RU2743365C1 - Method of detecting phylogenetic sublines of beijing mycobacterium tuberculosis genotype in real time format - Google Patents
Method of detecting phylogenetic sublines of beijing mycobacterium tuberculosis genotype in real time format Download PDFInfo
- Publication number
- RU2743365C1 RU2743365C1 RU2020116755A RU2020116755A RU2743365C1 RU 2743365 C1 RU2743365 C1 RU 2743365C1 RU 2020116755 A RU2020116755 A RU 2020116755A RU 2020116755 A RU2020116755 A RU 2020116755A RU 2743365 C1 RU2743365 C1 RU 2743365C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- beijing
- channel
- genotype
- wavelength
- tuberculosis
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Virology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к медицине, а именно к фтизиатрии, и может быть использовано для лабораторного определения микобактерий туберкулеза, относящихся к основным филогенетическим сублиниям генотипа Beijing.The invention relates to medicine, namely to phthisiology, and can be used for the laboratory determination of Mycobacterium tuberculosis belonging to the main phylogenetic subline of the Beijing genotype.
В настоящее время при снижении заболеваемости туберкулезом в России имеет место нарастание доли множественно/широко-лекарственно-устойчивых штаммов (MDR/XDR ТВ - multi/extensively drug resistant ТВ). Устойчивые к антибиотикам и одновременно способные к быстрому распространению штаммы Mycobacterium tuberculosis угрожают борьбе с глобальной эпидемией туберкулеза.Currently, with a decrease in the incidence of tuberculosis in Russia, there is an increase in the proportion of multi / extensively drug resistant TB strains (MDR / XDR TB). Antibiotic-resistant, yet rapidly spreading strains of Mycobacterium tuberculosis threaten the fight against the global tuberculosis epidemic.
М. tuberculosis является строго клональным видом, подразделяемым на 8 филогенетических линий, которые включают генетические семейства и клональные комплексы. Такие различные геногруппы имеют и различия в клинической значимости и патогенетическом потенциале как результат различий адаптивной коэволюции с человеком. Восточно-Азиатская линия является одной из наиболее распространенных линий M. tuberculosis, а генетическое семейство Beijing - наиболее известным и основным ее представителем. Впервые открытые в Китае в 1995 году (van Soolingen et al., 1995), сейчас штаммы Beijing глобально распространены, часто, но не всегда ассоциированы с лекарственной устойчивостью и определяются как гипервирулентные.M. tuberculosis is a strictly clonal species, subdivided into 8 phylogenetic lineages, which include genetic families and clonal complexes. Such different genogroups also have differences in clinical significance and pathogenetic potential as a result of differences in adaptive co-evolution with humans. The East Asian lineage is one of the most widespread M. tuberculosis lines, and the Beijing genetic family is its most famous and main representative. First discovered in China in 1995 (van Soolingen et al., 1995), Beijing strains are now globally distributed, often but not always associated with drug resistance, and are defined as hypervirulent.
Генетическое семейство Beijing разделяют на крупные филогенетические сублинии древних и современных штаммов (Mokrousov et al., 2002, 2006), которые выделяют на основе ряда маркеров генома, а именно делеции RD181, полиморфизмы в генах mutT2 и mutT4, и полиморфизма в локусе NTF (наличие/отсутствие IS6110) (Фиг. 1). Биоинформационный и филогенетический анализ генетических данных штаммов М. tuberculosis различных генотипов, включая штаммы семейства Beijing, позволил выявить однонуклеотидные полиморфизмы (мутация mutT2-58 GGA>CGA, что соответствует позиции 1286766 в геноме референтного штамма H37Rv NC_000962.3 и мутация mutT4-48 CGG>GGG что соответствует позиции 4393590 в геноме референтного штамма H37Rv NC_000962.3), позволяющие разграничить ранние древние, древние и современные штаммы генотипа Beijing (Ebrahimi-Rad et al., 2003; Wada et al., 2009; Yin et al., 2015).The Beijing genetic family is divided into large phylogenetic sublines of ancient and modern strains (Mokrousov et al., 2002, 2006), which are isolated based on a number of genome markers, namely, RD181 deletions, polymorphisms in the mutT2 and mutT4 genes, and polymorphism at the NTF locus (presence / no IS6110) (Fig. 1). Bioinformatic and phylogenetic analysis of the genetic data of M. tuberculosis strains of various genotypes, including strains of the Beijing family, revealed single nucleotide polymorphisms (mutation mutT2-58 GGA> CGA, which corresponds to position 1286766 in the genome of the reference H37Rv strain NC_000962.3 and mutation mutT4-48 GGG, which corresponds to position 4393590 in the genome of the reference strain H37Rv NC_000962.3), which makes it possible to distinguish between early ancient, ancient and modern strains of the Beijing genotype (Ebrahimi-Rad et al., 2003; Wada et al., 2009; Yin et al., 2015) ...
