RU2491079C1 - Composite probiotic preparation and method for preparing it - Google Patents
Composite probiotic preparation and method for preparing it Download PDFInfo
- Publication number
- RU2491079C1 RU2491079C1 RU2012129621/15A RU2012129621A RU2491079C1 RU 2491079 C1 RU2491079 C1 RU 2491079C1 RU 2012129621/15 A RU2012129621/15 A RU 2012129621/15A RU 2012129621 A RU2012129621 A RU 2012129621A RU 2491079 C1 RU2491079 C1 RU 2491079C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- probiotic
- preparation
- cells
- starch
- lactobacillus
- Prior art date
Links
Images
Abstract
Description
Изобретение относится к препаратам медицинского и ветеринарного назначения и способам их получения и может быть использовано в биотехнологии, медицине при создании лекарственных средств и биологически активных добавок (БАД), предназначенных для лечения и профилактики дисбактериозов и инфекционных заболеваний кишечника у детей и взрослых.The invention relates to drugs for medical and veterinary use and methods for their preparation and can be used in biotechnology, medicine to create drugs and biologically active additives (BAA), intended for the treatment and prevention of dysbiosis and infectious diseases of the intestines in children and adults.
Дисбиотические нарушения в микрофлоре желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) в последние годы имеют все большее распространение среди населения во всем мире и в России в частности. Дисбактериоз провоцируется экологическими, психоэмоциональными, техногенными и др. факторами; возникает вследствие лекарственной терапии, в частности, антибиотикотерапии; а также поражает новорожденных и детей раннего возраста. Возникнув, это заболевание может явиться пусковым механизмом для расстройства обменных процессов, развития аллергических реакций и возникновения различных соматических нарушений здоровья [Бондаренко В.М., Грачева Н.М., Мацулевич Т.В. Дисбактериозы кишечника у взрослых // Москва: КМК Scientific Press, 2003, 220 с.]. Одним из приемов коррекции микробной экологии человека и животных, нашедшим наибольшую практическую реализацию сегодня, является применение пробиотиков - живых микроорганизмов, которые при употреблении в адекватных количествах могут оказывать благотворное действие на здоровье пациентов [Бондаренко В.М., Грачева Н.М. Препараты пробиотики, пребиотики и синбиотики в терапии и профилактике кишечных дисбактериозов // Фарматека. 2003. №7. С.56-63]. Лечебно-профилактическая эффективность пробиотиков во многом зависит от полезных свойств входящих в их состав микроорганизмов, а также от их жизнеспособности в составе препаратов и после прохождения верхних отделов ЖКТ человека.Dysbiotic disorders in the microflora of the gastrointestinal tract (GIT) in recent years are becoming more widespread among the population throughout the world and in Russia in particular. Dysbacteriosis is provoked by environmental, psychoemotional, technogenic and other factors; arises as a result of drug therapy, in particular antibiotic therapy; and also affects infants and young children. Having arisen, this disease can be a trigger for metabolic disorders, the development of allergic reactions and the occurrence of various somatic health disorders [Bondarenko V. M., Gracheva N. M., Matsulevich T. V. Intestinal dysbacteriosis in adults // Moscow: KMK Scientific Press, 2003, 220 S.]. One of the methods of correction of the microbial ecology of humans and animals, which has found the greatest practical implementation today, is the use of probiotics - living microorganisms, which, when used in adequate amounts, can have a beneficial effect on the health of patients [Bondarenko VM, Gracheva NM Probiotics, prebiotics and synbiotics in the treatment and prevention of intestinal dysbiosis // Farmateka. 2003. No7. S.56-63]. The therapeutic and prophylactic effectiveness of probiotics largely depends on the beneficial properties of the microorganisms included in their composition, as well as on their viability in the composition of drugs and after passing through the upper gastrointestinal tract of a person.
Для создания пробиотиков широко используются микроорганизмы естественной микрофлоры кишечника здорового человека: бифидобактерии (род Bifidobacterium) и лактобациллы (род Lactobacillus). При этом более предпочтительными являются многовидовые по составу пробиотики, поскольку в них суммированы полезные свойства, присущие отдельным штаммам. Кроме того, такие пробиотики способствуют избирательному заселению кишечника культурой того вида, который наиболее адекватен микробиоценозу конкретного индивидуума, следовательно, в них снижен риск несовместимости бактерий препарата с реципиентом.To create probiotics, microorganisms of the natural intestinal microflora of a healthy person are widely used: bifidobacteria (genus Bifidobacterium) and lactobacilli (genus Lactobacillus). At the same time, probiotics with a multidimensional composition are more preferable, since they summarize the beneficial properties inherent in individual strains. In addition, such probiotics contribute to the selective colonization of the intestine with a culture of the species that is most appropriate for the microbiocenosis of a particular individual, therefore, they reduce the risk of drug incompatibility with the recipient.
Например, известны средства для коррекции микрофлоры человека, созданные на основе консорциумов бифидобактерий и лактобацилл (штаммы В.bifidum, В.longum, В.adolescentis, L.acidophilus, L.plantarum) [Алешкин В.А., Амерханова A.M. «Консорциум бифидобактерий и лактобацилл, используемый для приготовления бактериальных препаратов, заквасок для кисломолочных продуктов, ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, биологически активных добавок, предназначенных для коррекции микрофлоры человека в возрасте от 12 лет и старше» // Патент РФ №2180914 (2001); МКП C12N 1/20, А61К 35/74, А23С 9/12]. Собственно пробиотическое средство представляет собой консорциум пробиотических микроорганизмов, лиофильно высушенный для получения бактерийного препарата или используемый в качестве закваски для приготовления кисломолочного продукта, жидкой биологически активной добавки к пище или ферментированного напитка (кваса). Недостатком указанного пробиотического средства является его невысокая биологическая активность, связанная с инактивацией микроорганизмов при пероральном приеме и прохождении их суспензий через верхние отделы ЖКТ (желудок, двенадцатиперстная кишка), а также невысокая стабильность его биологических свойств при получении соответствующих препаратов и при длительном хранении, что ведет к снижению эффективности лечебно-профилактических процедур.For example, there are known means for correcting human microflora, created on the basis of consortia of bifidobacteria and lactobacilli (B. bifidum, B. longum, B. adolescentis, L. acidophilus, L. plantarum strains) [Aleshkin V.A., Amerkhanova A.M. “A consortium of bifidobacteria and lactobacilli used for the preparation of bacterial preparations, starter cultures for fermented milk products, fermented and non-fermented food products, biologically active additives intended for the correction of human microflora aged 12 years and older” // RF Patent No. 2180914 (2001); MKP C12N 1/20, A61K 35/74,
Более устойчивыми к агрессивному воздействию среды верхних отделов ЖКТ являются препараты пробиотиков, где культуры лактобацилл и бифидобактерий помещены в кислотоустойчивую кишечнорастворимую капсулу, например, пробиотический препарат «Линекс» [Toma M.M., Pokrotnieks J. Probiotics as functional food: microbiological and medical aspects // Acta Universitatis Latviensis. 2006, V.710. Biology. P.117-129]. Этот препарат содержит порядка 1.2×107 клеток на капсулу, но в реальности еще ниже, т.к. часть бактерий погибает при вакуумном блистеровании. К недостаткам данного препарата также относится невысокое содержание полезных микроорганизмов и низкое видовое разнообразие входящих в его состав пробиотических бактерий (три вида: Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium mfantis, Enterococcus faeciuni). Лактоза, также присутствующая в капсулах препарата, может спровоцировать проявление симптомов непереносимости лактозы у лиц с лактазной недостаточностью.More resistant to the aggressive environment of the upper gastrointestinal tract are probiotic preparations, where cultures of lactobacilli and bifidobacteria are placed in an acid-resistant enteric-soluble capsule, for example, the probiotic preparation Linex [Toma MM, Pokrotnieks J. Probiotics as functional food: microbiological and medical aspects // Acta Universitatis Latviensis. 2006, V.710. Biology. P.117-129]. This preparation contains about 1.2 × 10 7 cells per capsule, but in reality it is even lower, because some bacteria die during vacuum blistering. The disadvantages of this drug also include the low content of beneficial microorganisms and the low species diversity of its probiotic bacteria (three species: Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium mfantis, Enterococcus faeciuni). Lactose, also present in the capsules of the drug, can provoke the manifestation of symptoms of lactose intolerance in people with lactase deficiency.
