RU2707537C9 - Генотерапевтический ДНК-вектор на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, несущий целевой ген, выбранный из группы генов COL1A1, COL1A2, BMP2, BMP7, для повышения уровня экспрессии этих целевых генов, способ его получения и применения, штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17- COL1A1 или Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17- COL1A2 или Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17- BMP2 или Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17- BMP7, несущий генотерапевтический ДНК-вектор, способ его получения, способ производства в промышленных масштабах генотерапевтического ДНК-вектора - Google Patents
Генотерапевтический ДНК-вектор на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, несущий целевой ген, выбранный из группы генов COL1A1, COL1A2, BMP2, BMP7, для повышения уровня экспрессии этих целевых генов, способ его получения и применения, штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17- COL1A1 или Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17- COL1A2 или Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17- BMP2 или Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17- BMP7, несущий генотерапевтический ДНК-вектор, способ его получения, способ производства в промышленных масштабах генотерапевтического ДНК-вектора Download PDFInfo
- Publication number
- RU2707537C9 RU2707537C9 RU2018131708A RU2018131708A RU2707537C9 RU 2707537 C9 RU2707537 C9 RU 2707537C9 RU 2018131708 A RU2018131708 A RU 2018131708A RU 2018131708 A RU2018131708 A RU 2018131708A RU 2707537 C9 RU2707537 C9 RU 2707537C9
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- vtvaf17
- gene
- gene therapy
- dna vector
- therapy dna
- Prior art date
Links
- 239000013598 vector Substances 0.000 title claims abstract description 543
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 217
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 102
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 title claims abstract description 89
- 101000875067 Homo sapiens Collagen alpha-2(I) chain Proteins 0.000 title claims abstract description 89
- 102100036213 Collagen alpha-2(I) chain Human genes 0.000 title claims abstract description 75
- 108010029483 alpha 1 Chain Collagen Type I Proteins 0.000 title claims abstract description 25
- 101000899361 Homo sapiens Bone morphogenetic protein 7 Proteins 0.000 title claims abstract description 21
- 102100024506 Bone morphogenetic protein 2 Human genes 0.000 title claims abstract description 20
- 101000762366 Homo sapiens Bone morphogenetic protein 2 Proteins 0.000 title claims abstract description 20
- 102100022544 Bone morphogenetic protein 7 Human genes 0.000 title claims abstract 15
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 34
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 title abstract description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims abstract description 493
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 claims abstract description 405
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims abstract description 116
- 102100033601 Collagen alpha-1(I) chain Human genes 0.000 claims abstract description 40
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims abstract description 39
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 claims abstract description 21
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 claims abstract description 20
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 claims abstract description 17
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 17
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims abstract description 16
- 230000012010 growth Effects 0.000 claims abstract description 16
- 241000282412 Homo Species 0.000 claims abstract description 15
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims abstract description 15
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 14
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 13
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 11
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 claims abstract description 11
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims abstract description 10
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 claims abstract description 9
- 238000011161 development Methods 0.000 claims abstract description 8
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 claims abstract description 8
- 239000006152 selective media Substances 0.000 claims abstract description 5
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims abstract description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 133
- 238000001890 transfection Methods 0.000 claims description 95
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 51
- 210000000963 osteoblast Anatomy 0.000 claims description 47
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims description 43
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 claims description 42
- 101150008656 COL1A1 gene Proteins 0.000 claims description 41
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims description 38
- 101150061927 BMP2 gene Proteins 0.000 claims description 32
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims description 31
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 claims description 29
- 101150018057 BMP7 gene Proteins 0.000 claims description 27
- 101150072801 COL1A2 gene Proteins 0.000 claims description 27
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 27
- 210000001612 chondrocyte Anatomy 0.000 claims description 25
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 24
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 claims description 24
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 24
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 claims description 21
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 15
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 15
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 claims description 15
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 14
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 14
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 14
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims description 14
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 claims description 13
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 claims description 13
- 230000033558 biomineral tissue development Effects 0.000 claims description 13
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 claims description 13
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 13
- 230000011164 ossification Effects 0.000 claims description 13
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 claims description 12
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 claims description 12
- 208000010392 Bone Fractures Diseases 0.000 claims description 12
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 claims description 12
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 claims description 12
- 102000004067 Osteocalcin Human genes 0.000 claims description 12
- 108090000573 Osteocalcin Proteins 0.000 claims description 12
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 claims description 12
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 claims description 12
- 239000007943 implant Substances 0.000 claims description 12
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 claims description 12
- 208000034970 Heterotopic Ossification Diseases 0.000 claims description 11
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 11
- 230000007941 heterotopic ossification Effects 0.000 claims description 11
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 claims description 11
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 11
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 claims description 10
- 238000010367 cloning Methods 0.000 claims description 10
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 10
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 claims description 7
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 claims description 7
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 claims description 6
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 claims description 6
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 claims description 6
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 claims description 5
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims description 4
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 claims description 4
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 claims description 4
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 claims description 4
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 claims description 4
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 claims description 4
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 claims description 3
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 claims description 3
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 claims description 3
- 239000008272 agar Substances 0.000 claims description 3
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 claims description 3
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 claims description 2
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 claims description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 claims 22
- 230000018678 bone mineralization Effects 0.000 claims 11
- 230000003831 deregulation Effects 0.000 claims 11
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 claims 11
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 claims 11
- 230000002188 osteogenic effect Effects 0.000 claims 10
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 claims 4
- 239000013630 prepared media Substances 0.000 claims 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 14
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 abstract description 10
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 abstract description 7
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 abstract 2
- 210000001557 animal structure Anatomy 0.000 abstract 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 abstract 1
- 108010049931 Bone Morphogenetic Protein 2 Proteins 0.000 description 74
- 101000945357 Homo sapiens Collagen alpha-1(I) chain Proteins 0.000 description 71
- 108010049870 Bone Morphogenetic Protein 7 Proteins 0.000 description 69
- 102000008131 Bone Morphogenetic Protein 7 Human genes 0.000 description 65
- 102000008143 Bone Morphogenetic Protein 2 Human genes 0.000 description 64
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 57
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 49
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 46
- 102000012422 Collagen Type I Human genes 0.000 description 43
- 108010022452 Collagen Type I Proteins 0.000 description 43
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 33
- 239000000047 product Substances 0.000 description 29
- 210000001626 skin fibroblast Anatomy 0.000 description 27
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 26
- 239000000902 placebo Substances 0.000 description 26
- 229940068196 placebo Drugs 0.000 description 26
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 26
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 25
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 25
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 24
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 22
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 22
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 20
- 108010081355 beta 2-Microglobulin Proteins 0.000 description 20
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 20
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 19
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 18
- 238000007390 skin biopsy Methods 0.000 description 18
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 17
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 16
- 239000000412 dendrimer Substances 0.000 description 16
- 229920000736 dendritic polymer Polymers 0.000 description 16
- 201000008968 osteosarcoma Diseases 0.000 description 15
- 101100218941 Homo sapiens BMP2 gene Proteins 0.000 description 14
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 14
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 13
- 101150076800 B2M gene Proteins 0.000 description 12
- 102000015736 beta 2-Microglobulin Human genes 0.000 description 12
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 12
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 description 11
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 11
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 11
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 11
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 10
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 10
- 101100274954 Homo sapiens COL1A1 gene Proteins 0.000 description 9
- 101100060533 Homo sapiens COL1A2 gene Proteins 0.000 description 9
- 101710098761 Protein alpha-1 Proteins 0.000 description 9
- 230000008859 change Effects 0.000 description 9
- 101100165559 Homo sapiens BMP7 gene Proteins 0.000 description 8
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 8
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 8
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 8
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 8
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 8
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 8
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 description 8
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 7
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 7
- 101710098724 Protein alpha-2 Proteins 0.000 description 7
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 7
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 7
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 7
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 7
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 7
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 6
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 6
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 6
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 6
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 6
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 6
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 5
- 108010007726 Bone Morphogenetic Proteins Proteins 0.000 description 5
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 5
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 5
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 5
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 5
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 5
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 5
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 5
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 5
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 5
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 5
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 5
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 5
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 5
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- 102100036441 Amyloid-beta A4 precursor protein-binding family A member 2 Human genes 0.000 description 4
- 101710093616 Amyloid-beta A4 precursor protein-binding family A member 2 Proteins 0.000 description 4
- 102000007350 Bone Morphogenetic Proteins Human genes 0.000 description 4
- 241000282465 Canis Species 0.000 description 4
- 108091030084 RNA-OUT Proteins 0.000 description 4
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 4
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 4
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 4
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 4
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 4
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 4
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 4
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 4
- 210000000245 forearm Anatomy 0.000 description 4
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 4
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 4
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 4
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 4
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 4
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 4
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 4
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 4
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 4
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 3
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 3
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 3
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- NNJVILVZKWQKPM-UHFFFAOYSA-N Lidocaine Chemical compound CCN(CC)CC(=O)NC1=C(C)C=CC=C1C NNJVILVZKWQKPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920002873 Polyethylenimine Polymers 0.000 description 3
- 102000009661 Repressor Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010034634 Repressor Proteins Proteins 0.000 description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 3
- 229940112869 bone morphogenetic protein Drugs 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 3
- 229940096422 collagen type i Drugs 0.000 description 3
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 3
- 229960004194 lidocaine Drugs 0.000 description 3
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 3
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 3
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 3
- ZOOGRGPOEVQQDX-UUOKFMHZSA-N 3',5'-cyclic GMP Chemical compound C([C@H]1O2)OP(O)(=O)O[C@H]1[C@@H](O)[C@@H]2N1C(N=C(NC2=O)N)=C2N=C1 ZOOGRGPOEVQQDX-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 2
- 101150104241 ACT gene Proteins 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 108010041986 DNA Vaccines Proteins 0.000 description 2
- 229940021995 DNA vaccine Drugs 0.000 description 2
- 101100118093 Drosophila melanogaster eEF1alpha2 gene Proteins 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 239000012124 Opti-MEM Substances 0.000 description 2
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 2
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 2
- 239000007640 basal medium Substances 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 238000007470 bone biopsy Methods 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 101150064923 dapD gene Proteins 0.000 description 2
- 238000013079 data visualisation Methods 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 2
- 210000005069 ears Anatomy 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 2
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 2
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 2
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 2
- 102000045896 human BMP2 Human genes 0.000 description 2
- 102000046107 human BMP7 Human genes 0.000 description 2
- 102000048068 human COL1A2 Human genes 0.000 description 2
- 239000003547 immunosorbent Substances 0.000 description 2
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 2
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 2
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 2
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 2
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 229940126601 medicinal product Drugs 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 2
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 2
- 101150025220 sacB gene Proteins 0.000 description 2
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 2
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 2
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 2
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 210000002303 tibia Anatomy 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N (2R)-6-amino-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2R,3S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S,3S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[2-[[2-[[2-[(2-amino-1-hydroxyethylidene)amino]-3-carboxy-1-hydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1,5-dihydroxy-5-iminopentylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]hexanoic acid Chemical compound C[C@@H]([C@@H](C(=N[C@@H](CS)C(=N[C@@H](C)C(=N[C@@H](CO)C(=NCC(=N[C@@H](CCC(=N)O)C(=NC(CS)C(=N[C@H]([C@H](C)O)C(=N[C@H](CS)C(=N[C@H](CO)C(=NCC(=N[C@H](CS)C(=NCC(=N[C@H](CCCCN)C(=O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)N=C([C@H](CS)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](C)N=C(CN=C([C@H](CO)N=C([C@H](CS)N=C(CN=C(C(CS)N=C(C(CC(=O)O)N=C(CN)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100112372 Acinetobacter baylyi (strain ATCC 33305 / BD413 / ADP1) catM gene Proteins 0.000 description 1
- 206010067484 Adverse reaction Diseases 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 1
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 1
- 229920002271 DEAE-Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 1
- 101150083038 EF1A gene Proteins 0.000 description 1
- 241001596967 Escherichia coli M15 Species 0.000 description 1
- 241000701988 Escherichia virus T5 Species 0.000 description 1
- 206010017076 Fracture Diseases 0.000 description 1
- 208000034826 Genetic Predisposition to Disease Diseases 0.000 description 1
- 206010071602 Genetic polymorphism Diseases 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 108091005904 Hemoglobin subunit beta Proteins 0.000 description 1
- 108091005886 Hemoglobin subunit gamma Proteins 0.000 description 1
- 101000881168 Homo sapiens SPARC Proteins 0.000 description 1
- 241000598436 Human T-cell lymphotropic virus Species 0.000 description 1
- 241000700588 Human alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 1
- 241000701024 Human betaherpesvirus 5 Species 0.000 description 1
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- 108010036940 Levansucrase Proteins 0.000 description 1
- 108010059343 MM Form Creatine Kinase Proteins 0.000 description 1
- 208000024556 Mendelian disease Diseases 0.000 description 1
- 108090000157 Metallothionein Proteins 0.000 description 1
- 102000003792 Metallothionein Human genes 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 229920002274 Nalgene Polymers 0.000 description 1
- 238000011887 Necropsy Methods 0.000 description 1
- 206010031243 Osteogenesis imperfecta Diseases 0.000 description 1
- 208000001132 Osteoporosis Diseases 0.000 description 1
- 108020002230 Pancreatic Ribonuclease Proteins 0.000 description 1
- 108010067372 Pancreatic elastase Proteins 0.000 description 1
- 102000005891 Pancreatic ribonuclease Human genes 0.000 description 1
- 108010068204 Peptide Elongation Factors Proteins 0.000 description 1
- 102000002508 Peptide Elongation Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 241000700157 Rattus norvegicus Species 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 208000001647 Renal Insufficiency Diseases 0.000 description 1
- 241000714474 Rous sarcoma virus Species 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229910000831 Steel Inorganic materials 0.000 description 1
- 101100309436 Streptococcus mutans serotype c (strain ATCC 700610 / UA159) ftf gene Proteins 0.000 description 1
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 1
- 239000012505 Superdex™ Substances 0.000 description 1
- 101150003725 TK gene Proteins 0.000 description 1
- 101001099217 Thermotoga maritima (strain ATCC 43589 / DSM 3109 / JCM 10099 / NBRC 100826 / MSB8) Triosephosphate isomerase Proteins 0.000 description 1
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 208000037919 acquired disease Diseases 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000006838 adverse reaction Effects 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 108010050122 alpha 1-Antitrypsin Proteins 0.000 description 1
- 108010026331 alpha-Fetoproteins Proteins 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- 102000006635 beta-lactamase Human genes 0.000 description 1
- 238000010170 biological method Methods 0.000 description 1
- 210000002805 bone matrix Anatomy 0.000 description 1
- 230000010478 bone regeneration Effects 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000003848 cartilage regeneration Effects 0.000 description 1
- 101150053553 catR gene Proteins 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000013553 cell monolayer Substances 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 1
- 208000018631 connective tissue disease Diseases 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 210000000624 ear auricle Anatomy 0.000 description 1
- 210000002310 elbow joint Anatomy 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 210000002745 epiphysis Anatomy 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 238000001476 gene delivery Methods 0.000 description 1
- 230000009395 genetic defect Effects 0.000 description 1
- 244000144993 groups of animals Species 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 102000045436 human SPARC Human genes 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 201000006370 kidney failure Diseases 0.000 description 1
- 210000003127 knee Anatomy 0.000 description 1
- 210000003041 ligament Anatomy 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 102000006240 membrane receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020004084 membrane receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000009456 molecular mechanism Effects 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 210000003061 neural cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 238000007388 punch biopsy Methods 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 101150079601 recA gene Proteins 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000010187 selection method Methods 0.000 description 1
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 1
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000010959 steel Substances 0.000 description 1
- WPLOVIFNBMNBPD-ATHMIXSHSA-N subtilin Chemical compound CC1SCC(NC2=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C(C)CC)C(=O)NC(=C)C(=O)NC(CCCCN)C(O)=O)CSC(C)C2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C1NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C1NC(=O)C(=C/C)/NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)CNC(=O)C(NC(=O)C(NC(=O)C2NC(=O)CNC(=O)C3CCCN3C(=O)C(NC(=O)C3NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(=C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(CCCCN)NC(=O)C(N)CC=4C5=CC=CC=C5NC=4)CSC3)C(C)SC2)C(C)C)C(C)SC1)CC1=CC=CC=C1 WPLOVIFNBMNBPD-ATHMIXSHSA-N 0.000 description 1
- 108010073086 succinyl-CoA-tetrahydrodipicolinate N-succinyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 210000002435 tendon Anatomy 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Images
Abstract
Изобретение относится к генной инженерии. Описан генотерапевтический ДНК-вектор на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, несущий целевой ген, выбранный из группы генов COL1A1, COL1A2, ВМР2, ВМР7, для повышения уровня экспрессии этого целевого гена в организме человека и животных, при этом генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-COL1A1, или VTvaf17- COL1A2, или VTvaf17- ВМР2, или VTvaf17-ВМР7 имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID №1 или SEQ ID №2 или SEQ ID №3 или SEQ ID №4 соответственно. Каждый из созданных генотерапевтических ДНК-векторов: VTvaf17-COL1A1, или VTvaf17-COL1A2, или VTvaf17-ВМР2, или VTvaf17-ВМР7 за счет ограниченного размера векторной части VTvaf17, не превышающего 3200 п.н, обладает способностью эффективно проникать в клетки и экспрессировать клонированный в него целевой ген, выбранный из группы генов COL1A1, COL1A2, ВМР2, ВМР7. В составе генотерапевтического ДНК-вектора отсутствуют нуклеотидные последовательности вирусного происхождения и отсутствуют гены антибиотикорезистентности, обеспечивая возможность его безопасного применения для генетической терапии человека и животных. Создан также способ получения генотерапевтического ДНК-вектора на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, несущего целевой ген, выбранный из группы генов: COL1A1, COL1A2, ВМР2, ВМР7, который заключается в том, что каждый генотерапевтический ДНК-вектор: VTvaf17-COL1A1, или VTvaf17-COL1A2, или VTvaf17-ВМР2, или VTvaf17-ВМР7, получают следующим образом: кодирующую часть целевого гена из группы генов COL1A1, COL1A2, ВМР2, ВМР7 клонируют в ДНК-вектор VTvaf17 и получают генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-COL1A1, SEQ ID №1, или VTvaf17-COL1A2, SEQ ID №2 или VTvaf17-BMP2, SEQ ID №3, или VTvaf17-BMP7, SEQ ID №4 соответственно. Способ применения созданного генотерапевтического ДНК-вектора на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, несущего целевой ген, выбранный из группы генов: COL1A1, COL1A2, ВМР2, ВМР7, для повышения уровня экспрессии этих целевых генов заключается во введении выбранного генотерапевтического ДНК-вектора или нескольких выбранных генотерапевтических ДНК-векторов в клетки, органы и ткани человека или животного, и/или во введении в органы и ткани человека или животного аутологичных клеток человека или животного, трансфицированных выбранным генотерапевтическим ДНК-вектором или несколькими выбранными генотерапевтическими ДНК-векторами, или в сочетании обозначенных способов. Представлен способ получения штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-COL1A1 или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-COL1A2, или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-BMP2, или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-BMP7 заключается в электропорации компетентных клеток штамма Escherichia coli SCS110-AF созданным генотерапевтическим ДНК-вектором и последующей селекцией стабильных клонов штамма с использованием селективной среды. Представлен штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-COL1A1, или штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-COL1A2, или штамм Escherichia coli SCS110-AFA/Tvaf17-BMP2, или штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-BMP7, несущий генотерапевтический ДНК-вектор для его наработки с возможностью культивирования штамма без использования антибиотиков. Способ производства в промышленных масштабах генотерапевтического ДНК-вектора заключается в масштабировании бактериальной культуры штамма до количеств, необходимых для наращивания бактериальной биомассы в промышленном ферментере, после чего биомассу используют для выделения фракции, содержащей целевой ДНК-продукт - генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-COL1A1, или VTvaf17-COL1A2, или VTvaf17-VTvaf17-BMP2, или VTvaf17-BMP7, многостадийно фильтруют и очищают хроматографическими методами. Изобретение может быть использовано в биотехнологии, медицине и сельском хозяйстве для создания препаратов генной терапии. 12 н. и 2 з.п. ф-лы, 14 ил., 19 пр.
Description
Область техники
Изобретение относится к генной инженерии и может быть использовано в биотехнологии, медицине и сельском хозяйстве для создания препаратов генной терапии. То есть, созданный генотерапевтический ДНК-вектор с целевым геном может быть использован для введения в клетки организма животных и человека, характеризующихся сниженной или недостаточной экспрессией данного гена, обеспечивая таким образом достижение терапевтического эффекта.
