RU2528866C2

RU2528866C2 - Method for real-time detection of beijing genotype mycobacterium tuberculosis

Info

Publication number: RU2528866C2
Application number: RU2011129712/10A
Authority: RU
Inventors: Игорь Владиславович Мокроусов; Анна Александровна Вязовая; Татьяна Фердинандовна Оттен; Борис Израилевич Вишневский; Налин Растоги; Ольга Викторовна Нарвская
Priority date: 2011-07-15
Filing date: 2011-07-15
Publication date: 2014-09-20
Also published as: RU2011129712A

Abstract

FIELD: medicine, pharmaceutics.

SUBSTANCE: invention refers to medicine and microbiology. What is presented is a method for real-time detection of Beijing genotype mycobacterium tuberculosis by detecting IS6110 element insertion in a locus of dnaA-dnaN genome differing by the fact that real-time PCR is carried out with the use of two specific primers 5`-AGATCAGAGAGTCTCCGGACTCA and 5`-CGCCGGGACTGTATGAGTCT and fluorescence-labelled probe R6G-5`-TGTGCACAGCGACACTCACAGCCA-3`-BHQ2; the result is assessed by recording a fluorescence signal in R6G canal at wavelength 555nm; if a sample contains the DNA of the Beijing genotype mycobacterium tuberculosis strain, an exponential growth of the PCR fluorescence signal when a pure DNA analysed is observed between 10 to 15 cycles, and when cell lysates analysed - between 15 and 20 cycles.

EFFECT: invention can be used for laboratory detection of Beijing genotype mycobacterium tuberculosis.

3 dwg, 2 ex

Description

Изобретение относится к медицине, а именно к фтизиатрии, и может быть использовано для лабораторного определения микобактерий туберкулеза, относящихся к генотипу Beijing.The invention relates to medicine, namely to phthisiology, and can be used for laboratory determination of Mycobacterium tuberculosis, related to the Beijing genotype.

Возбудитель туберкулеза человека - Mycobacterium tuberculosis имеет клональную структуру популяции, представленную отдельными генетическими семействами. При этом генетическое семейство (далее - генотип) Beijing характеризуется достаточной однородностью по многим генетическим маркерам и широким географическим распространением (Bifani et al., 2002; Mokrousov, 2008). Впервые этот генотип был выявлен у штаммов, выделенных в Пекинском регионе Китая, что и объясняет его название (van Soolingen et al., 1995). Последующие исследования показали эндемичность генотипа Beijing в странах бывшего СССР, Южной Африке и Восточной Азии (Нарвская и др., 2002, Шемякин и др., 2003; Bifani et al., 2002; Marais et al., 2006; Millet et al., 2007) и его нарастающее проникновение в новые удаленные регионы (Glynn et al., 2005; Lavender et al., 2005; Garcia de Viedma et al., 2006). В отличие от многих других генетических семейств М. tuberculosis, для идентификации которых необходимо применение достаточно сложных и не всегда очевидных биоинформационных алгоритмов (Sebban et al., 2002; Ferdinand et al., 2002), генотип Beijing имеет характерную особенность генома, а именно «усеченный» локус DR (локус прямых повторов), состоящий из девяти спейсеров (с 35 по 43) и легко выявляемый при стандартном сполиготипировании (англ. spoligotyping [spacer oligonuceleotide typing]) в виде характерного профиля гибридизации (Kremer et al., 2004) (Фиг.1). У штаммов генотипа Beijing большинство спейсеров в локусе DR, вероятно, было утрачено в результате малого количества делеционных событий, по крайней мере, одно их которых было связано с рекомбинацией и транспозицией IS 6110.The causative agent of human tuberculosis - Mycobacterium tuberculosis has a clonal population structure, represented by individual genetic families. Moreover, the genetic family (hereinafter referred to as the genotype) of Beijing is characterized by sufficient homogeneity in many genetic markers and wide geographical distribution (Bifani et al., 2002; Mokrousov, 2008). This genotype was first detected in strains isolated in the Beijing region of China, which explains its name (van Soolingen et al., 1995). Subsequent studies have shown the endemicity of the Beijing genotype in the countries of the former USSR, South Africa and East Asia (Narva et al., 2002, Shemyakin et al., 2003; Bifani et al., 2002; Marais et al., 2006; Millet et al., 2007) and its increasing penetration into new remote regions (Glynn et al., 2005; Lavender et al., 2005; Garcia de Viedma et al., 2006). Unlike many other genetic families of M. tuberculosis, the identification of which requires the use of rather complex and not always obvious bioinformation algorithms (Sebban et al., 2002; Ferdinand et al., 2002), the Beijing genotype has a characteristic feature of the genome, namely “ the truncated "DR locus (direct repeat locus), consisting of nine spacers (from 35 to 43) and easily detected by standard spoligotyping (English spoligotyping [spacer oligonuceleotide typing]) in the form of a characteristic hybridization profile (Kremer et al., 2004) ( Figure 1). In Beijing genotype strains, most spacers at the DR locus were probably lost as a result of a small number of deletion events, at least one of which was associated with recombination and transposition of IS 6110.

Генотип Beijing привлекает внимание и с клинической точки зрения, поскольку его штаммы демонстрируют патогенные свойства: повышенную вирулентность на мышиной модели (Вишневский и др., 2002; Lopez et al., 2003) и на модели макрофагов (Zhang et al., 1999; Черноусова и др., 2008; Lasunskaia et al., 2010), ассоциацию с лекарственной устойчивостью (Нарвская, 2003; Toungoussova et al., 2002; Сох et al., 2005; Mokrousov et al., 2009) и высокую трансмиссивность (Андреевская и др., 2006; Caminero et al., 2001; Narvskaya et al., 2002). Неблагоприятная ситуация по туберкулезу в России в значительной степени связана с распространением мультирезистентных штаммов генотипа Beijing в популяции иммунизированных БЦЖ (Bifani et al., 2002). Таким образом, наблюдаемое сейчас широкое распространение штаммов Beijing представляет серьезную угрозу успешной реализации национальных программ борьбы с туберкулезом.The Beijing genotype also attracts attention from a clinical point of view, since its strains demonstrate pathogenic properties: increased virulence in the mouse model (Vishnevsky et al., 2002; Lopez et al., 2003) and on the macrophage model (Zhang et al., 1999; Chernousova et al., 2008; Lasunskaia et al., 2010), association with drug resistance (Narva, 2003; Toungoussova et al., 2002; Sokh et al., 2005; Mokrousov et al., 2009) and high transmissibility (Andreevskaya and et al., 2006; Caminero et al., 2001; Narvskaya et al., 2002). The adverse tuberculosis situation in Russia is largely associated with the spread of multiresistant strains of the Beijing genotype in the population of immunized BCG (Bifani et al., 2002). Thus, the widespread occurrence of Beijing strains now poses a serious threat to the successful implementation of national tuberculosis control programs.