Чтобы повысить стабильность пробиотиков в процессе хранения и во время нахождения в организме реципиента, наряду с компонентами среды культивирования, в соответствующие препараты часто добавляют олиго- и полисахариды, в основном, в качестве наполнителя. Так, известен пробиотический препарат «Стрептобифид» [Панин А.Н., Малик Е.В., Малик Н.И., Вершинина И.Ю. «Пробиотический препарат «Стрептобифид» для животных» // Пат. РФ №2086248 (2006) А61К 35/74, C12N 1/20, C12N 1/20, C12R 1/46], содержащий сухую бакмассу штаммов Bifidobacterium globosum ВГНКИ N БФ-4-ДЕП и Streptococcus faecium ВГНКИ N 27-/ПВ-ДЕП, а также окись алюминия, гидроокись алюминия, наполнитель, взятый в определенном количественном соотношении, и углеводы (сахарозу или лактозу). В качестве наполнителей используют муку, крахмал, сухую сыворотку молока, сухое молоко и заменитель цельного молока. Основным недостатком этого известного технического решения является слабая защита пробиотических лакто- и бифи-добактерий от инактивирующего действия желудочного сока и пищеварительных ферментов, поскольку указанные выше добавки и наполнители не предотвращают прямой контакт пробиотических микроорганизмов с такими инактиваторами при пероральном введении препарата в организм. Опасность присутствия лактозы в составе подобного пробиотического препарата в отношении лиц с лактазной недостаточностью уже отмечалась выше.In order to increase the stability of probiotics during storage and while the recipient is in the body, along with the components of the culture medium, oligo- and polysaccharides are often added to the corresponding preparations, mainly as a filler. So, the probiotic preparation Streptobifid is known [Panin A.N., Malik E.V., Malik N.I., Vershinina I.Yu. "The probiotic preparation" Streptobifid "for animals" // Pat. RF №2086248 (2006) А61К 35/74,
Наиболее близким к заявляемому техническим решением по составу является пробиотический препарат [Mulhbacher J., Mateescu M.A., Calinescu С.«Composition comprising polymeric material and uses thereof» // WO 2005074976 (2005); A61K 38/46], выбранный нами в качестве прототипа, представляющий собой композицию на основе пробиотических микроорганизмов и модифицированного кислотными группировками несшитого высокоамилозного (70 и более % амилозы) крахмала, в которой модифицированный крахмал, выбранный из группы карбоксилированный крахмал, сульфированный крахмал, фосфорилированный крахмал, служит носителем для доставки пробиотиков до мест их функциональной активности в организме человека - тонкой и толстой кишки, а в качестве микроорганизмов используются бактериальные культуры, относящиеся к родам Escherichia и Lactobacillus, причем для перорального применения заявлено использование композиции либо в форме капсул, либо таблеток, либо шариков, либо микросфер. Метод получения препарата-прототипа включает смешивание лиофилизованных клеток микроорганизмов с остальными компонентами композиции в определенном соотношении с последующим дозированием в пероральные формы, но конкретные примеры описывают только таблетирование прессованием.The closest to the claimed technical solution in composition is a probiotic preparation [Mulhbacher J., Mateescu M.A., Calinescu C. “Composition composite polymeric material and uses thereof” // WO 2005074976 (2005); A61K 38/46], which we selected as a prototype, which is a composition based on probiotic microorganisms and modified with acidic groups, uncrosslinked high amylose (70% and more amylose) starch, in which modified starch, selected from the group of carboxylated starch, sulfonated starch, phosphorylated starch serves as a carrier for the delivery of probiotics to the places of their functional activity in the human body - the small and large intestines, and bacterial bacteria are used as microorganisms e cultures belonging to the genera Escherichia and Lactobacillus, and for oral use, the use of the composition is claimed either in the form of capsules, or tablets, or spheres, or microspheres. The method of obtaining the prototype preparation involves mixing lyophilized cells of microorganisms with the other components of the composition in a certain ratio, followed by dosing into oral forms, but specific examples are described only by compression molding.
Недостатками прототипа являются:The disadvantages of the prototype are:
1. Высокий риск несовместимости с реципиентом из-за скудного видового состава пробиотической составляющей композиции - она представлена двумя видами: Lactobacillus rhamnosus и Escherichia coli.1. High risk of incompatibility with the recipient due to the poor species composition of the probiotic component of the composition — it is represented by two species: Lactobacillus rhamnosus and Escherichia coli.
2. Использованные в препарате штаммы L.rhamnosus и Е.coli не идентифицированы, тогда как для создания пробиотиков следует использовать полностью охарактеризованные (прежде всего с точки зрения безопасности) штаммы микроорганизмов или их консорциумы. В частности известно, что среди Е.coli широко представлены вирулентные штаммы, вызывающие желудочно-кишечные инфекции, воспаления мочеполовой системы, а также менингит у новорожденных [Kaper J.B., Nataro J.P., Mobley H.L. Pathogenic Escherichia coli. Nature Reviews Microbiology. 2004. V.2. N.2. P.123-140].2. The strains of L. rhamnosus and E. coli used in the preparation were not identified, while strains of microorganisms or their consortia that are fully characterized (primarily from a safety point of view) should be used to create probiotics. In particular, it is known that among E. coli virulent strains causing gastrointestinal infections, inflammation of the urogenital system, and also meningitis in newborns are widely represented [Kaper J.B., Nataro J.P., Mobley H.L. Pathogenic Escherichia coli. Nature Reviews Microbiology. 2004. V.2. N.2. P.123-140].
3. Входящие в состав препарата-прототипа бактериальные культуры L.rhamnosus и Е.coli уступают по своей пробиотической активности многим известным культурам лак-тобацилл, бифидобактерий и энтерококков [Tannock G.W. (ed.) Probiotics: a critical review. Wymondham, UK: Horizon Scientific Press. 1999. 161 р.].3. The bacterial cultures of L. rhamnosus and E. coli included in the composition of the prototype preparation are inferior in their probiotic activity to many known cultures of lactobacilli, bifidobacteria and enterococci [Tannock G.W. (ed.) Probiotics: a critical review. Wymondham, UK: Horizon Scientific Press. 1999. 161 p.].
4. Созданные на основе бактерий L.rhamnosus и Е.coli пробиотики отличает ограниченность спектра действия, так как они направлены против относительно узкой группы возбудителей заболеваний.4. Probiotics based on bacteria L. rhamnosus and E. coli are characterized by a limited spectrum of action, since they are directed against a relatively narrow group of pathogens.
5. Входящие в состав препарата-прототипа бактериальная культура Е.coli не имеет фермента NO-синтазы, продуцирующего важнейший метаболит - монооксид азота (NO), оказывающий регулирующее влияние на клетки и органы живых организмов [Ванин А.Ф. Динитрозильные комплексы железа и S-нитрозотиолы - две возможные формы стабилизации и транспорта монооксида азота в биосистемах // Биохимия, 1998, Т.63, №7, С.782-793], поэтому в случае приема препарата-прототипа при дисбактериозах организм пациентов не дополучает это вещество в необходимых количествах.5. The bacterial culture of E. coli, which is part of the prototype preparation, does not have an NO synthase enzyme producing the most important metabolite — nitrogen monoxide (NO), which has a regulatory effect on cells and organs of living organisms [Vanin A.F. Dinitrosyl iron complexes and S-nitrosothiols are two possible forms of stabilization and transport of nitrogen monoxide in biosystems // Biochemistry, 1998, T.63, No. 7, S.782-793], therefore, in the case of taking the prototype drug for dysbacteriosis, the patient’s body does not get this substance in the required quantities.