Уровень техники
Генная терапия - это современный медицинский подход, направленный на лечение наследственных и приобретенных заболеваний путем введения нового генетического материала в клетки, ткани, органы пациента с целью компенсации или подавления функции мутантного гена и/или исправления генетического дефекта. Целью генной терапии является, в большинстве случаев, введение в организм генов, обеспечивающих транскрипцию и последующую трансляцию белковых молекул, кодируемых этими генами. В рамках описания настоящего изобретения под экспрессией гена подразумевается продукция белковой молекулы, аминокислотная последовательность которой кодируется этим геном.
Гены, выбранные из группы генов COL1A1, COL1A2, ВМР2, ВМР7, играют важную роль в формированием костной и хрящевой тканей организма человека и животных. Показана связь низких/недостаточных концентраций этих белков с различными заболеваниями человека, которая, в ряде случаев, подтверждена нарушениями в нормальной экспрессии генов, кодирующих эти белки. Например, мутации в генах COL1A1, COL1A2 приводят к наследственным заболеваниям соединительной ткани - несовершенным остеогенезам, которые сопровождаются частыми переломами костей (Яхяева Г.Т. С соавт., Вопросы современной педиатрии. 2016; 15 (2): 175-179). Результатом генетически обусловленной недостаточности BMP 2 являются повышенная хрупкость костей, нарушения энхондрального остеогенеза и минерализации костного матрикса (Chen G., Deng С., Li Y.P. Int. J. Biol. Sci. 2012; 8 (2): 272-88). Таким образом, повышение экспрессии гена, выбранного из группы генов COL1A1, COL1A2, ВМР2, ВМР7, и введенного в организм геннотерапевтическим способом, актуально для коррекции состояний человека и животных, связанных с нарушением действия вышеназванных генов.
Для целей генной терапии используют специально сконструированные генотерапевтические векторы, которые разделяют на вирусные и невирусные. В последнее время все большее внимание уделяется разработке невирусных систем доставки генетического материала, среди которых лидируют плазмидные векторы. Данные векторы лишены недостатков, присущих вирусным векторам: в клетке-мишени они существуют в эписомальной форме, поэтому не происходит интеграции в геном; их производство достаточно дешево; отсутствие иммунного ответа и побочных реакций на введение плазмидного вектора делают их удобным инструментом генной терапии и генетической профилактики в качестве ДНК-вакцины (Li L, Petrovsky N. Molecular mechanisms for enhanced DNA vaccine immunogenicity. Expert Rev Vaccines. 2016; 15(3):313-29).
При этом имеются ограничения для использования плазмидных векторов для генной терапии: 1) наличие генов устойчивости к антибиотикам для наработки в штаммах-носителях, 2) наличие различных регуляторных элементов, представленных последовательностями вирусных геномов, 3) размер терапевтического плазмидного вектора, определяющий эффективность проникновения вектора в клетку-мишень.
Известно, что Европейское агентство по лекарственным средствам считает необходимым избегать введения маркеров антибиотикорезистентности в разрабатываемые плазмидные векторы для генной терапии (Reflection paper on design modifications of gene therapy medicinal products during development / 14 December 2011 EMA/CAT/GTWP/44236/2009 Committee for advanced therapies), а также рекомендует избегать наличия в составе терапевтических плазмидных векторов регуляторных элементов для повышения экспрессии целевых генов (промоторов, энхансеров, посттрансляционных регуляторных элементов), которые являются частями геномов различных вирусов (Guideline on the quality, non-clinical and clinical aspects of gene therapy medicinal products / 23 March 2015, EMA/CAT/80183/2014, Committee for Advanced Therapies).
Также, существенным моментом является размер генотерапевтического вектора. Известно, что современные плазмидные векторы зачастую перегружены нефункциональными участками, серьезно увеличивающими размер вектора (Mairhofer J, Grabherr R. Rational vector design for efficient non-viral gene delivery: challenges facing the use of plasmid DNA. Mol Biotechnol. 2008. 39(2):97-104), что порой не позволяет встраивать в состав вектора целевой ген нужного размера.
Известен способ накопления плазмидных векторов в штаммах Escherichia coli без использования антибиотиков (Cranenburgh RM, Hanak JA, Williams SG, Sherratt DJ. Escherichia coli strains that allow antibiotic-free plasmid selection and maintenance by repressor titration. Nucleic Acids Res. 2001. 29(5):E26). Были созданы штаммы Escherichia coli DH1lacdapD и DH1lacP2dapD, в которых ген dapD, кодирующий фермент 2,3,4,5-тетрагидропиридин-2,6-дикарбоксилат-N-сукцинилтрансферазу, участвующий в биосинтезе L-лизина, находится под контролем lac-промотора. В отсутствие индуктора IPTG (изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозид) эти штаммы подвержены лизису. Однако при введении мультикопийного вектора pORT, содержащего lac-оператор, индуцируется экспрессия гена dapD и, таким образом, трансформированные клоны могут быть отобраны и размножены. Однако, эти штаммы характеризуются низким уровнем трансформации и ее нестабильностью.
Известно решение по патентной заявке RU 2011152377 A, описывающей получение экспрессионного плазмидного вектора без устойчивости к антибиотику, которая содержит полинуклеотидную последовательность, кодирующую белок-репрессор. Экспрессия указанного белка-репрессора регулирует экспрессию токсичного генного продукта, встроенного в участок генома E.coli. Однако, как и все методы селекции, основанные на использовании белков-репрессоров, данный метод отличается нестабильностью трансформации и ее низкой эффективностью.
В патенте US 9644211 B2 описано получение минимального по размеру вектора. Данный вектор не содержит бактериальных геномных последовательностей и продуцируется путем parA-опосредованной рекомбинации, проходящей в специально полученном штамме E.coli. Недостатком данного метода получения минимального по размеру вектора является невозможность его использования при масштабировании производства.
Известно получение генотерапевтических векторов, в состав которых включены нуклеотидные последовательности, кодирующие структурные белки человека или факторы роста, связанные с репарацией костной и хрящевой тканей. Так, ген COL1A1 кодирует белок альфа1-цепи коллагена I типа, а ген COL1A2 кодирует белок альфа2-цепи коллагена I типа, которые являются потенциально значимым в формировании генетической предрасположенности к остеопорозу и хрупкости костей с риском переломов. Это связано с тем, что коллаген I типа входит в состав костей, сухожилий, связок, кожи и других соединительных тканей.
В заявке WO 2015035395 описано использование терапевтического полинуклеотида для получения хондроцитов или клеток хрящевого типа в суставе индивидуума, при этом полинуклеотид создан на основе вирусных и невирусных векторов с генами COL1A1 и COL1A2 под контролем промотора, подходящим для активности в бессосудистой, безнейронной или низко-кислородной среде.
Костные морфогенетические белки (BMPs; bone morphogenetic proteins) являются самыми важными факторами регенерации кости и хряща. Белки семейства BMP действуют на рецепторы клеточной мембраны и играют важную роль в регуляции роста, дифференцировки и апоптоза различных типов клеток включая остеобласты, хондробласты, нервные и эпителиальные клетки. Эти белки стимулируют увеличение числа клеток, а также вызывают ускоренную дифференцировку мезенхимальных стволовых клеток в хондробласты и остеобласты, усиливают синтез коллагена, повышают активность щелочной фосфатазы, увеличивают синтез остеокальцина, стимулируют синтез внеклеточного матрикса и его последующую минерализацию (Katagiri Т, Watabe Т. Bone Morphogenetic Proteins. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2016, 8(6)).
В настоящее время некоторые члены семейства BMP используются в медицине. Так, современные биологические методы повышения остеоиндуктивности костных имплантатов акцентированы на поставку значительных концентраций BMP на различных типах носителей (Lowery JW, Rosen V. Bone Morphogenetic Protein-Based Therapeutic Approaches. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2018, 10(4)). Применение рекомбинантных BMP для индукции остеогенеза в клинике ограничено быстрой деградацией этих белков в месте введения и в кровяном русле, а также опасностью развития гетеротопической оссификации.
Наиболее полно изученными из этой группы белков являются белки ВМР-2 и ВМР-7. В патенте RU 2408727 описана рекомбинантная плазмида pCollbd-BMP-2 размером 3447 п.н., которая находится в штамме Escherichia coli М15 и обеспечивает в нем экспрессию рекомбинантного белка Collbd-BMP-2, состоящего из коллагенсвязывающего домена Collbd из внеклеточного кальций-зависимого белка SPARC человека, спейсера из остатков глицина и серина и костного морфогенетического белка ВМР-2. Созданный искусственный бактериальный оперон химерных белков находится под контролем промоторной области раннего промотора бактериофага Т5. Полученная рекомбинантная плазмида содержит бактериальный оперон bla, кодирующий белок бета-лактамазу, являющуюся селективным маркером для отбора клонов-трансформантов E.coli методом контрселекции.
В источнике ЕР 2228071 (А1) описан рекомбинантный вектор, созданный на основе коммерческой плазмиды VR1012 (J. Hartikka et al. Human Gene Therapy 1996, 7, 1205-1217), экспрессирующий белок ВМР-7 (слитый с сигнальным пептидом для облегчения секреции ВМР-7 в экстраклеточную среду) в клетках хозяина, а также - фармацевтические композиции на основе таких рекомбинантных векторов для лечения почечной недостаточности у млекопитающих. Описанный вектор, содержит в себе полинуклеотид, кодирующий белок ВМР-7 млекопитающего или человека, функционально связанный с промоторным элементом. Промоторы и энхансеры, которые могут быть использованы в данном изобретении, включают, но не ограничиваются следующими элементами: промоторы и энхансеры LTR вируса саркомы Rous, ген ТК HSV-1, ранние или поздние промоторы SV40, аденовирусный промотор (MLP), гены фосфоглицераткиназы, гены металлотионеина, гены α-1-антитрипсина, гены альбумина, гены коллагеназы, гены эластазы I, гены β-актина, гены β-глобина, гены γ-глобина, гены α-фетопротеинов и гены мышечной креатинкиназы. Предпочтительным промотором для экспрессии гена белка ВМР-7 является ранний промотор цитомегаловируса (CMV-IE) человеческого или мышиного происхождения. Таким образом, в данном изобретении промотор имеет либо вирусное, либо клеточное происхождение. Вектор в изобретении может быть любым подходящим рекомбинантным вирусом или вирусным вектором, таким как поксвирус, аденовирус, герпесвирус, бакуловирус, ретровирус и т.д. или вектор может быть плазмидой.
Прототипом настоящего изобретения в части использования рекомбинантных ДНК-векторов для генной терапии является патент, US 9550998 (В2), в котором описан способ получения рекомбинантного вектора для генетической иммунизации. Полученный вектор представляет собой суперскрученный плазмидный ДНК-вектор, который предназначен для экспрессии клонированных генов в клетках животных и человека. Вектор состоит из области начала репликации (origin), регуляторных элементов, включающих промотор и энхансер цитомегаловируса человека, регуляторные элементы из Т-лимфотропного вируса человека. Накопление вектора производят в специальном штамме E.coli без использования антибиотиков за счет антисенс-комплементации гена sacB, введенного в штамм посредством бактериофага. Ограничением использования данного ДНК - вектора для генетической терапии является наличие в его составе регуляторных элементов, представляющих собой последовательности вирусных геномов.
Раскрытие изобретения.
Задачей изобретения является конструирование генотерапевтических ДНК-векторов на основе специально сконструированного генотерапевтического ДНК-вектора для повышения уровня экспрессии гена, выбранного из группы генов - гена COL1A1 белка альфа1-цепи коллагена I типа, гена COL1A2 белка альфа2-цепи коллагена I типа, гена костного морфогенетического белка ВМР-2, гена костного морфогенетического белка ВМР-7, а также - конструирование штаммов, несущих эти генотерапевтические ДНК-векторы для производства их промышленных масштабах.
При этом ДНК-векторы должны оптимально сочетать в себе следующие свойства:
I) возможность безопасного использования для генетической терапии человека и животных за счет отсутствия в составе генотерапевтического ДНК-вектора генов антибиотикорезистентности.
II) длину, обеспечивающую эффективное проникновение в клетку-мишень;
III) наличие регуляторных элементов, обеспечивающих эффективную экспрессию целевых генов и, в то же время, не представляющих собой нуклеотидные последовательности вирусных геномов;
IV) технологичность получения и возможность наработки в промышленных масштабах.
Пункты I и III предусмотрены в данном техническом решении в соответствии с рекомендациями государственных регуляторов к лекарственным средствам для генной терапии, в частности, Европейского Агентства по лекарственным средствам.
Поставленная задача решается за счет того, что создан генотерапевтический ДНК-вектор на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, несущий целевой ген, выбранный из группы генов COL1A1, COL1A2, ВМР2, ВМР7, для повышения уровня экспрессии этого целевого гена в организме человека и животных, при этом генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-COL1A1, или VTvaf17- COL1A2, или VTvaf17-ВМР2, или VTvaf17-ВМР7, имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID №1 или SEQ ID №2 или SEQ ID №3 или SEQ ID №4 соответственно. Каждый из созданных генотерапевтических ДНК-векторов: VTvaf17- COL1A1, или VTvaf17- COL1A2, или VTvaf17- ВМР2, или VTvaf17- ВМР7 за счет ограниченного размера векторной части VTvaf17, не превышающего 3200 п.н, обладает способностью эффективно проникать в клетки и экспрессировать клонированный в него целевой ген, выбранный из группы генов COL1A1, COL1A2, ВМР2, ВМР7. В составе генотерапевтического ДНК-вектора отсутствуют нуклеотидные последовательности вирусного происхождения и отсутствуют гены антибиотикорезистентности, обеспечивая возможность его безопасного применения для генетической терапии человека и животных.
Создан также способ получения генотерапевтического ДНК-вектора на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, несущего целевой ген, выбранный из группы генов: COL1A1, COL1A2, ВМР2, ВМР7, который заключается в том, что каждый генотерапевтический ДНК-вектор: VTvaf17- COL1A1, или VTvaf17- COL1A2, или VTvaf17- ВМР2, или VTvaf17- ВМР7, получают следующим образом: кодирующую часть целевого гена из группы генов COL1A1, COL1A2, ВМР2, ВМР7, клонируют в ДНК-вектор VTvaf17 и получают генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-COL1A1, SEQ ID №1, или VTvaf17- COL1A2, SEQ ID №2 или VTvaf17- BMP2, SEQ ID №3, или VTvaf17- BMP7, SEQ ID №4 соответственно.
Способ применения созданного генотерапевтического ДНК-вектора на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, несущего целевой ген, выбранный из группы генов: COL1A1, COL1A2, ВМР2, ВМР7, для повышения уровня экспрессии этих целевых генов заключается во введении выбранного генотерапевтического ДНК-вектора или нескольких выбранных генотерапевтических ДНК-векторов в клетки, органы и ткани человека или животного, и/или во введении в органы и ткани человека или животного аутологичных клеток человека или животного, трансфицированных выбранным генотерапевтическим ДНК-вектором или несколькими выбранными генотерапевтическими ДНК-векторами, или в сочетании обозначенных способов.
Способ получения штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-COL1A1 или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-COL1A2, или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-BMP2, или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17- BMP7 заключается в электропорации компетентных клеток штамма Escherichia coli SCS110-AF созданным генотерапевтическим ДНК-вектором и последующей селекцией стабильных клонов штамма с использованием селективной среды.
Заявлен штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-COL1A1, или штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-COL1A2, или штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-BMP2, или штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-BMP7, несущий генотерапевтический ДНК-вектор для его наработки с возможностью культивирования штамма без использования антибиотиков.
Способ производства в промышленных масштабах генотерапевтического ДНК-вектора заключается в масштабировании бактериальной культуры штамма до количеств, необходимых для наращивания бактериальной биомассы в промышленном ферментере, после чего биомассу используют для выделения фракции, содержащей целевой ДНК-продукт - генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-COL1A1 или VTvaf17-COL1A2 или VTvaf17- VTvaf17-BMP2 или VTvaf17-BMP7, многостадийно фильтруют и очищают хроматографическими методами.
При этом специалистам в данной области техники известно свойство вырожденности генетического кода, из которого следует, что под объем настоящего изобретения также подпадают варианты нуклеотидных последовательностей, отличающихся инсерцией, делецией или заменой нуклеотидов, которые не приводят к изменению полипептидной последовательности, кодируемой целевым геном, и/или не приводят к потере функциональной активности регуляторных элементов вектора VTvaf17. При этом специалистам в данной области техники известно явление генетического полиморфизма, из которого следует, что под объем настоящего изобретения также подпадают варианты нуклеотидных последовательностей генов из группы генов COL1A1, COL1A2, ВМР2, ВМР7, которые при этом кодируют различные варианты аминокислотных последовательностей белков COL1A1, COL1A2, ВМР2, ВМР7, не отличающихся от приведенных по своей функциональной активности при физиологических условиях.
Способ получения генотерапевтического ДНК-вектора на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, несущего целевой ген, выбранный из группы генов COL1A1, COL1A2, ВМР2, ВМР7, заключается в том, что кодирующую часть целевого гена COL1A1, или COL1A2, или ВМР2, или ВМР7 получают путем выделения РНК из биологического образца ткани человека с последующим проведением реакции обратной транскрипции и ПЦР-амплификации кДНК с использованием специфических олигонуклеотидов и расщеплением продукта амплификации эндонуклеазами рестрикции, причем клонирование в генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17 проводят по сайтам рестрикции, обеспечивающим попадание рамки считывания целевых генов в экспрессионную кассету вектора VTvaf17.
Известно, что способность ДНК-векторов проникать в эукариотические клетки обусловлена, главным образом, размером вектора. При этом ДНК-вектора с наименьшим размером обладают более высокой проникающей способностью. Таким образом, отсутствие в составе вектора элементов, которые не несут функциональной нагрузки, но при этом увеличивают размер ДНК вектора, является предпочтительным. Данные особенности ДНК-векторов были учтены при получении генотерапевтического ДНК-вектора на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, несущего целевой ген, выбранный из группы генов COL1A1, COL1A2, ВМР2, ВМР7, путем отсутствия в составе вектора крупных нефункциональных последовательностей и генов антибиотикорезистентности, что позволило, помимо технологических преимуществ и преимуществ в плане безопасности применения, значительно уменьшить размер полученного генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, несущего целевой ген, выбранный из группы генов COL1A1, COL1A2, ВМР2, ВМР7. Таким образом, способность проникать в эукариотические клетки полученного генотерапевтического ДНК-вектора обусловлена ограниченным размером векторной части VTvaf17 (в которую входит промотор, ориджин репликации, сигнал полиаденилирования, полилинкер, элемент RNA-out), не превышающим 3200 п.н.
Способность проникать в эукариотические клетки и проявлять функциональную активность, то есть способность экспрессировать целевой ген, полученного генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-COL1A1 или VTvaf17-COL1A2 или VTvaf17-ВМР2 или VTvaf17-BMP7 подтверждают путем введения в эукариотические клетки полученного вектора и последующим анализом экспрессии специфической мРНК и/или белкового продукта целевого гена. При этом наличие специфической мРНК в клетках, в которые был введен генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-COL1A1 или VTvaf17-COL1A2 или VTvaf17-BMP2 или VTvaf17-BMP7 свидетельствует как о способности полученного вектора проникать в эукариотические клетки, так и о его способности экспрессировать мРНК целевого гена. При этом, как известно специалистам в данной области техники, наличие мРНК гена является обязательным условием, но не является доказательством трансляции белка, кодируемого целевым геном. Поэтому для подтверждения свойства генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17- COL1A1, или VTvaf17- COL1A2, или VTvaf17-ВМР2, или VTvaf17- ВМР7 экспрессировать целевой ген на уровне белка в эукариотических клетках, в которые был введен генотерапевтический ДНК-вектор, проводят с использованием иммунологических методов анализ концентрации белков, кодируемых целевыми генами. Наличие белка COL1A1, или COL1A2, или ВМР2, или ВМР7 подтверждает эффективность экспрессии целевых генов в эукариотических клетках и возможность повышения уровня концентрации белка с помощью генотерапевтического ДНК-вектора на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, несущего целевой ген, выбранный из группы генов COL1A1, COL1A2, ВМР2, ВМР7.
Способ применения генотерапевтического ДНК-вектора на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, несущего целевой ген, выбранный из группы генов COL1A1, COL1A2, ВМР2, ВМР7, для повышения уровня экспрессии этих целевых генов, заключается во введении генотерапевтического ДНК-вектора, несущего целевой ген или нескольких выбранных генотерапевтических ДНК-векторов, в клетки, органы и ткани человека или животного, и/или во введении в органы и ткани человека или животного аутологичных клеток, в которые был введен генотерапевтический ДНК-вектор на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17 или несколько выбранных генотерапевтических ДНК-векторов, или в сочетании обозначенных способов.