Учитывая клиническую и эпидемиологическую значимость генотипа Beijing М. tuberculosis, необходимо наличие простого метода его детекции. Стандартным методом определения штаммов Beijing является сполиготипирование, которое основано на анализе структуры хромосомы М. tuberculosis в области прямых повторов (DR-локус), разделенных вариабельными спейсерами (Kamerbeek et al., 1997). Метод требует проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР) и последующей ДНК-гибридизации с иммобилизованными на мембране 43 зондами в специальном приборе (миниблоттере) и выявления сигналов хемилюминесценции на светочувствительной пленке (Фиг.1).Given the clinical and epidemiological significance of the Beijing M. tuberculosis genotype, a simple method for its detection is necessary. The standard method for determining Beijing strains is spoligotyping, which is based on the analysis of the structure of the M. tuberculosis chromosome in the region of direct repeats (DR locus) separated by variable spacers (Kamerbeek et al., 1997). The method requires polymerase chain reaction (PCR) and subsequent DNA hybridization with 43 probes immobilized on the membrane in a special device (mini-blotter) and detection of chemiluminescence signals on a photosensitive film (Figure 1).

Являясь «золотым стандартом» выявления принадлежности изолята М. tuberculosis к генотипу Beijing, метод неприменим для использования в практических бактериологических лабораториях. Кроме того, формат этого метода подразумевает одновременный анализ 40 штаммов, что не всегда экономично при необходимости анализа единичных изолятов. Сполиготипирование не требует получения очищенной ДНК М. tuberculosis, но тем не менее этот метод требует специального оборудования и достаточно сложной процедуры выявления профилей гибридизации. Другие методы, основанные на компьютерном сравнении профилей IS6770-RFLP с референс-профилями и повторной гибридизации мембраны с Beijing-специфическими пробами на локусы NTF и dnaA-dnaN (Kurepina et al., 2005), еще более трудоемки, чем классический анализ IS6770-RFLP. Кроме того, эти методы требуют проведение дополнительных экспериментов для исследования только штаммов Beijing.Being the "gold standard" for identifying the belonging of the M. tuberculosis isolate to the Beijing genotype, the method is not applicable for use in practical bacteriological laboratories. In addition, the format of this method involves the simultaneous analysis of 40 strains, which is not always economical if it is necessary to analyze single isolates. Spoligotyping does not require obtaining purified M. tuberculosis DNA, but nevertheless this method requires special equipment and a rather complicated procedure for identifying hybridization profiles. Other methods based on a computer comparison of IS6770-RFLP profiles with reference profiles and re-hybridization of the membrane with Beijing-specific samples for NTF and dnaA-dnaN loci (Kurepina et al., 2005) are even more time-consuming than the classical analysis of IS6770-RFLP . In addition, these methods require additional experiments to study only Beijing strains.

Особенностью структуры генома штаммов генотипа Beijing является наличие вставки элемента IS6110 в локусе dnaA-dnaN, расположенном вблизи от oriC (Bifani et al., 2002). Выявление этой характерной вставки IS 6110 методом ПЦР в формате «реального времени» составляет основу предложенного нами способа детекции штаммов М. tuberculosis генотипа Beijing.A feature of the structure of the genome of strains of the Beijing genotype is the presence of an insertion of the IS6110 element at the dnaA-dnaN locus located close to oriC (Bifani et al., 2002). The detection of this characteristic insert IS 6110 by real-time PCR is the basis of our proposed method for the detection of M. tuberculosis strains of the Beijing genotype.

В качестве прототипа предлагается метод блот-гибридизации хромосомной ДНК М. tuberculosis с мечеными зондами на основе элемента IS6110 и локуса dnaA-dnaN (van Embden et al., 1993; Kurepina et al., 2005). Фрагменты гидролиза ДНК рестриктазой PvuII, разделенные при электрофорезе в агарозном геле, переносят на нейлоновую мембрану и подвергают последовательной гибридизации со специфическими зондами: меченым фрагментом инсерционного элемента IS6110 (van Embden et al., 1993) и dnaA-dnaN (Kurepina et al., 2005). Профили гибридизации выявляют колориметрически или хемилюминесценцией и подвергают компьютерной обработке. Метод требует выделения большого количества очищенной ДНК и длительных процедур рестрикции ДНК, разделения в агарозном геле, переноса на мембрану по Саузерну и собственно гибридизации. В целом процедура занимает не менее 5-6 дней. Кроме того, метод требует использования соответствующих компьютерных программ для обработки и анализа сканированных профилей гибридизации.As a prototype, a method for blot hybridization of M. tuberculosis chromosomal DNA with labeled probes based on the IS6110 element and dnaA-dnaN locus is proposed (van Embden et al., 1993; Kurepina et al., 2005). Fragments of DNA hydrolysis by PvuII restriction enzyme, separated by agarose gel electrophoresis, are transferred onto a nylon membrane and subjected to sequential hybridization with specific probes: a labeled fragment of the insertion element IS6110 (van Embden et al., 1993) and dnaA-dnaN (Kurepina et al., 2005 ) Hybridization profiles are detected colorimetrically or by chemiluminescence and subjected to computer processing. The method requires the isolation of a large amount of purified DNA and lengthy DNA restriction procedures, separation in an agarose gel, Southern transfer to the membrane, and the actual hybridization. In general, the procedure takes at least 5-6 days. In addition, the method requires the use of appropriate computer programs for processing and analysis of scanned hybridization profiles.

