны, надежно изолированные друг от друга, что требует дополнительных затрат средств и наличия 2-3 отдельных лабораторных комнат, что далеко не всегда возможно. В настоящее время для выявления вирусоносителей по ВЛКРС предложен способ ПЦР-РВ, лишенный этих недостатков.
Прототипом в настоящей работе является патент №2521330 (автор Косовский Г.Ю. и соавт.), которые предложили «Способ выявления вируса лейкоза КРС по нуклеотидным последовательностям консервативных областей вирусного генома». Их изобретение обеспечивает детектирование провируса ВЛКРС за счет генов группоспецифического антигена (gag) для ядра и структурных белков вируса и полимеразы для обратной транскриптазы pol. Недостатками метода являются
- невысокая чувствительность - при низком уровне матрицы после 30-35 циклов реакции появляются неспецифические продукты реакции, в том числе в отрицательном контроле, что недопустимо в принципе;
- недостатком прототипа является нереализованная возможность количественного обнаружения провируса.
Задачей изобретения является разработка наборов олигонуклеотидов и подхода, являющегося основой для способа выявления провируса лейкоза крупного рогатого скота методом ПЦР-РВ, имеющего следующие преимущества по сравнению с прототипом:
1) повышенная специфичность детекции ВЛКРС, что стало возможным благодаря двум флуоресцентным меткам TagMan;
2) возможность увеличения количества циклов ПЦР для повышения чувствительности метода;
3) возможность проводить генотипирование местных изолятов вируса лейкоза, используя аллель-специфичные праймеры для гена env в реакции ПЦР в реальном времени.
Задача решается тем, что выявление провируса ВЛКРС с помощью полимеразной цепной реакции в реальном времени проводится на основе последовательности гена белка оболочки вируса env. Консенсусная последовательность использованного в работе фрагмента получена путем сравнения (выравнивания) 18 последовательностей разных изолятов, имеющихся в настоящий момент в банках генов (рисунок 2).
Представленная область генома ВЛКРС содержит консервативные участки, чередующиеся с вариабельными. Консервативные участки позволили подобрать олигонуклеотиды для анализа провируса лейкоза, независимо от распространенного изолята вируса. Вариабельные участки определяют антигенные свойства вируса, что является основанием для генотипирования вируса. В таблице 1 показаны наборы праймеров, включающие три прямых, два обратных праймера и две флуоресцентных пробы типа TagMan.
Для генотипирования в указанной области выбираются сайт-специфические праймеры (по 3'-концу), соответствующие участку gp51 внутри env-гена. Температура плавления линейной разрушаемой пробы TagMan должна быть на 3-5°С выше чем у пары используемых праймеров. Несколько повышенная температура плавления пробы необходима для более прочной гибридизации данного олигонуклеотида с участком провирусной ДНК, так как только в этом случае проба удержится на матрице до начала ее 5'-экзонуклеазного разрушения Taq-полимеразой.
Условия проведения реакции ПЦР-РВ приведены в таблице 2. При необходимости количество циклов увеличивается.
Результат применения подобранных праймеров при определении провируса ВЛКРС в образцах крови телят показан на рисунке 3.
Особенностью предлагаемого способа выявления провируса ВЛКРС с помощью полимеразной цепной реакции в реальном времени является наличие в наборе трех прямых, двух обратных праймеров и 2 флуоресцентных разрушаемых проб внутри одной последовательности внутри гена env, что позволяет существенно повысить специфичность и точность реакции, а также чувствительность при определении малых доз провируса в образце. Минимально выявляемое количество молекул вирусной ДНК равно 50-100 молекул на пробу при 40 циклах реакции.
Для подтверждения возможности использования методики ПЦР-РВ для массового скрининга были проанализированы образцы геномной ДНК животных четырех групп разного возраста и различным статусом по заболеваемости лейкозом, результаты представлены в таблице 4.
Полученные данные свидетельствуют о широком распространении ВЛКРС. Причем среди молодняка доля инфицированных животных значительно ниже, чем у взрослых коров. Среди РИД + скота только у половины обнаружен провирус лейкоза, что говорит либо об устойчивости животных к персистенции вируса в периферической крови, либо о бессимптомном вирусоносительстве, либо о сниженной специфичности реакции иммунопреципитации. Животные с гематологическими проявлениями лейкоза имеют 100%, как и должно быть, поскольку это больные животные.
Список использованной литературы
Косовский Г.Ю., Климов Е.А., Горюнов Д.В., Сиволапова А.Б. Пат.2521330 РФ, МПК С2 G01N. Способ выявления вируса лейкоза КРС по нуклеотидным последовательностям консервативных областей вирусного генома [Текст] /; заявл. 15.06.2012; опубл. 20.12.2013.
Ребриков Д.В., Саматов Г.А., Трофимов Д.Ю., Семенов П.А., Савилова A.M., Кофиади И.А., Абрамов Д.Д. ПЦР в реальном времени. - М., Издательство: БИНОМ. Лаборатория знаний, 2009, - 223 с. ил.