Указанные способы применения характеризуются отсутствием потенциальных рисков для генетической терапии человека и животных за счет отсутствия в составе генотерапевтического ДНК-вектора регуляторных элементов, представляющих собой нуклеотидные последовательности вирусных геномов и за счет отсутствия в составе генотерапевтического ДНК-вектора генов устойчивости к антибиотикам, что подтверждается отсутствием участков, гомологичных вирусным геномам и генам антибиотикорезистентности в нуклеотидных последовательностях генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17- COL1A1, или генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17- COL1A2, или генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17- ВМР2, или генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17- ВМР7 (SEQ ID №1 или SEQ ID №2 или SEQ ID №3 или SEQ ID №4 соответственно).
Как известно специалистам в данной области техники, гены антибиотикорезистентности в составе генотерапевтических ДНК-векторов используются с целью получения этих векторов в препаративных количествах путем наращивания бактериальной биомассы в питательной среде, содержащей селективный антибиотик. В рамках настоящего изобретения в целях возможности безопасного применения генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, несущего целевой ген COL1A1, или COL1A2, или ВМР2, или ВМР7, использование селективных питательных сред, содержащих антибиотик, не представляется возможным. В качестве технологического решения для получения генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, несущего целевой ген, выбранный из группы генов COL1A1, COL1A2, ВМР2, ВМР7, для возможности масштабирования до промышленных масштабов получения генотерапевтических векторов предлагается способ получения штаммов для наработки указанных генотерапевтических векторов на основе бактерии Escherichia coli SCS110-AF. Способ получения штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17- COL1A1 или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17- COL1A2, или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17- BMP2, или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17- BMP7 заключается в получении компетентных клеток штамма Escherichia coli SCS110-AF с введением в эти клетки генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17- COL1A1, или ДНК-вектора VTvaf17- COL1A2, или ДНК-вектора VTvaf17- ВМР2, или ДНК-вектора VTvaf17- ВМР7, соответственно с помощью методов трансформации (электропорации). Полученные штаммы используются для наработки генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, несущего целевой ген, выбранный из группы генов COL1A1, COL1A2, ВМР2, ВМР7, с возможностью использования сред без содержания антибиотиков.
Способ масштабирования получения бактериальной массы до промышленных масштабов для выделения генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, несущего целевой ген, выбранный из группы генов COL1A1, COL1A2, ВМР2, ВМР7, заключается в том, что затравочную культуру штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17- COL1A1 или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17- COL1A2, или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17- BMP2, или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17- BMP7 инкубируют в объеме питательной среды без содержания антибиотика обеспечивающим подходящую динамику накопления биомассы, по достижению достаточного количества биомассы в логарифмической фазе роста, бактериальную культуру переносят в промышленный ферментер, после чего растят до достижения стационарной фазы роста, затем выделяют фракцию, содержащую целевой ДНК-продукт генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17- COL1A1, или ДНК-вектор VTvaf17- COL1A2, или ДНК-вектор VTvaf17- ВМР2, или ДНК-вектор VTvaf17- ВМР7, многостадийно фильтруют и очищают хроматографическими методами. При этом специалистам в данной области техники понятно, что условия культивирования штаммов, состав питательных сред (за исключением содержания антибиотиков), используемое оборудование, методы очистки ДНК могут варьировать в рамках стандартных операционных процедур в зависимости от отдельно взятой производственной линии, но известные подходы к масштабированию, промышленному получению и очистке ДНК-векторов с использованием штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17- COL1A1, или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17- COL1A2, или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17- BMP2, или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17- BMP7 подпадают под объем настоящего изобретения.
Изобретение поясняется чертежами, где
На фиг. 1 представлена схема генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, несущего целевой гена человека, выбранный из группы генов COL1A1, COL1A2, ВМР2, ВМР7, который представляет собой кольцевую двуцепочечную молекулу ДНК, способную к автономной репликации в клетках бактерии Eshcerichia coli.
На фиг. 1 приведены схемы, соответствующие:
А - генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-COL1A1,
В - генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-COL1A2,
С - генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-ВМР2,
D - генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-ВМР7.
На схемах отмечены следующие структурные элементы вектора:
EF1a - промоторная область гена человеческого фактора элонгации EF1A с собственным энхансером, содержащимся в первом интроне гена. Служит для обеспечения высокого уровня транскрипции рекомбинантного гена в большинстве тканей человека.
Рамка считывания целевого гена, соответствующая кодирующей части гена COL1A1 (фиг. 1А), или COL1A2 (фиг. 1В), или ВМР2 (фиг. 1С), или ВМР7 (фиг. 1D), соответственно;
hGH-TA - терминатор транскрипции и сайт полиаденилирования гена фактора роста человека;
(4) RNA-out - регуляторный элемент РНК-out транспозона Tn 10, обеспечивающий возможность положительной селекции без использования антибиотиков при использовании штамма Eshcerichiacoli SCS 110;
ori - область начала репликации, участок служащий для автономной репликации с однонуклеотидной заменой для повышения копийности плазмиды в клетках большинства штаммов Eshc
Отмечены уникальные сайты рестрикции Eshcerichia coli.
На фиг. 2 представлены графики накопления мРНК целевого гена, а именно, гена COL1A1 человека, в клетках первичной культуры фибробластов кожи человека HDFa (АТСС PCS-201-012) до их трансфекции и через 48 часов после трансфекции этих клеток ДНК-вектором VTvaf17- COL1A1, с целью подтверждения эффективности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-COL1A1, несущего целевой ген COL1A1, где
1 - кДНК гена COL1A1 до трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17- COL1A1,
2 - кДНК гена COL1A1 после трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17- COL1A1;
3 - кДНК гена В2М до трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17- COL1A1;
4 - кДНК гена В2М после трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17- COL1A1;
В качестве референтного гена использовали ген В2М (Бета-2-микроглобулин) приведенного в базе данных GenBank под номером NM 004048.2.
На фиг. 3 представлены графики накопления мРНК целевого гена, а именно гена COL1A2 человека, в клетках культуры фибробластов кожи человека до их трансфекции и через 48 часов после трансфекции этих клеток ДНК-вектором VTvaf17- COL1A2, с целью подтверждения эффективности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17- COL1A2, несущего целевой ген COL1A2, где
1 - кДНК гена COL1A2 до трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17- COL1A2,
2 - кДНК гена COL1A2 после трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17- COL1A2,
3 - кДНК гена В2М до трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17- COL1A2,
4 - кДНК гена В2М после трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17- COL1A2.
В качестве референтного гена использовали ген В2М (Бета-2-микроглобулин) приведенного в базе данных GenBank под номером NM 004048.2. где
На фиг. 4 представлены графики накопления мРНК целевого гена, а именно гена ВМР2 человека в клетках остеосаркомы человека MG-63 (АТСС CRL-1427) до их трансфекции и через 48 часов после трансфекции этих клеток ДНК-вектором VTvaf17- ВМР2 с целью подтверждения эффективности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17- ВМР2, несущего целевой ген ВМР2, где
1 - кДНК гена ВМР2 до трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17- ВМР2;
2 - кДНК гена ВМР2 после трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17- ВМР2;
3 - кДНК гена В2М до трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17- ВМР2;
4 - кДНК гена В2М после трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17- ВМР2.
В качестве референтного гена использовали ген В2М (Бета-2-микроглобулин) приведенного в базе данных GenBank под номером NM 004048.2.
На фиг. 5 представлены графики накопления мРНК целевого гена, а именно гена ВМР7 человека, в клетках остеобластов человека hFOB 1.19 (АТСС CRL-11372) до их трансфекции и через 48 часов после трансфекции этих клеток ДНК-вектором VTvaf17- ВМР7 с целью подтверждения эффективности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17- ВМР7, несущего целевой ген ВМР7, где
1 - кДНК гена ВМР7 до трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17- ВМР7
2 - кДНК гена ВМР7 после трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17- ВМР7
3 - кДНК гена В2М до трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17- BMP7
4 - кДНК гена В2М в клетках после трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17- ВМР7
В качестве референтного гена использовали ген В2М (Бета-2-микроглобулин) приведенного в базе данных GenBank под номером NM 004048.2.
На фиг. 6 представлена диаграмма концентрации белка альфа-1 цепи коллагена I типа в культуральной среде клеток первичной культуры фибробластов кожи человека HDFa (АТСС PCS-201-012) после трансфекции этих клеток ДНК-вектором VTvaf17- COL1A1, с целью оценки изменения количества белка альфа-1 цепи коллагена I типа в культуральной среде клеток первичной культуры фибробластов кожи человека HDFa, при трансфекции этих клеток ДНК-вектором VTvaf17- COL1A1, несущим ген COL1A1, где
культура А - первичная культура фибробластов кожи человека HDFa, трансфицированных водным раствором дендримеров без плазмидной ДНК (контроль)
культура В - первичная культура фибробластов кожи человека HDFa, трансфицированных ДНК-вектором VTvaf17
культура С - первичная культура фибробластов кожи человека HDFa, трансфицированных ДНК-вектором VTvaf17-COL1A1, несущим ген COL1A1
На фиг. 7 представлена диаграмма концентрации белка альфа-2 цепи коллагена I типа в культуральной среде клеток культуры фибробластов кожи человека после трансфекции этих клеток ДНК-вектором VTvaf17- COL1A2, с целью оценки изменения количества белка альфа-2 цепи коллагена I типа в культуральной среде клеток культуры фибробластов кожи человека, при трансфекции этих клеток ДНК-вектором VTvaf17-COL1A2, несущим ген COL1A2, где
культура А - культура фибробластов кожи человека, трансфицированных водным раствором дендримеров без плазмидной ДНК (контроль)
культура В - культура фибробластов кожи человека, трансфицированных ДНК-вектором VTvaf17
культура С - культура фибробластов кожи человека, трансфицированных ДНК-вектором VTvaf17- COL1A2, несущим ген COL1A2.
На фиг. 8 представлена диаграмма концентрации костного морфогенетического белка 2 в культуральной среде клеток остеосаркомы человека MG-63 (АТСС CRL-1427) после трансфекции этих клеток ДНК-вектором VTvaf17- ВМР2, с целью оценки изменения количества костного морфогенетического белка 2 в культуральной среде клеток остеосаркомы человека MG-63 (АТСС CRL-1427), при трансфекции этих клеток ДНК-вектором VTvaf17- ВМР2, несущим ген ВМР2, где
культура А - культура клеток остеосаркомы человека MG-63, трансфицированных водным раствором дендримеров без плазмидной ДНК (контроль)
культура В - культура клеток остеосаркомы человека MG-63, трансфицированных ДНК-вектором VTvaf17
культура С - культура клеток остеосаркомы человека MG-63, трансфицированных ДНК-вектором VTvaf17- ВМР2, несущим ген ВМР2.
На фиг. 9 представлена диаграмма концентрации костного морфогенетического белка 7 в культуральной среде клеток остеобластов человека hFOB 1.19 (АТСС CRL-11372) после трансфекции этих клеток ДНК-вектором VTvaf17- ВМР7, с целью оценки изменения количества костного морфогенетического белка 7 в культуральной среде клеток остеобластов человека hFOB 1.19 (АТСС CRL-11372), при трансфекции этих клеток ДНК-вектором VTvaf17- ВМР7, несущим ген ВМР7, где
культура А - культура клеток остеобластов человека hFOB 1.19, трансфицированных водным раствором дендримеров без плазмидной ДНК (контроль)
культура В - культура клеток остеобластов человека hFOB 1.19, трансфицированных ДНК-вектором VTvaf17
культура С - культура клеток остеобластов человека hFOB 1.19, трансфицированных ДНК-вектором VTvaf17- ВМР7, несущим ген ВМР7.
На фиг. 10 представлена диаграмма концентрации белка COL1A2 в биоптатах кожи трех пациентов после введения в кожу этих пациентов генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17- COL1A2 с целью оценки функциональной активности, то есть экспрессии целевого гена на уровне белка, и возможности повышения уровня экспрессии белка с помощью генотерапевтического ДНК-вектора на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, несущего целевой ген COL1A2.
На фиг. 12 отмечены следующие элементы:
П1I - биоптат кожи пациента П1 в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора VTvaf17- COL1A2
П1II - биоптат кожи пациента П1 в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора VTvaf17 (плацебо)
П1III- биоптат кожи пациента П1 из интактного участка,
П2I - биоптат кожи пациента П2 в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора VTvaf17- COL1A2
П2II - биоптат кожи пациента П2 в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора VTvaf17 (плацебо)
П2III - биоптат кожи пациента П2 из интактного участка,
П3I - биоптат кожи пациента П3 в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора VTvaf17- COL1A2
П3II - биоптат кожи пациента П3 в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора VTvaf17 (плацебо)
П3III - биоптат кожи пациента П3 из интактного участка
На фиг. 11 представлена диаграмма концентрации белка COL1A1 в биоптатах хрящевой ткани трех пациентов после введения в хрящевую ткань этих пациентов генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17- COL1A1 с целью оценки функциональной активности, то есть экспрессии целевого гена на уровне белка, и возможности повышения уровня экспрессии белка с помощью генотерапевтического ДНК-вектора на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, несущего целевой ген COL1A1.
На фиг. 13 отмечены следующие элементы:
П1I - биоптат хрящевой ткани пациента П1 в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора VTvaf17- COL1A1
П1II - биоптат хрящевой ткани пациента П1 в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора VTvaf17 (плацебо)
П1III - биоптат хрящевой ткани пациента П1 из интактного участка,
П2I - биоптат хрящевой ткани пациента П2 в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора VTvaf17- COL1A1
П2II - биоптат хрящевой ткани пациента П2 в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора VTvaf17 (плацебо)
П2III - биоптат хрящевой ткани пациента П2 из интактного участка,
П3I - биоптат хрящевой ткани пациента П3 в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора VTvaf17- COL1A1
П3II - биоптат хрящевой ткани пациента П3 в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора VTvaf17 (плацебо)
П3III - биоптат хрящевой ткани пациента П3 из интактного участка.
На фиг. 12 представлена диаграмма концентрации белка COL1A1 в биоптатах кожи человека после введения в кожу культуры аутогенных фибробластов, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17- COL1A1 с целью демонстрации способа применения путем введения аутологичных клеток, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-COL1A1
На фиг. 15 отмечены следующие элементы:
П1А - биоптат кожи пациента П1 в зоне введения культуры аутогенных фибробластов пациента, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-COL1A1
П1В - биоптат кожи пациента П1 в зоне введения аутогенных фибробластов пациента, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17
П1С - биоптат кожи пациента П1 из интактного участка.
На фиг. 13:
На фигуре 13А представлена диаграмма изменения количества белков: белка альфа-1 цепи коллагена I типа (COL1A1), белка альфа-2 цепи коллагена I типа (COL1A2) в костных биоптатах крыс в зоне хирургически-смоделированной травмы после инъекционного введения в травмированную зону крысы:
в 1-й группе смеси генотерапевтических ДНК-векторов VTvaf17- COL1A1, VTvaf17- COL1A2, VTvaf17- ВМР2, VTvaf17-BMP7,
во 2-й группе - неочищенного кальций-фосфатный преципитата генотерапевтических ДНК-векторов VTvaf17-COL1A1, VTvaf17- COL1A2, VTvaf17- ВМР2, VTvaf17- BMP7,
в 3-й группе (контрольной) - физраствора,
COL1A1
COL1A2
На фигуре 13В представлена диаграмма изменения количества белков: костного морфогенетического белка 2 (ВМР2), костного морфогенетического белка 7 (ВМР7) в костных биоптатах крыс в зоне хирургически-смоделированной травмы после инъекционного введения в травмированную зону крысы:
в 1-й группе смеси генотерапевтических ДНК-векторов VTvaf17- COL1A1, VTvaf17- COL1A2, VTvaf17- ВМР2, VTvaf17- BMP7,
во 2-й группе - неочищенного кальций-фосфатный преципитата генотерапевтических ДНК-векторов VTvaf17- COL1A1, VTvaf17- COL1A2, VTvaf17- ВМР2, VTvaf17- BMP7,
в 3-й группе (контрольной) - физраствора,
ВМР2
ВМР7
На фиг. 14 представлены графики накопления мРНК целевого гена ВМР2 в культуральной среде клеток остеобластов собаки CnOb до трансфекции ДНК-вектором VTvaf17- ВМР2 и через 48 часов после трансфекции этих клеток ДНК-вектором VTvaf17- ВМР2, где
1 - кДНК гена ВМР2 в клетках остеобластов собаки CnOb до трансфекции ДНК-вектором VTvaf17- BMP2,
2 - кДНК гена ВМР2 в клетках остеобластов собаки CnOb после трансфекции ДНК-вектором VTvaf17- ВМР2,
3 - кДНК гена ACT в клетках остеобластов собаки CnOb до трансфекции ДНК-вектором VTvaf17- ВМР2,
4 - кДНК гена ACT в клетках остеобластов собаки после трансфекции ДНК-вектором VTvaf17-BMP2,
В качестве референтного гена использовали ген актина собаки (ACT), приведенного в базе данных GenBank под номером DQ131478.1.
Реализация изобретения
На основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17 размером 3165 п.н. созданы генотерапевтические ДНК-векторы, несущие целевые гены человека - ген COL1A1 белка альфа1-цепи коллагена I типа, или ген COL1A2 белка альфа2-цепи коллагена I типа, или ген костного морфогенетического белка ВМР-2, или ген костного морфогенетического белка ВМР-7, предназначенные для повышения уровня экспрессии этих целевых генов в тканях человека и животных. При этом способ получения каждого генотерапевтического ДНК-вектора, несущего целевые гены человека заключается в том, что в полилинкер генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17 клонируют белок-кодирующую последовательность целевого гена, выбранного из группы генов: COL1A1, COL1A2, ВМР2, ВМР7.
Способ получения генотерапевтического ДНК-вектора на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, несущего целевой ген, выбранный из группы генов: COL1A1, COL1A2, ВМР2, ВМР7 заключается в том, что:
1. кодирующую часть гена COL1A1 размером 4422 п.н., или гена COL1A2 размером 4128 п.н., или гена ВМР2 размером 1219 п.н., или гена ВМР7 размером 1322 п.н. получали путем выделения суммарной РНК из биологического образца ткани здорового человека с последующим проведением реакции обратной транскрипции и ПЦР-амплификации, с использованием созданных для этого методом химического синтеза олигонуклеотидов, с последующим расщеплением продукта амплификации эндонуклеазами рестрикции и
2. кодирующую часть целевого гена COL1A1, или COL1A2, или ВМР2, или ВМР7 клонировали в полилинкер генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17 по сайтам и и получали генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-COL1A1, SEQ ID №1, или VTvaf17- COL1A2, SEQ ID №2 или VTvaf17-BMP2, SEQ ID №3, или VTvaf17- BMP7, SEQ ID №4. Полученным генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17, несущий целевой ген, выбранный из группы генов COL1A1, COL1A2, ВМР2, ВМР7 трансформировали методом электропорации бактерии Escherichia coli SCS110-AF, а селекцию полученных клонов проводили без антибиотиков.
3. для подтверждения эффективности созданного генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17- COL1A1, SEQ ID №1, или VTvaf17- COL1A2, SEQ ID №2 или VTvaf17-BMP2, SEQ ID №3, или VTvaf17- BMP7, SEQ ID №4 оценивали:
A) изменение накопления мРНК целевых генов в клетках человека и животного, после трансфекции различных клеточных линий генотерапевтическими ДНК-векторами (методом ПЦР в реальном времени-RT-PCR);
B) изменение количественного уровня целевых белков в культуральной среде клеток человека, после трансфекции различных клеточных линий генотерапевтическими ДНК-векторами (методом иммуноферментного анализа - ИФА);
C) изменение количественного уровня целевых белков в супернатанте биоптатов тканей человека и животного, после введения в эти ткани генотерапевтических ДНК-векторов (методом ИФА);
D) изменение количественного уровня целевых белков в супернатанте биоптатов тканей человека, после введения в эти ткани аутологичных клеток этого человека, трансфицированных генотерапевтическими ДНК-векторами (методом ИФА);
Для подтверждения реализуемости способа применения созданного генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17- COL1A1, SEQ ID №1, или VTvaf17- COL1A2, SEQ ID №2 или VTvaf17-BMP2, SEQ ID №3, или VTvaf17- BMP7, SEQ ID №4 выполняли:
A) трансфекцию генотерапевтическими ДНК-векторами различных клеточных линий человека;
B) введение генотерапевтических ДНК-векторов в различные ткани человека и животного;
C) введение в ткани животного смеси генотерапевтических ДНК-векторов;
D) введение в ткани человека аутологичных клеток, трансфицированных генотерапевтическими ДНК-векторами.
