RU2740140C1

RU2740140C1 - Method of producing and a composition for increasing the effectiveness of probiotic microorganisms

Info

Publication number: RU2740140C1
Application number: RU2020123100A
Authority: RU
Inventors: Борис Алексеевич Кареткин; Дмитрий Владимирович Савельев; Елена Павловна Лоссь; Елена Андрияновна Терешкова
Original assignee: Общество с ограниченной ответственностью "АВАН"
Priority date: 2020-07-13
Filing date: 2020-07-13
Publication date: 2021-01-11

Abstract

FIELD: medicine; biotechnology.

SUBSTANCE: invention refers to medicine and biotechnology. Method of producing a composition for increasing probiotic microorganisms involves cultivating bifidobacteria in a medium with low concentration of the limiting energy carbohydrate substrate during its fractional delivery, at temperature from 36 to 38 °C, with pH of culture liquid in range from 5.0 to 7.0, and termination of cultivation process, when suspension contains at least 2·10⁹ CFU of bifidobacteria in ml and not less than 70 % of cells agglomerates in microcolony, with subsequent removal of cultivation medium and its replacement with medium of cultivation with buffered physiological solution, mixing and sorption on particles of activated carbon with size of not more than 100 mcm in amount of 10 to 40 %, addition of sucrose-gelatinous protective medium to 100 % and lyophilic drying. Described also is a composition obtained using said method.

EFFECT: method enables increasing the effectiveness of probiotic microorganisms by preparing them in the form of microcolonies immobilized on a suitable carrier, and also provides a composition for restoring and maintaining microecological balance in the intestinal microbial biocoenosis.

3 cl, 4 ex, 1 tbl, 3 dwg

Description

Область техники, к которой относится изобретениеThe technical field to which the invention relates

Изобретение относится к лекарственным препаратам - пробиотикам для медицинского и ветеринарного применения и способам их получения, и может быть использовано в медицине и сельском хозяйстве.The invention relates to medicinal products - probiotics for medical and veterinary use and methods for their production, and can be used in medicine and agriculture.

Уровень техникиState of the art

Пробиотики - живые микроорганизмы, которые при введении в адекватном количестве оказывают благотворное воздействие на здоровье хозяина (Report of a Joint FAO/WHO, 2001). Известно, что пробиотики эффективны для профилактики и лечении диарей различной природы, энтероколитов, воспалительных заболеваний кишечника, а также способствуют нормализации углеводного и липидного обмена, здоровью костей; могут применяться при неалкогольной жировой болезни печени, для лечения депрессии и тревожности (

2019; Amin N. et al., 2020; Liu R.T. et al., 2019; Liu L. et al., 2019).Probiotics are live microorganisms that, when administered in adequate amounts, have a beneficial effect on the health of the host (Report of a Joint FAO / WHO, 2001). It is known that probiotics are effective for the prevention and treatment of diarrhea of various nature, enterocolitis, inflammatory bowel diseases, and also contribute to the normalization of carbohydrate and lipid metabolism, bone health; can be used for non-alcoholic fatty liver disease, for the treatment of depression and anxiety (

2019; Amin N. et al., 2020; Liu RT et al., 2019; Liu L. et al., 2019).

В исследовании (Macfarlane S. et al., 2004) было установлено, что у здорового человека в биопленке кишечника преобладают микроорганизмы двух групп Bacteroides и Bifidobacterium. Показано, что бифидобактерии находятся в биопленке в виде микроколоний. Исследование колонизации частиц пищи в кишечнике человека (Macfarlane S., Macfarlane G.T., 2006) показало, что на них также формируются биопленки близкие по микробному составу к пристеночному биотопу. Толщина таких пленок составляет около 20 мкм, причем в наружнем слое локализованы в основном энтеробактериии и бактероиды, в то время как саму частицу покрывают преимущественно микроколонии бифидобактерий. Таким образом, преобладающей формой функционально активного существования пробиотиков, в частности, бифидобактерий, в кишечнике являются микроколонии. Под микроколонией понимают стабильную структуру, которая представляет собой сформировавшийся естественным путем агрегат микроорганизмов, и является, в сущности, элементарной единицей биопленки. Известно, что формирование биопленок начинается с образования микроколоний (Николаев Ю.А., Плакунов В.К., 2007).In a study (Macfarlane S. et al., 2004), it was found that in a healthy person, microorganisms of two groups Bacteroides and Bifidobacterium predominate in the intestinal biofilm. It was shown that bifidobacteria are present in the biofilm in the form of microcolonies. The study of the colonization of food particles in the human intestine (Macfarlane S., Macfarlane G.T., 2006) showed that biofilms similar in microbial composition to the parietal biotope are also formed on them. The thickness of such films is about 20 microns, and in the outer layer mainly enterobacteria and bacteroids are localized, while the particle itself is covered mainly by microcolonies of bifidobacteria. Thus, the predominant form of functionally active existence of probiotics, in particular, bifidobacteria, in the intestine are microcolonies. A microcolony is understood as a stable structure, which is a naturally formed aggregate of microorganisms, and is, in essence, an elementary unit of a biofilm. It is known that the formation of biofilms begins with the formation of microcolonies (Nikolaev Yu.A., Plakunov V.K., 2007).

