RU2684314C2 - Method of identification of mycobacteria of tuberculosis of the beijing genotype b0 cluster in real time format - Google Patents
Method of identification of mycobacteria of tuberculosis of the beijing genotype b0 cluster in real time format Download PDFInfo
- Publication number
- RU2684314C2 RU2684314C2 RU2017123302A RU2017123302A RU2684314C2 RU 2684314 C2 RU2684314 C2 RU 2684314C2 RU 2017123302 A RU2017123302 A RU 2017123302A RU 2017123302 A RU2017123302 A RU 2017123302A RU 2684314 C2 RU2684314 C2 RU 2684314C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- tuberculosis
- beijing
- cluster
- genotype
- pcr
- Prior art date
Links
- 201000008827 tuberculosis Diseases 0.000 title claims abstract description 29
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 16
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 12
- 241000187479 Mycobacterium tuberculosis Species 0.000 claims abstract description 7
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims abstract description 6
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims abstract description 6
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 claims abstract description 5
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 claims description 3
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 claims description 2
- 238000009533 lab test Methods 0.000 claims 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 abstract description 10
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 9
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 abstract description 7
- 230000003321 amplification Effects 0.000 abstract description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 abstract description 3
- 241000186359 Mycobacterium Species 0.000 abstract 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 14
- 238000007894 restriction fragment length polymorphism technique Methods 0.000 description 12
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 8
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 6
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 6
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 201000002661 Spondylitis Diseases 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 239000002987 primer (paints) Substances 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M Cetrimonium bromide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)C LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000905957 Channa melasoma Species 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 230000007023 DNA restriction-modification system Effects 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 108091029795 Intergenic region Proteins 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 241000382311 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Reading Species 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 230000000721 bacterilogical effect Effects 0.000 description 1
- 238000013477 bayesian statistics method Methods 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- ZYWFEOZQIUMEGL-UHFFFAOYSA-N chloroform;3-methylbutan-1-ol;phenol Chemical compound ClC(Cl)Cl.CC(C)CCO.OC1=CC=CC=C1 ZYWFEOZQIUMEGL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005094 computer simulation Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 238000007403 mPCR Methods 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к медицине, а именно к фтизиатрии, и может быть использовано для лабораторного определения микобактерий туберкулеза, относящихся к генотипу Beijing В0-кластер.The invention relates to medicine, namely to phthisiology, and can be used for laboratory determination of Mycobacterium tuberculosis, belonging to the Beijing B0-cluster genotype.
Возбудитель туберкулеза человека - Mycobacterium tuberculosis имеет клональную структуру популяции, внутри вида М. tuberculosis выделяют отдельные генетические семейства, которые могли сформироваться в различных географических регионах. Со временем, некоторые генотипы возбудителя распространились по всему миру [Sola С.et al., 2001; Gagneux S. et al., 2006]. Примером такого генотипа M. tuberculosis является генетическое семейство (генотип) Beijing, вероятно возникшее в северном Китае [van Soolingen D. et al. 1995]. Штаммы M. tuberculosis, принадлежащие к этому семейству, выделяют в различных странах, в том числе и в России (40-60% больных туберкулезом) [Нарвская О.