Для подтверждения получения штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17- COL1A1, или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17- COL1A2, или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17- BMP2, или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17- BMP7, проводили трансформацию, селекцию и последующее наращивание с выделением плазмидной ДНК.
Для подтверждения технологичности получения и возможности производства в промышленных масштабах генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17- COL1A1, SEQ ID №1, или VTvaf17- COL1A2, SEQ ID №2 или VTvaf17-BMP2, SEQ ID №3, или VTvaf17- BMP7, SEQ ID №4 выполняли:
А) ферментацию в промышленном масштабе штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-COL1A1 или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-COL1A2 или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-BMP2, или штамма Escherichia coli SCS 110-AF/VTvaf17- BMP7, каждый из которых содержит генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17, несущий белок-кодирующую последовательность целевого гена, выбранного из группы генов: COL1A1, COL1A2, ВМР2, ВМР7.
Пример 1.
Получение генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-COL1A1, несущего целевой ген COL1A1.
Генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-COL1A1 конструировали клонированием кодирующей части гена COL1A1 в ДНК-вектор VTvaf17 по сайтам рестрикции и . Кодирующую часть гена COL1A1 размером 4422 п.н. получали путем выделения суммарной РНК из биологического образца ткани человека с последующим проведением реакции обратной транскрипции с использованием коммерческого набора Mint-2 (Евроген, Россия) и созданных олигонуклеотидов
и ПЦР-амплификации с использованием коммерческого набора Phusion® High-Fidelity DNA Polymerase (New England Biolabs, США) и созданных олигонуклеотидов
Расщепление продукта амплификации кодирующей части гена COL1A1 и ДНК-вектора VTvaf17 проводили эндонуклеазами рестрикции и (New England Biolabs, США).
В результате получали ДНК-вектор VTvaf17- COL1A1 с нуклеотидной последовательностью SEQ ID №1, несущий целевой ген, а именно, ген COL1A1, размером 4422 п.н. с возможностью селекции без антибиотиков со структурой изображенной на фиг. 1.А.
При этом генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17 конструировали объединением шести фрагментов ДНК, полученных из разных источников:
(а) область начала репликации (ori) получали путем ПЦР-амплификации участка коммерческой плазмиды pBR322 с внесением точечной мутации;
(б) промоторный регион EF1a получали путем ПЦР-амплификации участка геномной ДНК человека;
(в) терминатор транскрипции hGH-TA получали путем ПЦР-амплификации участка геномной ДНК человека;
(г) регуляторный участок транспозона Tn10 РНК-out получали путем синтеза из олигонуклеотидов;
(д) ген устойчивости к канамицину получали путем ПЦР-амплификации участка коммерческой плазмиды рЕТ-28 человека;
(е) полилинкер получали отжигом двух синтетических олигонуклеотидов.
ПЦР-амплификацию проводили с использованием коммерческого набора Phusion® High-Fidelity DNA Polymerase (New England Biolabs) в соответствии с инструкцией производителя. Фрагменты имеют перекрывающиеся области для возможности их объединения с последующей ПЦР-амплификацией. Объединяли фрагменты (а) и (б) с использованием олигонуклеотидов Ori-F и EF1-R, а также фрагменты (в), (г) и (д) с использованием олигонуклеотидов hGH-F и Kan-R. Далее, полученные участки объединяли путем рестрикции с последующим лигированием по сайтам BamHI и . В результате получали плазмиду, пока еще не содержащую полилинкер. Для его введения проводили расщепление плазмиды по сайтам и , и лигирование с фрагментом (е). Таким образом, получали вектор размером 3165 п.н., несущий ген устойчивости к канамицину, который фланкирован сайтами рестрикции . Далее этот участок выщепляли по сайтам рестрикции , после чего оставшийся фрагмент лигировали сам на себя. Таким образом получали генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17 размером 3165 п.н., который является рекомбинантным, с возможностью селекции без антибиотиков.
Пример 2.
Получение генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-COL1A2, несущего целевой ген COL1A2.
Генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17- COL1A2 конструировали клонированием кодирующей части гена COL1A2 в ДНК-вектор VTvaf17 по сайтам рестрикции и . Кодирующую часть гена COL1A2 размером 4128 п.н. получали путем выделения суммарной РНК из биологического образца ткани человека с последующим проведением реакции обратной транскрипции с использованием коммерческого набора Mint-2 (Евроген, Россия) и созданных олигонуклеотидов
и ПЦР-амплификации с использованием коммерческого набора Phusion® High-Fidelity DNA Polymerase (New England Biolabs, США) и созданных олигонуклеотидов
Расщепление продукта амплификации кодирующей части гена COL1A1 и ДНК-вектора VTvaf17 проводили эндонуклеазами рестрикции и (New England Biolabs, США).
В результате получили ДНК-вектор VTvaf17- COL1A2 размером 7269 п.н. с нуклеотидной последовательностью SEQ ID №2, несущий целевой ген, а именно, ген COL1A2, размером 4128 п.н. с возможностью селекции без антибиотиков, со структурой изображенной на фиг. 1.В.
При этом генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17 конструировали по Примеру 1.
Пример 3
Получение ДНК-вектора VTvaf17-ВМР2, несущего целевой ген ВМР2 человека.
Генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17- ВМР2 конструировали клонированием кодирующей части гена ВМР2 в ДНК-вектор VTvaf17 по сайтам рестрикции и . Кодирующую часть гена ВМР2 размером 1219 п.н. получали путем выделения суммарной РНК из биопсийного образца ткани человека с последующим проведением реакции обратной транскрипции с использованием коммерческого набора Mint-2 (Евроген, Россия) и созданных олигонуклеотидов
и ПЦР-амплификации с использованием коммерческого набора Phusion® High-Fidelity DNA Polymerase (New England Biolabs, США) и созданных олигонуклеотидов
Расщепление продукта амплификации кодирующей части гена COL1A1 и ДНК-вектора VTvaf17 проводили эндонуклеазами рестрикции и (New England Biolabs, США).
В результате получили генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-ВМР2 размером 4360 п.н. с нуклеотидной последовательностью SEQ ID №3 несущий целевой ген ВМР2, размером 1219 п.н. с возможностью селекции без антибиотиков, со структурой изображенной на фиг. 1.С.
При этом генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17 конструировали по Примеру 1.
Пример 4.
Получение генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-ВМР7, несущего целевой ген ВМР7.
Генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17- ВМР7 конструировали клонированием кодирующей части гена ВМР7 в ДНК-вектор VTvaf17 по сайтам рестрикции и . Кодирующую часть гена ВМР7 размером 1322 п.н. получали путем выделения суммарной РНК из биопсийного образца ткани человека с последующим проведением реакции обратной транскрипции с использованием коммерческого набора Mint-2 (Евроген, Россия) и созданных олигонуклеотидов
и ПЦР-амплификации с использованием коммерческого набора Phusion® High-Fidelity DNA Polymerase (New England Biolabs, США) и созданных олигонуклеотидов
Расщепление продукта амплификации кодирующей части гена COL1A1 и ДНК-вектора VTvaf17 проводили эндонуклеазами рестрикции и (New England Biolabs, США).
В результате получили ДНК-вектор VTvaf17- ВМР7 размером 4463 п.н. с нуклеотидной последовательностью SEQ ID №4, несущий целевой ген, а именно, ген ВМР7, размером 1322 п.н. с возможностью селекции без антибиотиков со структурой изображенной на фиг. 1.D.
При этом генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17 конструировали по Примеру 1.
Пример 5.
Подтверждение эффективности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17- COL1A1, несущего целевой ген COL1A1. Данный пример также демонстрирует реализуемость способа применения генотерапевтического ДНК-вектора, несущего целевой ген COL1A1.
Для подтверждения эффективности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17- COL1A1 оценивали изменения накопления мРНК целевого гена COL1A1, в клетках первичной культуры фибробластов кожи человека HDFa (АТСС PCS-201-012) через 48 часов после их трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17- COL1A1.
Клетки первичной культуры фибробластов кожи человека HDFa выращивали в среде Fibroblast Basal Medium (АТСС PCS-201-030) с добавлением компонентов входящих в состав набора Fibroblast Growth Kit-Serum-Free (АТСС PCS-201-040) в атмосфере 5% CO2 при 37°С. Для получения 90% конфлюэнтности, за 24 часа до постановки трансфекции клетки высевали в 24-луночный планшет из расчета 5×104 клеток/лунку.
Для трансфекции использовали реагент Lipofectamine 3000 (ThermoFisher Scientific, США). Трансфекцию генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17- COL1A1 проводили следующим образом. В пробирке №1 к 25 мкл среды Opti-MEM (Gibco) добавляли 1 мкл раствора ДНК-вектора VTvaf17-COL1A1 (концентрация 500 нг/мкл) и 1 мкл реагента Р3000. Аккуратно перемешивали легким встряхиванием. В пробирке №2 к 25 мкл среды Opti-MEM (Gibco) добавляли 1 мкл раствора Lipofectamine 3000. Аккуратно перемешивали легким встряхиванием. Добавляли содержимое пробирки №1 к содержимому пробирки №2, инкубировали 5 мин при комнатной температуре. Полученный раствор по каплям добавляли к клеткам в объеме 40 мкл.
В качестве контроля использовали фибробласты кожи человека HDFa, трансфицированные генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17, не содержащим вставку целевого гена (кДНК гена COL1A1 до и после трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17, не содержащим вставку целевого гена на фигурах не показано для упрощения визуализации). Подготовку контрольного вектора VTvaf17 для трансфекции проводили как описано выше.
Суммарную РНК из трансфицированных клеток выделяли следующим образом. В лунку с клетками добавляли 1 мл Trizol Reagent (ThermoFisher Scientific) и гомогенизировали с последующим прогреванием в течение 5 мин при 65°С. Далее образец центрифугировали при 14000 g в течение 10 мин и снова прогревали в течение 10 мин при 65°С. Далее добавляли 200 мкл хлороформа, плавно перемешивали и центрифугировали при 14000 g в течение 10 мин. Затем отбирали водную фазу, добавляли к ней 1/10 объема 3М ацетата натрия рН5.2 и равный объем изопропилового спирта. Инкубировали образец при -20°С в течение 10 мин с последующим центрифугированием при 14000 g в течение 10 мин. Осадок промывали 1 мл 70% этилового спирта, высушивали на воздухе и растворяли в 10 мкл воды, свободной от РНКаз. Для определения уровня экспрессии мРНК гена COL1A1 после трансфекции использовали метод ПЦР в режиме реального времени (SYBR GreenRealTimePCR). Для амплификации кДНК, специфичной для гена COL1A1 человека, использовали олигонуклеотиды COL1A1_SF и COL1A1_SR согласно Примеру 1. Длина продукта амплификации - 756 п.н. В качестве референтного гена использовали ген бета-2-микроглобулина В2М.
ПЦР-амплификацию проводили с помощью набора реагентов SYBR GreenQuantitect RT-PCR Kit (Qiagen, США) в режиме реального времени в 20 мкл амплификационной смеси, содержащей: 25 мкл QuantiTect SYBR Green RT-PCR MasterMix, 2,5 mM хлорида магния, по 0,5 мкМ каждого праймера, 5 мкл суммарной РНК. Реакцию осуществляли на амплификаторе CFX96 (Bio-Rad, USA) при следующих условиях: 1 цикл обратной транскрипции при 42°С 30 минут, денатурация 98°С - 15 мин, затем 40 циклов, включающих денатурацию 94°С - 15 сек, отжиг праймеров 60°С - 30 сек и элонгацию 72°С - 120 сек. В качестве положительного контроля использовали ампликоны, получаемых при ПЦР на матрицах, представляющих собой плазмиды в известных концентрациях, содержащие последовательности кДНК генов COL1A1 и В2М. В качестве отрицательного контроля использовали деионизированную воду. Количество ПЦР продуктов - кДНК генов COL1A1 и В2М, полученных в результате амплификации, оценивали в режиме реального времени с помощью программного обеспечения амплификатора Bio-RadCFXManager2.1.
С целью подтверждения увеличения экспрессии гена COL1A1 в культуре клеток фибробластов кожи человека HDFa после трансфекции данных клеток генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17- COL1A1 на фиг. 2 приведены графики накопления ПЦР-продуктов, из которых следует, что в результате трансфекции первичной культуры фибробластов кожи человека HDFa генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17- COL1A1, уровень специфической мРНК гена COL1A1 человека вырос многократно. Это свидетельствует об эффективности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17- COL1A1. Представленные результаты также подтверждают реализуемость способа применения генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-COL1A1 для повышения уровня экспрессии гена COL1A1 в эукариотических клетках.
Пример 6.
Подтверждение эффективности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17- COL1A2, несущего целевой ген COL1A2. Данный пример также демонстрирует реализуемость способа применения генотерапевтического ДНК-вектора, несущего целевой ген COL1A2.
Для подтверждения эффективности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17- COL1A2, несущего целевой ген COL1A2, оценивали изменения накопления мРНК целевого гена COL1A2 в фибробластах кожи человека через 48 часов после их трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-COL1A2.
Культуру фибробластов кожи человека выращивали следующим образом. Брали биопсийный образец из зоны за мочкой уха пациента используя устройство для взятия биопсии DERMO PUNCH (компания Medax, USA). Кожу пациента в зоне отбора биоптата предварительно дезинфицировали 70% раствором этанола, промывали стерильным физиологическим раствором и анестезировали раствором лидокаина. Размер биопсийного образца составлял около 10 куб. мм, масса - около 11 мг. Образец помещали в буферный раствор, содержащий 0,05% трипсин (Gibco), 10 мМ ЭДТА. Клетки инкубировали при помешивании на магнитной мешалке при 37°С. Далее суспензию клеток фильтровали, используя фильтры с диамером пор 100 мкм (Nalgen, США), центрифугировали в течение 10 мин 130 g, осадок ресуспендировали в 15 мл среды Fibroblast Basal Medium (АТСС PCS-201-030) с добавлением компонентов входящих в состав набора Fibroblast Growth Kit-Serum-Free (АТСС PCS-201-040), помещали во флакон площадью 75 см2 (Eppendorf) и инкубировали в течение 36-72 часов при 37°С в атмосфере 5% CO2. Для получения 90% конфлюэнтности, за 24 часа до постановки трансфекции клетки высевали в 24-луночный планшет из расчета 4*104 клеток/лунку в среде того же состава. Для трансфекции использовали реагент Lipofectamine 3000 (ThermoFisher Scientific, США). Трансфекцию генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17- COL1A2, экспрессирующим ген COL1A2 человека проводили, как описано в примере 5. В качестве контроля использовали эти же клетки, трансфицированные генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17 (кДНК гена COL1A2 до и после трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17, не содержащим вставку целевого гена на фигурах не показано для упрощения визуализации). Выделение суммарной РНК из трансфицированных клеток и построение первой цепи кДНК проводили как описано в примере 5. Для определения уровня экспрессии мРНК гена COL1A2 после трансфекции использовали метод ПЦР в режиме реального времени (SYBR GreenRealTimePCR). Для амплификации кДНК, специфичной для гена COL1A2 человека, использовали олигонуклеотиды COL1A2_SF и COL1A2_SR согласно Примеру 2. Длина продукта амплификации - 853 п.н. В качестве референтного гена использовали ген бета-2-микроглобулина В2М.
ПЦР-амплификацию проводили с помощью набора реагентов SYBR GreenQuantitect RT-PCR Kit (Qiagen, США) в режиме реального времени в 20 мкл амплификационной смеси, содержащей: 25 мкл QuantiTect SYBR Green RT-PCR MasterMix, 2,5 mM хлорида магния, по 0,5 мкМ каждого праймера, 5 мкл суммарной РНК. Реакцию осуществляли на амплификаторе CFX96 (Bio-Rad, USA) при следующих условиях: 1 цикл обратной транскрипции при 42°С - 30 минут, денатурация 98°С - 15 мин, затем 40 циклов, включающих денатурацию 94°С - 15 сек, отжиг праймеров 60°С - 30 сек и элонгацию 72°С - 120 сек. В качестве положительного контроля использовали ампликоны, получаемых при ПЦР на матрицах, представляющих собой плазмиды в известных концентрациях, содержащие последовательности кДНК генов COL1A2 и В2М. В качестве отрицательного контроля использовали деионизированную воду. Количество ПЦР продуктов - кДНК генов COL1A2 и В2М, полученных в результате амплификации, оценивали в режиме реального времени с помощью программного обеспечения амплификатора Bio-RadCFXManager2.1.
С целью подтверждения увеличения экспрессии гена COL1A2 в культуре фибробластов кожи человека после трансфекции данных клеток генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-COL1A2, на фиг. 3 приведены графики накопления ПЦР-продуктов, из которых следует, что в результате трансфекции клеток культуры фибробластов кожи человека генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-COL1A2, несущим целевой ген COL1A2 человека, уровень специфической мРНК гена COL1A2 человека вырос многократно. Это свидетельствует об эффективности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-COL1A2. Представленные результаты также подтверждают реализуемость способа применения генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-COL1A2 для повышения уровня экспрессии гена COL1A2 в эукариотических клетках.
Пример 7.
Подтверждение эффективности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-ВМР2, несущего целевой ген ВМР2. Данный пример также демонстрирует реализуемость способа применения генотерапевтического ДНК-вектора, несущего целевой ген ВМР2.
Для подтверждения эффективности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-BMP2, несущего целевой ген ВМР2, оценивали изменения накопления мРНК целевого гена ВМР2 в клетках остеосаркомы человека MG-63 (АТСС CRL-1427) через 48 часов после их трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-BMP2.
Клетки остеосаркомы человека MG-63 культивировали в среде DMEM (Gibco) с добавлением 10% сыворотки эмбрионов коров (Gibco) и 10 мкг/мл гентамицина при 37 С в атмосфере 5% CO2. Для получения 90% конфлюэнтности, за 24 часа до постановки трансфекции клетки высевали в 24-луночный планшет из расчета 5×104 клеток/лунку. Для трансфекции использовали реагент Lipofectamine 3000 (ThermoFisher Scientific, США). Трансфекцию генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17- ВМР2, экспрессирующим ген ВМР2 человека, проводили как описано в примере 5. В качестве контроля использовали клетки остеосаркомы человека MG-63, трансфицированные генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17 (кДНК гена ВМР2 до и после трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17, не содержащим вставку целевого гена на фигурах не показано для упрощения визуализации). Выделение суммарной РНК из трансфицированных клеток и построение первой цепи кДНК проводили как описано в примере 5. Для определения уровня экспрессии мРНК гена ВМР2 после трансфекции использовали метод ПЦР в режиме реального времени (SYBR GreenRealTimePCR). Для амплификации кДНК, специфичной для гена ВМР2 человека, использовали олигонуклеотиды BMP2_SF и BMP2_SR согласно Примеру 3. Длина продукта амплификации -353 п.н. В качестве референтного гена использовали ген бета-2-микроглобулина В2М.
ПЦР-амплификацию проводили с помощью набора реагентов SYBR GreenQuantitect RT-PCR Kit (Qiagen, США) в режиме реального времени в 20 мкл амплификационной смеси, содержащей: 25 мкл QuantiTect SYBR Green RT-PCR MasterMix, 2,5 mM хлорида магния, по 0,5 мкМ каждого праймера, 5 мкл суммарной РНК. Реакцию осуществляли на амплификаторе CFX96 (Bio-Rad, USA) при следующих условиях: 1 цикл обратной транскрипции при 42°С - 30 минут, денатурация 98°С - 15 мин, затем 40 циклов, включающих денатурацию 94°С - 15 сек, отжиг праймеров 60°С - 30 сек и элонгацию 72°С - 30 сек. В качестве положительного контроля использовали ампликоны, получаемых при ПЦР на матрицах, представляющих собой плазмиды в известных концентрациях, содержащие последовательности кДНК генов ВМР2 и В2М. В качестве отрицательного контроля использовали деионизированную воду. Количество ПЦР продуктов - кДНК генов ВМР2 и В2М, полученных в результате амплификации, оценивали в режиме реального времени с помощью программного обеспечения амплификатора Bio-RadCFXManager2.1.