Известна композиция, включающая пробиотики в виде микрокапсул, и способ ее получения (US 20100189767 A1). Способы включают микроинкапсулирование живых микроорганизмов для получения сухого препарата с возможным нанесением покрытия на микрокапсулы, что позволяет сохранить жизнеспособность микроорганизмов в значительной степени. Указанный способ предполагает напыление суспензии пробиотических микрорганизмов на частицу носителя в установке кипящего слоя, после чего на частицу наносят защитное гидрофобное покрытие, например, воска, что обеспечивает защиту от влаги. Данная композиция обеспечивает стабильность пробиотиков при хранении. Однако не предоставлена информация о действии композиции в кишечнике. Также известна композиция в виде кишечных микрокапсул (Yus С. et al., 2019). Данная композиция обеспечивает защиту клеток пробиотиков при прохождении через экстремальные условия верхних отделов желудочно-кишечного тракта и таргетное высвобождение пробиотиков в кишечнике, что подтверждено в исследованиях in vitro. Однако разрушение произойдет в просвете кишечника, при этом образуются одиночные клетки. Вероятность внедрения таких клеток в биопленку кишечника невелика и пробиотики будут эффективны только во время транзита через кишечник вместе с химусом, т.е. непродолжительное время.Known composition, including probiotics in the form of microcapsules, and a method for its preparation (US 20100189767 A1). The methods include microencapsulation of living microorganisms to obtain a dry preparation with the possibility of coating the microcapsules, which allows maintaining the viability of the microorganisms to a large extent. This method involves spraying a suspension of probiotic microorganisms onto a carrier particle in a fluidized bed installation, after which a protective hydrophobic coating, for example, wax, is applied to the particle, which provides protection against moisture. This composition provides storage stability for probiotics. However, no information is provided on the effect of the composition in the intestine. Also known is the composition in the form of intestinal microcapsules (Yus C. et al., 2019). This composition provides protection of probiotic cells when passing through extreme conditions of the upper gastrointestinal tract and targeted release of probiotics in the intestine, which has been confirmed in in vitro studies. However, destruction will occur in the intestinal lumen, with the formation of single cells. The probability of the introduction of such cells into the intestinal biofilm is low and probiotics will be effective only during transit through the intestine together with the chyme, i.e. for a short time.

Известен препарат (RU 2118535 С1), который включает носитель, представляющий собой сорбент и клетки эубиотиков, иммобилизованные на указанном носителе. Клетки эубиотиков используют совместно с компонентами питательной среды с биотитром 10⁸-10¹⁰ КОЕ/мл. В качестве сорбента используют энтеросорбент на основе оксида алюминия типа СУМС, модифицированный углеродом, или энтеросорбент типа СИАЛ при следующем количественном соотношении компонентов препарата, мас.%: клетки эубиотиков (бифидо- или лактобактерии) с титром 10⁸-10¹⁰ КОЕ/мл 1,0-50,0, сорбент остальное до 100%. Комплексный бактериальный препарат обеспечивает более эффективное пролонгированное лечебно-профилактическое действие на организм человека или животного за счет сохранения активности препарата при введении в организм на всех участках желудочно-кишечного тракта. Однако указанное утверждение подтверждено только тестами in vitro. Также не показано, как повышение стабильности в неблагоприятных условиях связана с колонизацией биопленки кишечника.Known drug (RU 2118535 C1), which includes a carrier, which is a sorbent and eubiotic cells, immobilized on the specified carrier. Eubiotic cells are used in conjunction with the components of the nutrient medium with biotiter 10 ⁸ -10 ¹⁰ CFU / ml. An enterosorbent based on aluminum oxide of the SUMS type, modified with carbon, or an enterosorbent of the SIAL type with the following quantitative ratio of the preparation components, wt%: eubiotic cells (bifidobacteria or lactobacilli) with a titer of 10 ⁸ -10 ¹⁰ CFU / ml 1, is used as a sorbent. 0-50.0, the rest is up to 100% sorbent. The complex bacterial preparation provides a more effective prolonged therapeutic and prophylactic effect on the human or animal body due to the preservation of the activity of the drug when administered into the body in all parts of the gastrointestinal tract. However, this statement is confirmed only by in vitro tests. It has also not been shown how an increase in stability under adverse conditions is associated with colonization of the intestinal biofilm.

Известен препарат для медицинского и ветеринарного применения (RU 2164801 С1), который включает носитель, представляющий собой сорбент, и клетки пробиотиков, иммобилизованные на указанном носителе. Препарат содержит клетки пробиотиков с питательной средой, в частности концентрат бифидобактерий на молочной основе с титром 10⁸-10¹⁰ КОЕ/г и защитную среду. В качестве сорбента используют материал с антацидными свойствами, развитой мезо- и макропористой структурой в различных формах, в частности оксид алюминия, поверхность которого модифицирована углеродом при получении сорбента типа СУМС. Указанный препарат в иммобилизованной форме имеет более длительный срок хранения. Авторы утверждают, что указанный препарат обладает более эффективным пролонгированным лечебно-профилактическим действием на всех участках желудочно-кишечного тракта за счет более высокой его колонизационной активности. Тем не менее колонизационная активность определена косвенно, по увеличению численности бактерий в фекалиях подопытных животных, а не в биопленке кишечника. Также в представленных данных обращает на себя внимание, что увеличение численности бифидобактерий произошло не после длительного (15 дней) приема препарата, а после 12 дней с момента его отмены, что не объяснено авторами и может быть связано как с неисследованными особенностями препарата, так и с техникой постановки эксперимента.Known drug for medical and veterinary use (RU 2164801 C1), which includes a carrier, which is a sorbent, and probiotic cells immobilized on the specified carrier. The drug contains probiotic cells with a nutrient medium, in particular a concentrate of bifidobacteria on a milk basis with a titer of 10 ⁸ -10 ¹⁰ CFU / g and a protective medium. As a sorbent, a material with antacid properties, a developed meso- and macroporous structure in various forms is used, in particular, aluminum oxide, the surface of which is modified with carbon when obtaining a sorbent of the SUMS type. The specified drug in immobilized form has a longer shelf life. The authors argue that this drug has a more effective prolonged therapeutic and prophylactic effect in all parts of the gastrointestinal tract due to its higher colonization activity. Nevertheless, the colonization activity was determined indirectly by the increase in the number of bacteria in the feces of experimental animals, and not in the intestinal biofilm. Also in the presented data, it is noteworthy that an increase in the number of bifidobacteria did not occur after a long (15 days) intake of the drug, but after 12 days from the moment of its cancellation, which is not explained by the authors and may be associated with both unexplored features of the drug and technique of setting up the experiment.