В то время как современные штаммы Beijing циркулируют по всему миру, древние сублинии преобладают в Корее (Shamputa et al., 2010) и Японии (Wada et al., 2009), реже встречаются в Китае (Mokrousov et al., 2005; Luo et al., 2015) и Вьетнаме (Maeda et al., 2014) и редко в других странах. Например, в России, где генотип Beijing составляет от 35 до 65% от общей популяции М. tuberculosis, древние штаммы были обнаружены в 5-14% популяций Beijing на северо-западе России и в Западной Сибири (Mokrousov et al., 2002, 2019). Следует отметить, что различия в ассоциации устойчивости к определенным препаратам были отмечены еще в первых работах в Китае (Mokrousov et al., 2006) и Японии (Iwamoto et al., 2008). Во Вьетнаме устойчивость к изониазиду и стрептомицину чаще наблюдали у древних штаммов Beijing (Maeda et al. 2014). С другой стороны, нарастание циркуляции современных штаммов было отмечено в Японии среди молодого населения (Iwamoto et al., 2009) и увеличенная кластеризация, как прокси-маркер трансмиссивности была описана как среди древних, так и современных штаммов Beijing по сравнению со штаммами других, не-Beijing генотипов во Вьетнаме (Maeda et al., 2014). Недавно был описан клональный кластер относящийся к ранней древней сублинии генотипа Beijing в Западной Сибири в относительно высокой доле (14,3% популяции Beijing) и ассоциированный с множественной и широкой лекарственной устойчивостью (Mokrousov et al., 2019).While modern strains of Beijing circulate around the world, ancient sublines prevail in Korea (Shamputa et al., 2010) and Japan (Wada et al., 2009), less often in China (Mokrousov et al., 2005; Luo et al., 2015) and Vietnam (Maeda et al., 2014) and rarely in other countries. For example, in Russia, where the Beijing genotype accounts for 35 to 65% of the total population of M. tuberculosis, ancient strains were found in 5-14% of the Beijing populations in northwestern Russia and Western Siberia (Mokrousov et al., 2002, 2019 ). It should be noted that differences in the association of resistance to certain drugs were noted in the first works in China (Mokrousov et al., 2006) and Japan (Iwamoto et al., 2008). In Vietnam, resistance to isoniazid and streptomycin was more frequently observed in ancient Beijing strains (Maeda et al. 2014). On the other hand, an increase in the circulation of modern strains was noted in Japan among the young population (Iwamoto et al., 2009) and increased clustering, as a proxy marker of transmissibility, was described among both ancient and modern Beijing strains in comparison with strains of others, not -Beijing genotypes in Vietnam (Maeda et al., 2014). Recently, a clonal cluster related to the early ancient subline of the Beijing genotype in Western Siberia in a relatively high proportion (14.3% of the Beijing population) and associated with multiple and extensive drug resistance was described (Mokrousov et al., 2019).
Таким образом, разработка способа быстрой детекции крупных филогенетических сублиний внутри генотипа Beijing имеет и практическую значимость.Thus, the development of a method for the rapid detection of large phylogenetic sublines within the Beijing genotype is also of practical importance.
Известно определение штаммов древних и современных сублиний Beijing секвенированием фрагментов генов mutT2 и mutT4 (Ebrahimi Rad 2003, Kremer 2004) или с использованием мультиплексной ПЦР локуса NTF (Nakanishi et al., 2013). Также описана дифференциация штаммов древних и современных сублиний Beijing на основе анализа длины гена Rv3135, наличия вставок IS6110 в локусе IS61547 (Mokrousov et al., 2002), анализа структуры локуса NTF на наличие и количество вставок IS6110 (Mokrousov et al., 2005).It is known to identify strains of ancient and modern Beijing sublines by sequencing mutT2 and mutT4 gene fragments (Ebrahimi Rad 2003, Kremer 2004) or using multiplex PCR at the NTF locus (Nakanishi et al., 2013). The differentiation of strains of ancient and modern Beijing sublines was also described based on the analysis of the length of the Rv3135 gene, the presence of IS6110 insertions at the IS61547 locus (Mokrousov et al., 2002), and analysis of the NTF locus structure for the presence and number of IS6110 inserts (Mokrousov et al., 2005).
Недостатками данных подходов является трудоемкость анализа, требующего секвенирование генов mutT2 и mutT4, нестабильность локуса NTF, приводящая к неспецифическим продуктам ПЦР, отсутствие валидации методов на основе анализа генов Rv315 и IS1547.The disadvantages of these approaches are the laboriousness of the analysis requiring sequencing of the mutT2 and mutT4 genes, the instability of the NTF locus, leading to nonspecific PCR products, and the lack of validation of methods based on the analysis of the Rv315 and IS1547 genes.
Таким образом, разработка быстрого и простого способа детекции трех крупных филогенетических сублиний М. tuberculosis Beijing является актуальной задачей эпидемиологического мониторинга возбудителя туберкулеза.Thus, the development of a quick and simple method for the detection of three large phylogenetic sublines of M. tuberculosis Beijing is an urgent task of epidemiological monitoring of the causative agent of tuberculosis.
Задачей предлагаемого изобретения является разработка способа быстрой и надежной детекции сублиний генотипа Beijing микобактерий туберкулеза (ранние древние, древние и современные штаммы) на основе анализа кодона 58 в гене mutT2 и кодона 48 в гене mutT4.The objective of the present invention is to develop a method for fast and reliable detection of sublines of the Beijing mycobacterium tuberculosis genotype (early ancient, ancient and modern strains) based on the analysis of
Задача реализуется за счет того, что одновременно определяют наличие нуклеотидных замен в данных кодонах с помощью ПЦР в формате реального времени с использованием олигонуклеотидных праймеров (5'-CGGTTGCACGGTCTTGGT, 5'-GCAATATCGTCGCCCACAC, 5'-ACAAGCCAAATCACGTCGAC, 5'-AACCCTCCAGCCGATGTTT), и флуоресцентно-меченых зондов (FAM-5'-CTGGGACTCGAGGTCGC-RTQ1, НЕХ-5'-ACTGCGACTCGAGGTCG-BHQ2, ROX-5'-AGCGGTCCCGGTCC-BHQ2, Cy5-5'-AGCGGTCCGGGTCC-BHQ2), с оценкой результатов ПЦР между 15-35 циклами и при регистрации экспоненциального роста сигнала флуоресценции по НЕХ-каналу с длиной волны 555 нм и Cy5 каналу с длиной волны 670 нм судят о принадлежности штамма к современной сублинии генотипа Beijing М. tuberculosis, при регистрации экспоненциального роста по FAM-каналу с длиной волны 510 нм и Cy5 каналу с длиной волны 670 нм судят о принадлежности штамма к древней сублинии генотипа Beijing М. tuberculosis, а при регистрации экспоненциального роста по FAM-каналу с длиной волны 510 нм и ROX каналу с длиной волны 600 нм судят о принадлежности штамма к ранней древней сублинии генотипа Beijing М. tuberculosis.The task is realized due to the fact that simultaneously determine the presence of nucleotide substitutions in these codons using real-time PCR using oligonucleotide primers (5'-CGGTTGCACGGTCTTGGT, 5'-GCAATATCGTCGCCCACAC, 5'-ACAAGCCAATC'-GTCGACT -labeled probes (FAM-5'-CTGGGACTCGAGGTCGC-RTQ1, HEX-5'-ACTGCGACTCGAGGTCG-BHQ2, ROX-5'-AGCGGTCCCGGTCC-BHQ2, Cy5-5'-AGCGGTCCGGGTCC-BHQ2 PQ35) and when registering the exponential growth of the fluorescence signal through the HEX channel with a wavelength of 555 nm and the Cy5 channel with a wavelength of 670 nm, the strain is judged to belong to the modern subline of the Beijing M. tuberculosis genotype, when registering exponential growth through the FAM channel with a wavelength of 510 nm and Cy5 channel with a wavelength of 670 nm are judged that the strain belongs to the ancient subline of the Beijing M. tuberculosis genotype, and when registering exponential growth through the FAM channel with a wavelength of 510 nm and the ROX channel from lengths The second wave of 600 nm indicates that the strain belongs to the early ancient subline of the Beijing M. tuberculosis genotype.