6. Используемые в прототипе модифицированные кислотными группировками крах-малы, хотя и способны выполнять функцию частичной защиты пробиотических микроорганизмов от инактивации в верхних отделах ЖКТ, во-первых, сами по себе дороги, поскольку синтезируются их природного крахмала его обработкой соответствующими реагентами с последующими очисткой и выделением конечного продукта; во-вторых, эта очистка должна гарантировать отсутствие в модифицированном крахмале примесей токсичных веществ, например, таких как монохлоруксусная, 1-хлорпропионовая, 2-хлорпропионовая и хлормасляная кислоты, хлористый тионил, хлорокись фосфора и др., используемых для карбоксилирования, сульфирования или фосфорилирования крахмалов, т.е. при реализации прототипа не исключаются примеси ядовитых компонентов; в третьих, собственно модифицированные кислотными группировками крахмалы при их расщеплении под действием амилолитических ферментов в нижних отделах ЖКТ распадаются на кислотные фрагменты, способные (особенно сульфо- и фосфо-производные) сдвигать значение рН среды в кислую область, тем самым создавая опасность эрозии слизистой кишечника, что наиболее опасно для пациентов с патологиями пищеварительной системы.6. The acid-modified modified moieties used in the prototype are small-scaled starch, although they are able to fulfill the function of partial protection of probiotic microorganisms from inactivation in the upper gastrointestinal tract, firstly, they are expensive in themselves, since their natural starch is synthesized by treatment with appropriate reagents, followed by purification and isolation of the final product; secondly, this purification should ensure that there are no impurities of toxic substances in the modified starch, for example, monochloroacetic, 1-chloropropionic, 2-chloropropionic and chlorobutyric acids, thionyl chloride, phosphorus oxychloride, etc., used for carboxylation, sulfonation or phosphorylation of starches , i.e. when implementing the prototype, impurities of toxic components are not excluded; thirdly, starches that are actually modified by acidic groups when they are cleaved by amylolytic enzymes in the lower gastrointestinal tract decompose into acidic fragments that are capable (especially sulfo and phospho derivatives) of shifting the pH of the medium into the acidic region, thereby creating a risk of intestinal mucosal erosion, which is most dangerous for patients with pathologies of the digestive system.
7. Способ получения препарата-прототипа также имеет ряд недостатков, в частности, при таблетировании лиофильно сухих бактерий совместно с модифицированным кислотными группировками крахмалом используется высокое давление (до 3 тонн на см2), что обычно приводит к существенной потере жизнеспособности микроорганизмов, вызываемой как разрушающим действием самого высокого давления на клеточные мембраны, так и локальным разогревом смеси под действием компрессионных и сдвиговых усилий в объеме под плунжером таблетирующего механизма.7. The method for producing the prototype preparation also has a number of disadvantages, in particular, when tabletting lyophilically dried bacteria together with modified acid groups, starch uses high pressure (up to 3 tons per cm 2 ), which usually leads to a significant loss in the viability of microorganisms, caused as destructive by the action of the highest pressure on cell membranes, and by local heating of the mixture under the action of compression and shear forces in the volume under the plunger of the tabletting mechanism.
8. Согласно примерам прототипа, получаемые таким методом таблетки набухают без разрушения (в противовес таблеткам на основе нативного крахмала) в условиях верхних отделов ЖКТ, а солюбилизируются уже в условиях кишечника, где и происходит высвобождение клеток. Однако такое набухание в кислых средах делает возможным диффузию кислоты в таблетки и ее инактивирующее воздействие на пробиотические микроорганизмы. Иными словами, известное техническое решение лишь частично защищает клетки от неблагоприятных факторов верхних отделов пищеварительной системы пациентов.8. According to the examples of the prototype, the tablets obtained by this method swell without destruction (as opposed to tablets based on native starch) in the upper gastrointestinal tract, and are solubilized already in the intestine, where the cells are released. However, such swelling in acidic media makes possible the diffusion of acid into tablets and its inactivating effect on probiotic microorganisms. In other words, the known technical solution only partially protects cells from adverse factors in the upper digestive system of patients.
Задачей предлагаемого изобретения является создание более эффективного и стабильного по сравнению с аналогами и прототипом препарата-пробиотика для профилактики и лечения дисбактериозов кишечника и кишечных инфекций, а также повышение способности препарата к продуцированию монооксида азота по NO-синтазному механизму.The objective of the invention is to create a more effective and stable compared with analogues and prototype drug probiotic for the prevention and treatment of intestinal dysbacteriosis and intestinal infections, as well as increasing the ability of the drug to produce nitric monoxide by the NO synthase mechanism.
Указанная задача решается тем, что в заявляемом техническом решении комплексный противобиотический препарат представляет собой клетки пробиотических лакто- или бифидобактерий, или их смеси, и полимерную добавку, помещенные в кишечнорастворимую капсулу; при этом клетки пробиотических лакто- и бифидобактерий принадлежат к видам Lactobacillus plantarum, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus acidophilus, Lactoba-cillus casei, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium longum, а полимерная добавка, выполняющая функцию связующего и являющаяся полисахаридом, выбрана из группы: амило-пектин, крахмал восковидной кукурузы, нативный картофельный крахмал, растворимый картофельный крахмал, пшеничный крахмал, мальтодекстрин, их смеси, причем указанные компоненты входят в состав комплексного препарата в соотношении, равном 108-1012 клеток пробиотических лакто- и бифидобактерий на 0,01-1 г полимерной добавки. Способ получения заявляемого комплексного пробиотического препарата заключается в том, что клетки пробиотических лакто- или бифидобактерий, или их смеси суспендируют в водном растворе полимерной добавки, затем приготовленную суспензию замораживают при температуре от -10 до -196°С в течение 0,1-6 ч и высушивают лиофильно, после чего полученную сухую субстанцию помещают в кишечнорастворимую капсулу.This problem is solved in that in the claimed technical solution, the complex antibiotic preparation is a cell of probiotic lactobacilli or bifidobacteria, or mixtures thereof, and a polymer additive placed in an enteric capsule; in this case, the cells of probiotic lactobacilli and bifidobacteria belong to the species Lactobacillus plantarum, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium longum, and a polymeric additive that performs the function of waxy corn starch, native potato starch, soluble potato starch, wheat starch, maltodextrin, mixtures thereof, these components are included in the complex preparation in a ratio of 10 8 -10 12 cells of probiotic lacto and bifi additional bacteria per 0.01-1 g of polymer additives. A method of obtaining the inventive complex probiotic preparation is that the cells of probiotic lactobacilli or bifidobacteria, or mixtures thereof, are suspended in an aqueous solution of a polymer additive, then the prepared suspension is frozen at a temperature of from -10 to -196 ° C for 0.1-6 hours and freeze-dried, after which the resulting dry substance is placed in an enteric capsule.