Известен (RU 2317089 С2) схожий по составу препарата-пробиотик медицинского и ветеринарного назначения, который обеспечивает более высокую эффективность сорбции и десорбции клеток бактерий энтеросорбентом СУМС-1, определяющей его клиническую эффективность, и более высокую колонизационную активность бактерий-эубиотиков. Однако для указанного препарата также не подтверждена в исследованиях in vivo эффективная колонизация биопленки кишечника вводимыми пробиотическими микроорганизмами.It is known (RU 2317089 C2) a probiotic preparation similar in composition for medical and veterinary purposes, which provides a higher efficiency of sorption and desorption of bacterial cells with the enterosorbent SUMS-1, which determines its clinical effectiveness, and a higher colonization activity of eubiotic bacteria. However, for the specified drug, the effective colonization of the intestinal biofilm by the administered probiotic microorganisms has also not been confirmed in in vivo studies.

Таким образом, описанные изобретения направлены, преимуществено, на защиту пробиотических микроорганизмов от стрессового воздействия и гибели в экстремальных условиях желудка и верхних отделов кишечника, либо при длительном хранении. Недостатком всех описанных изобретений является то, что способ их получения не предполагает иммобилизацию микроколоний пробиотических бактерий, которые образовались в ходе предшествующего этапа культивирования. Таким образом, при попадании в нижние отделы кишечника, в которых пробиотики проявляют наибольшую активность и оказывают положительные эффекты на здоровье человека, каждая из иммобилизованных клеток должна сначала сформировать микроколонию, что требует нескольких последовательных актов бинарного деления и, как следствие, является длительным процессом, в течение которого с высокой долей вероятности частица носителя вместе с содержимым кишечника будет выведена из организма. Внедрение же одиночных клеток пробиотических микроорганизмов в густонаселенную биопленку кишечника является маловероятным, поскольку, как указывалось выше, автохтонные микроорганизмы в ней уже находятся в виде микроколоний.Thus, the described inventions are directed, predominantly, to protect probiotic microorganisms from stress and death in extreme conditions of the stomach and upper intestines, or during long-term storage. The disadvantage of all the described inventions is that the method of their preparation does not imply the immobilization of microcolonies of probiotic bacteria that were formed during the previous stage of cultivation. Thus, when entering the lower intestine, in which probiotics are most active and have positive effects on human health, each of the immobilized cells must first form a microcolony, which requires several consecutive acts of binary division and, as a consequence, is a long process, in during which, with a high degree of probability, the carrier particle along with the intestinal contents will be excreted from the body. The introduction of single cells of probiotic microorganisms into the densely populated intestinal biofilm is unlikely, since, as mentioned above, autochthonous microorganisms are already in it in the form of microcolonies.

Наиболее близким является средство для коррекции микробиоценоза (RU 2159624 С1), которое представляет собой выполненные из фармацевтически приемлемого полисахарида микрокапсулы диаметром, не превышающим 100 мкм, в каждой из которых размещен приемлемый сорбент с размером частиц 10-100 мкм с нанесенными на них не менее 12 клетками аутохтонных штаммов микроорганизмов. Средство обеспечивает защиту от воздействия среды кишечника и желудка. При этом авторы утверждают, что одна частица сорбента с нанесенными на нее не менее 12 клетками, является одной микроколонией. Также в изобретении показано, что частицы угля, полученного из растительных материалов, эффективно внедряются в муциновый слой. Однако в соответствии с данным изобретением на поверхности закреплены единичные клетки. Из сказанного выше очевидно, что закрепление на частицы нескольких микроколоний должно повысить эффективность композиции.The closest is a means for correcting microbiocenosis (RU 2159624 C1), which is made from a pharmaceutically acceptable polysaccharide microcapsules with a diameter not exceeding 100 μm, each of which contains an acceptable sorbent with a particle size of 10-100 μm with at least 12 cells of autochthonous strains of microorganisms. The product provides protection against the effects of the intestinal and stomach environment. At the same time, the authors claim that one sorbent particle with at least 12 cells applied to it is one microcolony. The invention also shows that particles of coal obtained from plant materials are effectively incorporated into the mucin layer. However, in accordance with the present invention, single cells are fixed to the surface. From the above, it is obvious that the attachment of several microcolonies to the particles should increase the effectiveness of the composition.

Раскрытие сущности изобретения.Disclosure of the essence of the invention.

Задачей настоящего изобретения является повышение эффективности пробиотических микроорганизмов путем получения их микроколоний в ходе ферментации с последующей иммобилизацией на подходящем носителе. Изобретение обеспечивает восстановление и поддержание микроэкологического равновесия в микробном биоценозе кишечника, благодаря чему усиливается полезное действие на организм человека или животного.The objective of the present invention is to increase the efficiency of probiotic microorganisms by obtaining their microcolonies during fermentation followed by immobilization on a suitable carrier. The invention provides for the restoration and maintenance of microecological balance in the microbial biocenosis of the intestine, thereby enhancing the beneficial effect on the human or animal organism.