Преимущества предлагаемого способа: 1. быстрота (менее одного дня от момента выделения ДНК); 2. простая и однозначная интерпретация результатов; 3. возможность быстрого анализа больших коллекций штаммов М. tuberculosis для оценки их принадлежности к сублиниям генотипа Beijing М. Tuberculosis; 4. возможность выявления контаминации и микс-инфекции.The advantages of the proposed method: 1. speed (less than one day from the moment of DNA extraction); 2. simple and unambiguous interpretation of the results; 3. the ability to quickly analyze large collections of M. tuberculosis strains to assess their belonging to the subline of the Beijing M. Tuberculosis genotype; 4. the ability to detect contamination and mix infection.
Аллель-специфическая ПЦР основана на использовании сконструированных нами 4 праймеров и 4 флуоресцентно-меченых зондов для одновременного выявления аллелей mutT2-58 GGA>CGA и muT4-48 CGG) (Фиг. 2).Allele-specific PCR is based on the use of our designed 4 primers and 4 fluorescently-labeled probes for the simultaneous detection of mutT2-58 GGA> CGA and muT4-48 CGG alleles) (Fig. 2).
Изобретение поясняется чертежами, где Фиг. 1 - Схема эволюции генотипа Beijing с указанием ключевых эволюционных событий, разделяющих три сублинии. Фиг. 2 - Схема ПЦР (не в масштабе) участков двух генов mutT2 и mutT4, где тонкие стрелки - позиции праймеров и зондов в геноме референс-штамма H37Rv; а широкая стрелка обозначает позиции маркерных нуклеотидных замен в генах mutT2-58 и mutT4-48. Фиг. 3 - накопление сигнала флуоресценции: (а) по HEX каналу детекции, на современную сублинию М. tuberculosis Beijing, (б) по FAM каналу детекции, на штамм ранней древней или древней сублинии генотипа Beijing М. tuberculosis. (в) по ROX каналу детекции, на раннюю древнюю сублинию генотипа Beijing М. tuberculosis. и (г) Cy5 каналу детекции, на штамм древней или современной сублинии генотипа Beijing М. tuberculosis. Вода служит отрицательным контрольным образцом.The invention is illustrated by drawings, where FIG. 1 - Diagram of the evolution of the Beijing genotype showing the key evolutionary events that separate the three sublines. FIG. 2 - PCR scheme (not to scale) of sections of two genes mutT2 and mutT4, where thin arrows are the positions of primers and probes in the genome of the reference strain H37Rv; and the wide arrow denotes the positions of marker nucleotide substitutions in the mutT2-58 and mutT4-48 genes. FIG. 3 - accumulation of the fluorescence signal: (a) by the HEX detection channel, to the modern M. tuberculosis Beijing subline, (b) by the FAM detection channel, to the strain of an early ancient or ancient subline of the Beijing M. tuberculosis genotype. (c) by ROX detection channel, to an early ancient subline of the Beijing M. tuberculosis genotype. and (d) the Cy5 detection channel, against an ancient or modern subline of the Beijing M. tuberculosis genotype. Water serves as a negative control.
Способ был отработан и условия были оптимизированы на 37 штаммах М. tuberculosis различных генотипов по которым ранее были получены данные полногеномного секвенирования (депонированы в NCBI Sequence Read Archive как PRJNA305488 и PRJNA489691) и соответственно были известны их аллели генов mutT2-58 и mutTE4-48.The method was worked out and the conditions were optimized on 37 M. tuberculosis strains of various genotypes for which the data of whole genome sequencing were previously obtained (deposited in the NCBI Sequence Read Archive as PRJNA305488 and PRJNA489691) and, accordingly, their alleles of the mutT2-58 and mutTE4-48 genes were known.
Способ осуществляется следующим образом.The method is carried out as follows.
(1) Выделение ДНК из культуры М. tuberculosis, выращенной на среде Левенштейна-Йенсена, проводят по van Embden et al. [1993]: суспендируют 1 стандартную бактериологическую петлю культуры в 400 мкл буфера ТЕ ×1 и инкубируют 20 мин при 85°С.Дальнейшую обработку проводят с использованием лизоцима, протеиназы К, додецилсульфата натрия и цетилтриметиламмонийбромида. Полученный клеточный лизат обрабатывают смесью фенол-хлороформ-изоамиловый спирт (25:24:1), центрифугируют, осаждают изопропанолом, промывают 70% этанолом, осадок высушивают и растворяют в 30-50 мкл ТЕ ×l.(1) Isolation of DNA from a culture of M. tuberculosis grown in Lowenstein-Jensen medium is carried out according to van Embden et al. [1993]: suspend 1 standard bacteriological loop of culture in 400 μl of TE × 1 buffer and incubate for 20 min at 85 ° C. Further processing is carried out using lysozyme, proteinase K, sodium dodecyl sulfate and cetyltrimethylammonium bromide. The obtained cell lysate is treated with a mixture of phenol-chloroform-isoamyl alcohol (25: 24: 1), centrifuged, precipitated with isopropanol, washed with 70% ethanol, the precipitate is dried and dissolved in 30-50 μl TE × l.