В. и соавт., 1999; Bifani P. et al., 2002; Drobniewski F., et al. 2005; Mokrousov I., 2015; Luo T. et al., 2015]. Молекулярное типирование штаммов M. tuberculosis, циркулирующих в России с середины 1990-х годов, выявило не только преобладание штаммов Beijing, но и широкое распространение варианта с характерным профилем IS6110-RFLP Beijing В0 (Нарвская О.В., 2003). Особенностью профиля Beijing В0 является наличие двух дополнительных фрагментов в верхней части профиля размером 7,1 тпн и 9,2 тпн (Фиг. 1). Этот профиль М. tuberculosis был впервые выявлен в российских штаммах в середине 1990-х годов [Marttila Н. et al., 1997; Нарвская О.В. и соавт., 1999; Portaels F. et al., 1999]. Эти штаммы широко циркулируют на территории постсоветского пространства и доминируют в США и Западной Европе среди мультирезистентных штаммов, выделенных от иммигрантов из бывшего СССР [Сох Н. et al., 2005; Kubica Т. et al., 2004; Ghebremichael S. et al., 2010]. Профиль В0 и сходные с ним профили гибридизации IS6110-RFLP определяют как В0-кластер [Mokrousov I. et al., 2008]. Компьютерное моделирование эволюции 17 полиморфных локусов VNTR с использованием Байесовой статистики показало существенно более быстрый (в 10.6 раза) рост субпопуляции ВО в сравнении с популяцией Beijing в целом [Мокроусов И.В., 2009].The causative agent of human tuberculosis - Mycobacterium tuberculosis has a clonal population structure; within the species M. tuberculosis, individual genetic families can be identified that could have formed in different geographical regions. Over time, some pathogen genotypes spread throughout the world [Sola C.et al., 2001; Gagneux S. et al., 2006]. An example of such a M. tuberculosis genotype is the Beijing genetic family (genotype), which probably originated in northern China [van Soolingen D. et al. 1995]. Strains of M. tuberculosis belonging to this family are isolated in various countries, including Russia (40-60% of patients with tuberculosis) [O. Narva et al., 1999; Bifani P. et al., 2002; Drobniewski F., et al. 2005; Mokrousov I., 2015; Luo T. et al., 2015]. The molecular typing of M. tuberculosis strains that have been circulating in Russia since the mid-1990s revealed not only the predominance of Beijing strains, but also the widespread distribution of the variant with a characteristic profile of IS6110-RFLP Beijing B0 (Narvskaya O.V., 2003). A feature of the Beijing B0 profile is the presence of two additional fragments in the upper part of the profile measuring 7.1 TPN and 9.2 TPN (Fig. 1). This profile of M. tuberculosis was first detected in Russian strains in the mid-1990s [Marttila N. et al., 1997; Narvskaya O.V. et al., 1999; Portaels F. et al., 1999]. These strains circulate widely in the post-Soviet territory and dominate in the USA and Western Europe among multi-resistant strains isolated from immigrants from the former USSR [Sokh N. et al., 2005; Kubica, T. et al., 2004; Ghebremichael S. et al., 2010]. The B0 profile and IS6110-RFLP hybridization profiles similar to it are defined as a B0 cluster [Mokrousov I. et al., 2008]. Computer simulation of the evolution of 17 polymorphic VNTR loci using Bayesian statistics showed a significantly faster (10.6 times) increase in the VO subpopulation in comparison with the Beijing population as a whole [Mokrousov IV, 2009].
Известен метод определения штаммов Beijing В0-кластера, основанный на гибридизационном анализе полиморфизма длин фрагментов рестрикции ДНК, содержащих инсерционный элемент IS6110 (метод IS6110-RFLP) с последующим сравнением с референтным профилем для этого штамма [Нарвская О.В., 2003]. Метод IS6110-RFLP ограничен трудоемкостью выполнения анализа, требующего выделения большого количества ДНК. Таким образом, разработка быстрого и простого способа детекции эпидемиологически и клинически значимого варианта М. tuberculosis Beijing В0-кластер является актуальной задачей программы контроля туберкулеза в России и мире.A known method for determining the strains of Beijing B0 cluster, based on a hybridization analysis of the polymorphism of the lengths of DNA restriction fragments containing the insertion element IS6110 (method IS6110-RFLP), followed by comparison with the reference profile for this strain [Narva OV, 2003]. The IS6110-RFLP method is limited by the complexity of the analysis, requiring the extraction of large amounts of DNA. Thus, the development of a quick and easy way to detect an epidemiologically and clinically significant variant of M. tuberculosis Beijing B0-cluster is an urgent task of the tuberculosis control program in Russia and the world.