Одним из оптимальных путей достижения поставленной задачи является создание композиции, обеспечивающей увеличение количества микроколоний в биопленке кишечника, поскольку данная форма организации микробной популяции является наиболее характерной для существования пробиотических бактерий в данном микробиоценозе. Особенностью предлагаемой композиции является то, что клетки пробиотических бактерий находятся в ней преимущественно в форме микроколоний. Таким образом, снижается вероятность элеминации из биопленки одиночных клеток до того, как они сформируют микроколонии. Микроколонии сорбированы на частицах носителя, обеспечивающего их внедрение в биопленку. Компоненты среды высушивания повышают устойчивость бактерий к стрессовым факторам. В основе получения композиции лежит способ, заключающийся в культивировании пробиотических бактерий в условиях, обеспечивающих их агломерацию с образованием микроколоний, очистке от среды культивирования, смешении и экспозиции с сорбентом-носителем, добавлении защитной среды и лиофильном высушивании.One of the optimal ways to achieve this task is to create a composition that provides an increase in the number of microcolonies in the intestinal biofilm, since this form of organization of the microbial population is the most characteristic for the existence of probiotic bacteria in this microbiocenosis. A feature of the proposed composition is that the cells of probiotic bacteria are in it mainly in the form of microcolonies. Thus, the probability of single cells being removed from the biofilm before they form microcolonies is reduced. Microcolonies are sorbed on carrier particles, which ensures their incorporation into the biofilm. The components of the drying medium increase the bacteria's resistance to stress factors. The preparation of the composition is based on a method consisting in the cultivation of probiotic bacteria under conditions ensuring their agglomeration with the formation of microcolonies, purification from the cultivation medium, mixing and exposure with a carrier sorbent, adding a protective medium and freeze drying.

Осуществление изобретенияImplementation of the invention

Ключевым этапом осуществления изобретения является процесс культивирования бактерий. Его необходимо проводить таким образом, чтобы в результате в суспензии находились в достаточном количестве не свободные клетки, а микроколонии и агломераты. Для этого используют среду культивирования, полностью обеспечивающую потребности пробиотических бактерий в питательных веществах, однако с пониженной концентрацией лимитирующего энергетического субстрата. В качестве лимитирующего энергетического субстрата выступает углеводный субстрат, например, глюкоза, или лактоза, или олигофруктоза, или лактулоза. Поддерживают оптимальные для роста условия: температуру и рН культивирования, концентрированный раствор энергетического субстрата подают дробно в течение всего времени роста. В результате жизнедеятельности пробиотических бактерий изменяется химический состав среды, происходит истощение по отдельным аминокислотам и накопление продуктов жизнедеятельности (лактат- и ацетат-ионов). В результате этого клетки бактерий, не переходя в стационарную фазу роста, не разъединяются после бинарного деления, а также активно агломерируют. Культивирование прекращают, когда не менее 70% культуры по результатам микроскопических исследований агломерируют в микроколонии из 5 и более клеток, что при используемой среде соответствует продолжительности более 8 часов. Данный подход отличает предлагаемый способ от предложенных ранее, в которых используют культуру на стадии роста, когда агломераты еще не образуются.The key step in the implementation of the invention is the process of culturing bacteria. It must be carried out in such a way that, as a result, there are not free cells in the suspension, but microcolonies and agglomerates. For this, a cultivation medium is used that fully satisfies the needs of probiotic bacteria for nutrients, but with a reduced concentration of the limiting energy substrate. A carbohydrate substrate, for example, glucose, or lactose, or oligofructose, or lactulose, acts as a limiting energy substrate. Optimal conditions for growth are maintained: temperature and pH of cultivation, a concentrated solution of an energy substrate is fed fractionally during the entire growth period. As a result of the vital activity of probiotic bacteria, the chemical composition of the medium changes, depletion of individual amino acids and the accumulation of waste products (lactate and acetate ions) occur. As a result, bacterial cells, without going into the stationary growth phase, do not separate after binary division, and also actively agglomerate. Cultivation is stopped when at least 70% of the culture, according to the results of microscopic studies, agglomerates in microcolonies of 5 or more cells, which, with the medium used, corresponds to a duration of more than 8 hours. This approach distinguishes the proposed method from those proposed earlier, in which the culture is used at the growth stage, when agglomerates are not yet formed.

Удаление продуктов жизнедеятельности и не потреблённых культурой компонентов питательной среды также важно для создания композиции, поскольку входящие в состав среды культивирования пептиды и углеводы, а также образованные органические кислоты будут конкурировать за сайты адгезии на частицах носителя (активированного угля) с пептидогликанами поверхностных структур (пили) пробиотических бактерий, что будет снижать эффективность сорбции последних. Лактат и ацетат являются известными природными консервантами, с повышением концентрации которых стабильность пробиотических бактерий при хранении и будет снижаться. Удаление продуктов проводят одним из доступных способов: ультрафильтрацией, микрофильтрацией, центрифугированием или сепарацией. Удаленный объем восстанавливают забуференным физиологическим раствором, однако могут быть использованы и другие растворы, например, раствор пептона 1%.Removal of waste products and components of the culture medium not consumed by the culture is also important for creating a composition, since peptides and carbohydrates included in the culture medium, as well as formed organic acids, will compete for adhesion sites on the carrier particles (activated carbon) with peptidoglycans of surface structures (pili) probiotic bacteria, which will reduce the efficiency of sorption of the latter. Lactate and acetate are known natural preservatives, with an increase in the concentration of which the stability of probiotic bacteria during storage will decrease. Products are removed by one of the available methods: ultrafiltration, microfiltration, centrifugation or separation. The removed volume is restored with buffered saline, but other solutions can be used, for example, 1% peptone solution.