Задачей предлагаемого изобретения является разработка способа быстрой и надежной детекции микобактерий туберкулеза генотипа Beijing посредством амплификации и флуоресцентно-гибридизационного выявления специфической для штаммов этого генотипа инсерции IS6110 в участке генома dnaA-dnaN.The objective of the invention is to develop a method for the rapid and reliable detection of Mycobacterium tuberculosis of the Beijing genotype through amplification and fluorescence-hybridization detection of specific for strains of this genotype insertion IS6110 in the genome dnaA-dnaN.

Задача реализуется за счет того, что применяют ПЦР в режиме реального времени с использованием двух специфических праймеров и флуоресцентно-меченого зонда, и при экспоненциальном накоплении сигнала флуоресценции между 10-15 циклами ПЦР при анализе чистой ДНК и 15-20 циклами при анализе клеточных лизатов судят о принадлежности М. tuberculosis к генотипу Beijing.The task is achieved due to the fact that PCR is used in real time using two specific primers and a fluorescently labeled probe, and when the fluorescence signal exponentially accumulates between 10-15 PCR cycles in the analysis of pure DNA and 15-20 cycles in the analysis of cell lysates, they are judged on the affiliation of M. tuberculosis to the Beijing genotype.

Преимущества предлагаемого способа:The advantages of the proposed method:

- быстрота (один день от момента выделения ДНК);- speed (one day from the moment of DNA extraction);

- простая и однозначная интерпретация результатов;- simple and unambiguous interpretation of the results;

- возможность быстрого анализа больших коллекций штаммов М. tuberculosis для оценки их принадлежности к генотипу Beijing с целью диагностики и при популяционных исследованиях;- the ability to quickly analyze large collections of M. tuberculosis strains to assess their affiliation with the Beijing genotype for diagnosis and population studies;

- возможность использования неочищенных препаратов ДНК (клеточных лизатов) для быстрой диагностики.- the possibility of using crude DNA preparations (cell lysates) for quick diagnosis.

Изобретение поясняется чертежами, где Фиг.1 - Примеры профилей сполиготипирова-ния микобактерий туберкулеза (генотип Beijing отмечен звездочкой). Фиг.2 - Схема ПЦР (не в масштабе). Крупная стрелка показывает ориентацию элемента IS6110, короткие стрелки - позиции праймеров и зондов. Фиг.3 - Профили - накопление сигнала флуоресценции: (а) по контрольному (FAM/Green) каналу детекции, на М. tuberculosis complex и (б) специфическому (R6G/Yellow) каналу детекции, на генотип Beijing. ОКО - отрицательный контрольный образец (вода).The invention is illustrated by drawings, where Figure 1 - Examples of spoligotyping profiles of mycobacterium tuberculosis (the Beijing genotype is marked with an asterisk). Figure 2 - Scheme of PCR (not to scale). The large arrow shows the orientation of the IS6110 element, the short arrows show the positions of the primers and probes. Figure 3 - Profiles - fluorescence signal accumulation: (a) on the control (FAM / Green) detection channel, on M. tuberculosis complex and (b) specific (R6G / Yellow) detection channel, on the Beijing genotype. OKO - negative control sample (water).

Способ осуществляется следующим образом.The method is as follows.

Выделение и очистку ДНК из культуры М. tuberculosis, выращенной на среде Левенштейна-Йенсена, проводят по van Embden et al. (1993). Суспендируют 1 стандартную бактериологическую петлю культуры в 400 мкл буфера ТЕ x1 и инкубируют 20 мин при 85°С. Дальнейшую обработку проводят с использованием лизоцима, протеиназы К, додецилсульфата натрия и цетилтриметиламмонийбромида. Полученный лизат обрабатывают смесью фенол-хлороформ-изоамиловый спирт (25:24:1), центрифугируют, осаждают изопропанолом, промывают 70% этанолом, осадок высушивают и растворяют в 30-50 мкл ТЕ х0.5. При получении грубого препарата ДНК (клеточного лизата) 1 петлю культуры суспендируют в 100 мкл буфера ТЕ x1, кипятят 20 мин на водяной бане, центрифугируют 15 мин (12000 об/мин) и полученный супернатант используют для ПЦР.Isolation and purification of DNA from M. tuberculosis culture grown on Levenshtein-Jensen medium is carried out according to van Embden et al. (1993). Suspend 1 standard bacteriological culture loop in 400 μl of TE x1 buffer and incubate for 20 min at 85 ° C. Further processing is carried out using lysozyme, proteinase K, sodium dodecyl sulfate and cetyltrimethylammonium bromide. The resulting lysate is treated with a mixture of phenol-chloroform-isoamyl alcohol (25: 24: 1), centrifuged, precipitated with isopropanol, washed with 70% ethanol, the precipitate is dried and dissolved in 30-50 μl TE x0.5. Upon receipt of a coarse DNA preparation (cell lysate), 1 loop of the culture was suspended in 100 μl of TE x1 buffer, boiled for 20 minutes in a water bath, centrifuged for 15 minutes (12000 rpm) and the resulting supernatant was used for PCR.