Выбор параметров предлагаемого технического решения обусловлен следующими моментами:The choice of parameters of the proposed technical solution is due to the following points:
1. Клетки пробиотических лакто- или бифидобактерий, или их смеси, входящие в состав препарата, помещены в полимерное связующее полисахаридной природы, что достигается лиофилизацией суспензии микроорганизмов в водного растворе этого связующего, в результате чего каждая клетка оказывается окруженной сухой полимерной оболочкой (Фиг.1), которая, с одной стороны, защищает микроорганизмы от ферментов ЖКТ, а с другой стороны, служит для клеток питательным субстратом после солюбилизации кишечнорастворимой капсулы, являющейся, в свою очередь, защитой пробиотических бактерий от инактивации желудочным соком.1. Cells of probiotic lacto- or bifidobacteria, or mixtures thereof, which are part of the drug, are placed in a polymer binder of a polysaccharide nature, which is achieved by lyophilization of a suspension of microorganisms in an aqueous solution of this binder, as a result of which each cell is surrounded by a dry polymer shell (Figure 1 ), which, on the one hand, protects microorganisms from gastrointestinal enzymes, and on the other hand, serves as a nutrient substrate for cells after solubilization of the enteric capsule, which, in turn, protects total probiotic bacteria from inactivation by gastric juice.
2. Заявляемое в предлагаемом техническом решении соотношение пробиотических лакто- и бифидобактерий к полимерному связующему полисахаридной природы, равное 108-1012 клеток на 0,01-1 г связующего, выбрано на основании экспериментов. В частности, при меньшем, чем 108 количестве микроорганизмов биологическая активность препарата находится на уровне, не обеспечивающем необходимый физиологический эффект, а большее, чем 1012 количество клеток, приводит к существенному удорожанию технологии изготовления препарата, не влияя при этом на его лечебную эффективность. В свою очередь, содержание полимерного связующего в заявляемом препарате обусловлено как природой используемого полисахарида, так и необходимостью формирования защитного слоя вокруг клеток. Опыт показал, что меньше, чем 0,01 г связующего (т.е. минимум заявляемого диапазона) на 1012 клеток (максимум заявляемого диапазона) является недостаточным для формирования эффективно работающего защитного слоя. Если же в состав препарата вводится более 1 г полимерного связующего (максимум заявляемого диапазона) на 108 клеток (минимум заявляемого диапазона), то эффективность препарата снижается из-за недостаточной удельной концентрации в нем пробиотических микроорганизмов.2. The ratio of probiotic lacto- and bifidobacteria to a polymer binder of a polysaccharide nature, equal to 10 8 -10 12 cells per 0.01-1 g of the binder, as claimed in the proposed technical solution, was selected on the basis of experiments. In particular, with a smaller than 10 8 number of microorganisms, the biological activity of the drug is at a level that does not provide the necessary physiological effect, and more than 10 12 the number of cells leads to a significant increase in the cost of manufacturing technology of the drug, without affecting its therapeutic effectiveness. In turn, the content of the polymer binder in the inventive preparation is due to both the nature of the polysaccharide used and the need to form a protective layer around the cells. Experience has shown that less than 0.01 g of a binder (i.e., a minimum of the claimed range) per 10 12 cells (maximum of the claimed range) is insufficient to form an effective working protective layer. If more than 1 g of a polymeric binder (maximum of the claimed range) per 10 8 cells (minimum of the claimed range) is introduced into the composition of the drug, then the effectiveness of the drug decreases due to insufficient specific concentration of probiotic microorganisms in it.
3. Использование в предлагаемом техническом решении пробиотических лакто- и бифидобактерий видов Lactobacillus plantarum, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus aci-dophilus, Lactobacillus casei, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium longum обусловлено тем, что данные микроорганизмы, являясь представителями резидентной нормофлоры, обладают доказанным противоинфекционным действием, а также стимулируют иммуно-логическую реактивность и толерантность организма. Кроме того, бактерии L.plantarum и L.fermentum, благодаря их способности продуцировать монооксид азота [Яруллина Д.Р., Ильинская О.Н., Аганов А.В., Силкин Н.И., Зверев Д.Г. Альтернативные пути образования оксида азота у лактобацилл: обнаружение возможной NO-синтазной активности методом ЭПР // Микробиология. 2006. Т.75. №6. С.731-736; Morita H., Yoshikawa H., Sacata R., Nagata Y., Tanaka H. Synthesis of nitric oxide from the two equivalent guanidine nitrogens of L-arginine by Lactobacillus fermentum II J. Bacteriol. 1997. V.179. N.24. P.7812-7815], могут оказывать положительное влияние на процессы пищеварительной системы, регулируемые NO, а именно: регуляцию сосудистого тонуса, передачу нервных импульсов и моторную функцию ЖКТ.3. The use in the proposed technical solution of probiotic lactobacilli and bifidobacteria of the species Lactobacillus plantarum, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium longum is due to the fact that these microorganisms are normal, also stimulate the immune-logical reactivity and tolerance of the body. In addition, the bacteria L.plantarum and L.fermentum, due to their ability to produce nitrogen monoxide [Yarullina DR, Ilyinskaya ON, Aganov AV, Silkin NI, Zverev D.G. Alternative ways of formation of nitric oxide in lactobacilli: detection of possible NO-synthase activity by EPR method // Microbiology. 2006.V. 75. No. 6. S.731-736; Morita H., Yoshikawa H., Sacata R., Nagata Y., Tanaka H. Synthesis of nitric oxide from the two equivalent guanidine nitrogens of L-arginine by Lactobacillus fermentum II J. Bacteriol. 1997. V.179. N.24. P.7812-7815], can have a positive effect on the digestive system processes regulated by NO, namely: regulation of vascular tone, transmission of nerve impulses and motor function of the gastrointestinal tract.
4. Выбор в качестве полимерной добавки, выполняющей функцию связующего, таких веществ полисахаридной природы, как амилопектин, крахмал восковидной кукурузы, картофельный крахмал, растворимый картофельный крахмал, пшеничный крахмал, маль-тодекстрин, и их смеси, обусловлен, во-первых, их биосовместимостью и нетоксичностью, во-вторых, невысокой стоимостью и доступностью, в-третьих, простотой приготовления растворов для диспергирования микроорганизмов при получении целевого продукта изобретения - нового пробиотического препарата. Кроме того, что уже отмечалось выше, перечисленные полисахариды служат питательным субстратом для включаемых в матрицу полимерного связующего клеток, что обеспечивает их высокую жизнеспособность и, как следствие, хорошую NO-синтазную активность.4. The choice of a polysaccharide substance such as amylopectin, waxy maize starch, potato starch, soluble potato starch, wheat starch, maltodextrin, and mixtures thereof, as a polymer additive serving as a binder, is, first of all, due to their biocompatibility and non-toxic, secondly, low cost and availability, and thirdly, the simplicity of the preparation of solutions for dispersing microorganisms upon receipt of the target product of the invention is a new probiotic preparation. In addition, as noted above, the polysaccharides listed serve as a nutrient substrate for the polymer binder cells included in the matrix, which ensures their high viability and, as a result, good NO-synthase activity.
5. Параметры способа получения заявляемого пробиотического препарата также найдены экспериментально. В частности, при температуре выше -10°С суспензии клеток в водном растворе заявляемого полимерного связующего часто из-за эффектов переохлаждения просто не замерзают, что не дает возможности высушить затем систему лиофильно, а использование температур замораживания ниже -196°С нецелесообразно по экономическим соображениям из-за высокой стоимости сверхглубокого холода. Время замораживания определяется сочетанием объема замораживаемой системы и температурным режимом процесса. Использование кишечнорастворимой капсулы, устойчивой в кислой среде желудка, связано с необходимостью дополнительной защиты пробиотических бактерий от инактивации в этом отделе ЖКТ организмов пациентов.5. The parameters of the method of obtaining the inventive probiotic preparation are also found experimentally. In particular, at temperatures above -10 ° C, cell suspensions in an aqueous solution of the inventive polymer binder often simply do not freeze due to supercooling effects, which makes it impossible to freeze the system then, and using freezing temperatures below -196 ° C is not practical for economic reasons due to the high cost of super deep cold. The freezing time is determined by the combination of the volume of the frozen system and the temperature regime of the process. The use of an enteric-soluble capsule, stable in the acidic environment of the stomach, is associated with the need for additional protection of probiotic bacteria from inactivation in this section of the gastrointestinal tract of patient organisms.