Проведенный нами анализ полного генома штамма Mycobacterium tuberculosis NZ_CP012090.1 (номер доступа в GenBank), относящегося к В0-кластеру, позволил картировать известные фрагменты его профиля IS6110-RFLP в определенных локусах генома, ограниченных сайтами рестрикции PvuII. В частности, мы установили, что элемент IS6110 в позициях 2755667-2757021 обратно ориентирован и расположен внутри фрагмента рестрикции Pvull длиной 9162 пн. Это соответствует одному из двух крупных фрагментов гибридизации (9,2 тпн), характерных для профиля В0. Данная вставка IS6110 соответствует позициям 2982598/9 в полном геноме лабораторного штамма H37Rv, в интактном участке между генами Rv2664 и Rv2665 (GenBank NC 000962.3). Данный участок является интактным и во всех других полных геномах штаммов М. tuberculosis различных генотипов, депонированных в GenBank, за исключением вышеупомянутого штамма NZ_CP012090.1 (Фиг. 2).Our analysis of the complete genome of the Mycobacterium tuberculosis strain NZ_CP012090.1 (access number in the GenBank) belonging to the B0 cluster allowed us to map the known fragments of its IS6110-RFLP profile at specific loci of the genome bounded by PvuII restriction sites. In particular, we found that the element IS6110 at positions 2755667-2757021 is reverse oriented and is located inside the Pvull restriction fragment of 9162 bp length. This corresponds to one of two large fragments of hybridization (9.2 TPN), characteristic of the B0 profile. This insert IS6110 corresponds to
Задачей предлагаемого изобретения является разработка способа быстрой и надежной детекции микобактерий туберкулеза генотипа Beijing В0-кластер.The objective of the invention is to develop a method for the rapid and reliable detection of mycobacterium tuberculosis genotype Beijing B0-cluster.
Задача реализуется за счет того, что определяют вставку элемента IS6110 в локусе генома Rv2664-Rv2665 с помощью ПЦР в формате реального времени с использованием олигонуклеотидных праймеров BZF 
Мультиплексная ПЦР основана на использовании сконструированных нами: (1) трех праймеров - двух внешних (по отношению к специфической вставке IS6110 в геноме В0, фланкирующих ее и выступающих в качестве прямого и обратного) и одного внутреннего (расположенного внутри IS6110 и действующего как обратный праймер) и (2) двух флуоресцентно-меченых зондов для выявления наличия или отсутствия специфической вставки IS6110 в определенной позиции в межгенном участке Rv2664-Rv2665. Преимущества предлагаемого способа:Multiplex PCR is based on the use of the following designed by us: (1) three primers - two external (with respect to the specific insert IS6110 in the B0 genome, flanking it and acting as direct and reverse) and one internal (located inside IS6110 and acting as a reverse primer) and (2) two fluorescently-labeled probes to detect the presence or absence of a specific insert IS6110 at a specific position in the intergenic region Rv2664-Rv2665. The advantages of the proposed method:
1. быстрота (меньше одного дня от момента выделения ДНК);1. speed (less than one day from the moment of DNA extraction);
2. простая и однозначная интерпретация результатов;2. simple and unambiguous interpretation of the results;
3. возможность быстрого анализа больших коллекций штаммов М. tuberculosis для оценки их принадлежности к кластеру Beijing В0 с диагностической целью и при популяционных исследованиях.3. the ability to quickly analyze large collections of M. tuberculosis strains to assess their affiliation with the Beijing B0 cluster for diagnostic purposes and in population studies.
Изобретение поясняется чертежами, где Фиг. 1 - Примеры профилей IS6110-RFLP микобактерий туберкулеза (генотип Beijing В0 отмечен звездочкой, профили Beijing В0-кластера - серый фон). Фиг. 2 - Схема ПЦР (не в масштабе). Крупная стрелка показывает ориентацию элемента IS6110, короткие стрелки - позиции праймеров и зондов в геномах референс-штаммов В0 и H37Rv. Фиг. 3 - накопление сигнала флуоресценции: (а) по специфическому (FAM) каналу детекции, на М. tuberculosis Beijing В0-кластер и (б) контрольному (HEX) каналу детекции, на штамм другого генотипа М. tuberculosis. Вода служит отрицательным контрольным образцом.The invention is illustrated by drawings, where FIG. 1 - Examples of profiles of IS6110-RFLP of Mycobacterium tuberculosis (the Beijing B0 genotype is marked with an asterisk, the profiles of Beijing B0 cluster are a gray background). FIG. 2 - Scheme of PCR (not to scale). The large arrow shows the orientation of the IS6110 element, the short arrows show the positions of primers and probes in the genomes of reference strains B0 and H37Rv. FIG. 3 - accumulation of the fluorescence signal: (a) through a specific (FAM) detection channel, on M. tuberculosis Beijing B0 cluster and (b) a control (HEX) detection channel, on a strain of another M. tuberculosis genotype. Water serves as a negative control.