Материалом для ПЦР служит чистая ДНК или клеточный лизат. ПЦР проводят в мультиплексном формате в режиме реального времени. Во-первых, амплификацию специфического для генотипа Beijing фрагмента ДНК, расположенного между элементом IS6110 и прилегающим к нему участком локуса dnaA-dnaN, проводят методом ПЦР с использованием двух праймеров (Фиг.2). Продукты амплификации выявляют с использованием флуоресцентно-меченного олигонуклеотиднного зонда в ПЦР в формате реального времени. Во-вторых, для контроля качества ДНК одновременно используют специфические праймеры, для амплификации внутреннего фрагмента элемента IS6110, присутствующего во всех штаммах микобактерий туберкулезного комплекса (М. tuberculosis complex); продукты амплификации также выявляют в режиме реального времени по другому каналу детекции флуоресценции (Фиг.3а). В качестве контрольных используют: ДНК известного штамма Beijing и ДНК штамма H37R.V (не-Beijing). Накопление сигнала флуоресценции определенной длины волны специфического олигонуклеотидного зонда свидетельствует о принадлежности изучаемых ДНК к генотипу Beijing (Фиг.36).The material for PCR is pure DNA or a cell lysate. PCR is carried out in multiplexed format in real time. First, amplification of a Beijing-specific DNA fragment located between the IS6110 element and the adjacent dnaA-dnaN locus is carried out by PCR using two primers (Figure 2). Amplification products are detected using a fluorescently-labeled oligonucleotide probe in real-time PCR. Secondly, specific primers are simultaneously used for DNA quality control, for amplification of the internal fragment of the element IS6110, present in all strains of mycobacterium tuberculosis complex (M. tuberculosis complex); amplification products are also detected in real time via another fluorescence detection channel (Fig. 3a). As control use: DNA of the famous Beijing strain and DNA of the strain H37R.V (non-Beijing). The accumulation of a fluorescence signal of a specific wavelength of a specific oligonucleotide probe indicates the belonging of the studied DNA to the Beijing genotype (Fig. 36).

Были использованы следующие сконструированные нами праймеры и зонды для ПЦР в реальном времени (Фиг.2). Для детекции генотипа Beijing использовали праймеры BGF (5'-AGATCAGAGAGTCTCCGGACTCA) и BGR (5'-CGCCGGGACTGTATGAGTCT) и зонд BGP (R6G-5'-TGTGCACAGCGACАСТСACAGCCA-3'-BHQ2). Зонд BGP мечен флуорофром R6G по 5'-концу и гасителем флуоресценции BHQ2 по 3'-концу; детекцию сигнала проводили по «желтому» (R6G/Yellow) каналу детекции в термоциклере Ro-torGene6000 (длина волны 555 нм).The following primers and probes for real-time PCR designed by us were used (FIG. 2). To detect the Beijing genotype, BGF primers (5'-AGATCAGAGAGTCTCCGGACTCA) and BGR (5'-CGCCGGGACTGTATGAGTCT) and a BGP probe (R6G-5'-TGTGCACAGCGACACTSACACCCCCA-3'-BHQ2) were used. The BGP probe is labeled with a fluorofrom R6G at the 5'-end and a BHQ2 fluorescence quencher at the 3'-end; the signal was detected via the “yellow” (R6G / Yellow) channel of detection in the Ro-torGene6000 thermal cycler (wavelength 555 nm).

Для детекции М. tuberculosis complex использовали праймеры MTF (5'-CCATCGACCTACTACGACCACAT), MTR (5'-CGGCTGATGTGCTCCTTGAGT) и зонд МТР (FAM-5' CAGCCGCCGCGAGCTGC-3'-RTQ-1). Зонд МТР мечен флуорофором FAM по 5'-концу и гасителем флуоресценции RTQ-1 (Синтол, Москва) по 3'-концу; детекцию сигнала проводили по «зеленому» (FAM/Green) каналу (длина волны 510 нм) (Фиг.3).For the detection of M. tuberculosis complex, MTF primers (5'-CCATCGACCTACTACGACCACAT), MTR (5'-CGGCTGATGTGCTCCTTGAGT) and an MTP probe (FAM-5 'CAGCCGCCGCGAGCTGC-3'-RTQ-1) were used. The MTP probe is labeled with a FAM fluorophore at the 5'-end and RTQ-1 fluorescence quencher (Synthol, Moscow) at the 3'-end; signal detection was carried out on the "green" (FAM / Green) channel (wavelength 510 nm) (Figure 3).

Очищенная ДНК (0.1-0.5 мкл) или клеточный лизат (супернатант, 4 мкл) добавляется к смеси ПЦР (конечный объем 30 мкл), содержащей 1,5 mM MgCl₂, 1 U Tag ДНК полимеразы для ПЦР в реальном времени (Синтол, Москва), 200 µМ каждого из дНТФ, праймеры BGF, BGR, MTF и MTR (по 10 пмоль), зонды МТР и BGP (по 3 пмоль). Добавляли: чистой ДНК - 0.1 мкл, лизата - 4 мкл. ПЦР проводили в термоциклере Rotorgene6000 (Corbette Research) в следующих условиях: 95°С, 8 мин; далее 40 циклов 94°С, 15 с, 60°С, 50 с. Считывание флуоресценции - при 60°С.Purified DNA (0.1-0.5 μl) or cell lysate (supernatant, 4 μl) is added to the PCR mixture (final volume 30 μl) containing 1.5 mM MgCl ₂ , 1 U Tag DNA polymerase for real-time PCR (Syntol, Moscow ), 200 μM of each of the DNTFs, primers BGF, BGR, MTF and MTR (10 pmol each), MTP and BGP probes (3 pmol each). Added: pure DNA - 0.1 μl, lysate - 4 μl. PCR was performed in a Rotorgene6000 thermal cycler (Corbette Research) under the following conditions: 95 ° C, 8 min; further 40 cycles 94 ° C, 15 s, 60 ° C, 50 s. Reading fluorescence at 60 ° C.

Оценка результатов.Evaluation of the results.