С целью подтверждения увеличения экспрессии гена ВМР2 в клетках остеосаркомы человека MG-63 после трансфекции данных клеток генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17- ВМР2 на фиг. 4 приведены графики накопления ПЦР-продуктов, из которых следует, что в результате трансфекции клеток остеосаркомы человека MG-63 генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17- ВМР2, несущим целевой ген ВМР2 человека, уровень специфической мРНК гена ВМР2 человека вырос многократно. Это свидетельствует об эффективности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17- ВМР2. Представленные результаты также подтверждают реализуемость способа применения генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-ВМР2 для повышения уровня экспрессии гена ВМР2 в эукариотических клетках.
Пример 8.
Подтверждение эффективности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-ВМР7, несущего целевой ген. Данный пример также демонстрирует реализуемость способа применения генотерапевтического ДНК-вектора, несущего целевой ген ВМР7..
Для подтверждения эффективности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-ВМР7 оценивали изменения накопления мРНК целевого гена ВМР7 в первичной культуре остеобластов человека hFOB 1.19 (АТСС CRL-11372) через 48 часов после их трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-ВМР7.
Линию первичной культуры остеобластов человека hFOB 1.19 выращивают в смеси сред F12 (Gibco, США) и DMEM (Gibco, США) (1:1), содержащей 2 мМ L-глутамина, 0.3 мг/мл G418 и 10% сыворотки эмбрионов коров (Gibco, США) в атмосфере 5% CO2 при 37°С. Для получения 90% конфлюэнтности, за 24 часа до постановки трансфекции клетки высевали в 24-луночный планшет из расчета 5×104 клеток/лунку.
Для трансфекции использовали реагент Lipofectamine 3000 (ThermoFisher Scientific, США). Трансфекцию генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-ВМР7, экспрессирующим ген ВМР7 человека, проводили как описано в примере 5. В качестве контроля использовали клетки остеобластов человека hFOB 1.19, трансфицированные генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17 (кДНК гена ВМР7 до и после трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17, не содержащим вставку целевого гена на фигурах не показано для упрощения визуализации). Выделение суммарной РНК из трансфицированных клеток и построение первой цепи кДНК проводили как описано в примере 5. Для определения уровня экспрессии мРНК гена ВМР7 после трансфекции использовали метод ПЦР в режиме реального времени (SYBR GreenRealTimePCR). Для амплификации кДНК, специфичной для гена ВМР7 человека, использовали олигонуклеотиды BMP7_SF и BMP7_SR согласно Примеру 4. Длина продукта амплификации - 459 п.н. В качестве референтного гена использовали ген бета-2-микроглобулина В2М.
ПЦР-амплификацию проводили с помощью набора реагентов SYBR GreenQuantitect RT-PCR Kit (Qiagen, США) в режиме реального времени в 20 мкл амплификационной смеси, содержащей: 25 мкл QuantiTect SYBR Green RT-PCR MasterMix, 2,5 mM хлорида магния, по 0,5 мкМ каждого праймера, 5 мкл суммарной РНК. Реакцию осуществляли на амплификаторе CFX96 (Bio-Rad, USA) при следующих условиях: 1 цикл обратной транскрипции при 42°С 30 минут, денатурация 98°С - 15 мин, затем 40 циклов, включающих денатурацию 94°С - 15 сек, отжиг праймеров 60°С - 30 сек и элонгацию 72°С - 30 сек. В качестве положительного контроля использовали ампликоны, получаемых при ПЦР на матрицах, представляющих собой плазмиды в известных концентрациях, содержащие последовательности кДНК генов ВМР7 и В2М. В качестве отрицательного контроля использовали деионизированную воду. Количество ПЦР продуктов - кДНК генов ВМР7 и В2М, полученных в результате амплификации, оценивали в режиме реального времени с помощью программного обеспечения амплификатора Bio-RadCFXManager 2.1.
С целью подтверждения увеличения экспрессии гена ВМР7 в клетках остеобластов человека hFOB 1.19 после трансфекции данных клеток генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-ВМР7, несущим целевой ген ВМР7 на фиг. 5 приведены графики накопления ПЦР-продуктов, из которых следует, что в результате трансфекции первичной культуры остеобластов человека hFOB 1.19 генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17- ВМР7, несущим целевой ВМР7 человека, уровень специфической мРНК гена ВМР7 человека вырос многократно. Это свидетельствует об эффективности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-ВМР7 и подтверждает реализуемость способа его использования. Представленные результаты также подтверждают реализуемость способа применения генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-ВМР7 для повышения уровня экспрессии гена ВМР7 в эукариотических клетках.
Пример 9.
Подтверждение эффективности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17- COL1A1, несущего целевой ген, а именно, ген COL1A1 и реализуемости способа его использования.
Для подтверждения эффективности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17- COL1A1, несущего целевой ген, а именно, ген COL1A1 и реализуемости способа его использования оценивали изменение количества белка альфа-1 цепи коллагена I типа в культуральной среде клеток первичной культуры фибробластов кожи человека HDFa (АТСС PCS-201-012) после трансфекции этих клеток ДНК-вектором VTvaf17- COL1A1, несущим ген COL1A1 человека.
Для оценки изменения количества белка альфа-1 цепи коллагена I типа, использовали клетки первичной культуры фибробластов кожи человека HDFa, которые выращивали по примеру 5.
В качестве транспортной молекулы использовали дендримеры SuperFect Transfection Reagent 6-го поколения (Qiagen, Германия), в качестве контроля - водный раствор дендримеров без ДНК-вектора (А), ДНК-вектор VTvaf17, не содержащий кДНК гена COL1A1 (В), в качестве трансфицируемых агентов - ДНК-вектор VTvaf17-COL1A1, несущий ген COL1A1 человека SEQ ID No: 1 (С). Приготовление комплекса ДНК/дендример проводили по методике производителя (QIAGEN, SuperFect Transfection Reagent Handbook, 2002) с некоторыми изменениями. Для трансфекции клеток в одной лунке 24-луночного планшета к 1 мкг ДНК-вектора, растворенного в буфере ТЕ, добавляли среду DMEM не содержащую антибиотиков, до конечного объема 60 мкл, затем добавляли 5 мкл SuperFect Transfection Reagent и осторожно перемешивали пятикратным пипетированием. Комплекс инкубировали при комнатной температуре в течение 10-15 мин. Далее отбирали из лунок культуральную среду, лунки промывали 1 мл буфера PBS. К образовавшемуся комплексу добавляли 350 мкл полной среды DMEM, содержащей 10 мкг/мл гентамицина, осторожно перемешивали и добавляли к клеткам. Клетки инкубировали с комплексом 2-3 часа при 37°С в атмосфере, содержащей 5% CO2.
Затем осторожно удаляли среду, промывали клеточный монослой 1 мл буфера PBS. Затем добавляли полную среду DMEM, содержащую 10 мкг/мл гентамицина и инкубировали 24-48 часов при 37°С в атмосфере 5% CO2.
После трансфекции к 0,5 мл культуральной жидкости приливали 0,1 мл 1N HCl, тщательно перемешивали и инкубировали 10 минут при комнатной температуре. Затем нейтрализовали смесь, добавляя 0,1 мл 1.2N NaOH/0.5M HEPES (рН 7-7,6) и тщательно перемешивали. Отбирали супернатант и использовали его для количественного определения целевого белка. Количественное определение белка COL1A1 проводили методом твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), используя набор Human collagen, type I, alpha 1 (COL1A1) ELISA Kit (MyBioSource, США) согласно методике производителя с детекцией оптической плотности при длине волны 450 нм при помощи автоматического биохимического и иммуноферментного анализатора ChemWell (Awareness Technology Inc., США).
Численное значение концентрации определяли с помощью калибровочной кривой, построенной по стандартным образцам с известной концентрацией белка альфа-1 цепи коллагена I типа, входящим в состав набора. Статистическую обработку полученных результатов осуществляли с помощью программного обеспечения для статистической обработки и визуализации данных R, версия 3.0.2 (https://www.r-project.org/).
Диаграмма, полученная в результате анализа представлена на фиг. 6, из которой следует, что трансфекция клеток первичной культуры фибробластов кожи человека HDFa генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-COL1A1, несущим ген COL1A1, приводит к увеличению количества белка альфа-1 цепи коллагена I типа по сравнению с контрольными образцами, что свидетельствует об эффективности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-COL1A1 и подтверждает способность вектора проникать в эукариотические клетки и экспрессировать ген COL1A1 на уровне белка. Представленные результаты также подтверждают реализуемость способа применения генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17- COL1A1 для повышения уровня экспрессии COL1A1 в эукариотических клетках.
Пример 10.
Подтверждение эффективности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17- COL1A2, несущего целевой ген, а именно, ген COL1A2 и реализуемости способа его использования.
Для подтверждения эффективности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17- COL1A2, несущего целевой ген, а именно, ген COL1A2 и реализуемости способа его использования оценивали изменение количества белка альфа-2 цепи коллагена I типа в культуральной среде клеток культуры фибробластов кожи человека после трансфекции этих клеток ДНК-вектором VTvaf17-COL1A2, несущим ген COL1A2 человека.
Для оценки изменения количества белка альфа-2 цепи коллагена I типа клетки культуры фибробластов кожи человека выращивали как описано в примере 6. В качестве транспортной молекулы использовали дендримеры SuperFect Transfection Reagent 6-го поколения (Qiagen, Германия), в качестве контроля - водный раствор дендримеров без ДНК-вектора (А), ДНК-вектор VTvaf17, не содержащий кДНК гена COL1A2 (В), в качестве трансфицирующих агентов - ДНК-вектор VTvaf17- COL1A2, несущий ген COL1A2 человека SEQ ID No: 2 (С). Приготовление комплекса ДНК-дендример и трансфекцию культуры клеток фибробластов кожи человека проводили как описано в примере 9.
После трансфекции клетки промывали три раза PBS, далее к клеткам добавляли 1 мл PBS и подвергали трехкратному замораживанию/оттаиванию. Далее суспензию центрифугировали при 15000 об/мин в течение 15 мин, отбирали супернатант и использовали его для количественного определения целевого белка.
Количественное определение продукта гена COL1A2 проводили методом твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), используя набор Human Collagen Type I Alpha 2 (COL1A2) ELISA Kit (MyBioSource, США) согласно методике производителя с детекцией оптической плотности при длине волны 450 нм при помощи автоматического биохимического и иммуноферментного анализатора ChemWell (Awareness Technology Inc., США).
Численное значение концентрации определяли с помощью калибровочной кривой, построенной по стандартным образцам с известной концентрацией белка альфа-2 цепи коллагена I типа, входящим в состав набора
Статистическую обработку полученных результатов осуществляли с помощью программного обеспечения для статистической обработки и визуализации данных R, версия 3.0.2 (https://www.r-project.org/).
Диаграмма, полученная в результате анализа представлена на фиг. 7, из которой следует, что трансфекция клеток фибробластов кожи человека генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-COL1A2, несущим ген COL1A2, приводит к увеличению количества белка альфа-2 цепи коллагена I типа по сравнению с контрольными образцами, что свидетельствует об эффективности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17- COL1A2 и подтверждает способность вектора проникать в эукариотические клетки и экспрессировать ген COL1A2 на уровне белка. Представленные результаты также подтверждают реализуемость способа применения генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-COL1A2 для повышения уровня экспрессии COL1A2 в эукариотических клетках.
Пример 11.
Подтверждение эффективности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17- ВМР2, несущего целевой ген, а именно, ген ВМР2 и реализуемости способа его использования.
Для подтверждения эффективности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-ВМР2, несущего целевой ген ВМР2, и реализуемости способа его использования оценивали изменение количества костного морфогенетического белка 2 в культуральной среде клеток остеосаркомы человека MG-63 (АТСС CRL-1427) после трансфекции этих клеток ДНК-вектором VTvaf17- ВМР2, несущим ген ВМР2 человека.
Для оценки изменения количества костного морфогенетического белка 2 культуру клеток остеосаркомы человека MG-63 выращивали как описано в примере 7. В качестве транспортной молекулы использовали дендримеры SuperFect Transfection Reagent 6-го поколения (Qiagen, Германия), в качестве контроля - водный раствор дендримеров без ДНК-вектора (А), ДНК-вектор VTvaf17, не содержащий кДНК гена ВМР2 (В), в качестве трансфицируемых агентов - ДНК-вектор VTvaf17- ВМР2, несущий целевой ген ВМР2 человека SEQ ID No: 3 (С). Приготовление комплекса ДНК-дендример и трансфекцию клеток остеосаркомы человека MG-63 проводили согласно Примеру 9.
После трансфекции клетки промывали три раза PBS, далее к клеткам добавляли 1 мл PBS и подвергали трехкратному замораживанию/оттаиванию. Далее суспензию центрифугировали при 15000 об/мин в течение 15 мин, отбирали супернатант и использовали его для количественного определения целевого белка.
Количественное определение продукта гена ВМР-2 проводили методом твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), используя набор Human ВМР-2, ELISA Kit (MyBioSource, США) согласно методике производителя с детекцией оптической плотности при длине волны 450 нм при помощи автоматического биохимического и иммуноферментного анализатора ChemWell (Awareness Technology Inc., США).
Численное значение концентрации определяли с помощью калибровочной кривой, построенной по стандартным образцам с известной концентрацией костного морфогенетического белка 2, входящим в состав набора
Диаграмма, полученная в результате анализа представлена на фиг. 8, из которой следует, что трансфекция клеток остеосаркомы человека MG-63 генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17- ВМР2, несущим ген ВМР2, приводит к увеличению количества костного морфогенетического белка 2 по сравнению с контрольными образцами, что свидетельствует об эффективности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-ВМР2 и подтверждает способность вектора проникать в эукариотические клетки и экспрессировать ген ВМР2 на уровне белка. Представленные результаты также подтверждают реализуемость способа применения генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17- ВМР2 для повышения уровня экспрессии ВМР2 в эукариотических клетках.
Пример 12.
Подтверждение эффективности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17- ВМР7, несущего целевой ген, а именно, ген ВМР7 и реализуемости способа его использования.
Для подтверждения эффективности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-ВМР7, несущего целевой ген ВМР7, и реализуемости способа его использования оценивали изменение количества костного морфогенетического белка 7 в культуральной среде клеток остеобластов человека hFOB 1.19 (АТСС CRL-11372) после трансфекции этих клеток ДНК-вектором VTvaf17-ВМР7, несущим ген ВМР7 человека.
Для оценки изменения количества костного морфогенетического белка 7 культуру клеток остеобластов человека hFOB 1.19 выращивали как описано в примере 8. В качестве транспортной молекулы использовали дендримеры SuperFect Transfection Reagent 6-го поколения (Qiagen, Германия), в качестве контроля - водный раствор дендримеров без ДНК-вектора (А), ДНК-вектор VTvaf17, не содержащий кДНК гена ВМР7 (В), в качестве трансфицируемых агентов - ДНК-вектор VTvaf17-ВМР7, несущий целевой ген ВМР7 человека SEQ ID No: 4 (С). Приготовление комплекса ДНК-дендример и трансфекцию клеток остеобластов человека hFOB 1.19 проводили согласно Примеру 9.
После трансфекции клетки промывали три раза PBS, далее к клеткам добавляли 1 мл PBS и подвергали трехкратному замораживанию/оттаиванию. Далее суспензию центрифугировали при 15000 об/мин в течение 15 мин, отбирали супернатант и использовали его для количественного определения целевого белка.
Количественное определение продукта гена ВМР-7 проводили методом твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), используя набор Human ВМР-7, ELISA Kit (MyBioSource, США) согласно методике производителя с детекцией оптической плотности при длине волны 450 нм при помощи автоматического биохимического и иммуноферментного анализатора ChemWell (Awareness Technology Inc., США).
Численное значение концентрации определяли с помощью калибровочной кривой, построенной по стандартным образцам с известной концентрацией костного морфогенетического белка 7, входящим в состав набора
Диаграмма, полученная в результате анализа представлена на фиг. 9, из которой следует, что трансфекция клеток клеток остеобластов человека hFOB 1.19 генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17- ВМР7, несущим ген ВМР7, приводит к увеличению количества костного морфогенетического белка 7 по сравнению с контрольными образцами, что свидетельствует об эффективности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-ВМР7 и подтверждает способность вектора проникать в эукариотические клетки и экспрессировать ген ВМР7 на уровне белка. Представленные результаты также подтверждают реализуемость способа применения генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17- ВМР7 для повышения уровня экспрессии ВМР7 в эукариотических клетках.
Пример 13.
Подтверждение эффективности и реализуемости способа применения генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17- COL1A2, несущего ген COL1A2, для повышения экспрессии белка COL1A2 в тканях человека
С целью анализа изменения количества белка альфа-2 цепи коллагена I типа трем пациентам вводили в кожу предплечья генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17- COL1A2, несущий ген COL1A2 и параллельно вводили плацебо, представляющее собой генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17, не содержащий ген COL1A2.
Пациент 1, мужчина 65 лет, (П1); пациент 2, женщина 67 лет, (П2); пациент 3, мужчина, 62 года, (П3). В качестве транспортной системы использовали полиэтиленимин Transfection reagent cGMP grade in-vivo-jetPEI (Polyplus Transfection, Франция). Генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17- COL1A2, который содержит ген COL1A2 и генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17, используемый в качестве плацебо, растворяли в стерильной воде степени очистки Nuclease-Free. Комплексы ДНК- cGMP grade in-vivo-jetPEI готовили в соответствии с рекомендациями производителя.
Генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17 (плацебо) и генотерапевтический ДНК вектор VTvaf17- COL1A2 вводили в количестве 1 мг для каждой генетической конструкции тоннельным методом иглой 30G на глубину 3 мм. Объем вводимого раствора генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17 (плацебо) и генотерапевтического ДНК вектора VTvaf17-COL1A2 -0,3 мл для каждой генетической конструкции. Очаги введения каждой генетической конструкции располагались на участке предплечья на расстоянии 8-10 см друг от друга.
Биопсийные образцы отбирали на 2-е сутки после введения генетических конструкций генотерапевтических ДНК-векторов. Взятие биопсии осуществляли из участков кожи пациентов в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора VTvaf17-COL1A2, несущего ген COL1A2 (I), генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17 (плацебо) (II), а также из интактных участков кожи (III), используя устройство для взятия биопсии Epitheasy 3.5 (Medax SRL, Италия). Кожу пациентов в зоне отбора биоптата предварительно промывали стерильным физиологическим раствором и анестезировали раствором лидокаина. Размер биопсийного образца составлял около 10 куб. мм, масса - около 11 мг. Образец помещали в буферный раствор, содержащий 50 мМ Трис-HCl рН 7.6, 100 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА и 1 мМ фенилметилсульфонилфторид, и гомогенизировали до получения однородной суспензии. Полученную суспензию центрифугировали в течение 10 мин при 14000 g. Отбирали супернатант и использовали его для количественного определения целевого белка альфа-2 цепи коллагена I типа методом твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), используя набор Human Collagen Type I Alpha 2 (COL1A2) ELISA Kit (MyBioSource, США) согласно методике производителя с детекцией оптической плотности при длине волны 450 нм при помощи автоматического биохимического и иммуноферментного анализатора ChemWell (Awareness Technology Inc., США).
Численное значение концентрации определяли с помощью калибровочной кривой, построенной по стандартным образцам с известной концентрацией белка альфа-2 цепи коллагена I типа, входящим в состав набора. Диаграммы, полученные в результате анализа представлены на фиг. 10.
Из фигуры 10 следует, что в коже всех трех пациентов в области введения генотерапевтического ДНК вектора VTvaf17-COL1A2, несущего целевой ген COL1A2 человека, произошло увеличение количества белка альфа-2 цепи коллагена I типа в сравнении с количеством белка альфа-2 цепи коллагена I типа в области введения генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17 (плацебо), не содержащего ген COL1A2 человека, что свидетельствует об эффективности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-COL1A2 и подтверждает реализуемость способа его применения, в частности при введении генотерапевтического ДНК-вектора в ткани/ органы человека.
Пример 14.
Подтверждение эффективности и реализуемости способа применения генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17- COL1A1, несущего ген COL1A1, для повышения экспрессии белка COL1A1 в тканях человека
С целью анализа изменения количества белка альфа-1 цепи коллагена I типа трем пациентам вводили в хрящевую ткань ушных раковин с тыльной стороны генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17- COL1A1, несущий ген COL1A1 и параллельно вводили плацебо, представляющее собой генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17, не содержащий ген COL1A1.