(2) Выявление генотипа Beijing любым удобным способом, например, методом сполготипирования (Kamerbeek et al., 1997). Дальнейший анализ проводят только для штаммов генотипа Beijing.(2) Detection of the Beijing genotype by any convenient method, for example, by spolotyping (Kamerbeek et al., 1997). Further analysis is carried out only for strains of the Beijing genotype.
(3) Реализация разработанного нами способа детекции сублиний генотипа Beijing.(3) Implementation of the method developed by us for detecting sublines of the Beijing genotype.
Были использованы следующие сконструированные нами праймеры и зонды для ПЦР в реальном времени для проведения реакции ПЦР и детекции флуоресценции по 4 каналам в одной пробирке одновременно: праймеры mutT2-58F mutT2-58R, mutT4-48F, mutT4-48R, и зонды mutT2-58wt FAM, mutT2-58m HEX, mutT4-48wt ROX, mutT4-48m Cy5 (Фиг. 2).We used the following primers and probes for real-time PCR we designed to carry out the PCR reaction and fluorescence detection in 4 channels in one tube simultaneously: mutT2-58F mutT2-58R primers, mutT4-48F, mutT4-48R, and mutT2-58wt FAM probes , mutT2-58m HEX, mutT4-48wt ROX, mutT4-48m Cy5 (Fig. 2).
Для детекции штамма генотипа Beijing современной сублинии служили зонды mutT2-58m HEX и mutT4-48m Су5 (Фиг. 2), детекцию сигнала проводили по HEX и Су5 каналам детекции (Фиг. 3а). Для детекции штамма генотипа Beijing древней сублинии служили зонды mutT2-58wt FAM и mutT4-48m Су5 (Фиг. 2), детекцию сигнала проводили по FAM и Су5 каналам детекции (Фиг. 3а). Для детекции штамма генотипа Beijing ранней древней сублинии служили зонды mutT2-58wt FAM и mutT4-48wt ROX (Фиг. 2), детекцию сигнала проводили по FAM и ROX каналам детекции (Фиг. 3а).The probes mutT2-58m HEX and mutT4-48m Cy5 (Fig. 2) were used to detect the Beijing genotype strain of the modern subline (Fig. 2), the signal was detected using the HEX and Cy5 detection channels (Fig. 3a). For the detection of the Beijing genotype strain of the ancient subline, the probes mutT2-58wt FAM and mutT4-48m Cy5 (Fig. 2) were used, the signal was detected using the FAM and Cy5 detection channels (Fig. 3a). For the detection of the Beijing genotype strain of the early ancient subline, the probes mutT2-58wt FAM and mutT4-48wt ROX (Fig. 2) were used, the signal was detected by the FAM and ROX detection channels (Fig. 3a).
Очищенная ДНК (0.01 мкл ДНК разведенной 1 к 10) добавляется к смеси ПЦР (конечный объем 30 мкл) содержащей 1,5 mM MgCh, 1 U Taq ДНК полимеразы для ПЦР в реальном времени в режиме «горячего старта», 200 μМ каждого из дНТФ, праймеры и зонды (по 5 пмоль каждый кроме зонда mutT2-58m-HEX). ПЦР проводили в термоциклере RotorGene6000 (Corbette Research) в следующих условиях: 95°С, 3 мин; далее 40 циклов 95°С, 15 с; 63°С, 40 с. Считывание сигнала флуоресценции - при 63°С по каналам с длиной волны 510, 555, 600, 670 нм.Purified DNA (0.01 μl DNA diluted 1 in 10) is added to a PCR mixture (
Оценка результатовAssessment of results
Полученные данные - кривые накопления флуоресцентного сигнала по 4 каналам - анализируют с помощью программного обеспечения прибора, используемого для проведения ПЦР в формате реального времени. Результаты интерпретируют по экспоненциальному накоплению сигнала флуоресценции по тому или иному каналу детекции между 15-35 циклами ПЦР. По каналам HEX и Су5 регистрируется накопление фрагментов ДНК, специфических для современной сублинии генотипа М. tuberculosis Beijing (Фиг. 3аг), по каналам FAM и Су5 - фрагментов ДНК, специфических для древней сублинии генотипа М. tuberculosis Beijing (Фиг. 3бг), по каналам FAM и ROX - фрагментов ДНК, специфических для ранней древней сублинии генотипа М. tuberculosis Beijing (Фиг. 3бв).The data obtained - the curves of the accumulation of the fluorescent signal in 4 channels - are analyzed using the software of the device used for real-time PCR. The results are interpreted by the exponential accumulation of the fluorescence signal for one or another detection channel between 15-35 PCR cycles. Accumulation of DNA fragments specific for the modern subline of the M. tuberculosis Beijing genotype (Fig. 3d) is recorded along the HEX and Cy5 channels, along the FAM and Cy5 channels - DNA fragments specific for the ancient subline of the M. tuberculosis Beijing genotype (Fig. 3d), according to channels FAM and ROX - DNA fragments specific for the early ancient subline of the M. tuberculosis Beijing genotype (Fig. 3bc).
При отсутствии сигнала флуоресценции по всем каналам делается вывод о недостаточном количестве и/или качестве ДНК или ингибировании реакции ПЦР и невозможности какого-либо вывода о наличии или отсутствии ДНК штамма Beijing той или иной сублини в образце.In the absence of a fluorescence signal through all channels, it is concluded that the amount and / or quality of DNA is insufficient or that the PCR reaction is inhibited and that no conclusion is possible about the presence or absence of Beijing strain DNA of a particular subline in the sample.