Полученные данные - кривые накопления флуоресцентного сигнала по двум каналам - анализируют с помощью программного обеспечения прибора, используемого для проведения ПЦР в формате реального времени. По каналу FAM/Green - регистрируется накопление продукта амплификации фрагмента ДНК, специфического для М. tuberculosis complex (Фиг.3а), по каналу R6G/Yellow - фрагмента ДНК, специфического для генотипа Beijing М. tuberculosis (Фиг.3b). Результаты интерпретируют по наличию (отсутствию) пересечения нормализованной кривой флуоресценции с установленной на заданном уровне (как правило, 0,1) пороговой линией, что соответствует наличию (отсутствию) значению порогового цикла Ct.The data obtained — the fluorescence signal accumulation curves over two channels — are analyzed using the instrument software used for real-time PCR. On the FAM / Green channel, the accumulation of the amplification product of a DNA fragment specific for M. tuberculosis complex (Fig. 3a) is recorded, on the R6G / Yellow channel - a DNA fragment specific for the Beijing M. tuberculosis genotype (Fig. 3b) is recorded. The results are interpreted by the presence (absence) of the intersection of the normalized fluorescence curve with the threshold line set at a predetermined level (usually 0.1), which corresponds to the presence (absence) of the threshold cycle Ct.

При наличии в образце ДНК штамма Beijing экспоненциальный рост сигнала флуоресценции начинается на 10-15 циклах ПЦР при анализе чистой ДНК и на 15-20 циклах при анализе клеточных лизатов («желтый» канал). При отсутствии сигнала флуоресценции по обоим каналам (т.е. и по контрольному «зеленому» каналу) делается вывод о недостаточном количестве и/или качестве ДНК или ингибировании реакции ПЦР и невозможности какого-либо вывода о наличии или отсутствии ДНК штамма Beijing в образце.If a Beijing strain DNA sample is present, the exponential growth of the fluorescence signal begins at 10-15 cycles of PCR when analyzing pure DNA and at 15-20 cycles when analyzing cell lysates (yellow channel). In the absence of a fluorescence signal through both channels (that is, through the control "green" channel), a conclusion is drawn about the insufficient amount and / or quality of DNA or inhibition of the PCR reaction and the impossibility of any conclusion about the presence or absence of DNA of the Beijing strain in the sample.

Пример 1. Анализ 265 проб ДНК штаммов микобактерий туберкулеза, выделенных в 1997-2007 гг. в России, Китае и Вьетнаме, был проведен методами сполиготипирования (использован в качестве «золотого» стандарта идентификации генотипа Beijing) и методом ПЦР в реальном времени, предлагаемым в настоящей заявке в качестве способа быстрой детекции М. tuberculosis генотипа Beijing. Была определена принадлежность 143 штаммов М. tuberculosis к генотипу Beijing. При этом результаты анализа обоими методами полностью совпали. Таким образом, предлагаемый способ обеспечивает высокую чувствительность определения штаммов микобактерий туберкулеза генотипа Beijing.Example 1. Analysis of 265 DNA samples of strains of Mycobacterium tuberculosis isolated in 1997-2007. in Russia, China and Vietnam, it was carried out by spoligotyping methods (used as the "gold" standard for identifying the Beijing genotype) and real-time PCR, proposed in this application as a method for the rapid detection of M. tuberculosis of the Beijing genotype. The affiliation of 143 M. tuberculosis strains to the Beijing genotype was determined. In this case, the analysis results by both methods completely coincided. Thus, the proposed method provides high sensitivity determination of strains of Mycobacterium tuberculosis of the Beijing genotype.

Пример 2. Анализ проб из 70 клеточных лизатов штаммов микобактерий туберкулеза, выделенных в Санкт-Петербурге и ранее отнесенных к генотипу Beijing в результате сполиготипирования. В результате применения метода ПЦР в реальном времени для 67 образцов был получен специфический сигнал микобактерий туберкулеза генотипа Beijing. Отсутствие сигнала для 3 лизатов может быть связано с ингибированием ПЦР и/или недостаточным количеством ДНК, поэтому эффективность метода применительно к клеточным лизатам составила 95,7%.Example 2. Analysis of samples of 70 cell lysates of strains of Mycobacterium tuberculosis isolated in St. Petersburg and previously assigned to the Beijing genotype as a result of spoligotyping. As a result of applying the real-time PCR method for 67 samples, a specific signal of mycobacterium tuberculosis of the Beijing genotype was obtained. The absence of a signal for 3 lysates may be due to inhibition of PCR and / or insufficient DNA, therefore, the efficiency of the method with respect to cell lysates was 95.7%.

Литература:Literature:

1. Андреевская С.Н., Черноусова Л.Н., Смирнова Т.Г., Ларионова Е.Е., Кузьмин А.В. Трансмиссия штаммов микобактерий туберкулеза, обусловленная миграционными процессами в Российской Федерации (на примере миграции населения из Кавказского региона в Москву и Московскую область) // Пробл. туб. и болезней легких. - 2006. - №1. - С.29-35.1. Andreevskaya S.N., Chernousova L.N., Smirnova T.G., Larionova E.E., Kuzmin A.V. Transmission of strains of mycobacterium tuberculosis due to migration processes in the Russian Federation (by the example of population migration from the Caucasus region to Moscow and the Moscow region) // Probl. tube and lung diseases. - 2006. - No. 1. - S. 29-35.

2. Вишневский Б.И., Нарвская О.В., Васильева С.Н., Сапожникова Н.В., Мокроусов И.В., Оттен Т.Ф. Вирулентность микобактерий туберкулеза // Пробл. туб. - 2002. -№10. - С.33-36.2. Vishnevsky B. I., Narvskaya O. V., Vasiliev S. N., Sapozhnikova N. V., Mokrousov I. V., Otten T. F. Virulence of Mycobacterium Tuberculosis // Probl. tube - 2002.-№10. - S.33-36.

3. Нарвская О.В. Геномный полиморфизм Mycobacterium tuberculosis и его роль в эпидемическом процессе: Дис. д-ра мед. наук. - СПб., 2003.3. Narvskaya OV Genomic polymorphism of Mycobacterium tuberculosis and its role in the epidemic process: Dis. Dr. med. sciences. - SPb., 2003.

4. Нарвская О.В., И.В. Мокроусов, Е.В. Лимещенко, Л.Н. Стеклова, Т.Ф. Оттен, Б.И.Вишневский. 2002. Характеристика циркулирующих на Северо-Западе России штаммов Mycobacterium tuberculosis с использованием сполиготипирования // Пробл. туб. - №4. - С.44-47.4. Narvskaya OV, I.V. Mokrousov, E.V. Limeshchenko, L.N. Steklova, T.F. Otten, B.I. Vishnevsky. 2002. Characterization of Mycobacterium tuberculosis strains circulating in the North-West of Russia using spoligotyping // Probl. tube - No. 4. - S. 44-47.