Пациент 1, мужчина 65 лет, (П1); пациент 2, женщина 67 лет, (П2); пациент 3, мужчина, 62 года, (П3). В качестве транспортной системы использовали полиэтиленимин Transfection reagent cGMP grade in-vivo-jetPEI (Polyplus Transfection, Франция). Генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17- COL1A1, который содержит ген COL1A1 и генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17, используемый в качестве плацебо, растворяли в стерильной воде степени очистки Nuclease-Free. Комплексы ДНК- cGMP grade in-vivo-jetPEI готовили в соответствии с рекомендациями производителя.
Генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17 (плацебо) и генотерапевтический ДНК вектор VTvaf17- COL1A1 вводили в количестве 1 мг для каждой генетической конструкции тоннельным методом иглой 30G на глубину 1-2 мм в хрящевую ткань ушных раковин с тыльной стороны. Объем вводимого раствора генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17 (плацебо) и генотерапевтического ДНК вектора VTvaf17- COL1A1 - 0,2 мл для каждой генетической конструкции. Очаги введения биологически активной генно-терапевтической субстанции и плацебо располагались на расстоянии 2-3 см друг от друга.
Биопсийные образцы отбирали на 3-е сутки после введения генотерапевтических ДНК-векторов. Взятие биопсии осуществляли из участков кожи пациентов в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора VTvaf17- COL1A1, несущего ген COL1A1 (I), генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17 (плацебо) (II), а также из интактных участков (III), методом чрескожной пункционного биопсии при помощи одноразовой ручной биопсийной иглы и далее проводили манипуляции по примеру 13.
Количество белка альфа-1 цепи коллагена I типа оценивали в супернатантах биоптатов хрящевой ткани пациентов методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА ELISA), используя набор Human collagen, type I, alpha 1 (COL1A1) ELISA Kit (MyBioSource, США) согласно методике производителя с детекцией оптической плотности при длине волны 450 нм при помощи автоматического биохимического и иммуноферментного анализатора ChemWell (Awareness Technology Inc., США).
Численное значение концентрации определяли с помощью калибровочной кривой, построенной по стандартным образцам с известной концентрацией белка альфа-1 цепи коллагена I типа, входящим в состав набора. Диаграммы, полученные в результате анализа представлены на фиг. 11.
Из фигуры 11 следует, что в хрящевой ткани всех трех пациентов в области введения генотерапевтического ДНК вектора VTvaf17- COL1A1, несущего целевой ген COL1A1 человека, произошло увеличение количества белка альфа-1 цепи коллагена I типа в сравнении с количеством белка альфа-1 цепи коллагена I типа в области введения генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17 (плацебо), не содержащего ген COL1A1 человека, что свидетельствует об эффективности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17- COL1A1 и подтверждает реализуемость способа его применения, в частности при введении генотерапевтического ДНК-вектора в хрящевую ткань человека.
Пример 15.
Подтверждение эффективности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-COL1A1, несущего ген COL1A1 и реализуемости способа его применения для повышения уровня экспрессии белка COL1A1 в тканях человека путем введения аутологичных фибробластов, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17- COL1A1.
Для подтверждения эффективности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17- COL1A1, несущего ген COL1A1 и реализуемости способа его применения оценивали изменения количества белка COL1A1 в коже человека при введении в кожу пациента культуры аутогенных фибробластов этого пациента, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-COL1A1.
Пациенту вводили в кожу предплечья соответствующую культуру аутогенных фибробластов, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17- COL1A1, несущим ген COL1A1, и параллельно вводили плацебо, представляющее собой культуру аутогенных фибробластов пациента, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17, не несущим ген COL1A1.
Первичную культуру фибробластов человека выделяли из биоптатов кожи пациента. Используя устройство для взятия биопсии кожи Epitheasy 3.5 (Medax SRL, Италия) брали образец биоптата кожи из зоны, защищенной от действия ультрафиолета, а именно за ушной раковиной или с боковой внутренней поверхности в зоне локтевого сустава, размером около 10 кв. мм, массой - около 11 мг. Кожу пациента предварительно промывали стерильным физиологическим раствором и анестезировали раствором лидокаина. Культивирование первичной культуры клеток осуществляли при 37°С в атмосфере, содержащей 5% CO2 в среде DMEM с 10% фетальной телячьей сывороткой и ампициллином 100 Ед/мл. Пересев культуры и смену культуральной среды осуществляли каждые 2 дня. Общая продолжительность роста культуры не превышала 25-30 дней. Из культуры клеток отбирали аликвоту, содержащую 5×104 клеток. Культуру фибробластов пациента трансфицировали генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17- COL1A1, несущим ген COL1A1 или плацебо - вектор VTvaf17, не несущий целевой ген COL1A1.
Трансфекцию осуществляли с помощью катионного полимера полиэтиленимина JETPEI (Polyplus transfection, Франция), согласно инструкции фирмы-производителя. Клетки культивировали 72 часа и затем вводили пациенту. Введение пациенту культуры аутогенных фибробластов этого пациента, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-COL1A1, и плацебо, представляющее собой культуру аутогенных фибробластов пациента, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17, осуществляли туннельным методом в область предплечья иглой 30G длиной 13 мм на глубину около 3 мм. Концентрация модифицированных аутогенных фибробластов в вводимой суспензии составляла примерно 5 млн клеток на 1 мл суспензии, количество вводимых клеток не превышало 15 млн. Очаги введения культуры аутогенных фибробластов располагались на расстоянии 8-10 см друг от друга.
Биопсийные образцы отбирали на 4-е сутки после введения культуры аутогенных фибробластов, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17- COL1A1, несущим целевой ген, а именно, ген COL1A1 и плацебо. Взятие биопсии осуществляли из участков кожи пациента в зоне введения культуры аутогенных фибробластов, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17- COL1A1, несущим целевой ген COL1A1 (С), культуры аутогенных фибробластов, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17, не несущим целевой ген COL1A1 (плацебо) (В), а также из участков интактной кожи (А), используя устройство для взятия биопсии Epitheasy 3.5 (Medax SRL, Италия) и далее проводили манипуляции по примеру 13.
Количество белка альфа-1 цепи коллагена I типа оценивали в супернатантах биоптатов кожи пациентов методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА ELISA), используя набор Human collagen, type I, alpha 1 (COL1A1) ELISA Kit (MyBioSource, США) согласно методике производителя с детекцией оптической плотности при длине волны 450 нм при помощи автоматического биохимического и иммуноферментного анализатора ChemWell (Awareness Technology Inc., США).
Численное значение концентрации определяли с помощью калибровочной кривой, построенной по стандартным образцам с известной концентрацией белка альфа-1 цепи коллагена I типа, входящим в состав набора. Диаграммы, полученные в результате анализа, представлены на фиг. 12.
Из фигуры 12 следует, что в коже пациента в области введения культуры аутогенных фибробластов, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-COL1A1, несущим ген COL1A1, произошло увеличение количества белка COL1A1 в сравнении с количеством белка COL1A1 в области введения культуры аутогенных фибробластов, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17, не несущим ген COL1A1 (плацебо), что свидетельствует об эффективности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-COL1A1 и подтверждает реализуемость способа его применения для повышения уровня экспрессии COL1A1 в тканях/ органах человека, в частности при введении в кожу аутологичных фибробластов, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17- COL1A1.
Пример 16.
Подтверждение эффективности и реализуемости способа сочетанного применения генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17- COL1A1, несущего целевой ген COL1A1, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17- COL1A2, несущего целевой ген COL1A2, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-ВМР2, несущего целевой ген ВМР2, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17- ВМР7, несущего целевой ген ВМР7 для повышения уровня экспрессии белков COL1A1, COL1A2, ВМР2 и ВМР7 в тканях млекопитающих..
Для подтверждения эффективности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17- COL1A1, несущего целевой ген COL1A1, ДНК-вектора VTvaf17- COL1A2, несущего целевой ген, COL1A2, ДНК-вектора VTvaf17- ВМР2, несущего целевой ген ВМР2, ДНК-вектора VTvaf17- ВМР7, несущего целевой ген ВМР7 и реализуемости способа использования данных векторов оценивали изменение количества белков: белка альфа-1 цепи коллагена I типа, белка альфа-2 цепи коллагена I типа, костного морфогенетического белка 2, костного морфогенетического белка 7 соответственно в зоне предварительно хирургически-смоделированной травмы большеберцовой кости крысы Вистар (самцы, в возрасте 22-24 недель).
Было сформировано 3 группы животных по 11 особей в каждой.
Всем животным под анестезией была сделана хирургическая операция по созданию дефекта большеберцовой кости. В частности, по наружной поверхности правой голени был произведен разрез кожи длиной до 3.0 см. Далее были раздвинуты мышцы и осуществлен доступ к большеберцовой кости. В диафизарной области сверлом диаметром 2 мм вручную была произведена остеотомия до костного канала. После этого с помощью стального мандрена - иглы диаметром 1.6 мм по направлению к коленному эпифизу был пробит дефект глубиной примерно 10 мм. Дефект был заполнен через катетер РЕ-50 с помощью гамильтоновского шприца:
в 1-й группе смесью генотерапевтических ДНК-векторов VTvaf17- COL1A1, VTvaf17- COL1A2, VTvaf17- ВМР2, VTvaf17-BMP7 в объеме 20 мкл. (50 мкг.), причем раствор готовили из лиофилизата смеси кДНК и физраствора,
во 2-й группе - неочищенным кальций-фосфатный преципитатом смеси генотерапевтических ДНК-векторов VTvaf17-COL1A1, VTvaf17- C0L1A2, VTvaf17- BMP2, VTvaf17- BMP7 в объеме 20 мкл. (50 мкг.),
в 3-й группе (контрольной) - физраствором в объеме 20 мкл..
После моделирования дефекта большеберцовой кости и введения тестируемых ДНК-векторов и физраствора дефект герметизировали хирургическим воском.
Биопсийные образцы отбирали через 72 часа после введения смеси генотерапевтических ДНК-векторов и плацебо. Взятие биопсии осуществляли после некропсии животных из участков травмы в зоне введения смеси четырех генотерапевтических ДНК-векторов, несущих целевые гены COL1A1, COL1A2, ВМР2, ВМР7 (1-й группы), в зоне введения неочищенного кальций-фосфатного преципитата смеси четырех генотерапевтических ДНК-векторов, несущих целевые гены COL1A1, COL1A2, ВМР2, ВМР7 (2-й группы), в зоне введения физраствора (3-й группы). Масса каждого биопсийного образца составляла около 20 мг. Далее проводили манипуляции по примеру 13.
Количественное определение продуктов генов COL1A1, COL1A2, ВМР2, ВМР7 проводили методом твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), используя наборы Human collagen, type I, alpha 1 (COL1A1) ELISA Kit (MyBioSource, США), Human Collagen Type I Alpha 2 (COL1A2) ELISA Kit (MyBioSource, США, Human BMP-2, ELISA Kit (MyBioSource, США), Human BMP-7, ELISA Kit (MyBioSource, США). Подготовку тестируемых образцов, измерение и обработку результатов проводили как описано в Примерах 9, 10, 11, 12.
Диаграммы, полученные в результате анализа представлены на фиг. 13А и 13В, на которых показано, что в травмированной зоне животных в области введения преципитата смеси четырех генотерапевтических ДНК-векторов: VTvaf17-COL1A1, несущего целевой ген, COL1A1 человека, VTvaf17-COL1A2, несущего целевой COL1A2 человека, VTvaf17- ВМР2, несущего целевой ген ВМР2 человека, VTvaf17- ВМР7, несущего целевой ген ВМР7 человека в 1-й группе животных произошло существенное увеличение количества белков: белка альфа-1 цепи коллагена I типа, белка альфа-2 цепи коллагена I типа, костного морфогенетического белка 2, костного морфогенетического белка 7 в сравнении соответственно с количеством белков COL1A1 альфа-1 цепи коллагена I типа, альфа-2 цепи коллагена I типа, костного морфогенетического белка 2, костного морфогенетического белка 7 в контрольной 3-й группе. Также показано, что что в травмированной зоне животных в области введения смеси четырех генотерапевтических ДНК-векторов: VTvaf17- COL1A1, несущего целевой ген, COL1A1 человека, VTvaf17- COL1A2, несущего целевой COL1A2 человека, VTvaf17- ВМР2, несущего целевой ген ВМР2 человека, VTvaf17- ВМР7, несущего целевой ген ВМР7 человека в 2-й группе животных произошло умеренное увеличение количества белков: белка альфа-1 цепи коллагена I типа, белка альфа-2 цепи коллагена I типа, костного морфогенетического белка 2, костного морфогенетического белка 7 соответственно в сравнении с количеством белков COL1A1 альфа-1 цепи коллагена I типа, альфа-2 цепи коллагена I типа, костного морфогенетического белка 2, костного морфогенетического белка 7 в контрольной 3-й группе. Приведенные результаты подтверждает реализуемость способа применения генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17- COL1A1, несущего целевой ген COL1A1, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-COL1A2, несущего целевой ген, COL1A2, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17- ВМР2, несущего целевой ген ВМР2, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17- ВМР7, несущего целевой ген ВМР7 для повышения уровня экспрессии белков COL1A1, COL1A2, ВМР2 и ВМР7 в тканях животного, в частности при введении этих генотерапевтических ДНК-векторов в костную ткань млекопитающих и свидетельствует об эффективности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17- COL1A1, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17- COL1A2, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17- ВМР2, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17- ВМР7.
Пример 17.
Подтверждение эффективности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-ВМР2, несущего целевой ген ВМР2 и реализуемости способа его применения для повышения уровня экспрессии костного морфогенетического белка 2 в клетках млекопитающих.
Для подтверждения эффективности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-ВМР2, несущего целевой ген ВМР2 человека, оценивали изменение накопления мРНК целевого гена ВМР2 в клетках остеобластов собаки CnOb (Cell Applications, Inc., USA) через 48 часов после их трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-ВМР2.
Клетки линии остеобластов собак (CnOb) выращивали согласно методики производителя (https://www.cellapplications.com/canine-osteoblasts-cnob). Трансфекцию генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-ВМР2, несущим целевой ген ВМР2 человека и ДНК-вектором VTvaf17, не несущим ген ВМР2 человека (контороль) проводили как описано в примере 8. Суммарную РНК из трансфицированных клеток и построение первой цепи кДНК проводили как описано в примере 5. Для определения уровня экспрессии мРНК гена ВМР2 после трансфекции использовали метод ПЦР в режиме реального времени (SYBR GreenRealTimePCR) как описано в примере 3. В качестве референтного гена использовали ген актина собаки (ACT).
В качестве положительного контроля использовали ампликоны, получаемых при ПЦР на матрицах, представляющих собой плазмиды в известных концентрациях, содержащие последовательности генов ВМР2 и ACT. В качестве отрицательного контроля использовали деионизированную воду. Количество ПЦР продуктов - кДНК генов ВМР2 и ACT, полученных в результате амплификации, оценивали в режиме реального времени с помощью программного обеспечения амплификатора Bio-RadCFXManager 2.1. (Bio-Rad, USA).
Графики накопления ПЦР-продуктов, полученные в результате анализа представлены на фиг. 14., на которых показано, что в результате трансфекции клеток остеобластов собаки CnOb генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17- ВМР2, несущим целевой ген ВМР2 человека, уровень специфической мРНК гена ВМР2 вырос многократно, что свидетельствует об эффективности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-ВМР2. Представленные результаты также подтверждают реализуемость способа применения генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-ВМР2 для повышения уровня экспрессии гена ВМР2 в клетках млекопитающих.
Пример 18.
Штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-COL1A1 или штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-COL1A2 или штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-BMP2 или штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-BMP7, несущий генотерапевтический ДНК-вектор, способ его получения.
Конструирование штамма для наработки в промышленных масштабах генотерапевтического ДНК-вектора на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, несущего целевой ген COL1A1 или COL1A2 или ВМР2 или ВМР7: а именно штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-COL1A1, или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-COL1A2, или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-BMP2, или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17- BMP7, несущего генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17- COL1A1, или VTvaf17- COL1A2, или VTvaf17-ВМР2, или VTvaf17- ВМР7 соответственно для его наработки с возможностью селекции без использования антибиотиков заключается в получении электрокомпетентных клеток штамма Escherichia coli SCS110-AF с проведением электропорации этих клеток генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17- COL1A1, или ДНК-вектором VTvaf17- COL1A2, или ДНК-вектором VTvaf17-ВМР2, или ДНК-вектором VTvaf17- ВМР7, после чего клетки высеивали на чашки Петри с агаризованной селективной средой, содержащей дрожжевой экстракт, пептон, 6% сахарозы, а также 10 мкг/мл хлорамфеникола. При этом штамм Escherichia coli SCS110-AF для наработки генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17 или генотерапевтических ДНК-векторов на его основе с возможностью положительной селекции без использования антибиотиков получали путем конструирования линейного фрагмента ДНК, содержащего регуляторный элемент RNA-in транспозона Tn10 для селекции без применения антибиотиков размером 64 п.н., ген левансахаразы sacB, продукт которого обеспечивает селекцию на сахарозо-содержащей среде размером 1422 п.н., ген устойчивости к хлорамфениколу catR, необходимый для отбора клонов штамма, в которых прошла гомологичная рекомбинация размером 763 п.н. и две гомологичные последовательности, обеспечивающие процесс гомологичной рекомбинации в области гена recA с одновременной его инактивацией размером 329 п.н. и 233 п.н., после чего проводили трансформацию клеток Escherichia coli путем электропорации и отбирали клоны, выжившие на среде, содержащей 10 мкг/мл хлорамфеникола.
Пример 19.
Способ производства в промышленных масштабах генотерапевтического ДНК-вектора на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, несущего целевой ген, выбранный из группы генов COL1A1, COL1A2, ВМР2, ВМР7.
Для подтверждения технологичности получения и возможности производства в промышленных масштабах генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17- COL1A1 (SEQ ID №1), или VTvaf17- COL1A2 (SEQ ID №2), или VTvaf17-BMP2 (SEQ ID №3), или VTvaf17- BMP7 (SEQ ID №4), каждый из которых несет целевой ген, а именно, COL1A1, или COL1A2, или ВМР2, или ВМР7 проводили масштабную ферментацию штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-COL1A1 (регистрационный № ВКПМ В-13165, INTERNATIONAL DEPOSITARY AUTHORITY № NCIMB 43033 или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-COL1A2 (регистрационный № ВКПМ B-13164, INTERNATIONAL DEPOSITARY AUTHORITY № NCIMB 43035 или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-BMP2 (регистрационный № ВКПМ В-13167, INTERNATIONAL DEPOSITARY AUTHORITY № NCIMB 43034), или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17- BMP7 (регистрационный № ВКПМ B-13166, INTERNATIONAL DEPOSITARY AUTHORITY № NCIMB 43036), каждый из которых содержит генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17, несущий целевой ген, а именно COL1A1, или COL1A2, или ВМР2, или ВМР7. Каждый штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-COL1A1, или Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-COL1A2, или Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17- BMP2, или Escherichia coli SCS 110-AF/VTvaf17- BMP7 получали на базе штамма Escherichia coli SCS110-AF (Cell and Gene Therapy LLC, PIT Ltd) по примеру 18 путем электропорации компетентных клеток этого штамма генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-COL1A1, или VTvaf17- COL1A2, или VTvaf17-ВМР2, или VTvaf17-ВМР7, несущим целевой ген, а именно, COL1A1, или COL1A2, или ВМР2, или ВМР7, с последующим высевом трансформированных клеток на чашки Петри с агаризованной селективной средой, содержащей дрожжевой экстракт, пептон, 6% сахарозы и отбором отдельных клонов.
Ферментацию полученного штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-COL1A1, несущего генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17- COL1A1 проводили в ферментере объемом 10 л с последующим выделением генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17- COL1A1.