Способ был апробирован на коллекциях ДНК клинических изолятов М. tuberculosis из коллекции лаборатории молекулярной микробиологии ФБУН НИИЭМ им. Пастера, представляющих страны с различными популяциями возбудителя и различной долей штаммов Beijing древних и современных сублиний, что показано на примерах ниже.The method was tested on DNA collections of clinical isolates of M. tuberculosis from the collection of the Laboratory of Molecular Microbiology, FBUN NIIEM im. Pasteur, representing countries with different populations of the pathogen and different proportions of Beijing strains of ancient and modern sublines, as shown in the examples below.
ПримерыExamples of
Пример 1Example 1
Анализ ДНК изолятов М. tuberculosis из Северо-Запада России, региона с незначительной долей ранних древних штаммов Beijing (5% от всех Beijing) (Mokrousov et al., 2002).DNA analysis of M. tuberculosis isolates from the North-West of Russia, a region with a small proportion of early ancient strains of Beijing (5% of all Beijing) (Mokrousov et al., 2002).
Всего было проверено 126 образцов ДНК изолятов М. tuberculosis генотипа Beijing, выделенных от больных туберкулезом легких в 2017-2018 годах в Республике Коми (73 изолята) и Вологодской области (53 изолята). Все образцы ДНК М. tuberculosis были охарактеризованы методом 24-MIRU-VNTR типирования (Supply et al., 2006) с последующим сравнением с базой данных MIRU-VNTRplus.org. 2 изолята имели профили 1071-32, который как было показано ранее, включает штаммы ранней древний сублинии Beijing (Mokrousov et al., 2019). В результате применения разработанного способа ПЦР в формате реального времени нами было установлено, что данные 2 изолята имели аллели дикого типа в кодонах mutT4-48 и mutT2-58 и, таким образом, относились к ранней древней сублинии, а остальные 124 изолята имели мутантные аллели в кодонах mutT4-48 и mutT2-58 и, таким образом, относились к современной филогенетической сублинии генотипа Beijing, что соответствовало результатам 24-MIRU-VNTR анализа.A total of 126 DNA samples of M. tuberculosis isolates of the Beijing genotype isolated from patients with pulmonary tuberculosis in 2017-2018 in the Komi Republic (73 isolates) and the Vologda region (53 isolates) were tested. All M. tuberculosis DNA samples were characterized by 24-MIRU-VNTR typing (Supply et al., 2006) with subsequent comparison with the MIRU-VNTRplus.org database. Two isolates had profiles 1071-32, which, as shown earlier, includes strains of the early ancient subline Beijing (Mokrousov et al., 2019). As a result of using the developed PCR method in real-time format, we found that these 2 isolates had wild-type alleles in the mutT4-48 and mutT2-58 codons and, thus, belonged to the early ancient subline, and the remaining 124 isolates had mutant alleles in codons mutT4-48 and mutT2-58 and, thus, belonged to the modern phylogenetic subline of the Beijing genotype, which corresponded to the results of 24-MIRU-VNTR analysis.
Пример 2. Анализ ДНК изолятов М. tuberculosis выделенных во Вьетнаме.Example 2. DNA analysis of M. tuberculosis isolates isolated in Vietnam.
Изучено 35 изолятов М. tuberculosis Beijing выделенных от больных туберкулезом легких из Вьетнама. Все образцы ДНК М. tuberculosis были охарактеризованы методом сполиготипирования (Kamerbeek et al., 1997) и 24-MIRU-VNTR типирования (Supply et al., 2006) с последующим сравнением с базой данных MIRU-VNTRplus.org. Все штаммы были проанализированы с помощью мультиплексной ПЦР локуса NTF, позволяющей разделить штаммы Beijing на древние и современные сублинии по наличию или отсутствию вставки IS6110 (Mokrousov et al., 2005).Studied 35 isolates of M. tuberculosis Beijing isolated from patients with pulmonary tuberculosis from Vietnam. All M. tuberculosis DNA samples were characterized by spoligotyping (Kamerbeek et al., 1997) and 24-MIRU-VNTR typing (Supply et al., 2006), followed by comparison with the MIRU-VNTRplus.org database. All strains were analyzed using multiplex PCR at the NTF locus, which allows the Beijing strains to be divided into ancient and modern sublines by the presence or absence of the IS6110 insert (Mokrousov et al., 2005).
Далее ДНК всех штаммов была протестирована разработанным нами способом ПЦР в формате реального времени для определения филогенетических сублиний генотипа Beijing микобактерий туберкулеза (ранние древние, древние и современные штаммы). В результате проведения ПЦР было выявлено 2 изолята ранней древней сублинии (дикие аллели mutT4-48 и mutT2-58), 15 изолятов древней сублинии (дикий аллель mutT4-48 и мутантный аллель mutT2-58) и 18 изолятов современной сублинии Beijing (мутантные аллели в кодонах mutT4-48 и mutT2-58). Эти результаты соответствовали результатам типирования локуса NTF.Further, the DNA of all strains was tested by the real-time PCR method developed by us to determine the phylogenetic sublines of the Beijing Mycobacterium tuberculosis genotype (early ancient, ancient and modern strains). As a result of PCR, 2 isolates of the early ancient subline (wild alleles of mutT4-48 and mutT2-58), 15 isolates of the ancient subline (wild allele mutT4-48 and mutant allele mutT2-58) and 18 isolates of the modern subline Beijing (mutant alleles in codons mutT4-48 and mutT2-58). These results were consistent with the typing results for the NTF locus.
Пример 3. Анализ ДНК изолятов М. tuberculosis выделенных в Китае.Example 3. DNA analysis of M. tuberculosis isolates isolated in China.
Изучено 25 изолятов М. tuberculosis генотипа Beijing, выделенных от больных туберкулезом легких из северного Китая (Пекин и соседние провинции).Studied 25 isolates of M. tuberculosis of genotype Beijing, isolated from patients with pulmonary tuberculosis from northern China (Beijing and neighboring provinces).