5. Черноусова Л.Н., Андреевская С.Н., Смирнова Т.Г., Земскова З.С., Ларионова Е.Е. Биологические свойства штаммов М. tuberculosis кластера W // Пробл. туб. и болезней легких. - 2008. - №10. - С.45-50.5. Chernousova L.N., Andreevskaya S.N., Smirnova T.G., Zemskova Z.S., Larionova E.E. Biological properties of strains of M. tuberculosis cluster W // Probl. tube and lung diseases. - 2008. - No. 10. - S. 45-50.

6. Шемякин И.Г., Степаншина В.Н., Иванов И.Ю., Липин М.Ю., Коробова О.В., Анисимова В.А. Характеристика клинических изолятов Mycobacterium tuberculosis с использованием молекулярно-биологических методов // Молекулярная генетика микробиология и вирусология. - 2003. - №1. - С.32-40.6. Shemyakin I.G., Stepanshina V.N., Ivanov I.Yu., Lipin M.Yu., Korobova O.V., Anisimova V.A. Characterization of clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis using molecular biological methods // Molecular Genetics, Microbiology and Virology. - 2003. - No. 1. - S. 32-40.

7. Bifani P.J., Mathema В., Kurepina N.E., Kreiswirth B.N. Global dissemination of the Mycobacterium tuberculosis W-Beijing family strains // Trends Microbiol. - 2002. - Vol.10. - P. 45-52.7. Bifani P.J., Mathema B., Kurepina N.E., Kreiswirth B.N. Global dissemination of the Mycobacterium tuberculosis W-Beijing family strains // Trends Microbiol. - 2002 .-- Vol.10. - P. 45-52.

8. Caminero J.A., Pena M.J., Campos-Herrero M.I., Rodriguez J.C., Garcia I., Cabrera P., Lafoz C., Samper S., Takiff H., Afonso O., Pavon J.M., Torres M.J., van Soolingen D., Enarson D.A., Martin C. Epidemiological evidence of the spread of a Mycobacterium tuberculosis strain of the Beijing genotype on Gran Canaria Island // Am. J. Respir. Crit. Care Med. - 2001. - Vol.164. - P. 1165-1170.8. Caminero JA, Pena MJ, Campos-Herrero MI, Rodriguez JC, Garcia I., Cabrera P., Lafoz C., Samper S., Takiff H., Afonso O., Pavon JM, Torres MJ, van Soolingen D. , Enarson DA, Martin C. Epidemiological evidence of the spread of a Mycobacterium tuberculosis strain of the Beijing genotype on Gran Canaria Island // Am. J. Respir. Crit. Care Med. - 2001 .-- Vol.164. - P. 1165-1170.

9. Сох Н.S., Kubica Т., Doshetov D., Kebede Y., Riisch-Gerdess S., Niemann S. The Beijing genotype and drug resistant tuberculosis in the Aral Sea region of Central Asia // Respir. Res. - 2005. - Vol.6. - P. 134.9. Sokh N.S., Kubica T., Doshetov D., Kebede Y., Riisch-Gerdess S., Niemann S. The Beijing genotype and drug resistant tuberculosis in the Aral Sea region of Central Asia // Respir. Res. - 2005 .-- Vol.6. - P. 134.

10. Ferdinand S., Valetudie G., Sola C, Rastogi N. Data mining of Mycobacterium tuberculosis complex genotyping results using mycobacterial interspersed repetitive units validates the clonal structure of spoligotyping-defined families // Res. Microbiol. - 2004. - Vol.155. - N8.- P. 647-654.10. Ferdinand S., Valetudie G., Sola C, Rastogi N. Data mining of Mycobacterium tuberculosis complex genotyping results using mycobacterial interspersed repetitive units validates the clonal structure of spoligotyping-defined families // Res. Microbiol. - 2004 .-- Vol. 155. - N8.- P. 647-654.

11. Gagneux S. Small P.M. Global phylogeography of Mycobacterium tuberculosis and implications for tuberculosis product development // Lancet Infect. Dis. - 2007. - Vol.7. -P. 328-337.11. Gagneux S. Small P.M. Global phylogeography of Mycobacterium tuberculosis and implications for tuberculosis product development // Lancet Infect. Dis. - 2007. - Vol. 7. -P. 328-337.

12. Garcia de Viedma D., Chaves F., Inigo J. New route of importation of Mycobacterium tuberculosis Beijing genotype // Emerg. Infect. Dis. - 2006. - Vol.12. - P. 169-170.12. Garcia de Viedma D., Chaves F., Inigo J. New route of importation of Mycobacterium tuberculosis Beijing genotype // Emerg. Infect. Dis. - 2006. - Vol. 12. - P. 169-170.

13. Kamerbeek J., Schouls L., Kolk A., van Agterveld M., van Soolingen D., Kuijper S., Bunschoten A., Molhuizen H., Shaw R., Goyal M., van Embden J.D.A. Simultaneous detection and strain differentiation of Mycobacterium tuberculosis for diagnosis and epidemiology // J. Clin. Microbiol. - 1997. - Vol.35. - P. 907-914.13. Kamerbeek J., Schouls L., Kolk A., van Agterveld M., van Soolingen D., Kuijper S., Bunschoten A., Molhuizen H., Shaw R., Goyal M., van Embden J.D.A. Simultaneous detection and strain differentiation of Mycobacterium tuberculosis for diagnosis and epidemiology // J. Clin. Microbiol. - 1997. - Vol. 35. - P. 907-914.