К подготовленной таким образом суспензии клеток добавляют сорбент. В качестве сорбента используют активированный уголь, полученный из растительных материалов, таких как древесина лиственных пород, скорлупа кокоса, косточки фруктовых плодов. Активированный уголь должен по безопасности соответствовать требованиям, предъявляемым к углям, которые применяют в фармацевтической или пищевой промышленности. Перед использованием активированный уголь подвергают стерилизации сухим жаром при 160°C в течение 2 часов, либо в водной суспензии паром при 127°C в течение 1 часа.The sorbent is added to the cell suspension prepared in this way. As a sorbent, activated carbon obtained from plant materials such as hardwood, coconut shells, and fruit seeds is used. Activated carbon must meet the safety requirements for coals used in the pharmaceutical or food industry. Before use, the activated carbon is sterilized by dry heat at 160 ° C for 2 hours, or in an aqueous suspension with steam at 127 ° C for 1 hour.

Уголь вносят из расчета от 10 до 40% от массы готовой сухой композиции. Проводят сорбцию с перемешиванием суспензии в течение 5-60 минут. После завершения сорбции вводят защитную среду для лиофильного высушивания. Может быть применена защитная среда на основании желатина (5-15%) и сахарозы (до 100%), на основе 10% суспензии обезжиренного молока или другие известные среды. Полученную суспензию замораживают до температуры не выше минус 38°C и подвергают лиофильному высушиванию.Coal is added at the rate of 10 to 40% by weight of the finished dry composition. Sorption is carried out with stirring of the suspension for 5-60 minutes. After the completion of the sorption, a protective medium is introduced for freeze drying. A protective medium based on gelatin (5-15%) and sucrose (up to 100%), based on a 10% skim milk suspension or other known media can be used. The resulting suspension is frozen to a temperature not higher than minus 38 ° C and subjected to freeze-drying.

Пример 1Example 1

Для получения биосуспензии бифидобактерий проводят культивирование в ферментере. Используют питательную среду, содержащую: панкреатический гидролизат казеина (жидкий) - от 20 до 30% об. (стандартизуют по содержанию аминного азота), дрожжевой аутолизат - от 7 до 10% об., солевую основу. В качестве солевой основы используют цитрат натрия, хлорид натия, сульфат магния, фосфаты. Глюкозу вводят из расчета концентрации в среде не более 10 г/л, предпочтительно от 2 до 7 г/л. Жидкий гидролизат казеина может быть заменен на триптон казеиновый (концентрация в среде 15 г/л), а дрожжевой аутолизат, на сухой дрожжевой экстракт (концентрация в среде 15 г/л). Среду стерилизуют паром в ферментере.To obtain a biosuspension of bifidobacteria, cultivation is carried out in a fermenter. Use a nutrient medium containing: casein pancreatic hydrolyzate (liquid) - from 20 to 30% vol. (standardized by the content of amine nitrogen), yeast autolysate - from 7 to 10% vol., salt base. Sodium citrate, sodium chloride, magnesium sulfate, phosphates are used as a salt base. Glucose is introduced on the basis of a concentration in the medium of not more than 10 g / l, preferably from 2 to 7 g / l. Liquid casein hydrolyzate can be replaced with casein tryptone (concentration in the medium 15 g / l), and yeast autolysate, with dry yeast extract (concentration in the medium 15 g / l). The medium is steam sterilized in a fermenter.

Инокулят готовят в 2 пассажа на среде Блаурокка. При необходимости проводят дополнительный пассаж в среде близкой по составу к среде культивирования. Инкубирование всех пассажей проводят при температуре от 36 до 38°C. Мутность инокулята должна составлять не менее 1,0 единицы.The inoculum is prepared in 2 passages on Blaurocca medium. If necessary, an additional passage is carried out in a medium similar in composition to the culture medium. All passages are incubated at a temperature of 36 to 38 ° C. The turbidity of the inoculum must be at least 1.0 units.

Культивирование проводят в ферментере при температуре от 36 до 38°C и перемешивании. Ферментер заполняют инертным газом (азотом или аргоном). Все операции по внесению инокулята и добавок проводят в асептичеких условиях. В ходе культивирования поддерживают рН культуральной жидкости в интервале от 5,0 до 7,0 в зависимости от предпочтений используемого штамма. Например, для штаммов вида Bifidobacterium bifidum поддерживают рН в интервале от 5,7 до 6,5, для штаммов вида Bifidobacterium adolescentis - от 5,5 до 6,5, для штаммов Bifidobacterium infantis и Bifidobacterium longum - от 6,0 до 6,8. Для поддержания рН используют водный раствор аммиака (25% об.) или гидроокиси натрия (от 20 до 40% об.) или их смесь. Когда концентрация глюкозы в среде опускается ниже 1 г/л, добавляют ее раствор из расчета восстановления исходной концентрации в среде. Примерно после 8 часов культивирования, обычно после 10 часов культивирования для Bifidobacterium bifidum, после 6 часов культивирования, обычно после 7 часов для Bifidobacterium adolescentis, после 10 часов культивирования, обычно после 12 часов для Bifidobacterium infantis и Bifidobacterium longum при микроскопии начинает наблюдаться образование агломератов бактериальных клеток. К этому моменту культура накапливает не менее 2⋅10⁹ КОЕ/мл. Культивирование продолжают, выполняя микроскопирование примерно 1 раз за час и определяя соотношение агломератов и свободных клеток в культуральной жидкости, а также число клеток в агломерате. Агломерат, содержащий более 12 клеток можно считать микроколонией. Культивирование прекращают, когда более 70% клеток находится в агломератах.The cultivation is carried out in a fermenter at a temperature of 36 to 38 ° C and stirring. The fermenter is filled with an inert gas (nitrogen or argon). All operations for the introduction of inoculum and additives are carried out under aseptic conditions. During cultivation, the pH of the culture liquid is maintained in the range from 5.0 to 7.0, depending on the preferences of the strain used. For example, for strains of the species Bifidobacterium bifidum, the pH is maintained in the range from 5.7 to 6.5, for strains of the species Bifidobacterium adolescentis - from 5.5 to 6.5, for strains of Bifidobacterium infantis and Bifidobacterium longum - from 6.0 to 6, 8. To maintain the pH, an aqueous solution of ammonia (25% vol.) Or sodium hydroxide (from 20 to 40% vol.) Or a mixture thereof is used. When the glucose concentration in the medium falls below 1 g / L, add its solution based on the restoration of the initial concentration in the medium. After about 8 hours of culture, usually after 10 hours of culture for Bifidobacterium bifidum, after 6 hours of culture, usually after 7 hours for Bifidobacterium adolescentis, after 10 hours of culture, usually after 12 hours for Bifidobacterium infantis and Bifidobacterium longum, bacterial agglomeration begins to form on microscopy cells. By this time, the culture accumulates at least 2⋅10 ⁹ CFU / ml. The cultivation is continued, performing microscopy about 1 time per hour and determining the ratio of agglomerates and free cells in the culture fluid, as well as the number of cells in the agglomerate. An agglomerate containing more than 12 cells can be considered a microcolony. The cultivation is stopped when more than 70% of the cells are in agglomerates.