Способ осуществляется следующим образом. Выделение ДНК из культуры М. tuberculosis, выращенной на среде Левенштейна-Йенсена, проводят по van Embden et al. [1993]: суспендируют 1 стандартную бактериологическую петлю культуры в 400 мкл буфера ТЕ х1 и инкубируют 20 мин при 85°C. Дальнейшую обработку проводят с использованием лизоцима, протеиназы К, додецилсульфата натрия и цетилтриметиламмонийбромида. Полученный клеточный лизат обрабатывают смесью фенол-хлороформ-изоамиловый спирт (25:24:1), центрифугируют, осаждают изопропанолом, промывают 70% этанолом, осадок высушивают и растворяют в 30-50 мкл ТЕ x1.The method is as follows. Isolation of DNA from M. tuberculosis culture grown on Levenshtein-Jensen medium is carried out according to van Embden et al. [1993]: 1 standard bacteriological culture loop is suspended in 400 μl of TE x1 buffer and incubated for 20 min at 85 ° C. Further processing is carried out using lysozyme, proteinase K, sodium dodecyl sulfate and cetyltrimethylammonium bromide. The obtained cell lysate is treated with a mixture of phenol-chloroform-isoamyl alcohol (25: 24: 1), centrifuged, precipitated with isopropanol, washed with 70% ethanol, the precipitate is dried and dissolved in 30-50 μl of TE x1.
Были использованы следующие сконструированные нами праймеры и зонды для ПЦР в реальном времени (Фиг. 2) для проведения реакции ПЦР и детекции флуоресценции по двум каналам в одной пробирке одновременно: праймеры BZF 
Для детекции генотипа Beijing В0-кластер служили праймеры BZF и BZRi и зонд PBZ (Фиг. 2). Детекцию сигнала проводили по FAM-каналу детекции (длина волны 510 нм) (Фиг. 3а).To detect the Beijing B0 cluster genotype, primers BZF and BZRi and a PBZ probe were used (Fig. 2). The signal was detected by the FAM channel of detection (wavelength 510 nm) (Fig. 3a).
Для детекции штамма любого другого генотипа М. tuberculosis служили праймеры BZF, BZR и зонд nPBZ (Фиг. 2); детекцию сигнала проводили по НЕХ-каналу (длина волны 555 нм) (Фиг. 3б).For detection of a strain of any other M. tuberculosis genotype, primers BZF, BZR and nPBZ probe were used (Fig. 2); signal detection was performed on the HEX channel (wavelength 555 nm) (Fig. 3b).
Очищенная ДНК (0.1-0.5 мкл) добавляется к смеси ПЦР (конечный объем 30 мкл) содержащей 1,5 mM MgCl2, 1 U Taq ДНК полимеразы для ПЦР в реальном времени в режиме «горячего старта», 200 μМ каждого из дНТФ, праймеры (по 5 пмоль), зонды (по 2 пмоль). ПЦР проводили в термоциклере Rotorgene6000 (Corbette Research) в следующих условиях: 95°C, 10 мин; далее 40 циклов 94°C, 15 с; 60°C, 40 с. Считывание сигнала флуоресценции - при 60°C по каналам 510 и 555 нм.Purified DNA (0.1-0.5 μl) is added to the PCR mixture (
Оценка результатов.Evaluation of the results.