Заявляемый комплексный пробиотический препарат, его качественный и количественный состав, а также совокупность операций при его получении, не известны из уровня техники, поэтому заявляемое техническое решение отвечает критерию новизны, поскольку оказалось, что именно сочетание заявляемых признаков, а именно, высокое содержание обладающих доказанной пробиотической активностью бифидобактерий и NO-продуцирующих лактобацилл и их включение в матрицу полимерного связующего полисахаридной природы, позволяет не только повысить стабильность биологического действующего начала (т.е. пробиотических микроорганизмов), но и существенно усилить способность пробиотического препарата к продуцированию монооксида азота по NO-синтазному механизму, что не свойственно ни для аналогов, ни для прототипа.The inventive complex probiotic preparation, its qualitative and quantitative composition, as well as the totality of operations upon receipt thereof, are not known from the prior art, therefore, the claimed technical solution meets the criterion of novelty, since it turned out that it is a combination of the claimed features, namely, a high content of proven probiotic the activity of bifidobacteria and NO-producing lactobacilli and their inclusion in the matrix of a polymer binder polysaccharide nature, allows not only to increase stability biologically active principle (i.e., probiotic microorganisms), but also significantly enhance the ability of a probiotic preparation to produce nitrogen monoxide by the NO synthase mechanism, which is not characteristic of either analogues or prototype.
Сущность предлагаемого технического решения иллюстрируется типичным примером, поясняющим изобретение, но не ограничивающего его объем; остальные примеры, отвечающие диапазонам заявляемых параметров, суммированы в таблице, а достигаемый в этих случаях положительный эффект (уровень сохранения жизнеспособности свободных клеток пробиотических микроорганизмов и тех же культур в составе заявляемого препарата in vitro и in vivo) суммирован в виде диаграмм на Фиг.5.The essence of the proposed technical solution is illustrated by a typical example illustrating the invention, but not limiting its scope; other examples corresponding to the ranges of the claimed parameters are summarized in the table, and the positive effect achieved in these cases (the level of preservation of viability of free cells of probiotic microorganisms and the same cultures as part of the claimed preparation in vitro and in vivo) is summarized in the form of diagrams in Figure 5.
Приводимые ниже графики, диаграммы и микрофотографии содержат следующую информацию:The graphs, charts, and microphotographs below contain the following information:
Фиг.1. Микрофотографии (сканирующая электронная микроскопия) клеток Lacto-bacillus plantarum 8P-A3, смешанных с водным раствором мальтодекстрина и лиофильно высушенных в нем (а) и помещенных в изотонический раствор NaCl (б). Изображения получены с помощью сканирующего электронного микроскопа Carl Zeiss Evo-40 при увеличении 20000-25000 раз.Figure 1. Micrographs (scanning electron microscopy) of Lacto-bacillus plantarum 8P-A3 cells mixed with an aqueous solution of maltodextrin and freeze-dried in it (a) and placed in an isotonic NaCl solution (b). Images were obtained with a Carl Zeiss Evo-40 scanning electron microscope at a magnification of 20,000-25,000 times.
Фиг.2. Содержание микроорганизмов (а), в том числе лактобацилл (б) и бактерий семейства Enterobacteriaceae (в), в фекалиях кроликов во время (1-5 день) и после (9-18 день) приема пробиотического препарата по примеру №1 в таблице примеров. Микрофлора фекалий контрольных кроликов, не получавших препарат, показана светлыми столбцами на рис.а, б и на рис.г. На рис.в, г: темные столбцы - кислотообразующие бактерии, заштрихованные - бактерии, не ферментирующие лактозу и (или) сахарозу.Figure 2. The content of microorganisms (a), including lactobacilli (b) and bacteria of the Enterobacteriaceae family (c), in rabbit feces during (1-5 day) and after (9-18 day) administration of the probiotic preparation according to example No. 1 in the table of examples . The microflora of feces of control rabbits who did not receive the drug is shown by light columns in Fig. A, b and in fig. In Fig. C, d: the dark columns are acid-forming bacteria, the shaded ones are bacteria that do not ferment lactose and (or) sucrose.
Фиг.3. Жизнеспособность бактерий Lactobacillus plantarum 8P-A3, включенных в полисахаридное связующее на основе растворимого картофельного крахмала в соотношении 1011 клеток на 2,5 г связующего - №1 в таблице примеров (а); на основе мальтодекстрина при соотношении 1011 клеток на 5 г связующего - №2 в таблице примеров (б) и свободных клеток (в). Жизнеспособность бактерий определяли с помощью окрашивания LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kit.Figure 3. The viability of bacteria Lactobacillus plantarum 8P-A3, included in the polysaccharide binder based on soluble potato starch in the ratio of 10 11 cells per 2.5 g of binder - No. 1 in the table of examples (a); based on maltodextrin at a ratio of 10 11 cells per 5 g of binder - No. 2 in the table of examples (b) and free cells (c). Bacterial viability was determined using the LIVE / DEAD BacLight Bacterial Viability Kit.
Фиг.4. Биосинтез монооксида азота в клетках Lactobacillus plantarum 8P-A3 в составе пробиотических препаратов по примерам №1 и №2 (таблица примеров), а также в свободных клетках (Контроль). NO определяли флуоресцентным методом с помощью DAF-FM DA (а, б) и DAA (в, г).Figure 4. The biosynthesis of nitric oxide in Lactobacillus plantarum 8P-A3 cells as part of probiotic preparations according to examples No. 1 and No. 2 (table of examples), as well as in free cells (Control). NO was determined by fluorescence using DAF-FM DA (a, b) and DAA (c, d).
Фиг.5. Содержание жизнеспособных клеток в одной капсуле пробиотического препарата после in vitro воздействия физиологической концентрации желчных солей 0,5% (а) и значений рН 3,0 в желудке (б) для №№1-24 таблицы примеров (серые столбцы) и для свободных клеток (черные столбцы). Жизнеспособность бактерий определяли с помощью окрашивания LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kit.Figure 5. The content of viable cells in one capsule of a probiotic preparation after in vitro exposure to a physiological concentration of bile salts of 0.5% (a) and pH values of 3.0 in the stomach (b) for No. 1-24 of the table of examples (gray columns) and for free cells (black columns). Bacterial viability was determined using the LIVE / DEAD BacLight Bacterial Viability Kit.
Пример 1. Пробиотический препарат на основе бактерий Lactobacillus plantarum 8Р-А3 и растворимого картофельного крахмалаExample 1. Probiotic preparation based on bacteria Lactobacillus plantarum 8P-A3 and soluble potato starch
а) Бактериальный компонент препарата.a) The bacterial component of the drug.
Бактерии Lactobacillus plantarum 8P-A3 выращивают 24 ч при 37°С на среде DeMan-Rogosa-Sharpe (MRS) производства Merck (Германия) с добавлением 100 мкМ L-аргинина, трижды отмывают от среды центрифугированием с изотоническим раствором NaCl и ресуспендируют в нем до плотности 1010 кл./мл.The bacteria Lactobacillus plantarum 8P-A3 was grown 24 hours at 37 ° C on DeMan-Rogosa-Sharpe (MRS) medium manufactured by Merck (Germany) with the addition of 100 μM L-arginine, washed three times from the medium by centrifugation with isotonic NaCl solution and resuspended in it until
б) Полисахаридный компонент препарата.b) The polysaccharide component of the drug.