Проводят удаление продуктов жизнедеятельности и не потребленных культурой компонентов питательной среды. Для этого в асептических условиях подсоединяют ферментер к предварительно подвергнутой химической стерилизации ультрафильтрационной установке. Удаляют от 20 до 40% пермеата, при этом клетки остаются в системе и циркулируют между ферментером и ультрафильтрационной установкой. Восстанавливают суспензию до исходного объема, добавляя стерильный раствор, содержащий 8 г/л натрия хлористого, по 0,5 г/л гидрофосфат натрия и дигидрофосфат калия. Диафильтрацию по указанной схеме проводят от 2 до 4 раз. После последнего цикла в ферментер вносят подготовленный стерильный активированный уголь. Количество угля определяют в зависимости от его сорбционной активности, определенной при входном контроле. Данная величина составляет от 10 до 40% от массы готовой сухой композиции, оптимально, около 30%. Сорбцию проводят при температуре не ниже 20°C при постоянном перемешивании. Продолжительность составляет от 10 до 50 минут. После этого в ферментер вводят защитную среду.Waste products and nutrient medium components not consumed by the culture are removed. To do this, under aseptic conditions, the fermenter is connected to an ultrafiltration plant previously subjected to chemical sterilization. 20 to 40% of the permeate is removed, while the cells remain in the system and circulate between the fermenter and the ultrafiltration unit. The suspension is restored to its original volume by adding a sterile solution containing 8 g / l sodium chloride, 0.5 g / l sodium hydrogen phosphate and potassium dihydrogen phosphate each. Diafiltration according to the specified scheme is carried out 2 to 4 times. After the last cycle, prepared sterile activated carbon is introduced into the fermenter. The amount of coal is determined depending on its sorption activity, determined during the input control. This value is from 10 to 40% by weight of the finished dry composition, optimally, about 30%. Sorption is carried out at a temperature not lower than 20 ° C with constant stirring. The duration is from 10 to 50 minutes. After that, a protective environment is introduced into the fermenter.

На стерильные кассеты для лиофильного высушивания разливают полученную суспензию из расчета, чтобы высота слоя составляла от 10 до 15 мм. Замораживают суспензию на плитах установки лиофильного высушивания до температуры не выше минус 38°C или в морозильном ларе, работающем при минус 40°C. Установку вакуумируют и производят постепенный нагрев до температуры 25°C в течение 30-40 часов.The resulting suspension is poured onto sterile cassettes for freeze drying so that the layer height is from 10 to 15 mm. Freeze the suspension on the plates of the lyophilic drying unit to a temperature not exceeding minus 38 ° C or in a chest freezer operating at minus 40 ° C. The installation is evacuated and gradually heated to a temperature of 25 ° C for 30-40 hours.

В результате получены частицы угля с сорбированными на них микроколониями бифидобактерий. Для контроля проводили сканирующую электронную микроскопию. Как видно из полученной микрофотографии (фиг. 1) на поверхности примерно 0,0036 мм² иммобилизовано не менее 7 микроколоний, каждая из которых включает более 20 клеток бифидобактерий. Остальные клетки иммобилизованы в несколько слоев и образуют агломераты меньшего размера. При этом макропоры, как видно из фиг. 1 практически не участвуют в иммобилизации бактерий. Следовательно, иммобилизация осуществляется преимущественно за счет связывания молекул поверхностных структур пробиотических бактерий с активными центрами связывания сорбента-носителя. Таким образом, удаление из среды конкурирующих за химическое связывание углеводов и аминокислот является необходимым, т.к. позволяет управлять процессом сорбции. На фиг. 2 и 3 показана тонкая структура микроколоний и видно, что в их окружении свободные клетки отсутствуют.As a result, coal particles with microcolonies of bifidobacteria sorbed on them were obtained. For control, scanning electron microscopy was performed. As can be seen from the obtained micrograph (Fig. 1), at least 7 microcolonies are immobilized on the surface of approximately 0.0036 mm ² , each of which includes more than 20 cells of bifidobacteria. The rest of the cells are immobilized in several layers and form smaller agglomerates. In this case, macropores, as can be seen from FIG. 1 practically do not participate in the immobilization of bacteria. Consequently, immobilization is carried out mainly due to the binding of molecules of the surface structures of probiotic bacteria with active binding sites of the carrier sorbent. Thus, removal of carbohydrates and amino acids competing for chemical binding from the medium is necessary, since allows you to control the sorption process. FIG. Figures 2 and 3 show the fine structure of microcolonies and it can be seen that there are no free cells in their environment.