Все образцы ДНК М. tuberculosis были охарактеризованы методом сполиготипирования (Kamerbeek et al., 1997), 24-MIRU-VNTR типирования (Supply et al., 2006) и мультиплексной ПЦР локуса NTF позволяющему разделить штаммы Beijing на древние и современные сублинии по наличию или отсутствию вставки IS6110 (Mokrousov et al., 2005).All DNA samples of M. tuberculosis were characterized by spoligotyping (Kamerbeek et al., 1997), 24-MIRU-VNTR typing (Supply et al., 2006) and multiplex PCR of the NTF locus, which allows the Beijing strains to be divided into ancient and modern sublines by the presence or the absence of insert IS6110 (Mokrousov et al., 2005).
Далее ДНК всех штаммов была протестирована предлагаемым способом ПЦР в формате реального времени для определения филогенетических сублиний генотипа Beijing микобактерий туберкулеза (ранние древние, древние и современные штаммы). В результате проведения ПЦР, было выявлено 12 изолятов ранней древней сублинии Beijing, 12 изолятов древней сублинии Beijing и один изолят определен как современный Beijing, что полностью соответствовало результатам 24-MIRU-VNTR типирования и мультиплексной ПЦР локуса NTF.Further, the DNA of all strains was tested by the proposed PCR method in real time to determine the phylogenetic sublines of the Beijing Mycobacterium tuberculosis genotype (early ancient, ancient and modern strains). As a result of PCR, 12 isolates of the early ancient Beijing subline, 12 isolates of the ancient Beijing subline, and one isolate was identified as modern Beijing, which fully corresponded to the results of 24-MIRU-VNTR typing and multiplex PCR of the NTF locus.
Работа выполнена при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (грант 19-04-00263).This work was supported by the Russian Foundation for Basic Research (grant 19-04-00263).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫLIST OF REFERENCES
Ebrahimi-Rad М, Bifani Р, Martin С, Kremer K, Samper S, Rauzier J, et al. Mutations in putative mutator genes of Mycobacterium tuberculosis strains of the W-Beijing family. Emerg Infect Dis. 2003; 9:838-45.Ebrahimi-Rad M, Bifani P, Martin C, Kremer K, Samper S, Rauzier J, et al. Mutations in putative mutator genes of Mycobacterium tuberculosis strains of the W-Beijing family. Emerg Infect Dis. 2003; 9: 838-45.
Iwamoto T, Yoshida S, Suzuki K, Wada T. Population structure analysis of the Mycobacterium tuberculosis Beijing family indicates an association between certain sublineages and multidrug resistance. Antimicrob Agents Chemother. 2008; 52:3805-9.Iwamoto T, Yoshida S, Suzuki K, Wada T. Population structure analysis of the Mycobacterium tuberculosis Beijing family indicates an association between certain sublineages and multidrug resistance. Antimicrob Agents Chemother. 2008; 52: 3805-9.
Iwamoto T, Fujiyama R, Yoshida S, Wada T, Shirai C, Kawakami Y. Population structure dynamics of Mycobacterium tuberculosis Beijing strains during past decades in Japan. J Clin Microbiol. 2009; 47:3340-3.Iwamoto T, Fujiyama R, Yoshida S, Wada T, Shirai C, Kawakami Y. Population structure dynamics of Mycobacterium tuberculosis Beijing strains during past decades in Japan. J Clin Microbiol. 2009; 47: 3340-3.
Kamerbeek J, Schouls L, Kolk A, van Agterveld M, van Soolingen D, Kuijper S, et al. Simultaneous detection and strain differentiation of Mycobacterium tuberculosis for diagnosis and epidemiology. J Clin Microbiol. 1997; 35:907-14.Kamerbeek J, Schouls L, Kolk A, van Agterveld M, van Soolingen D, Kuijper S, et al. Simultaneous detection and strain differentiation of Mycobacterium tuberculosis for diagnosis and epidemiology. J Clin Microbiol. 1997; 35: 907-14.
Kremer K, Glynn JR, Lillebaek T, Niemann S, Kurepina NE, Kreiswirth BN, et al. Definition of the Beijing/W lineage of Mycobacterium tuberculosis on the basis of genetic markers. J Clin Microbiol. 2004; 42:4040-9.Kremer K, Glynn JR, Lillebaek T, Niemann S, Kurepina NE, Kreiswirth BN, et al. Definition of the Beijing / W lineage of Mycobacterium tuberculosis on the basis of genetic markers. J Clin Microbiol. 2004; 42: 4040-9.
Luo T, Comas I, Luo D, Lu B, Wu J, Wei L, et al. Southern East Asian origin and coexpansion of Mycobacterium tuberculosis Beijing family with Han Chinese. Proc Natl Acad Sci USA. 2015; 112:8136-41.Luo T, Comas I, Luo D, Lu B, Wu J, Wei L, et al. Southern East Asian origin and coexpansion of Mycobacterium tuberculosis Beijing family with Han Chinese. Proc Natl Acad Sci USA. 2015; 112: 8136-41.
Maeda S, Hang NT, Lien LT, Thuong PH, Hung NV, Hoang NP, et al. Mycobacterium tuberculosis strains spreading in Hanoi, Vietnam: Beijing sublineages, genotypes, drug susceptibility patterns, and host factors. Tuberculosis (Edinb). 2014; 94:649-56.Maeda S, Hang NT, Lien LT, Thuong PH, Hung NV, Hoang NP, et al. Mycobacterium tuberculosis strains spreading in Hanoi, Vietnam: Beijing sublineages, genotypes, drug susceptibility patterns, and host factors. Tuberculosis (Edinb). 2014; 94: 649-56.
Mokrousov I, Vyazovaya A, Pasechnik O, Gerasimova A, Dymova M, Chernyaeva E, et al. Early ancient sublineages of Mycobacterium tuberculosis Beijing genotype: unexpected clues from phylogenomics of the pathogen and human history. Clin Microbiol Infect. 2019; 25:1039.el-1039.e6.Mokrousov I, Vyazovaya A, Pasechnik O, Gerasimova A, Dymova M, Chernyaeva E, et al. Early ancient sublineages of Mycobacterium tuberculosis Beijing genotype: unexpected clues from phylogenomics of the pathogen and human history. Clin Microbiol Infect. 2019; 25: 1039.el-1039.e6.