14. Kremer K., Glynn J.R., Lillebaek Т., Niemann S., Kurepina N.E., Kreiswirth B.N., Bifani P.J., van Soolingen D. Definition of the Beijing / W lineage of Mycobacterium tuberculosis on the basis of genetic markers // J. Clin. Microbiol. - 2004.- Vol.42. - P.4040-4049.14. Kremer K., Glynn JR, Lillebaek T., Niemann S., Kurepina NE, Kreiswirth BN, Bifani PJ, van Soolingen D. Definition of the Beijing / W lineage of Mycobacterium tuberculosis on the basis of genetic markers // J. Clin. Microbiol. - 2004.- Vol. 42. - P.4040-4049.

15. Kurepina N., Likhoshvay E., Shashkina E., Mathema В., Kremer K., van Soolingen D., Bifani P., Kreiswirth B.N. Targeted hybridization of IS6110 fingerprints identifies the W-Beijing Mycobacterium tuberculosis strains among clinical isolates // J. Clin. Microbiol. - 2005. - Vol.43(5). - P. 2148-54.15. Kurepina N., Likhoshvay E., Shashkina E., Mathema B., Kremer K., van Soolingen D., Bifani P., Kreiswirth B.N. Targeted hybridization of IS6110 fingerprints identifies the W-Beijing Mycobacterium tuberculosis strains among clinical isolates // J. Clin. Microbiol. - 2005 .-- Vol. 43 (5). - P. 2148-54.

16. Lasunskaia E., Ribeiro S.C., Manicheva O., Gomes L.L., Suffys P.N., Mokrousov I., Fer-razoli L., Andrade M.R., Kritski A., Otten Т., Kipnis T.L., da Silva W.D., Vishnevsky В., Gomes H.M., Baptista I.F., Narvskaya O. Emerging multi-drug resistant Mycobacterium tuberculosis strains of the Beijing genotype circulating in Russia express a pattern of biological properties associated with enhanced virulence // Microbes Infect. - 2010. - Mar 6.16. Lasunskaia E., Ribeiro SC, Manicheva O., Gomes LL, Suffys PN, Mokrousov I., Ferrazoli L., Andrade MR, Kritski A., Otten T., Kipnis TL, da Silva WD, Vishnevsky B. , Gomes HM, Baptista IF, Narvskaya O. Emerging multi-drug resistant Mycobacterium tuberculosis strains of the Beijing genotype circulating in Russia express a pattern of biological properties associated with enhanced virulence // Microbes Infect. - 2010 .-- Mar 6.

17. Lavender C., Globan M., Sievers A., Billman-Jacobe H., Fyfe J. Molecular characterization of isoniazid-resistant Mycobacterium tuberculosis isolates collected in Australia // Antimicrob. Agents Chemother. - 2005. - Vol.49. - P. 4068-4074.17. Lavender C., Globan M., Sievers A., Billman-Jacobe H., Fyfe J. Molecular characterization of isoniazid-resistant Mycobacterium tuberculosis isolates collected in Australia // Antimicrob. Agents Chemother. - 2005. - Vol. 49. - P. 4068-4074.

18. Lopez В., Aguilar D., Orozco H., Burger M., Espitia C, Ritacco V., Barrera L., Kremer K., Hernandez-Pando R., Huygen K., van Soolingen D. A marked difference in pathogenesis and immune response induced by different Mycobacterium tuberculosis genotypes // Clin. Exp.Immunol. - 2003. - Vol.133. - P. 30-37.18. Lopez B., Aguilar D., Orozco H., Burger M., Espitia C, Ritacco V., Barrera L., Kremer K., Hernandez-Pando R., Huygen K., van Soolingen D. A marked difference in pathogenesis and immune response induced by different Mycobacterium tuberculosis genotypes // Clin. Exp.Immunol. - 2003 .-- Vol.133. - P. 30-37.

19. Marais B.J., Victor T.C., Hesseling A.C., Barnard M, Jordaan A., Brittle W., Reuter H., Beyers N., van Helden P.D., Warren R.M., Schaaf H.S. Beijing and Haarlem genotypes are overrepresented among children with drug-resistant tuberculosis in the Western Cape Province of South Africa // J. Clin. Microbiol. - 2006. - Vol.44. - P. 3539-3543.19. Marais B.J., Victor T.C., Hesseling A.C., Barnard M, Jordaan A., Brittle W., Reuter H., Beyers N., van Helden P.D., Warren R.M., Schaaf H.S. Beijing and Haarlem genotypes are overrepresented among children with drug-resistant tuberculosis in the Western Cape Province of South Africa // J. Clin. Microbiol. - 2006 .-- Vol.44. - P. 3539-3543.

20. Millet J., Miyagi-Shiohira C., Yamane N., Sola C, Rastogi N. Assessment of mycobacterial interspersed repetitive unit-QUB markers to further discriminate the Beijing genotype in a population-based study of the genetic diversity of Mycobacterium tuberculosis clinical isolates from Okinawa, Ryukyu Islands, Japan // J. Clin. Microbiol. - 2007. - Vol.45. - P. 3606-3615.20. Millet J., Miyagi-Shiohira C., Yamane N., Sola C, Rastogi N. Assessment of mycobacterial interspersed repetitive unit-QUB markers to further discriminate the Beijing genotype in a population-based study of the genetic diversity of Mycobacterium tuberculosis clinical isolates from Okinawa, Ryukyu Islands, Japan // J. Clin. Microbiol. - 2007. - Vol. 45. - P. 3606-3615.

21. Mokrousov I. Genetic geography of Mycobacterium tuberculosis Beijing genotype: a multifacet mirror of human history // Infect. Genet. Evol. - 2008. -Vol.8. - P. 777-785.21. Mokrousov I. Genetic geography of Mycobacterium tuberculosis Beijing genotype: a multifacet mirror of human history // Infect. Genet. Evol. - 2008. -Vol. 8. - P. 777-785.