Пример 2Example 2

Проводили исследование стабильности композиции и лекарственного препарата на ее основе. Три серии композиции, полученной по примеру 1, хранили в течение 1 года при температуре от 2 до 10°C. Определяли долю мертвых клеток путем прямого подсчета с применением флюоресцентной микроскопии и набора LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kit (табл. 1). После года хранения измельчали композицию на мельнице ударно-ножевой конструкции, смешивали с подходящим наполнителем. Подходящим наполнителем является лактоза. Полученный продукт фасовали в пакеты из комбинированного материала на основе фольги и хранили в течение 2 лет при температуре от 2 до 10°C. Результаты см. в табл. 1. Суммарное снижение численности живых бифидобактерий составило не более 35% за суммарные 3 года хранения.Conducted a study of the stability of the composition and the drug based on it. Three batches of the composition obtained in example 1 were stored for 1 year at a temperature of 2 to 10 ° C. The proportion of dead cells was determined by direct counting using fluorescence microscopy and the LIVE / DEAD BacLight Bacterial Viability Kit (Table 1). After a year of storage, the composition was ground in an impact-knife mill, mixed with a suitable filler. A suitable filler is lactose. The resulting product was packaged in bags made of a combined foil-based material and stored for 2 years at a temperature of 2 to 10 ° C. See the results in table. 1. The total decrease in the number of living bifidobacteria was no more than 35% over the total 3 years of storage.

Пример 3Example 3

Крысам самцам массой 180-200 г давали со стандартным рационом композицию, полученную в соответствии с примером 1, в разовой дозе, соответствующей численности бифидобактерий 10⁸ КОЕ. В группе сравнения животным давали не сорбированные бифидобактерий того же вида и в той же дозе, а в контрольной группе - только стандартный рацион. Крыс вскрывали через 24 часа после дачи препарата. Исследовали состав пристеночного биотопа толстой кишки. Для этого препарат фиксировали по стандартной методике и микроскопировали с применением метода флюоресцентной in situ гибридизации с зондом Bif164-FAM, позволяющего визуализировать отдельные клетки и микроколонии выбранной группы микроорганизмов в многовидовых микробных сообществах, в частности в биопленке кишечника. Оценка количества микроколоний бифидобактерий в различных вариантах показала, что после 24 часов в контрольной группе и группе сравнения количество микроколоний на участке слизистой протяженностью примерно 100 мкм составляло не более 1-2 (7 полей зрения), в то время как после введения предлагаемой композиции количество микроколоний составило на участке той же протяженности 5-8. Отсутствие разницы между контрольной группой и группой сравнения говорит о низком уровне приживаемости несорбированных пробиотиков. Увеличение численности микроколоний в биопленке кишечника крысы, по сравнению с контролем напротив говорит о более высоком уровне заселения бифидобактериями. Наличие большего числа внедрившихся в биопленку и не элиминировавших микроколоний бифидобактерий также можно связать с усилением полезных эффектов пробиотических бактерий.Male rats weighing 180-200 g were given with a standard diet the composition obtained in accordance with example 1, in a single dose corresponding to the number of bifidobacteria 10 ⁸ CFU. In the comparison group, animals were given non-sorbed bifidobacteria of the same species and in the same dose, and in the control group, only a standard diet was given. The rats were dissected 24 hours after dosing. The composition of the parietal biotope of the large intestine was investigated. For this, the preparation was fixed according to a standard technique and microscoped using the method of fluorescent in situ hybridization with the Bif164-FAM probe, which allows visualizing individual cells and microcolonies of a selected group of microorganisms in multispecies microbial communities, in particular, in the intestinal biofilm. Evaluation of the number of microcolonies of bifidobacteria in various variants showed that after 24 hours in the control group and the comparison group, the number of microcolonies in a mucosal area with a length of about 100 μm was no more than 1-2 (7 fields of view), while after the introduction of the proposed composition, the number of microcolonies amounted to 5-8 in the section of the same length. The absence of a difference between the control group and the comparison group indicates a low level of survival of unsorbed probiotics. The increase in the number of microcolonies in the biofilm of the rat intestine, in comparison with the control, on the contrary, indicates a higher level of colonization with bifidobacteria. The presence of a larger number of bifidobacteria that have invaded the biofilm and did not eliminate microcolonies can also be associated with an increase in the beneficial effects of probiotic bacteria.

Пример 4Example 4

Пациентам обоего пола возрастом от 21 до 58 лет с диагнозом острая кишечная инфекция проводили в контрольной группе (21 человек) лечение в соответствии с утвержденными протоколами лечения с применением антимикробных агентов, а в основной группе (24 человека) с применением композиции, полученной в соответствии с примером 1, в разовой дозе, соответствующей численности бифидобактерий 3×10⁹ КОЕ в форме препарата. У пациентов в основной группе по сравнению с контрольной достоверно сокращалась частота стула, купировались диарея и боли в животе. К тому же у больных контрольной группы на фоне применения антимикробной терапии возникали осложнения, которых не было в опытной группе.Patients of both sexes aged from 21 to 58 years with a diagnosis of acute intestinal infection were treated in the control group (21 people) in accordance with the approved treatment protocols with the use of antimicrobial agents, and in the main group (24 people) with the use of a composition obtained in accordance with example 1, in a single dose corresponding to the number of bifidobacteria 3 × 10 ⁹ CFU in the form of the drug. In patients in the main group, compared with the control group, there was a significant reduction in stool frequency, diarrhea and abdominal pain subsided. In addition, the patients in the control group, while using antimicrobial therapy, developed complications that were not in the experimental group.