Полученные данные - кривые накопления флуоресцентного сигнала между 15-35 циклом по двум каналам - анализируют с помощью программного обеспечения прибора, используемого для проведения ПЦР в формате реального времени. По каналу FAM (длина волны 510 нм) - регистрируется накопление продукта амплификации фрагмента ДНК, специфического для генотипа М. tuberculosis Beijing В0-кластер (Фиг. 3а), по каналу HEX (длина волны 555 нм) - фрагмента ДНК, специфического для любого другого генотипа М. tuberculosis (Фиг. 3б).The data obtained — the fluorescence signal accumulation curves between the 15-35 cycle through two channels — are analyzed using the instrument software used for real-time PCR. Via the FAM channel (wavelength 510 nm) - the accumulation of the amplification product of a DNA fragment specific for the M. tuberculosis Beijing genotype B0 cluster (Fig. 3a) is recorded; through the HEX channel (wavelength 555 nm) - a DNA fragment specific to any other genotype M. tuberculosis (Fig. 3b).
При отсутствии сигнала флуоресценции по обоим каналам (510 и 555 нм) делается вывод о недостаточном количестве и/или качестве ДНК или ингибировании реакции ПЦР и невозможности какого-либо вывода о наличии или отсутствии ДНК штамма Beijing В0 в образце.In the absence of a fluorescence signal through both channels (510 and 555 nm), a conclusion is drawn about the insufficient amount and / or quality of DNA or inhibition of the PCR reaction and the impossibility of any conclusion about the presence or absence of DNA of Beijing B0 strain in the sample.
Обязательная амплификация одного или другого продукта ПЦР является контролем качества: при отсутствии сигнала судят о деградированной ДНК или ингибировании реакции, при наличии сигнала по обоим каналам делают вывод о микс-образце (контаминация на каком-либо из этапов исследования или выделение двух штаммов от одного больного).Mandatory amplification of one or the other PCR product is a quality control: in the absence of a signal, degraded DNA or inhibition of the reaction is judged, if there is a signal through both channels, a mix-sample is concluded (contamination at any stage of the study or isolation of two strains from one patient )
Пример 1. Анализ ДНК клинических изолятов М. tuberculosis из коллекции лаборатории молекулярной микробиологии ФБУН НИИЭМ им. Пастера.Example 1. DNA analysis of clinical isolates of M. tuberculosis from the collection of the laboratory of molecular microbiology Pasteur.
Способ был апробирован на представительной и ранее охарактеризованной методами сполиготипирования и IS6110-RFLP типирования коллекции ДНК штаммов М. tuberculosis различных генотипов, выделенных от больных из России, Вьетнама и Китая. При этом все штаммы генотипа Beijing были генотипированы методом IS6110-RFLP для точного выявления штаммов В0-кластера. Штаммы других генотипов представляли различные генетические семейства (LAM, Haarlem, Т, Ural, Manu, X, EAI), установленные на основе результатов сполиготипирования и дополнительного анализа других генетических маркеров для отдельных семейств (однонуклеотидные или делеционные полиморфизмы).The method was tested on a representative and previously characterized by spoligotyping and IS6110-RFLP typing methods for the collection of DNA of M. tuberculosis strains of various genotypes isolated from patients from Russia, Vietnam and China. Moreover, all strains of the Beijing genotype were genotyped using the IS6110-RFLP method to accurately identify strains of the B0 cluster. Strains of other genotypes represented various genetic families (LAM, Haarlem, T, Ural, Manu, X, EAI), established on the basis of spoligotyping and additional analysis of other genetic markers for individual families (single nucleotide or deletion polymorphisms).
Всего предлагаемым способом ПЦР в формате реального времени было проанализировано 204 штамма из Санкт-Петербурга и Пскова (из них 136 штаммов генотипа Beijing), 57 штаммов из Китая (из них 45 штаммов генотипа Beijing), 59 штаммов из Вьетнама (из них 37 штаммов генотипа Beijing). В результате, специфический участок генома, характерный для штамма с профилем IS6110-RFLP В0, был выявлен только у штаммов кластера В0 (n=35), что подтверждает наличие у них специфической инсерции IS6110 в Rv2664-Rv2665, характерной для этого геноварианта М. tuberculosis.In total, the proposed real-time PCR method analyzed 204 strains from St. Petersburg and Pskov (of which 136 strains of the Beijing genotype), 57 strains from China (of which 45 strains of the Beijing genotype), 59 strains from Vietnam (of which 37 strains of the genotype Beijing). As a result, a specific part of the genome characteristic of the strain with the IS6110-RFLP B0 profile was detected only in strains of the B0 cluster (n = 35), which confirms the presence of a specific insertion of IS6110 in Rv2664-Rv2665 characteristic of this M. tuberculosis genovariant .