Растворимый картофельный крахмал производства НИИ Крахмалопродуктов (Москва) в количестве 2,5 г суспендируют в 90 мл воды и нагревают на водяной бане при перемешивании до получения однородного раствора, который затем охлаждают до комнатной температуры.Soluble potato starch produced by the Research Institute of Starch Products (Moscow) in the amount of 2.5 g is suspended in 90 ml of water and heated in a water bath with stirring until a homogeneous solution is obtained, which is then cooled to room temperature.
в) Получение сухой субстанции.c) Obtaining a dry substance.
Суспензию клеток лактобактерий L.plantarum смешивают с раствором полисахаридного компонента при объемном соотношении 1:9, полученную смесь разливают в плоские поддоны, замораживают при -18°С в течение 6 ч и высушивают лиофильно.A suspension of L. plantarum lactobacilli cells is mixed with a solution of the polysaccharide component at a volume ratio of 1: 9, the resulting mixture is poured into flat trays, frozen at -18 ° C for 6 hours and freeze-dried.
г) Приготовление конечного пробиотического препарата.g) Preparation of the final probiotic preparation.
Сухую субстанцию, содержащую клетки и полимерное связующее в соотношении 109 клеток на 0,25 г полисахарида, порциями по 0,04 г фасуют в кишечнорастворимые капсулы, которые укупоривают и хранят при 4-6°С.A dry substance containing cells and a polymeric binder in a ratio of 10 9 cells per 0.25 g of polysaccharide is packed in 0.04 g portions into enteric capsules, which are sealed and stored at 4-6 ° С.
д) Биологическое тестирование.e) Biological testing.
В ходе биологического тестирования проводят оценку влияния полученного пробиотического препарата на микрофлору ЖКТ кроликов путем анализа эффектов приема препарата в отношении количественного и качественного состава микрофлоры фекалий подопытных животных во время (5 дней) и по окончании приема препарата (через 9, 12, 15 и 18 дней после начала приема). В экспериментах используют кроликов возрастом 1 месяц. Животных содержат в идентичных условиях. Животным опытной группы препарат вводят один раз в день в течение 5 дней перорально в дозах, эквивалентных при пересчете по поверхности тела терапевтической дозе для человека, а именно 2×109 клеток L.plantarum на животное. Кролики контрольной группы получают плацебо. Болюсы кроликов собирают и хранят при -18°С не более 24 ч. Для анализа взвешенные образцы болюсов (0.5 г) гомогенизируют в стерильной водопроводной воде и готовят серию последовательных разведении в ней же. Из соответствующего разведения делают высевы на чашках Петри с агаризованными питательными средами: MRS (для лактобацилл), средой Левина (для выделения, подсчета и дифференциации микроорганизмов семейства Enterobacteriaceae) и средой для определения общего микробного числа следующего состава: питательный бульон - 15 г/л; глюкоза - 5 г/л; пептон - 10 г/л; дрожжевой экстракт - 5 г/л; агар - 20 г/л. Чашки Петри инкубируют при 37°С в течение 48 ч, после чего их анализируют присутствие колоний, их число и внешний вид.In the course of biological testing, the effect of the obtained probiotic preparation on the microflora of the gastrointestinal tract of rabbits is assessed by analyzing the effects of taking the drug in relation to the quantitative and qualitative composition of the feces microflora in experimental animals during (5 days) and after taking the drug (after 9, 12, 15 and 18 days after the start of reception). In experiments,
По данным анализа микробной обсемененности фекалий кроликов, прием препарата оказывает положительный эффект на микрофлору ЖКТ (Фиг.2). Во время приема препарата и в течение двух недель после окончания курса лечения в фекалиях кроликов содержание лактобацилл составляет 3-6×106 кл./г (Фиг.2б). Поскольку обнаружение перорально принятых пробиотических бактерий в образцах фекалий рассматривают как показатель их выживания [Ahrne S., Johansson M.L., Molin G. Intestinal passage of Lactobacillus rhamnosus DSM6594 after oral administration in fermented milk // Netherlands Milkland Dairy Journal. 1995. V.49. P.201-206], регистрируемое высокое содержание лактобацилл свидетельствует о том, что ацидорезистентная капсула и полисахаридное связующее обеспечивают надежную защиту клеток во время хранения и при прохождении верхних отделов ЖКТ, а также способствуют высокой жизнеспособности бактерий препарата в нижних отделах ЖКТ. Тестируемый пробиотический препарат не оказывает существенного влияния на общую обсемененность фекалий (Фиг.2а), однако доказано возрастание в ней доли лактобацилл (Фиг.2б) и сахаролитических энтеробактерий (Фиг.2в, г), что свидетельствует о благотворном эффекте препарата на микрофлору кишечника. При наблюдении за животными в течение и после курса введения препарата не обнаруживается отклонений в их внешнем виде, состоянии шерстного покрова, характере выделений, поведенческих реакциях и в динамике прибавки массы тела у самок и самцов. Также не наблюдаются побочные эффекты и осложнения.According to the analysis of microbial contamination of feces of rabbits, the drug has a positive effect on the microflora of the gastrointestinal tract (Figure 2). During administration of the drug and within two weeks after the end of the course of treatment in the feces of rabbits, the content of lactobacilli is 3-6 × 10 6 cells / g (Fig.2b). Since the detection of orally ingested probiotic bacteria in fecal samples is considered an indicator of their survival [Ahrne S., Johansson ML, Molin G. Intestinal passage of Lactobacillus rhamnosus DSM6594 after oral administration in fermented milk // Netherlands Milkland Dairy Journal. 1995. V. 49. P.201-206], the recorded high content of lactobacilli indicates that the acid-resistant capsule and polysaccharide binder provide reliable protection of cells during storage and during the passage of the upper gastrointestinal tract, and also contribute to the high viability of the drug bacteria in the lower gastrointestinal tract. The tested probiotic preparation does not significantly affect the total dissemination of feces (Fig.2a), however, an increase in the proportion of lactobacilli (Fig.2b) and saccharolytic enterobacteria (Fig.2c, d) is proved, which indicates the beneficial effect of the drug on the intestinal microflora. When observing animals during and after the course of drug administration, no abnormalities were found in their appearance, condition of the coat, the nature of the secretions, behavioral reactions and the dynamics of weight gain in females and males. Side effects and complications are also not observed.
е) Сохранение жизнеспособности микробной составляющей пробиотического препарата при длительном хранении.f) Preservation of the viability of the microbial component of the probiotic preparation during prolonged storage.
Полученный согласно пункту «г» пробиотический препарат хранят в сухом темном месте при 4-6°С. На протяжении 6 месяцев ежемесячно проводят оценку жизнеспособности бактерий препарата методом чашечного подсчета и дифференциального флуоресцентного окрашивания реактивом LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kit (Molecular Probes, Invitrogen).Obtained according to paragraph "g" the probiotic preparation is stored in a dry dark place at 4-6 ° C. For 6 months, the bacterial viability of the drug is assessed monthly by cup counting and differential fluorescence staining with the LIVE / DEAD BacLight Bacterial Viability Kit (Molecular Probes, Invitrogen).
Проведенный анализ показывает, что жизнеспособность лактобацилл в составе пробиотического препарата не изменяется в течение всего времени хранения, причем доля мертвых клеток, проницаемых для йодида пропидия, сохраняется на низком уровне - менее 1% от общего числа бактерий (Фиг.3).The analysis shows that the viability of lactobacilli in the composition of the probiotic preparation does not change during the entire storage time, and the proportion of dead cells permeable to propidium iodide remains at a low level - less than 1% of the total number of bacteria (Figure 3).