Библиография:Bibliography:

1. Report of a Joint FAO/WHO expert consultation on evaluation of health and nutritional properties of probiotics in food. - Cordoba, 2001. - 34 p.1. Report of a Joint FAO / WHO expert consultation on evaluation of health and nutritional properties of probiotics in food. - Cordoba, 2001 .-- 34 p.

2.

Probiotics and prebiotics in clinical tests: an update. F1000Research, 2019, Vol. 8, F1000 Faculty Rev-1157.2.

Probiotics and prebiotics in clinical tests: an update. F1000Research, 2019, Vol. 8, F1000 Faculty Rev-1157.

3. Amin N., Boccardi V., Taghizadeh M., Jafarnejad S. Probiotics and bone disorders: the role of RANKL/RANK/OPG pathway. // Aging Clin Exp Res. 2020, Vol. 32(3), p. 363-371.3. Amin N., Boccardi V., Taghizadeh M., Jafarnejad S. Probiotics and bone disorders: the role of RANKL / RANK / OPG pathway. // Aging Clin Exp Res. 2020, Vol. 32 (3), p. 363-371.

4. Liu R.T., Walsh R.F.L., Sheehan A.E. Prebiotics and probiotics for depression and anxiety: A systematic review and meta-analysis of controlled clinical trials. // Neurosci Biobehav Rev. 2019, Vol. 102, p 13-23.4. Liu R.T., Walsh R.F.L., Sheehan A.E. Prebiotics and probiotics for depression and anxiety: A systematic review and meta-analysis of controlled clinical trials. // Neurosci Biobehav Rev. 2019, Vol. 102, p 13-23.

5. Liu L., Li P., Liu Y., Zhang Y. Efficacy of Probiotics and Synbiotics in Patients with Nonalcoholic Fatty Liver Disease: A Meta-Analysis. // Dig Dis Sci. 2019, Vol. 64(12), p. 3402-3412.5. Liu L., Li P., Liu Y., Zhang Y. Efficacy of Probiotics and Synbiotics in Patients with Nonalcoholic Fatty Liver Disease: A Meta-Analysis. // Dig Dis Sci. 2019, Vol. 64 (12), p. 3402-3412.

6. Macfarlane S., Furrie E., Cummings J.H., Macfarlane G.T. Chemotaxonomic analysis of bacterial populations colonizing the rectal mucosa in patients with ulcerative colitis. // Clin Infect Dis. 2004. Vol. 38(12), pp. 1690-1699.6. Macfarlane S., Furrie E., Cummings J.H., Macfarlane G.T. Chemotaxonomic analysis of bacterial populations colonizing the rectal mucosa in patients with ulcerative colitis. // Clin Infect Dis. 2004. Vol. 38 (12), pp. 1690-1699.

7. Macfarlane S., Macfarlane G.T. Composition and Metabolic Activities of Bacterial Biofilms Colonizing Food Residues in the Human Gut. Applied and Environmental Microbiology. 2006. Vol. 72 (9), pp. 6204-6211.7. Macfarlane S., Macfarlane G.T. Composition and Metabolic Activities of Bacterial Biofilms Colonizing Food Residues in the Human Gut. Applied and Environmental Microbiology. 2006. Vol. 72 (9), pp. 6204-6211.

8. Николаев Ю.А., Плакунов B.K. Биопленка - «город микробов» или аналог многоклеточного организма? Микробиология. 2007. Т. 76. №2. С. 149-163.8. Nikolaev Yu.A., Plakunov V.K. Is biofilm a “city of microbes” or an analogue of a multicellular organism? Microbiology. 2007. T. 76. No. 2. S. 149-163.

9. Yus С, Gracia R., Larrea A., Andreu V., Irusta S., Sebastian V., Mendoza G., Arruebo M. Targeted Release of Probiotics from Enteric Microparticulated Formulations. // Polymers, 2019. Vol. 11(10), p. 1668.9. Yus C, Gracia R., Larrea A., Andreu V., Irusta S., Sebastian V., Mendoza G., Arruebo M. Targeted Release of Probiotics from Enteric Microparticulated Formulations. // Polymers, 2019. Vol. 11 (10), p. 1668.

Claims

1. A method of obtaining a composition for increasing the efficiency of probiotic microorganisms, which consists in the cultivation of bifidobacteria in a medium with a reduced concentration of the limiting energy carbohydrate substrate with its fractional supply, at a temperature from 36 to 38 ° C, at a pH of the culture liquid in the range from 5.0 to 7 , 0, and the termination of the cultivation process, when the suspension contains at least 2 × 10 ⁹ CFU of bifidobacteria per ml and at least 70% of the cells agglomerate in microcolonies, with the subsequent removal of the cultivation medium and its replacement of the cultivation medium with a buffered saline solution, mixing and sorption for particles of activated carbon with a size of not more than 100 microns in an amount of 10 to 40%, adding sucrose-gelatin protective medium to 100% and freeze drying.

2. Composition for increasing the efficiency of probiotic microorganisms, obtained by the method according to claim 1, consisting of microcolonies of bifidobacteria formed during cultivation, sorbed on particles of activated carbon, preferably of plant origin, and sucrose-gelatin drying medium.

3. The composition according to claim 2, characterized in that the bacteria Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium adolescentis are used as bifidobacteria.