22. Mokrousov I., Otten Т., Zozio Т., Turkin E., Nazemtseva V., Sheremet A., Vishnevsky В., Narvskaya O., Rastogi N. At Baltic crossroads: a molecular snapshot of Mycobacterium tuberculosis population diversity in Kaliningrad, Russia // FEMS Immunol Med Microbiol. - 2009. - Vol.55. - P. 13-22.22. Mokrousov I., Otten T., Zozio T., Turkin E., Nazemtseva V., Sheremet A., Vishnevsky B., Narvskaya O., Rastogi N. At Baltic crossroads: a molecular snapshot of Mycobacterium tuberculosis population diversity in Kaliningrad, Russia // FEMS Immunol Med Microbiol. - 2009 .-- Vol.55. - P. 13-22.

23. Narvskaya O., Otten Т., Limeschenko E., Sapozhnikova N., Graschenkova O., Steklova L., Nikonova A., Filipenko M.L., Mokrousov I., Vyshnevskiy B. Nosocomial outbreak of multidrug-resistant tuberculosis caused by a strain of Mycobacterium tuberculosis W-Beijing family in St. Petersburg, Russia // Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. - 2002. -Vol.21. - P. 596-602.23. Narvskaya O., Otten T., Limeschenko E., Sapozhnikova N., Graschenkova O., Steklova L., Nikonova A., Filipenko ML, Mokrousov I., Vyshnevskiy B. Nosocomial outbreak of multidrug-resistant tuberculosis caused by a strain of Mycobacterium tuberculosis W-Beijing family in St. Petersburg, Russia // Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. - 2002.-Vol. 21. - P. 596-602.

24. Sebban M., Mokrousov I., Rastogi N., Sola C. A data-mining approach to spacer oligonucleotide typing of Mycobacterium tuberculosis II Bioinformatics. - 2002. - Vol.18. - N2. - P. 235-243.24. Sebban M., Mokrousov I., Rastogi N., Sola C. A data-mining approach to spacer oligonucleotide typing of Mycobacterium tuberculosis II Bioinformatics. - 2002. - Vol. 18. - N2. - P. 235-243.

25. Sola C., Filliol I., Legrand E., Mokrousov I., Rastogi N. Mycobacterium tuberculosis phylogeny reconstruction based on combined numerical analysis with IS/087, IS6//0, VNTR, and DR-based spoligotyping suggests the existence of two new phylogeographical clades // J. Mol. Evol. - 2001. - Vol.53. - P. 680-689.25. Sola C., Filliol I., Legrand E., Mokrousov I., Rastogi N. Mycobacterium tuberculosis phylogeny reconstruction based on combined numerical analysis with IS / 087, IS6 // 0, VNTR, and DR-based spoligotyping suggests the existence of two new phylogeographical clades // J. Mol. Evol. - 2001. - Vol. 53. - P. 680-689.

26. Toungoussova O., Sandven P., Mariandyshev A., Nizovtseva N., Bjune G., Caugant D.A. Spread of drug-resistant Mycobacterium tuberculosis strains of the Beijing genotype in the Archangel Oblast, Russia // J. Clin. Microbiol. - 2002. - Vol.40. - P. 1930-1937.26. Toungoussova O., Sandven P., Mariandyshev A., Nizovtseva N., Bjune G., Caugant D.A. Spread of drug-resistant Mycobacterium tuberculosis strains of the Beijing genotype in the Archangel Oblast, Russia // J. Clin. Microbiol. - 2002 .-- Vol. 40. - P. 1930-1937.

27. Van Embden J.D.A., Cave M.D., Crawford J.T., Dale J.W., Eisenach K.D., Gicquel В., Hermans P., Martin C., McAdam R., Shinnik T.M., Small P.M. Strain identification of Mycobacterium tuberculosis by DNA fingerprinting: recommendations for a standardized methodology // J. Clin. Microbiol. - 1993. - Vol.31. - P. 406-409.27. Van Embden J.D.A., Cave M.D., Crawford J.T., Dale J.W., Eisenach K. D., Gicquel B., Hermans P., Martin C., McAdam R., Shinnik T.M., Small P.M. Strain identification of Mycobacterium tuberculosis by DNA fingerprinting: recommendations for a standardized methodology // J. Clin. Microbiol. - 1993 .-- Vol.31. - P. 406-409.

28. Van Soolingen D., Qian L., de Haas P.E.W., Douglas J.Т., Traore H., Portaels F., Quing Z., Enkhasaikan D., Nymadawa P., van Embden J.D.A. Predominance of a single genotype of Mycobacterium tuberculosis in countries of East Asia // J. Clin. Microbiol. -1995. - Vol.33. - P. 3234-3238.28. Van Soolingen D., Qian L., de Haas P.E.W., Douglas J.T., Traore H., Portaels F., Quing Z., Enkhasaikan D., Nymadawa P., van Embden J.D.A. Predominance of a single genotype of Mycobacterium tuberculosis in countries of East Asia // J. Clin. Microbiol. -1995. - Vol. 33. - P. 3234-3238.

29. Zhang M., Cong J., Yang Z., Samten В., Barnes P.F. Enhanced capacity of a widespread strain of Mycobacterium tuberculosis to grow in human macrophages // J. Infect. Dis. - 1999. - Vol.179. - P. 1213-1217.29. Zhang M., Cong J., Yang Z., Samten B., Barnes P.F. Enhanced capacity of a widespread strain of Mycobacterium tuberculosis to grow in human macrophages // J. Infect. Dis. - 1999 .-- Vol. 179. - P. 1213-1217.

Claims

The method of determining mycobacterium tuberculosis of the Beijing genotype in real time by determining the insertion of the element IS6110 at the locus of the dnaA-dnaN genome, characterized in that they use real-time PCR using two specific primers 5`-AGATCAGAGAGTCTCCGGACTCA and 5`-CGCCGGGACTGTATGAGTCT and a fluorescently labeled probe R6G-5`-TGTGCACAGCGACACTCACAGCCH-2, the B channel is evaluated by measuring the signal R6G with a wavelength of 555nm, and in the presence of a Beijing Mycobacterium tuberculosis strain DNA sample in the DNA sample, the exponential growth of the PCR fluorescence signal in the analysis of pure DNA occurs between 10-15 cycles, and in the analysis of cell lysates between 15 and 20 cycles.