Для ферментации штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-COL1A1 готовили среду, содержащую на 10 л: 100 г триптон, 50 г дрожжевой экстракт (Becton Dickinson), доводили водой до 8800 мл и автоклавировали при 121°С 20 мин, затем добавляли 1200 мл 50% (вес/объем) сахарозы. Далее засевали в колбу затравочную культуру штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17- COL1A1 в объеме 100 мл. Инкубировали в шейкере-инкубаторе 16 ч при 30°С. Переносили затравочную культуру в ферментер Techfors S (Infors НТ, Швейцария), растили до достижения стационарной фазы. Контроль осуществляли измерением оптической плотности культуры при длине волны 600 нм. Клетки осаждали центрифугированием 30 мин при 5000-10000 g. Супернатант удаляли, клеточную массу ресуспендировали в 10% по объему фосфатно-солевого буфера. Повторно центрифугировали 30 мин при 5000-10000 g. Супернатант удаляли, к клеточной массе добавляли раствор 20 мМ TrisCl, 1 мМ ЭДТА, 200 г/л сахароза, рН 8,0 в объеме 1000 мл, тщательно перемешивали до образования гомогенной суспензии. Добавляли раствор яичного лизоцима до конечной концентрации 100 мкг/мл. Инкубировали 20 мин на льду при бережном перемешивании. Далее, добавляли 2500 мл раствора 0,2 М NaOH, 10 г/л додецилсульфат натрия, инкубировали 10 мин на льду при бережном перемешивании, затем добавляли 3500 мл раствора 3 М ацетат натрия, 2 М уксусная кислота, рН 5-5,5, инкубировали 10 мин на льду при бережном перемешивании. Полученный образец центрифугировали 20-30 мин при 15000 g или более. Раствор аккуратно декантировали, от остатков осадка избавлялись фильтрацией через грубый фильтр (фильтровальную бумагу). Добавляли РНКазу A (Sigma) до конечной концентрации 20 нг/мл, инкубировали ночь 16 ч при комнатной температуре. Раствор центрифугировали 20-30 мин при 15000 g, затем фильтровали через мембранный фильтр с порами 0,45 мкм (Millipore). Далее проводили ультрафильтрацию через мембрану размером отсечения 100 кДа (Millipore) и разбавляли до начального объема буфером 25 мМ TrisCl, рН 7.0. Операцию повторяли три-четыре раза. Наносили раствор, на колонку с 250 мл сорбента DEAE sepharose HP (GE, США), уравновешенную раствором 25 мМ TrisCl, рН 7.0. После нанесения образца колонку промывали тремя объемами этого же раствора, а затем проводили элюцию генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17- COL1A1 линейным градиентом от раствора 25 мМ TrisCl, рН 7.0 до раствора 25 мМ TrisCl, рН 7.0, 1М NaCl в объеме пяти объемов колонки. Контроль элюции осуществляли по оптической плотности сходящего раствора при 260 нм. Хроматографические фракции, содержащие генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17- COL1A1, объединяли и проводили гель-фильтрацию на сорбенте Superdex 200 (GE, США). Колонку уравновешивали фосфатно-солевым буфером. Контроль элюции осуществляли по оптической плотности сходящего раствора при 260 нм, фракции анализировали электрофорезом в агарозном геле. Фракции, содержащие генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-COL1A1 объединяли и хранили при -20°С. Для оценки воспроизводимости техпроцесса обозначенные технологические операции повторяли пятикратно. Все технологические операции для штаммов Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-COL1A2, или Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17- BMP2, или Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17- BMP7 проводили аналогичным образом.
Воспроизводимость техпроцесса и количественные характеристики выхода конечного продукта подтверждают технологичность получения и возможность производства в промышленных масштабах генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17- COL1A1, или VTvaf17- COL1A2, или VTvaf17-ВМР2, или VTvaf17- ВМР7.
Таким образом, задача, поставленная в данном изобретении, а именно: конструирование генотерапевтических ДНК-векторов, несущих целевые гены человека на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17 для лечения заболеваний, связанных с необходимостью повышения уровня экспрессии этих целевых генов оптимально сочетающего в себе:
I) возможность безопасного использования для генетической терапии человека и животных за счет отсутствия в составе генотерапевтического ДНК-вектора генов антибиотикорезистентности;
II) длину, обеспечивающую эффективное проникновение в клетку-мишень;
III) наличие регуляторных элементов, обеспечивающих эффективную экспрессию целевых генов и, в то же время, не представляющих собой нуклеотидные последовательности вирусных геномов;
IV) технологичность получения и возможность наработки в промышленных масштабах, а также задача по конструированию штаммов, несущих эти генотерапевтические ДНК-вектора для производства в промышленных масштабах этих генотерапевтических ДНК-векторов решена, что подтверждается примерами: для п. I - пример 1, 2, 3, 4, 5; для п. II - пример 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17; для п. III - пример 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17; для п. IV - пример 18, 19.
Промышленная применимость:
Все представленные выше примеры подтверждают промышленную применимость предлагаемого генотерапевтического ДНК-вектора на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, несущего целевой ген, выбранный из группы генов COL1A1, COL1A2, ВМР2, ВМР7 для повышения уровня экспрессии этих целевых генов, способа его получения и использования, штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-COL1A1 или Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-COL1A2 или Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-BMP2 или Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-BMP7, несущего генотерапевтический ДНК-вектор, способа его получения, способа производства в промышленных масштабах генотерапевтического ДНК-вектора.
Перечень сокращений
VTvaf17 - вектор генотерапевтический, не содержащий последовательностей вирусных геномов и маркеров антибиотико-резистентности (vector therapeutic virus-antibiotic-free)
ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота
кДНК - комплементарная дезоксирибонуклеиновая кислота
РНК - рибонуклеиновая кислота
мРНК - матричная рибонуклеиновая кислота
п.н. - пар нуклеотидов
ПЦР - полимеразная цепная реакция
RT-PCR - ПЦР в режиме реального времени
мл - миллилитр, мкл - микролитр
куб. мм - кубический миллиметр
л - литр
мкг – микрограмм
мг – миллиграмм
г – грамм
мкМ – микромоль
мМ – миллимоль
мин – минута
сек - секунда
об/мин - обороты в минуту
нм – нанометр
см – сантиметр
мВт - милливатт
о.е. ф-относительная единица флуоресценции
РВС - фосфатно-солевой буфер.
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> Общество с ограниченной ответственностью «Аллель Центр Инновационных
Биотехнологий», Общество с ограниченной ответственностью
«Прорывные Инновационные Технологии», Селл энд Джин Терапи Лтд
(CELL and GENE THERAPY Ltd)
<120> Генотерапевтический ДНК-вектор на основе генотерапевтического
ДНК-вектора VTvaf17, несущий целевой ген, выбранный из группы генов
COL1A1, COL1A2, BMP2, BMP7, для повышения уровня экспрессии этих
целевых генов, способ его получения и применения, штамм Escherichia coli
SCS110-AF/VTvaf17- COL1A1 или Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17- COL1A2
или Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17- BMP2 или Escherichia coli SCS110-
AF/VTvaf17- BMP7, несущий генотерапевтический ДНК-вектор, способ его
получения, способ производства в промышленных масштабах генотерапевтического
ДНК-вектора.
<160> 4
<170> BiSSAP 1.3.6
<210> 1
<211> 7563
<212> DNA
<213> Homo Sapiens
<400> 1
cgtgaggctc cggtgcccgt cagtgggcag agcgcacatc gcccacagtc cccgagaagt 60
tggggggagg ggtcggcaat tgaaccggtg cctagagaaa gtggcgcggg gtaaactggg 120
aaagtgatgt cgtgtactgg ctccgccttt ttcccgaggg tgggggagaa ccgtatataa 180
gtgcagtagt cgccgtgaac gttctttttc gcaacgggtt tgccgccaga acacaggtaa 240
gtgccgtgtg tggttcccgc gggcctggcc tctttacggg ttatggccct tgcgtgcctt 300
gaattacttc cacgcccctg gctgcagtac gtgattcttg atcccgagct tcgggttgga 360
agtgggtggg agagttcgag gccttgcgct taaggagccc cttcgcctcg tgcttgagtt 420
gaggcctggc ttgggcgctg gggccgccgc gtgcgaatct ggtggcacct tcgcgcctgt 480
ctcgctgctt tcgataagtc tctagccatt taaaattttt gatgacctgc tgcgacgctt 540
tttttctggc aagatagtct tgtaaatgcg ggccaagatc tgcacactgg tatttcggtt 600
tttggggccg cgggcggcga cggggcccgt gcgtcccagc gcacatgttc ggcgaggcgg 660
ggcctgcgag cgcggccacc gagaatcgga cgggggtagt ctcaagctgg ccggcctgct 720
ctggtgcctg gcctcgcgcc gccgtgtatc gccccgccct gggcggcaag gctggcccgg 780
tcggcaccag ttgcgtgagc ggaaagatgg ccgcttcccg gccctgctgc agggagctca 840
aaatggagga cgcggcgctc gggagagcgg gcgggtgagt cacccacaca aaggaaaagg 900
gcctttccgt cctcagccgt cgcttcatgt gactccacgg agtaccgggc gccgtccagg 960
cacctcgatt agttctcgag cttttggagt acgtcgtctt taggttgggg ggaggggttt 1020
tatgcgatgg agtttcccca cactgagtgg gtggagactg aagttaggcc agcttggcac 1080
ttgatgtaat tctccttgga atttgccctt tttgagtttg gatcttggtt cattctcaag 1140
cctcagacag tggttcaaag tttttttctt ccatttcagg tgtcgtgaaa actaccccta 1200
aaagccagct agcgtctagg gtctagacat gttcagcttt gtggacctcc ggctcctgct 1260
cctcttagcg gccaccgccc tcctgacgca cggccaagag gaaggccaag tcgagggcca 1320
agacgaagac atcccaccaa tcacctgcgt acagaacggc ctcaggtacc atgaccgaga 1380
cgtgtggaaa cccgagccct gccggatctg cgtctgcgac aacggcaagg tgttgtgcga 1440
tgacgtgatc tgtgacgaga ccaagaactg ccccggcgcc gaagtccccg agggcgagtg 1500
ctgtcccgtc tgccccgacg gctcagagtc acccaccgac caagaaacca ccggcgtcga 1560
gggacccaag ggagacactg gcccccgagg cccaagggga cccgcaggcc cccctggccg 1620
agatggcatc cctggacagc ctggacttcc cggacccccc ggaccccccg gacctcccgg 1680
accccctggc ctcggaggaa actttgctcc ccagctgtct tatggctatg atgagaaatc 1740
aaccggagga atttccgtgc ctggccccat gggtccctct ggtcctcgtg gtctccctgg 1800
cccccctggt gcacctggtc cccaaggctt ccaaggtccc cctggtgagc ctggcgagcc 1860
tggagcttca ggtcccatgg gtccccgagg tcccccaggt ccccctggaa agaatggaga 1920
tgatggggaa gctggaaaac ctggtcgtcc tggtgagcgt gggcctcctg ggcctcaggg 1980
tgctcgagga ttgcccggaa cagctggcct ccctggaatg aagggacaca gaggtttcag 2040
tggtttggat ggtgccaagg gagatgctgg tcctgctggt cctaagggtg agcctggcag 2100
ccctggtgaa aatggagctc ctggtcagat gggcccccgt ggcctgcctg gtgagagagg 2160
tcgccctgga gcccctggcc ctgctggtgc tcgtggaaat gatggtgcta ctggtgctgc 2220
cgggccccct ggtcccaccg gccccgctgg tcctcctggc ttccctggtg ctgttggtgc 2280
taagggtgaa gctggtcccc aagggccccg aggctctgaa ggtccccagg gtgtgcgtgg 2340
tgagcctggc ccccctggcc ctgctggtgc tgctggccct gctggaaacc ctggtgctga 2400
tggacagcct ggtgctaaag gtgccaatgg tgctcctggt attgctggtg ctcctggctt 2460
ccctggtgcc cgaggcccct ctggacccca gggccccggc ggccctcctg gtcccaaggg 2520
taacagcggt gaacctggtg ctcctggcag caaaggagac actggtgcta agggagagcc 2580
tggccctgtt ggtgttcaag gaccccctgg ccctgctgga gaggaaggaa agcgaggagc 2640
tcgaggtgaa cccggaccca ctggcctgcc cggaccccct ggcgagcgtg gtggacctgg 2700
tagccgtggt ttccctggcg cagatggtgt tgctggtccc aagggtcccg ctggtgaacg 2760
tggttctcct ggccccgctg gccccaaagg atctcctggt gaagctggtc gtcccggtga 2820
agctggtctg cctggtgcca agggtctgac tggaagccct ggcagccctg gtcctgatgg 2880
caaaactggc ccccctggtc ccgccggtca agatggtcgc cccggacccc caggcccacc 2940
tggtgcccgt ggtcaggctg gtgtgatggg attccctgga cctaaaggtg ctgctggaga 3000
gcccggcaag gctggagagc gaggtgttcc cggaccccct ggcgctgtcg gtcctgctgg 3060
caaagatgga gaggctggag ctcagggacc ccctggccct gctggtcccg ctggcgagag 3120
aggtgaacaa ggccctgctg gctcccccgg attccagggt ctccctggtc ctgctggtcc 3180
tccaggtgaa gcaggcaaac ctggtgaaca gggtgttcct ggagaccttg gcgcccctgg 3240
cccctctgga gcaagaggcg agagaggttt ccctggcgag cgtggtgtgc aaggtccccc 3300
tggtcctgct ggaccccgag gggccaacgg tgctcccggc aacgatggtg ctaagggtga 3360
tgctggtgcc cctggagctc ccggtagcca gggcgcccct ggccttcagg gaatgcctgg 3420
tgaacgtggt gcagctggtc ttccagggcc taagggtgac agaggtgatg ctggtcccaa 3480
aggtgctgat ggctctcctg gcaaagatgg cgtccgtggt ctgaccggcc ccattggtcc 3540
tcctggccct gctggtgccc ctggtgacaa gggtgaaagt ggtcccagcg gccctgctgg 3600
tcccactgga gctcgtggtg cccccggaga ccgtggtgag cctggtcccc ccggccctgc 3660
tggctttgct ggcccccctg gtgctgacgg ccaacctggt gctaaaggcg aacctggtga 3720
tgctggtgcc aaaggcgatg ctggtccccc tgggcctgcc ggacccgctg gaccccctgg 3780
ccccattggt aatgttggtg ctcctggagc caaaggtgct cgcggcagcg ctggtccccc 3840
tggtgctact ggtttccctg gtgctgctgg ccgagtcggt cctcctggcc cctctggaaa 3900
tgctggaccc cctggccctc ctggtcctgc tggcaaagaa ggcggcaaag gtccccgtgg 3960
tgagactggc cctgctggac gtcctggtga agttggtccc cctggtcccc ctggccctgc 4020
tggcgagaaa ggatcccctg gtgctgatgg tcctgctggt gctcctggta ctcccgggcc 4080
tcaaggtatt gctggacagc gtggtgtggt cggcctgcct ggtcagagag gagagagagg 4140
cttccctggt cttcctggcc cctctggtga acctggcaaa caaggtccct ctggagcaag 4200
tggtgaacgt ggtccccccg gtcccatggg cccccctgga ttggctggac cccctggtga 4260
atctggacgt gagggggctc ctgctgccga aggttcccct ggacgagacg gttctcctgg 4320
cgccaagggt gaccgtggtg agaccggccc cgctggaccc cctggtgctc ctggtgctcc 4380
tggtgcccct ggccccgttg gccctgctgg caagagtggt gatcgtggtg agactggtcc 4440
tgctggtccc gccggtcccg tcggccccgt cggcgcccgt ggccccgccg gaccccaagg 4500
cccccgtggt gacaagggtg agacaggcga acagggcgac agaggcataa agggtcaccg 4560
tggcttctct ggcctccagg gtccccctgg ccctcctggc tctcctggtg aacaaggtcc 4620
ctctggagcc tctggtcctg ctggtccccg aggtccccct ggctctgctg gtgctcctgg 4680
caaagatgga ctcaacggtc tccctggccc cattgggccc cctggtcctc gcggtcgcac 4740
tggtgatgct ggtcctgttg gtccccccgg ccctcctgga cctcctggtc cccctggtcc 4800
tcccagcgct ggtttcgact tcagcttcct gccccagcca cctcaagaga aggctcacga 4860
tggtggccgc tactaccggg ctgatgatgc caatgtggtt cgtgaccgtg acctcgaggt 4920
ggacaccacc ctcaagagcc tgagccagca gatcgagaac atccggagcc cagagggaag 4980
ccgcaagaac cccgcccgca cctgccgtga cctcaagatg tgccactctg actggaagag 5040
tggagagtac tggattgacc ccaaccaagg ctgcaacctg gatgccatca aagtcttctg 5100
caacatggag actggtgaga cctgcgtgta ccccactcag cccagtgtgg cccagaagaa 5160
ctggtacatc agcaagaacc ccaaggacaa gaggcatgtc tggttcggcg agagcatgac 5220
cgatggattc cagttcgagt atggcggcca gggctccgac cctgccgatg tggccatcca 5280
gctgaccttc ctgcgcctga tgtccaccga ggcctcccag aacatcacct accactgcaa 5340
gaacagcgtg gcctacatgg accagcagac tggcaacctc aagaaggccc tgctcctcaa 5400
gggctccaac gagatcgaga tccgcgccga gggcaacagc cgcttcacct acagcgtcac 5460
tgtcgatggc tgcacgagtc acaccggagc ctggggcaag acagtgattg aatacaaaac 5520
caccaagtcc tcccgcctgc ccatcatcga tgtggccccc ttggacgttg gtgccccaga 5580
ccaggaattc ggcttcgacg ttggccctgt ctgcttcctg tagaagcttg gtaccgaatt 5640
ccctgtgacc cctccccagt gcctctcctg gccctggaag ttgccactcc agtgcccacc 5700
agccttgtcc taataaaatt aagttgcatc attttgtctg actaggtgtc cttctataat 5760
attatggggt ggaggggggt ggtatggagc aaggggcaag ttgggaagac aacctgtagg 5820
gcctgcgggg tctattggga accaagctgg agtgcagtgg cacaatcttg gctcactgca 5880
atctccgcct cctgggttca agcgattctc ctgcctcagc ctcccgagtt gttgggattc 5940
caggcatgca tgaccaggct cagctaattt ttgttttttt ggtagagacg gggtttcacc 6000
atattggcca ggctggtctc caactcctaa tctcaggtga tctacccacc ttggcctccc 6060
aaattgctgg gattacaggc gtgaaccact gctcccttcc ctgtccttac gcgtagaatt 6120
ggtaaagaga gtcgtgtaaa atatcgagtt cgcacatctt gttgtctgat tattgatttt 6180
tggcgaaacc atttgatcat atgacaagat gtgtatctac cttaacttaa tgattttgat 6240
aaaaatcatt aactagtcca tggctgcctc gcgcgtttcg gtgatgacgg tgaaaacctc 6300
tgacacatgc agctcccgga gacggtcaca gcttgtctgt aagcggatgc cgggagcaga 6360
caagcccgtc agggcgcgtc agcgggtgtt ggcgggtgtc ggggcgcagc catgacccag 6420
tcacgtagcg atagcggagt gtatactggc ttaactatgc ggcatcagag cagattgtac 6480
tgagagtgca ccatatgcgg tgtgaaatac cgcacagatg cgtaaggaga aaataccgca 6540