ж) Продукция монооксида азота (NO) бактериями пробиотического препаратаg) Production of nitrogen monoxide (NO) by bacteria of a probiotic preparation
Для полученного согласно пункту «г» пробиотического препарата продукцию NO определяют с помощью NO-чувствительных флуоресцентных индикаторов: сульфата 1,2-диаминоантрахипона (DAA) (Molecular Probes, Invitrogen) и диацетильного производного 4-амино-5-метиламино-2',7'-дифторфлуоресцеина (DAF-FM DA) (Molecular Probes, Invitrogen) в концентрациях 10 мкМ и 50 мкг/мл соответственно. Образцы микроскопируют под флуоресцентным микроскопом Leica DM 6000B (Германия); полученные изображения флуоресцентного сигнала анализируют с помощью компьютерной программы Leica FW4000.For the probiotic preparation obtained according to paragraph g), NO production is determined using NO-sensitive fluorescent indicators: 1,2-diaminoantrachipone sulfate (DAA) (Molecular Probes, Invitrogen) and 4-amino-5-methylamino-2 'diacetyl derivative, 7 β-difluorofluorescein (DAF-FM DA) (Molecular Probes, Invitrogen) at concentrations of 10 μM and 50 μg / ml, respectively. Samples are microscopied under a Leica DM 6000B fluorescence microscope (Germany); The obtained images of the fluorescent signal are analyzed using the Leica FW4000 computer program.
Уровень внутриклеточного NO, измеренный с помощью DAF-FM DA (Фиг.4а, б), и общее содержание монооксида азота в пробах, регистрируемое с помощью DAA (Фиг.4в, г), в клетках пробиотического препарата не отличаются, как показывают измерения, от таковых в контрольных интактных лактобациллах (Фиг.4а, в). Следовательно, бактерии заявляемого пробиотического препарата способны продуцировать NO, что может успешно использоваться как дополнительный фактор активности лактобацилл в пробиотикотерапии.The level of intracellular NO, measured using DAF-FM DA (Fig. 4a, b), and the total content of nitric monoxide in the samples recorded using DAA (Fig. 4c, d) in the cells of the probiotic preparation do not differ, as the measurements show, from those in control intact lactobacilli (Fig. 4a, c). Therefore, the bacteria of the claimed probiotic preparation are capable of producing NO, which can be successfully used as an additional factor of the activity of lactobacilli in probiotic therapy.
Таким образом, предлагаемое техническое решение, т.е. новый комплексный пробиотический препарат и способ его получения, имеют следующие преимущества по сравнению с аналогами и прототипом:Thus, the proposed technical solution, i.e. The new complex probiotic preparation and the method for its preparation have the following advantages compared to analogues and prototype:
1. Заявляемый пробиотический препарат превосходит аналоги и прототип по спектру входящих в его состав лакто- и бифидобактерий с доказанной пробиотической активностью, т.е. он содержит пробиотические штаммы лакто- и бифидобактерий, обладающие благотворным действием на организм человека.1. The inventive probiotic preparation is superior to analogues and prototype in the spectrum of its constituent lactobacilli and bifidobacteria with proven probiotic activity, ie it contains probiotic strains of lactobacilli and bifidobacteria with beneficial effects on the human body.
2. Заявляемый препарат имеет более высокий, чем в аналогах и прототипе, титр пробиотических бактерий - 108-1012 клеток в одной дозе (таблица).2. The inventive preparation has a higher than in analogues and prototype, the titer of probiotic bacteria - 10 8 -10 12 cells in a single dose (table).
3. Заявляемый пробиотический препарат является эндогенным донором физиологических концентраций монооксида азота (NO) - универсального регулятора клеточного и тканевого метаболизма. Кроме того, состав питательной среды, на которой выращиваются бактерии, положительно влияет на их пробиотические свойства, а именно, способствует продукции монооксида азота [Яруллина Д.Р., Ильинская О.Н. Детекция NO-синтазной активности лактобацилл методом флуоресцентного окрашивания // Микробиология. 2007. Т.76, №4. С.570-572]. Следовательно, новый пробиотический препарат, наряду с традиционными полезными качествами, демонстрирует свойства высокоэффективного эндогенного донора физиологических концентраций NO.3. The inventive probiotic preparation is an endogenous donor of physiological concentrations of nitrogen monoxide (NO) - a universal regulator of cellular and tissue metabolism. In addition, the composition of the nutrient medium on which bacteria are grown has a positive effect on their probiotic properties, namely, it promotes the production of nitric monoxide [Yarullina DR, Ilyinskaya ON Detection of NO synthase activity of lactobacilli by fluorescence staining // Microbiology. 2007. V.76, No4. S.570-572]. Therefore, the new probiotic preparation, along with traditional useful qualities, demonstrates the properties of a highly effective endogenous donor of physiological concentrations of NO.
4. Микробная биомасса включена в пространственную структуру полимерного связующего полисахаридной природы, что обеспечивает клеткам дополнительную защиту от инактивирующих факторов внешней среды (что видно из диаграмм Фиг.5) и, вместе с тем, само связующее в кишечнике служит питательным субстратом для пробиотических бактерий заявляемого препарата.4. Microbial biomass is included in the spatial structure of the polymer binder of a polysaccharide nature, which provides cells with additional protection against inactivating environmental factors (as can be seen from the diagrams of Figure 5) and, at the same time, the binder itself in the intestine serves as a nutrient substrate for the probiotic bacteria of the claimed preparation .
5. Предлагаемый пробиотический препарат обладает пролонгированным действием на всем протяжении кишечника за счет постепенного высвобождения бактерий из полимерного связующего полисахаридной природы по мере деградации последнего.5. The proposed probiotic preparation has a prolonged action throughout the intestine due to the gradual release of bacteria from the polymer binder of a polysaccharide nature as the latter degrades.
6. Поскольку в качестве полимерного связующего используются различные крахмалы (в частности, крахмал восковидной кукурузы, нативный картофельный крахмал, растворимый картофельный крахмал, пшеничный крахмал, их смеси) или составляющие крахмал полисахариды (например, амилопектин, мальтодекстрин, их смеси), то, в противовес препарату-прототипу, содержащему клетки в смеси с модифицированными кислотными группировками крахмалами, которые при расщеплении под действием амилолитических ферментов распадаются на кислотные фрагменты, способные (особенно сульфо- и фосфопроизводные) сдвигать значение рН среды в кислую область, тем самым создавая опасность эрозии слизистой кишечника, что наиболее опасно для пациентов с патологиями пищеварения, полимерные связующее заявляемого препарата исключает такую опасность полностью, поскольку под действием амилаз крахмалы и его полисахариды распадаются до простых нейтральных сахаров, потребляемых кишечной микрофлорой.6. Since various starches are used as a polymer binder (in particular, waxy corn starch, native potato starch, soluble potato starch, wheat starch, mixtures thereof) or starch polysaccharides (for example, amylopectin, maltodextrin, mixtures thereof), counterbalance to the prototype drug containing cells mixed with modified acidic groups of starches, which, when cleaved by amylolytic enzymes, decompose into acid fragments capable of ( especially sulfo and phospho derivatives) to shift the pH of the medium into the acidic region, thereby creating a risk of erosion of the intestinal mucosa, which is most dangerous for patients with digestive pathologies, the polymer binder of the claimed drug eliminates this danger completely, because under the action of amylases, starches and its polysaccharides break down to simple neutral sugars consumed by intestinal microflora.
7. Кроме того, в полимерном связующем заявляемого технического решения вообще отсутствуют возможные примеси токсичных реагентов, используемых в прототипе для химической модификации крахмалов.7. In addition, in the polymer binder of the proposed technical solution there are generally no possible impurities of toxic reagents used in the prototype for the chemical modification of starches.