Mokrousov I, Ly HM, Often T, Lan NN, Vyshnevskyi B, Hoffner S, et al. Origin and primary dispersal of the Mycobacterium tuberculosis Beijing genotype: clues from human phylogeography. Genome Res. 2005; 15:1357-64.Mokrousov I, Ly HM, Often T, Lan NN, Vyshnevskyi B, Hoffner S, et al. Origin and primary dispersal of the Mycobacterium tuberculosis Beijing genotype: clues from human phylogeography. Genome Res. 2005; 15: 1357-64.
Mokrousov I, Narvskaya O, Often T, Vyazovaya A, Limeschenko E, Steklova L, et al. Phylogenetic reconstruction within Mycobacterium tuberculosis Beijing genotype in northwestern Russia. Res. Microbiol. 2002; 153: 629-37Mokrousov I, Narvskaya O, Often T, Vyazovaya A, Limeschenko E, Steklova L, et al. Phylogenetic reconstruction within Mycobacterium tuberculosis Beijing genotype in northwestern Russia. Res. Microbiol. 2002; 153: 629-37
Mokrousov I, Jiao WW, Sun GZ, Liu JW, Valcheva V, Li M, Narvskaya O, Shen AD. Evolution of drug resistance in different sublineages of Mycobacterium tuberculosis Beijing genotype. Antimicrob Agents Chemother. 2006 Aug; 50(8):2820-3.Mokrousov I, Jiao WW, Sun GZ, Liu JW, Valcheva V, Li M, Narvskaya O, Shen AD. Evolution of drug resistance in different sublineages of Mycobacterium tuberculosis Beijing genotype. Antimicrob Agents Chemother. 2006 Aug; 50 (8): 2820-3.
Nakanishi N, Wada T, Arikawa K, Millet J, Rastogi N, Iwamoto T. Evolutionary robust SNPs reveal the misclassification of Mycobacterium tuberculosis Beijing family strains into sublineages. Infect Genet Evol. 2013 Jun; 16:174-7. doi: 10.1016/j.meegid.2013.02.007.Nakanishi N, Wada T, Arikawa K, Millet J, Rastogi N, Iwamoto T. Evolutionary robust SNPs reveal the misclassification of Mycobacterium tuberculosis Beijing family strains into sublineages. Infect Genet Evol. 2013 Jun; 16: 174-7. doi: 10.1016 / j.meegid.2013.02.007.
Shamputa IC, Lee J, Allix-Béguec C, Cho EJ, Lee JI, Rajan V, et al. Genetic diversity of Mycobacterium tuberculosis isolates from a tertiary care tuberculosis hospital in South Korea. J Clin Microbiol. 2010; 48:387-94.Shamputa IC, Lee J, Allix-Béguec C, Cho EJ, Lee JI, Rajan V, et al. Genetic diversity of Mycobacterium tuberculosis isolates from a tertiary care tuberculosis hospital in South Korea. J Clin Microbiol. 2010; 48: 387-94.
Supply P, Allix C, Lesjean S, Cardoso-Oelemann M, Rüsch-Gerdes S, Willery E, et al. Proposal for standardization of optimized mycobacterial interspersed repetitive unit-variable-number tandem repeat typing of Mycobacterium tuberculosis. J Clin Microbiol. 2006; 44:4498-510.Supply P, Allix C, Lesjean S, Cardoso-Oelemann M, Rüsch-Gerdes S, Willery E, et al. Proposal for standardization of optimized mycobacterial interspersed repetitive unit-variable-number tandem repeat typing of Mycobacterium tuberculosis. J Clin Microbiol. 2006; 44: 4498-510.
van Embden J, Cave M, Crawford J, Dale JW, Eisenach KD, Gicquel B, et al. Strain identification on Mycobacterium tuberculosis by DNA fingerprinting: recommendations for a standardized methodology. J. Clin. Microbiol. 1993; 31:406-409.van Embden J, Cave M, Crawford J, Dale JW, Eisenach KD, Gicquel B, et al. Strain identification on Mycobacterium tuberculosis by DNA fingerprinting: recommendations for a standardized methodology. J. Clin. Microbiol. 1993; 31: 406-409.
van Soolingen D, Qian L, de Haas PE, Douglas JT, Traore H, Portaels F, Qing HZ, Enkhsaikan D, Nymadawa P, van Embden JD. Predominance of a single genotype of Mycobacterium tuberculosis in countries of east Asia. J Clin Microbiol. 1995 Dec; 33(12):3234-8.van Soolingen D, Qian L, de Haas PE, Douglas JT, Traore H, Portaels F, Qing HZ, Enkhsaikan D, Nymadawa P, van Embden JD. Predominance of a single genotype of Mycobacterium tuberculosis in countries of east Asia. J Clin Microbiol. 1995 Dec; 33 (12): 3234-8.
Wada Т., Iwamoto Т., Maeda S. FEMS Microbiol Lett, 2009, 291: 35-43Wada T., Iwamoto T., Maeda S. FEMS Microbiol Lett, 2009, 291: 35-43
Yin QQ, Liu HC, Jiao WW, Li QJ, Han R, Tian JL, et al. Evolutionary History and Ongoing Transmission of Phylogenetic Sublineages of Mycobacterium tuberculosis Beijing Genotype in China. SciRep. 2016; 6:34353.Yin QQ, Liu HC, Jiao WW, Li QJ, Han R, Tian JL, et al. Evolutionary History and Ongoing Transmission of Phylogenetic Sublineages of Mycobacterium tuberculosis Beijing Genotype in China. SciRep. 2016; 6: 34353.