Claims (1)
- Набор олигонуклеотидов для анализа провируса лейкоза крупного рогатого скота методом полимеразной цепной реакции в реальном времени включает три прямых праймера: env_5400_F ttc-cct-ctg-tca-gat-cat-gg; env_5442_F cac-ggg-cct-tcc-cag-a; env F aag-ggc-ggc-gcc-ggt-tt, один обратный праймер env_5620_R gga-agg-gtg-gtg-cca-tc и две флуоресцентных разрушаемые пробы типа TagMan: env_5441 (ROX) ct-acg-ggc-ctt-ccc-ag (RTQ2); env_5549 (FAM)ct-ccc-gga-cgc-cca-aa (RTQ1), позволяющий количественно определять провирус ВЛКРС с повышенной чувствительностью и высокой специфичностью.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2020122390A RU2747192C1 (ru) | 2020-07-07 | 2020-07-07 | Наборы олигонуклеотидов для количественного определения провируса лейкоза крупного рогатого скота |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2020122390A RU2747192C1 (ru) | 2020-07-07 | 2020-07-07 | Наборы олигонуклеотидов для количественного определения провируса лейкоза крупного рогатого скота |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2747192C1 true RU2747192C1 (ru) | 2021-04-29 |
Family
ID=75850945
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2020122390A RU2747192C1 (ru) | 2020-07-07 | 2020-07-07 | Наборы олигонуклеотидов для количественного определения провируса лейкоза крупного рогатого скота |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2747192C1 (ru) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2521330C2 (ru) * | 2012-06-15 | 2014-06-27 | Государственное научное учреждение Центр экспериментальной эмбриологии и репродуктивных биотехнологий Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ЦЭЭРБ Россельхозакадемии) | Способ выявления вируса лейкоза крс по нуклеотидным последовательностям консервативных областей вирусного генома |
-
2020
- 2020-07-07 RU RU2020122390A patent/RU2747192C1/ru active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2521330C2 (ru) * | 2012-06-15 | 2014-06-27 | Государственное научное учреждение Центр экспериментальной эмбриологии и репродуктивных биотехнологий Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ЦЭЭРБ Россельхозакадемии) | Способ выявления вируса лейкоза крс по нуклеотидным последовательностям консервативных областей вирусного генома |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| D. V. REBRIKOV, real-time PCR. - M., Publisher: BINOM. Knowledge Laboratory, 2009, - 223 p. * |
| IRINA M. DONNIK, et al, Genrtic identification of bovine leukaemia virus, Foods and Raw Materials, 2018, vol. 6, N 2, pp. 314-324, DOI: http: daorr / 10.21603 / 2308-4057-2018-2-314-324. * |
| РЕБРИКОВ Д.В., ПЦР в реальном времени. - М., Издательство: БИНОМ. Лаборатория знаний, 2009, - 223 с. IRINA M.DONNIK, et al, Genrtic identification of bovine leukaemia virus, Foods and Raw Materials, 2018, vol. 6, N 2, c.314-324, DOI: http: daorr/10.21603/2308-4057-2018-2-314-324. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Hofmann-Lehmann et al. | Feline leukaemia virus infection: A practical approach to diagnosis | |
| Oura et al. | Virological diagnosis of African swine fever—comparative study of available tests | |
| Lu et al. | Multi-target PCR analysis by capillary electrophoresis and laser-induced fluorescence. | |
| JP6329370B2 (ja) | 呼吸器系ウイルスによる疾患の同時診断キット | |
| James et al. | LamPORE: rapid, accurate and highly scalable molecular screening for SARS-CoV-2 infection, based on nanopore sequencing | |
| Clewley | The polymerase chain reaction, a review of the practical limitations for human immunodeficiency virus diagnosis | |
| US20060099628A1 (en) | Diagnostic assay for rickettsia prowazekii disease by detection of responsive gene expression | |
| Heenemann et al. | Development of a Bovine leukemia virus polymerase gene–based real-time polymerase chain reaction and comparison with an envelope gene–based assay | |
| RU2732608C1 (ru) | Набор реагентов для выявления РНК вируса SARS-CoV-2, возбудителя нового коронавирусного заболевания COVID-2019, методом обратной транскрипции-полимеразной цепной реакции в реальном времени | |
| Boyd et al. | Development of multiplexed bead arrays for the simultaneous detection of nucleic acid from multiple viruses in bat samples | |
| Mahendran et al. | Droplet digital polymerase chain reaction (ddPCR) for the detection of Plasmodium knowlesi and Plasmodium vivax | |
| Arumugam et al. | The potential use of unprocessed sample for RT-qPCR detection of COVID-19 without an RNA extraction step | |
| Crawford et al. | New challenges for the diagnosis of feline immunodeficiency virus infection | |
| De Brun et al. | Development of a droplet digital PCR assay for quantification of the proviral load of bovine leukemia virus | |
| CN110305988A (zh) | 鸽新城疫病毒LAMP-TaqMan检测试剂盒 | |
| Zeybek et al. | Optimization and validation of a real-time polymerase chain reaction protocol for the diagnosis of human brucellosis | |
| RU2747192C1 (ru) | Наборы олигонуклеотидов для количественного определения провируса лейкоза крупного рогатого скота | |
| Sako et al. | Loop-mediated isothermal amplification method for a differential identification of human Taenia tapeworms | |
| Braham et al. | Evaluation of the Roche LightCycler parvovirus B19 quantification kit for the diagnosis of parvovirus B19 infections | |
| Alnaeem et al. | Surveillance of the equine infectious anemia virus in Eastern and Central Saudi Arabia during 2014-2016 | |
| Komiyama et al. | Development of loop-mediated isothermal amplification method for diagnosis of bovine leukemia virus infection | |
| Gorbunova et al. | A new approach to the diagnosis of enzootic leukosis by genetic markers of bovine leukemia virus | |
| Agnihotri et al. | Comparative evaluation of immunochromatographic and reverse transcriptase polymerase chain reaction based tests for diagnosis of canine distemper | |
| RU2595373C1 (ru) | Набор для выявления днк провируса иммунодефицита крупного рогатого скота, содержащий пару специфичных праймеров и зонд, и способ диагностики вирусного иммунодефицита крупного рогатого скота методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени | |
| AU2015413017B2 (en) | Method and identification kit for identifying sensitizing drug for drug allergic reaction |