8. Способ получения заявляемого пробиотического препарата по сравнению со способом-прототипом является более щадящим по отношению к пробиотическим микроорганизмам, входящим в состав препарата, поскольку, во-первых, предусматривает лиофилизацию суспензии клеток в присутствии защищающего гидроколлойда, роль которого выполняет водный раствор полимерного связующего полисахаридной природы, и, во-вторых, исключает воздействие на клетки высоких давлений.8. The method of obtaining the inventive probiotic preparation in comparison with the prototype method is more gentle with respect to the probiotic microorganisms that are part of the preparation, since, firstly, it involves lyophilization of a cell suspension in the presence of a protective hydrocolloid, the role of which is played by an aqueous solution of a polysaccharide polymer binder nature, and, secondly, eliminates the effect on cells of high pressures.
9. Использование устойчивой к действию желудочного сока кишечнорастворимой капсулы обеспечивает бактериям заявляемого пробиотического препарата сохранение жизнеспособности при прохождении через верхние отделы ЖКТ, тогда как в случае прототипа, несмотря на присутствие в препарате вместе с клетками еще полимерных компонентов, желудочный сок может оказывать инактивирующее воздействие на клетки по мере частичного набухания модифицированного кислотными группировками крахмала.9. The use of a gastrointestinal capsule resistant to the action of gastric juice provides the bacteria of the claimed probiotic preparation with preservation of viability when passing through the upper gastrointestinal tract, while in the case of the prototype, despite the presence of polymeric components in the preparation together with the cells, gastric juice may have an inactivating effect on the cells with partial swelling of acid-modified starch.
Claims (2)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2012129621/15A RU2491079C1 (en) | 2012-07-13 | 2012-07-13 | Composite probiotic preparation and method for preparing it |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2012129621/15A RU2491079C1 (en) | 2012-07-13 | 2012-07-13 | Composite probiotic preparation and method for preparing it |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2491079C1 true RU2491079C1 (en) | 2013-08-27 |
Family
ID=49163738
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2012129621/15A RU2491079C1 (en) | 2012-07-13 | 2012-07-13 | Composite probiotic preparation and method for preparing it |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2491079C1 (en) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2584578C1 (en) * | 2015-02-09 | 2016-05-20 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Бурятская государственная сельскохозяйственная академия им. В.Р. Филиппова" | Method of using composite hemo-preparation by animal |
| CN112273652A (en) * | 2020-10-29 | 2021-01-29 | 鲲鱼健康药业江苏有限公司 | Preparation method of weight-losing probiotic soft capsule |
| CN114073313A (en) * | 2021-11-19 | 2022-02-22 | 北京局气网络技术有限公司 | Compound oligosaccharide active bacterium medlar tablet and preparation method thereof |
| RU2767400C2 (en) * | 2018-07-05 | 2022-03-17 | Общество С Ограниченной Ответственностью "Валента - Интеллект" | Probiotic composition for restoring and maintaining a balanced intestinal microflora in children and infants and a method for production thereof |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005074976A1 (en) * | 2004-02-09 | 2005-08-18 | Transfert Plus Société En Commandite | Composition comprising polymeric material and uses thereof |
| US20070166295A1 (en) * | 2006-01-13 | 2007-07-19 | Vet Solutions L.P. | Anti-Diarrhea Preparations for Small Domestic Animals |
| RU2376023C2 (en) * | 2004-05-28 | 2009-12-20 | Мерк Патент Гмбх | Oral administration form and method of producing said form |
| US20120107395A1 (en) * | 2010-11-01 | 2012-05-03 | Viva Pharmaceutical Inc. | Probiotic Soft Gel Compositions |
-
2012
- 2012-07-13 RU RU2012129621/15A patent/RU2491079C1/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005074976A1 (en) * | 2004-02-09 | 2005-08-18 | Transfert Plus Société En Commandite | Composition comprising polymeric material and uses thereof |
| RU2376023C2 (en) * | 2004-05-28 | 2009-12-20 | Мерк Патент Гмбх | Oral administration form and method of producing said form |
| US20070166295A1 (en) * | 2006-01-13 | 2007-07-19 | Vet Solutions L.P. | Anti-Diarrhea Preparations for Small Domestic Animals |
| US20120107395A1 (en) * | 2010-11-01 | 2012-05-03 | Viva Pharmaceutical Inc. | Probiotic Soft Gel Compositions |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2584578C1 (en) * | 2015-02-09 | 2016-05-20 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Бурятская государственная сельскохозяйственная академия им. В.Р. Филиппова" | Method of using composite hemo-preparation by animal |
| RU2767400C2 (en) * | 2018-07-05 | 2022-03-17 | Общество С Ограниченной Ответственностью "Валента - Интеллект" | Probiotic composition for restoring and maintaining a balanced intestinal microflora in children and infants and a method for production thereof |
| CN112273652A (en) * | 2020-10-29 | 2021-01-29 | 鲲鱼健康药业江苏有限公司 | Preparation method of weight-losing probiotic soft capsule |
| CN114073313A (en) * | 2021-11-19 | 2022-02-22 | 北京局气网络技术有限公司 | Compound oligosaccharide active bacterium medlar tablet and preparation method thereof |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Klayraung et al. | Development of tablets containing probiotics: Effects of formulation and processing parameters on bacterial viability | |
| Li et al. | Preserving viability of Lactobacillus rhamnosus GG in vitro and in vivo by a new encapsulation system | |
| Li et al. | Encapsulation of Lactobacillus plantarum in porous maize starch | |
| JP5392672B2 (en) | Novel lactobacilli strains and uses thereof | |
| ES2561629T3 (en) | Treatment of IBS using both probiotic bacteria and fermented cereals as effectors of treatment | |
| Poulin et al. | β-Lactoglobulin tablets as a suitable vehicle for protection and intestinal delivery of probiotic bacteria | |
| JP2018111711A (en) | Riboflavin, riboflavin phosphate, and physiologically acceptable salt thereof | |
| ES2568955T3 (en) | Metabolically active microorganisms and methods for their production | |
| TWI572354B (en) | Composition for suppressing inflammation | |
| US11103542B2 (en) | Composition and method for maintaining healthy kidney function | |
| Gbassi et al. | In vitro effects of pH, bile salts and enzymes on the release and viability of encapsulated Lactobacillus plantarum strains in a gastrointestinal tract model | |
| Cai et al. | In vitro evaluation by PCA and AHP of potential antidiabetic properties of lactic acid bacteria isolated from traditional fermented food | |
| KR102390806B1 (en) | Use of probiotics in the treatment and/or prevention of atopic dermatitis | |
| TW201408311A (en) | New use of Lactobacillus plantarum CMU995 strain | |
| CN104413334A (en) | Edible composition as well as preparation method and application thereof | |
| Zhao et al. | Lactobacillus plantarum YS2 (yak yogurt Lactobacillus) exhibited an activity to attenuate activated carbon-induced constipation in male Kunming mice | |
| RU2744452C2 (en) | Composition for targeted delivery of biologically active component into large intestine and its application | |
| JP5592640B2 (en) | Antistress agent containing lactic acid bacteria fermented royal jelly, method for producing the same, hypothalamus-pituitary-adrenocortical activity inhibitor, and sympathetic-adrenal medullary activity inhibitor | |
| RU2491079C1 (en) | Composite probiotic preparation and method for preparing it | |
| Kolida et al. | Gastrointestinal microflora: probiotics | |
| Thantsha et al. | Probiotics–what they are, their benefits and challenges | |
| RU2303058C2 (en) | Agent "biobalans-k" for treatment of intestine infections complicated with dysbacteriosis | |
| Metlakunta et al. | Safety evaluation of Bacillus coagulans SNZ 1969 in Wistar rats | |
| ES2963547T3 (en) | IBS treatment with probiotics | |
| US11179426B2 (en) | Composition and method for maintaining healthy kidney function |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20190714 |