В то же время, у российских штаммов других вариантов генотипа Beijing, не относящихся к кластеру В0, и штаммов других генетических семейств, а также всех штаммов из Вьетнама и Китая был выявлен фрагмент, соответствующий данному участку генома, не содержащему инсерцию IS6110. Таким образом, специфичность и чувствительность данного способа выявления штаммов кластера В0 генотипа Beijing составили 100% для изученной коллекции штаммов.At the same time, Russian strains of other variants of the Beijing genotype, not belonging to the B0 cluster, and strains of other genetic families, as well as all strains from Vietnam and China, revealed a fragment corresponding to this part of the genome that does not contain the IS6110 insertion. Thus, the specificity and sensitivity of this method for identifying strains of the B0 cluster of the Beijing genotype amounted to 100% for the studied collection of strains.
Пример 2. Анализ коллекции ДНК изолятов М. tuberculosis, выделенных от больных туберкулезным спондилитом.Example 2. Analysis of the DNA collection of M. tuberculosis isolates isolated from patients with tuberculous spondylitis.
Всего было проверено 107 образцов ДНК, выделенных от больных туберкулезным спондилитом, находившихся на лечении в Санкт-Петербургском НИИ фтизиопульмонологии в 2009-2012 годах. Все образцы ДНК М. tuberculosis были охарактеризованы методами сполиготипирования и IS110-RFLP типирования. Штаммы генотипа Beijing (n=80) были генотипированы методом IS6110-RFLP для выявления штаммов В0-кластера. Штаммы других генотипов представляли различные генетические семейства, установленные методом сполиготипирования, а именно, Т (n=12), Ural (n=7), LAM (n=3), Manu (n=2), Haarlem (n=1), S (n=1). Далее ДНК всех штаммов была протестирована предлагаемым способом ПЦР в формате реального времени для выявления штаммов Beijing В0-кластера. В результате проведения ПЦР было установлено, что 30 изолятов относились к Beijing В0-кластеру, что полностью соответствовало результатам IS6110-RFLP анализа.In total, 107 DNA samples isolated from patients with tuberculous spondylitis who were treated at the St. Petersburg Research Institute of Phthisiopulmonology in 2009-2012 were tested. All M. tuberculosis DNA samples were characterized by spoligotyping and IS110-RFLP typing. Strains of the Beijing genotype (n = 80) were genotyped using the IS6110-RFLP method to identify strains of the B0 cluster. Strains of other genotypes represented various genetic families established by spoligotyping, namely, T (n = 12), Ural (n = 7), LAM (n = 3), Manu (n = 2), Haarlem (n = 1), S (n = 1). Next, the DNA of all strains was tested by the proposed real-time PCR method to identify Beijing B0 cluster strains. As a result of PCR, it was found that 30 isolates belonged to the Beijing B0 cluster, which is fully consistent with the results of IS6110-RFLP analysis.
ЛитератураLiterature
1. Мокроусов И.В., дис. д-ра биол. наук. СПб., 2009.1. Mokrousov IV, dis. Dr. biol. sciences. SPb., 2009.
2. Нарвская О.В., дис. д-ра мед. наук. С.-Петербург, 20032. Narvskaya OV, dis. Dr. med. sciences. St. Petersburg, 2003
3. Bifani P. et al. Trends Microbiol. 2002, 10: 45-52.3. Bifani P. et al. Trends Microbiol. 2002, 10: 45-52.
4. Cox H. et al. Respir. Res. 2005, 6: 134.4. Cox H. et al. Respir. Res. 2005, 6: 134.
5. Drobniewski F. et al. JAMA 2005, 293: 2726-2731.5. Drobniewski F. et al. Jama 2005, 293: 2726-2731.
6. Gagneux S. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2006, 103: 2869-2873.6. Gagneux S. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2006, 103: 2869-2873.