Claims (1)
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2020116755A RU2743365C1 (en) | 2020-05-12 | 2020-05-12 | Method of detecting phylogenetic sublines of beijing mycobacterium tuberculosis genotype in real time format |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2020116755A RU2743365C1 (en) | 2020-05-12 | 2020-05-12 | Method of detecting phylogenetic sublines of beijing mycobacterium tuberculosis genotype in real time format |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2743365C1 true RU2743365C1 (en) | 2021-02-17 |
Family
ID=74666218
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2020116755A RU2743365C1 (en) | 2020-05-12 | 2020-05-12 | Method of detecting phylogenetic sublines of beijing mycobacterium tuberculosis genotype in real time format |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2743365C1 (en) |
Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2003016562A2 (en) * | 2001-08-14 | 2003-02-27 | Institut Pasteur | Compositions and methods for detecting multidrug resistant strains of m. tuberculosis having mutations in genes of the mutt family |
RU2405836C2 (en) * | 2008-05-12 | 2010-12-10 | Федеральное государственное учреждение "Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт фтизиопульмонологии Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи" | Method for mycobacterium tuberculosis beijing genotype detection |
RU2528866C2 (en) * | 2011-07-15 | 2014-09-20 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт фтизиопульмонологии" Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации | Method for real-time detection of beijing genotype mycobacterium tuberculosis |
RU2684314C2 (en) * | 2017-06-30 | 2019-04-05 | федеральное государственное бюджетное учреждение "Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт фтизиопульмонологии" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Method of identification of mycobacteria of tuberculosis of the beijing genotype b0 cluster in real time format |
RU2689800C1 (en) * | 2017-12-07 | 2019-05-29 | федеральное государственное бюджетное учреждение "Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт фтизиопульмонологии" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Method for detection of isolates mycobacterium tuberculosis beijing 94-32-cluster in real time format |
-
2020
- 2020-05-12 RU RU2020116755A patent/RU2743365C1/en active
Patent Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2003016562A2 (en) * | 2001-08-14 | 2003-02-27 | Institut Pasteur | Compositions and methods for detecting multidrug resistant strains of m. tuberculosis having mutations in genes of the mutt family |
RU2405836C2 (en) * | 2008-05-12 | 2010-12-10 | Федеральное государственное учреждение "Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт фтизиопульмонологии Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи" | Method for mycobacterium tuberculosis beijing genotype detection |
RU2528866C2 (en) * | 2011-07-15 | 2014-09-20 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт фтизиопульмонологии" Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации | Method for real-time detection of beijing genotype mycobacterium tuberculosis |
RU2684314C2 (en) * | 2017-06-30 | 2019-04-05 | федеральное государственное бюджетное учреждение "Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт фтизиопульмонологии" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Method of identification of mycobacteria of tuberculosis of the beijing genotype b0 cluster in real time format |
RU2689800C1 (en) * | 2017-12-07 | 2019-05-29 | федеральное государственное бюджетное учреждение "Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт фтизиопульмонологии" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Method for detection of isolates mycobacterium tuberculosis beijing 94-32-cluster in real time format |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Neonakis et al. | Molecular diagnostic tools in mycobacteriology | |
Van Der Zanden et al. | Use of DNA extracts from Ziehl-Neelsen-stained slides for molecular detection of rifampin resistance and spoligotyping of Mycobacterium tuberculosis | |
Parashar et al. | Applications of real-time PCR technology to mycobacterial research | |
Wade et al. | Accurate mapping of mutations of pyrazinamide-resistant Mycobacterium tuberculosis strains with a scanning-frame oligonucleotide microarray | |
Isola et al. | A Pyrosequencing assay for rapid recognition of SNPs in Mycobacterium tuberculosis embB306 region | |
Marras et al. | A molecular-beacon-based multiplex real-time PCR assay to distinguish Mycobacterium abscessus subspecies and determine macrolide susceptibility | |
Clarke | Pyrosequencing: nucleotide sequencing technology with bacterial genotyping applications | |
Kurkela et al. | Molecular diagnostic techniques | |
Lee et al. | Detection of first-line anti-tuberculosis drug resistance mutations by allele-specific primer extension on a microsphere-based platform | |
Grillova et al. | Core genome sequencing and genotyping of Leptospira interrogans in clinical samples by target capture sequencing | |
Marttila et al. | Prospective evaluation of pyrosequencing for the rapid detection of isoniazid and rifampin resistance in clinical Mycobacterium tuberculosis isolates | |
RU2619258C2 (en) | Method for determination of mycobacterium tuberculosis resistance to rifampicin and isoniazid | |
RU2743365C1 (en) | Method of detecting phylogenetic sublines of beijing mycobacterium tuberculosis genotype in real time format | |
US7592135B2 (en) | High resolution typing system for pathogenic Mycobacterium tuberculosum | |
RU2684314C2 (en) | Method of identification of mycobacteria of tuberculosis of the beijing genotype b0 cluster in real time format | |
RU2689800C1 (en) | Method for detection of isolates mycobacterium tuberculosis beijing 94-32-cluster in real time format | |
Abbadi et al. | Strain differentiation of Mycobacterium tuberculosis complex isolated from sputum of pulmonary tuberculosis patients | |
WO2007109854A1 (en) | A method of genotyping cells using real-time pcr | |
Srilohasin et al. | Novel DNA chip based on a modified DigiTag2 assay for high-throughput species identification and genotyping of Mycobacterium tuberculosis complex isolates | |
RU2768021C1 (en) | Method for detection of mycobacterium tuberculosis beijing 1071-32-cluster genotype in real-time format | |
RU2737775C1 (en) | Method for identifying yersinia pestis and yersinia pseudotuberculosis and simultaneous differentiation of yersinia pestis of main and central asian subspecies by multiplex pcr | |
Wu et al. | Detection of tuberculosis laboratory cross-contamination using whole-genome sequencing | |
Sun et al. | A rapid fluorescence polarization-based method for genotypic detection of drug resistance in Mycobacterium tuberculosis | |
WO2019027005A1 (en) | Method for evaluating tuberculosis onset risk specifically to genetic lineage of mycobacterium tuberculosis | |
Xue et al. | A color-reaction-based biochip detection assay for RIF and INH resistance of clinical mycobacterial specimens |