7. Ghebremichael S. et al. PLoS One, 2010, 5: e10893.7. Ghebremichael S. et al. PLoS One, 2010, 5: e10893.
8. Kubica T.et al. Int. J. Tuberc. Lung Dis. 2004, 8: 1107-1113.8. Kubica T. et al. Int. J. Tuberc. Lung dis. 2004, 8: 1107-1113.
9. Luo T. et al., PNAS. 2015, 112: 8136-8141.9. Luo, T. et al., PNAS. 2015, 112: 8136-8141.
10. Marttila H. et al. Antimicrob. Agents Chemother. 1997, 42: 2443-2445.10. Marttila H. et al. Antimicrob. Agents Chemother. 1997, 42: 2443-2445.
11. Mokrousov I. Tuberculosis (Edinb). 2015; 95: S167-176.11. Mokrousov I. Tuberculosis (Edinb). 2015; 95: S167-176.
12. Mokrousov I. et al. J Clin Microbiol. 2008, 46: 3576-3584.12. Mokrousov I. et al. J Clin Microbiol. 2008, 46: 3576-3584.
13. Sola С.et al. J. Mol. Evol. 2001, 53: 680-689.13. Sola C. et al. J. Mol. Evol. 2001, 53: 680-689.
14. Portaels F. et al. Int. J. Tuberc. Lung Dis. 1999, 3: 582-588.14. Portaels F. et al. Int. J. Tuberc. Lung dis. 1999, 3: 582-588.
15. van Soolingen D. et al. J. Clin. Microbiol. 1995, 33: 3234-3238.15. van Soolingen D. et al. J. Clin. Microbiol. 1995, 33: 3234-3238.
16. van Embden J. et al. J. Clin. Microbiol. 31: 406-409.16. van Embden J. et al. J. Clin. Microbiol. 31: 406-409.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017123302A RU2684314C2 (en) | 2017-06-30 | 2017-06-30 | Method of identification of mycobacteria of tuberculosis of the beijing genotype b0 cluster in real time format |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017123302A RU2684314C2 (en) | 2017-06-30 | 2017-06-30 | Method of identification of mycobacteria of tuberculosis of the beijing genotype b0 cluster in real time format |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2017123302A RU2017123302A (en) | 2019-01-09 |
| RU2017123302A3 RU2017123302A3 (en) | 2019-01-09 |
| RU2684314C2 true RU2684314C2 (en) | 2019-04-05 |
Family
ID=64977297
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2017123302A RU2684314C2 (en) | 2017-06-30 | 2017-06-30 | Method of identification of mycobacteria of tuberculosis of the beijing genotype b0 cluster in real time format |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2684314C2 (en) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2735415C1 (en) * | 2019-11-15 | 2020-11-02 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт фтизиопульмонологии" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "СПб НИИФ" Минздрава России) | Method for detecting mycobacteria tuberculosis central asian epidemic cluster beijing genotype |
| RU2743365C1 (en) * | 2020-05-12 | 2021-02-17 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт фтизиопульмонологии" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "СПб НИИФ" Минздрава России) | Method of detecting phylogenetic sublines of beijing mycobacterium tuberculosis genotype in real time format |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2012031752A2 (en) * | 2010-09-07 | 2012-03-15 | Institut Pasteur Korea | Tuberculosis mutants |
| EP2576831B1 (en) * | 2010-05-25 | 2015-04-08 | National University of Ireland, Galway | Diagnostic method |
| RU2551764C2 (en) * | 2013-07-04 | 2015-05-27 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Научно-исследовательский институт физико-химической медицины Федерального медико-биологического агентства (ФГБУН НИИ ФХМ ФМБА России) | METHOD FOR DETECTING TUBERCULOUSIS MYCOBACTERIA OF GENETIC CLUSTER Beijing B0/W148 |
-
2017
- 2017-06-30 RU RU2017123302A patent/RU2684314C2/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2576831B1 (en) * | 2010-05-25 | 2015-04-08 | National University of Ireland, Galway | Diagnostic method |
| WO2012031752A2 (en) * | 2010-09-07 | 2012-03-15 | Institut Pasteur Korea | Tuberculosis mutants |
| RU2551764C2 (en) * | 2013-07-04 | 2015-05-27 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Научно-исследовательский институт физико-химической медицины Федерального медико-биологического агентства (ФГБУН НИИ ФХМ ФМБА России) | METHOD FOR DETECTING TUBERCULOUSIS MYCOBACTERIA OF GENETIC CLUSTER Beijing B0/W148 |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2735415C1 (en) * | 2019-11-15 | 2020-11-02 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт фтизиопульмонологии" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "СПб НИИФ" Минздрава России) | Method for detecting mycobacteria tuberculosis central asian epidemic cluster beijing genotype |
| RU2743365C1 (en) * | 2020-05-12 | 2021-02-17 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт фтизиопульмонологии" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "СПб НИИФ" Минздрава России) | Method of detecting phylogenetic sublines of beijing mycobacterium tuberculosis genotype in real time format |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2017123302A (en) | 2019-01-09 |
| RU2017123302A3 (en) | 2019-01-09 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Neonakis et al. | Molecular diagnostic tools in mycobacteriology | |
| CN110541022B (en) | Mycobacterium tuberculosis complex detection kit based on CRISPR-Cas12a system | |
| Ushio et al. | Digital PCR assay detection of circulating Mycobacterium tuberculosis DNA in pulmonary tuberculosis patient plasma | |
| Ikryannikova et al. | Misidentification of alpha-hemolytic streptococci by routine tests in clinical practice | |
| Weiss et al. | An extended multilocus sequence typing (MLST) scheme for rapid direct typing of Leptospira from clinical samples | |
| Herthnek et al. | New PCR systems to confirm real-time PCR detection of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis | |
| BRPI0517131B1 (en) | METHODS TO SIMPLIFY MICROBIAL NUCLEIC ACIDS BY CHEMICAL MODIFICATION OF CYTOSINES | |
| Gosiewski et al. | Comparison of methods for isolation of bacterial and fungal DNA from human blood | |
| Isola et al. | A Pyrosequencing assay for rapid recognition of SNPs in Mycobacterium tuberculosis embB306 region | |
| Hoshino et al. | Differential diagnostic assays for discriminating mycobacteria, especially for nontuberculous mycobacteria: what does the future hold? | |
| Marras et al. | A molecular-beacon-based multiplex real-time PCR assay to distinguish Mycobacterium abscessus subspecies and determine macrolide susceptibility | |
| US20110287965A1 (en) | Methods and compositions to detect clostridium difficile | |
| JP2014207895A (en) | Genotypic typing method of acinetobacter bacteria and primer set using the same | |
| RU2684314C2 (en) | Method of identification of mycobacteria of tuberculosis of the beijing genotype b0 cluster in real time format | |
| RU2405836C2 (en) | Method for mycobacterium tuberculosis beijing genotype detection | |
| Lyu et al. | CRISPR-based biosensing is prospective for rapid and sensitive diagnosis of pediatric tuberculosis | |
| Amlerova et al. | Genotyping of Mycobacterium tuberculosis using whole genome sequencing | |
| Kılıç et al. | Brucella melitensis and Brucella abortus genotyping via real-time PCR targeting 21 variable genome loci | |
| Eichbaum et al. | Tuberculosis: advances in laboratory diagnosis and drug susceptibility testing | |
| RU2689800C1 (en) | Method for detection of isolates mycobacterium tuberculosis beijing 94-32-cluster in real time format | |
| EP2999798A1 (en) | Method for simultaneous detection of bacteria and fungi in a biological preparation by pcr, primers as well as bacteria and fungi detection kit | |
| Uy et al. | Serological and molecular evaluation of Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis (Johne’s disease) infecting riverine-type water buffaloes (Bubalus bubalis) in the Philippines | |
| CN103509859B (en) | PCR detection kit for goat tuberculosis | |
| RU2689801C1 (en) | Method for detecting mycobacterium bovis bcg strains in real time format | |
| RU2735415C1 (en) | Method for detecting mycobacteria tuberculosis central asian epidemic cluster beijing genotype |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20200701 |