tcaggcgctc ttccgcttcc tcgctcactg actcgctgcg ctcggtcgtt cggctgcggc 6600
gagcggtatc agctcactca aaggcggtaa tacggttatc cacagaatca ggggataacg 6660
caggaaagaa catgtgagca aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt 6720
tgctggcgtt tttccatagg ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa 6780
gtcagaggtg gcgaaacccg acaggactat aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct 6840
ccctcgtgcg ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc 6900
cttcgggaag cgtggcgctt tctcatagct cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg 6960
tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct 7020
tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag 7080
cagccactgg taacaggatt agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga 7140
agtggtggcc taactacggc tacactagaa gaacagtatt tggtatctgc gctctgctga 7200
agccagttac cttcggaaaa agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg 7260
gtagcggtgg tttttttgtt tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag 7320
aagatccttt gatcttttct acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag 7380
ggattttggt catgagatta tcaaaaagga tcttcaccta gatcctttta aattaaaaat 7440
gaagttttaa atcaatctaa agtatatatg agtaaacttg gtctgacagt taccaatgct 7500
taatcagtga ggcacctatc tcagcgatct gtctatttcg ttcatccata gttgcctgac 7560
tcc 7563
<210> 2
<211> 7269
<212> DNA
<213> Homo Sapiens
<400> 2
cgtgaggctc cggtgcccgt cagtgggcag agcgcacatc gcccacagtc cccgagaagt 60
tggggggagg ggtcggcaat tgaaccggtg cctagagaaa gtggcgcggg gtaaactggg 120
aaagtgatgt cgtgtactgg ctccgccttt ttcccgaggg tgggggagaa ccgtatataa 180
gtgcagtagt cgccgtgaac gttctttttc gcaacgggtt tgccgccaga acacaggtaa 240
gtgccgtgtg tggttcccgc gggcctggcc tctttacggg ttatggccct tgcgtgcctt 300
gaattacttc cacgcccctg gctgcagtac gtgattcttg atcccgagct tcgggttgga 360
agtgggtggg agagttcgag gccttgcgct taaggagccc cttcgcctcg tgcttgagtt 420
gaggcctggc ttgggcgctg gggccgccgc gtgcgaatct ggtggcacct tcgcgcctgt 480
ctcgctgctt tcgataagtc tctagccatt taaaattttt gatgacctgc tgcgacgctt 540
tttttctggc aagatagtct tgtaaatgcg ggccaagatc tgcacactgg tatttcggtt 600
tttggggccg cgggcggcga cggggcccgt gcgtcccagc gcacatgttc ggcgaggcgg 660
ggcctgcgag cgcggccacc gagaatcgga cgggggtagt ctcaagctgg ccggcctgct 720
ctggtgcctg gcctcgcgcc gccgtgtatc gccccgccct gggcggcaag gctggcccgg 780
tcggcaccag ttgcgtgagc ggaaagatgg ccgcttcccg gccctgctgc agggagctca 840
aaatggagga cgcggcgctc gggagagcgg gcgggtgagt cacccacaca aaggaaaagg 900
gcctttccgt cctcagccgt cgcttcatgt gactccacgg agtaccgggc gccgtccagg 960
cacctcgatt agttctcgag cttttggagt acgtcgtctt taggttgggg ggaggggttt 1020
tatgcgatgg agtttcccca cactgagtgg gtggagactg aagttaggcc agcttggcac 1080
ttgatgtaat tctccttgga atttgccctt tttgagtttg gatcttggtt cattctcaag 1140
cctcagacag tggttcaaag tttttttctt ccatttcagg tgtcgtgaaa actaccccta 1200
aaagccagct agcgtctaag tgctagacat gctcagcttt gtggatacgc ggactttgtt 1260
gctgcttgca gtaaccttat gcctagcaac atgccaatct ttacaagagg aaactgtaag 1320
aaagggccca gccggagata gaggaccacg tggagaaagg ggtccaccag gccccccagg 1380
cagagatggt gaagatggtc ccacaggccc tcctggtcca cctggtcctc ctggcccccc 1440
tggtctcggt gggaactttg ctgctcagta tgatggaaaa ggagttggac ttggccctgg 1500
accaatgggc ttaatgggac ctagaggccc acctggtgca gctggagccc caggccctca 1560
aggtttccaa ggacctgctg gtgagcctgg tgaacctggt caaactggtc ctgcaggtgc 1620
tcgtggtcca gctggccctc ctggcaaggc tggtgaagat ggtcaccctg gaaaacccgg 1680
acgacctggt gagagaggag ttgttggacc acagggtgct cgtggtttcc ctggaactcc 1740
tggacttcct ggcttcaaag gcattagggg acacaatggt ctggatggat tgaagggaca 1800
gcccggtgct cctggtgtga agggtgaacc tggtgcccct ggtgaaaatg gaactccagg 1860
tcaaacagga gcccgtgggc ttcctggtga gagaggacgt gttggtgccc ctggcccagc 1920
tggtgcccgt ggcagtgatg gaagtgtggg tcccgtgggt cctgctggtc ccattgggtc 1980
tgctggccct ccaggcttcc caggtgcccc tggccccaag ggtgaaattg gagctgttgg 2040
taacgctggt cctgctggtc ccgccggtcc ccgtggtgaa gtgggtcttc caggcctctc 2100
cggccccgtt ggacctcctg gtaatcctgg agcaaacggc cttactggtg ccaagggtgc 2160
tgctggcctt cccggcgttg ctggggctcc cggcctccct ggaccccgcg gtattcctgg 2220
ccctgttggt gctgccggtg ctactggtgc cagaggactt gttggtgagc ctggtccagc 2280
tggctccaaa ggagagagcg gtaacaaggg tgagcccggc tctgctgggc cccaaggtcc 2340
tcctggtccc agtggtgaag aaggaaagag aggccctaat ggggaagctg gatctgccgg 2400
ccctccagga cctcctgggc tgagaggtag tcctggttct cgtggtcttc ctggagctga 2460
tggcagagct ggcgtcatgg gccctcctgg tagtcgtggt gcaagtggcc ctgctggagt 2520
ccgaggacct aatggagatg ctggtcgccc tggggagcct ggtctcatgg gacccagagg 2580
tcttcctggt tcccctggaa atatcggccc cgctggaaaa gaaggtcctg tcggcctccc 2640
tggcatcgac ggcaggcctg gcccaattgg ccccgctgga gcaagaggag agcctggcaa 2700
cattggattc cctggaccca aaggccccac tggtgatcct ggcaaaaacg gtgataaagg 2760
tcatgctggt cttgctggtg ctcggggtgc tccaggtcct gatggaaaca atggtgctca 2820
gggacctcct ggaccacagg gtgttcaagg tggaaaaggt gaacagggtc ccgctggtcc 2880
tccaggcttc cagggtctgc ctggcccctc aggtcccgct ggtgaagttg gcaaaccagg 2940
agaaaggggt ctccatggtg agtttggtct ccctggtcct gctggtccaa gaggggaacg 3000
cggtccccca ggtgagagtg gtgctgccgg tcctactggt cctattggaa gccgaggtcc 3060
ttctggaccc ccagggcctg atggaaacaa gggtgaacct ggtgtggttg gtgctgtggg 3120
cactgctggt ccatctggtc ctagtggact cccaggagag aggggtgctg ctggcatacc 3180
tggaggcaag ggagaaaagg gtgaacctgg tctcagaggt gaaattggta accctggcag 3240
agatggtgct cgtggtgctc ctggtgctgt aggtgcccct ggtcctgctg gagccacagg 3300
tgaccggggc gaagctgggg ctgctggtcc tgctggtcct gctggtcctc ggggaagccc 3360
tggtgaacgt ggtgaggtcg gtcctgctgg ccccaatgga tttgctggtc ctgctggtgc 3420
tgctggtcaa cctggtgcta aaggagaaag aggagccaaa gggcctaagg gtgaaaacgg 3480
tgttgttggt cccacaggcc ccgttggagc tgctggccca gctggtccaa atggtccccc 3540
cggtcctgct ggaagtcgtg gtgatggagg cccccctggt atgactggtt tccctggtgc 3600
tgctggacgg actggtcccc caggaccctc tggtatttct ggccctcctg gtccccctgg 3660
tcctgctggg aaagaagggc ttcgtggtcc tcgtggtgac caaggtccag ttggccgaac 3720
tggagaagta ggtgcagttg gtccccctgg cttcgctggt gagaagggtc cctctggaga 3780
ggctggtact gctggacctc ctggcactcc aggtcctcag ggtcttcttg gtgctcctgg 3840
tattctgggt ctccctggct cgagaggtga acgtggtcta ccaggtgttg ctggtgctgt 3900
gggtgaacct ggtcctcttg gcattgccgg ccctcctggg gcccgtggtc ctcctggtgc 3960
tgtgggtagt cctggagtca acggtgctcc tggtgaagct ggtcgtgatg gcaaccctgg 4020
gaacgatggt cccccaggtc gcgatggtca acccggacac aagggagagc gcggttaccc 4080
tggcaatatt ggtcccgttg gtgctgcagg tgcacctggt cctcatggcc ccgtgggtcc 4140
tgctggcaaa catggaaacc gtggtgaaac tggtccttct ggtcctgttg gtcctgctgg 4200
tgctgttggc ccaagaggtc ctagtggccc acaaggcatt cgtggcgata agggagagcc 4260
cggtgaaaag gggcccagag gtcttcctgg cttaaaggga cacaatggat tgcaaggtct 4320
gcctggtatc gctggtcacc atggtgatca aggtgctcct ggctccgtgg gtcctgctgg 4380
tcctaggggc cctgctggtc cttctggccc tgctggaaaa gatggtcgca ctggacatcc 4440
tggtacagtt ggacctgctg gcattcgagg ccctcagggt caccaaggcc ctgctggccc 4500
ccctggtccc cctggccctc ctggacctcc aggtgtaagc ggtggtggtt atgactttgg 4560
ttacgatgga gacttctaca gggctgacca gcctcgctca gcaccttctc tcagacccaa 4620
ggactatgaa gttgatgcta ctctgaagtc tctcaacaac cagattgaga cccttcttac 4680
tcctgaaggc tctagaaaga acccagctcg cacatgccgt gacttgagac tcagccaccc 4740
agagtggagc agtggttact actggattga ccctaaccaa ggatgcacta tggatgctat 4800
caaagtatac tgtgatttct ctactggcga aacctgtatc cgggcccaac ctgaaaacat 4860
cccagccaag aactggtata ggagctccaa ggacaagaaa cacgtctggc taggagaaac 4920
tatcaatgct ggcagccagt ttgaatataa tgtagaagga gtgacttcca aggaaatggc 4980
tacccaactt gccttcatgc gcctgctggc caactatgcc tctcagaaca tcacctacca 5040
ctgcaagaac agcattgcat acatggatga ggagactggc aacctgaaaa aggctgtcat 5100
tctacagggc tctaatgatg ttgaacttgt tgctgagggc aacagcaggt tcacttacac 5160
tgttcttgta gatggctgct ctaaaaagac aaatgaatgg ggaaagacaa tcattgaata 5220
caaaacaaat aagccatcac gcctgccctt ccttgatatt gcacctttgg acatcggtgg 5280
tgctgaccag gaattctttg tggacattgg cccagtctgt ttcaaataaa agcttggtac 5340
cgaattccct gtgacccctc cccagtgcct ctcctggccc tggaagttgc cactccagtg 5400
cccaccagcc ttgtcctaat aaaattaagt tgcatcattt tgtctgacta ggtgtccttc 5460
tataatatta tggggtggag gggggtggta tggagcaagg ggcaagttgg gaagacaacc 5520
tgtagggcct gcggggtcta ttgggaacca agctggagtg cagtggcaca atcttggctc 5580
actgcaatct ccgcctcctg ggttcaagcg attctcctgc ctcagcctcc cgagttgttg 5640
ggattccagg catgcatgac caggctcagc taatttttgt ttttttggta gagacggggt 5700
ttcaccatat tggccaggct ggtctccaac tcctaatctc aggtgatcta cccaccttgg 5760
cctcccaaat tgctgggatt acaggcgtga accactgctc ccttccctgt ccttacgcgt 5820
agaattggta aagagagtcg tgtaaaatat cgagttcgca catcttgttg tctgattatt 5880
gatttttggc gaaaccattt gatcatatga caagatgtgt atctacctta acttaatgat 5940
tttgataaaa atcattaact agtccatggc tgcctcgcgc gtttcggtga tgacggtgaa 6000
aacctctgac acatgcagct cccggagacg gtcacagctt gtctgtaagc ggatgccggg 6060
agcagacaag cccgtcaggg cgcgtcagcg ggtgttggcg ggtgtcgggg cgcagccatg 6120
acccagtcac gtagcgatag cggagtgtat actggcttaa ctatgcggca tcagagcaga 6180
ttgtactgag agtgcaccat atgcggtgtg aaataccgca cagatgcgta aggagaaaat 6240
accgcatcag gcgctcttcc gcttcctcgc tcactgactc gctgcgctcg gtcgttcggc 6300
tgcggcgagc ggtatcagct cactcaaagg cggtaatacg gttatccaca gaatcagggg 6360
ataacgcagg aaagaacatg tgagcaaaag gccagcaaaa ggccaggaac cgtaaaaagg 6420
ccgcgttgct ggcgtttttc cataggctcc gcccccctga cgagcatcac aaaaatcgac 6480
gctcaagtca gaggtggcga aacccgacag gactataaag ataccaggcg tttccccctg 6540
gaagctccct cgtgcgctct cctgttccga ccctgccgct taccggatac ctgtccgcct 6600
ttctcccttc gggaagcgtg gcgctttctc atagctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg 6660
tgtaggtcgt tcgctccaag ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct 6720
gcgccttatc cggtaactat cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac 6780
tggcagcagc cactggtaac aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt 6840
tcttgaagtg gtggcctaac tacggctaca ctagaagaac agtatttggt atctgcgctc 6900
tgctgaagcc agttaccttc ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca 6960
ccgctggtag cggtggtttt tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat 7020
ctcaagaaga tcctttgatc ttttctacgg ggtctgacgc tcagtggaac gaaaactcac 7080
gttaagggat tttggtcatg agattatcaa aaaggatctt cacctagatc cttttaaatt 7140
aaaaatgaag ttttaaatca atctaaagta tatatgagta aacttggtct gacagttacc 7200
aatgcttaat cagtgaggca cctatctcag cgatctgtct atttcgttca tccatagttg 7260
cctgactcc 7269
<210> 3
<211> 4360
<212> DNA
<213> Homo Sapiens
<400> 3
cgtgaggctc cggtgcccgt cagtgggcag agcgcacatc gcccacagtc cccgagaagt 60
tggggggagg ggtcggcaat tgaaccggtg cctagagaaa gtggcgcggg gtaaactggg 120
aaagtgatgt cgtgtactgg ctccgccttt ttcccgaggg tgggggagaa ccgtatataa 180
gtgcagtagt cgccgtgaac gttctttttc gcaacgggtt tgccgccaga acacaggtaa 240
gtgccgtgtg tggttcccgc gggcctggcc tctttacggg ttatggccct tgcgtgcctt 300
gaattacttc cacgcccctg gctgcagtac gtgattcttg atcccgagct tcgggttgga 360
agtgggtggg agagttcgag gccttgcgct taaggagccc cttcgcctcg tgcttgagtt 420
gaggcctggc ttgggcgctg gggccgccgc gtgcgaatct ggtggcacct tcgcgcctgt 480
ctcgctgctt tcgataagtc tctagccatt taaaattttt gatgacctgc tgcgacgctt 540
tttttctggc aagatagtct tgtaaatgcg ggccaagatc tgcacactgg tatttcggtt 600
tttggggccg cgggcggcga cggggcccgt gcgtcccagc gcacatgttc ggcgaggcgg 660
ggcctgcgag cgcggccacc gagaatcgga cgggggtagt ctcaagctgg ccggcctgct 720
ctggtgcctg gcctcgcgcc gccgtgtatc gccccgccct gggcggcaag gctggcccgg 780
tcggcaccag ttgcgtgagc ggaaagatgg ccgcttcccg gccctgctgc agggagctca 840
aaatggagga cgcggcgctc gggagagcgg gcgggtgagt cacccacaca aaggaaaagg 900
gcctttccgt cctcagccgt cgcttcatgt gactccacgg agtaccgggc gccgtccagg 960
cacctcgatt agttctcgag cttttggagt acgtcgtctt taggttgggg ggaggggttt 1020
tatgcgatgg agtttcccca cactgagtgg gtggagactg aagttaggcc agcttggcac 1080
ttgatgtaat tctccttgga atttgccctt tttgagtttg gatcttggtt cattctcaag 1140
cctcagacag tggttcaaag tttttttctt ccatttcagg tgtcgtgaaa actaccccta 1200
aaagccagct agcctcctaa aggtccacca tggtggccgg gacccgctgt cttctagcgt 1260
tgctgcttcc ccaggtcctc ctgggcggcg cggctggcct cgttccggag ctgggccgca 1320
ggaagttcgc ggcggcgtcg tcgggccgcc cctcatccca gccctctgac gaggtcctga 1380
gcgagttcga gttgcggctg ctcagcatgt tcggcctgaa acagagaccc acccccagca 1440
gggacgccgt ggtgcccccc tacatgctag acctgtatcg caggcactca ggtcagccgg 1500
gctcacccgc cccagaccac cggttggaga gggcagccag ccgagccaac actgtgcgca 1560
gcttccacca tgaagaatct ttggaagaac taccagaaac gagtgggaaa acaacccgga 1620
gattcttctt taatttaagt tctatcccca cggaggagtt tatcacctca gcagagcttc 1680
aggttttccg agaacagatg caagatgctt taggaaacaa tagcagtttc catcaccgaa 1740
ttaatattta tgaaatcata aaacctgcaa cagccaactc gaaattcccc gtgaccagac 1800
ttttggacac caggttggtg aatcagaatg caagcaggtg ggaaagtttt gatgtcaccc 1860
ccgctgtgat gcggtggact gcacagggac acgccaacca tggattcgtg gtggaagtgg 1920
cccacttgga ggagaaacaa ggtgtctcca agagacatgt taggataagc aggtctttgc 1980
accaagatga acacagctgg tcacagataa ggccattgct agtaactttt ggccatgatg 2040
gaaaagggca tcctctccac aaaagagaaa aacgtcaagc caaacacaaa cagcggaaac 2100
gccttaagtc cagctgtaag agacaccctt tgtacgtgga cttcagtgac gtggggtgga 2160
atgactggat tgtggctccc ccggggtatc acgcctttta ctgccacgga gaatgccctt 2220
ttcctctggc tgatcatctg aactccacta atcatgccat tgttcagacg ttggtcaact 2280
ctgttaactc taagattcct aaggcatgct gtgtcccgac agaactcagt gctatctcga 2340
tgctgtacct tgacgagaat gaaaaggttg tattaaagaa ctatcaggac atggttgtgg 2400
agggttgtgg gtgtcgctag aagcttggta ccgaattccc tgtgacccct ccccagtgcc 2460
tctcctggcc ctggaagttg ccactccagt gcccaccagc cttgtcctaa taaaattaag 2520
ttgcatcatt ttgtctgact aggtgtcctt ctataatatt atggggtgga ggggggtggt 2580
atggagcaag gggcaagttg ggaagacaac ctgtagggcc tgcggggtct attgggaacc 2640
aagctggagt gcagtggcac aatcttggct cactgcaatc tccgcctcct gggttcaagc 2700
gattctcctg cctcagcctc ccgagttgtt gggattccag gcatgcatga ccaggctcag 2760
ctaatttttg tttttttggt agagacgggg tttcaccata ttggccaggc tggtctccaa 2820
ctcctaatct caggtgatct acccaccttg gcctcccaaa ttgctgggat tacaggcgtg 2880
aaccactgct cccttccctg tccttacgcg tagaattggt aaagagagtc gtgtaaaata 2940
tcgagttcgc acatcttgtt gtctgattat tgatttttgg cgaaaccatt tgatcatatg 3000
acaagatgtg tatctacctt aacttaatga ttttgataaa aatcattaac tagtccatgg 3060
ctgcctcgcg cgtttcggtg atgacggtga aaacctctga cacatgcagc tcccggagac 3120
ggtcacagct tgtctgtaag cggatgccgg gagcagacaa gcccgtcagg gcgcgtcagc 3180
gggtgttggc gggtgtcggg gcgcagccat gacccagtca cgtagcgata gcggagtgta 3240
tactggctta actatgcggc atcagagcag attgtactga gagtgcacca tatgcggtgt 3300
gaaataccgc acagatgcgt aaggagaaaa taccgcatca ggcgctcttc cgcttcctcg 3360
ctcactgact cgctgcgctc ggtcgttcgg ctgcggcgag cggtatcagc tcactcaaag 3420
gcggtaatac ggttatccac agaatcaggg gataacgcag gaaagaacat gtgagcaaaa 3480
ggccagcaaa aggccaggaa ccgtaaaaag gccgcgttgc tggcgttttt ccataggctc 3540
cgcccccctg acgagcatca caaaaatcga cgctcaagtc agaggtggcg aaacccgaca 3600
ggactataaa gataccaggc gtttccccct ggaagctccc tcgtgcgctc tcctgttccg 3660
accctgccgc ttaccggata cctgtccgcc tttctccctt cgggaagcgt ggcgctttct 3720
catagctcac gctgtaggta tctcagttcg gtgtaggtcg ttcgctccaa gctgggctgt 3780
gtgcacgaac cccccgttca gcccgaccgc tgcgccttat ccggtaacta tcgtcttgag 3840
tccaacccgg taagacacga cttatcgcca ctggcagcag ccactggtaa caggattagc 3900
agagcgaggt atgtaggcgg tgctacagag ttcttgaagt ggtggcctaa ctacggctac 3960
actagaagaa cagtatttgg tatctgcgct ctgctgaagc cagttacctt cggaaaaaga 4020
gttggtagct cttgatccgg caaacaaacc accgctggta gcggtggttt ttttgtttgc 4080
aagcagcaga ttacgcgcag aaaaaaagga tctcaagaag atcctttgat cttttctacg 4140
gggtctgacg ctcagtggaa cgaaaactca cgttaaggga ttttggtcat gagattatca 4200
aaaaggatct tcacctagat ccttttaaat taaaaatgaa gttttaaatc aatctaaagt 4260
atatatgagt aaacttggtc tgacagttac caatgcttaa tcagtgaggc acctatctca 4320
gcgatctgtc tatttcgttc atccatagtt gcctgactcc 4360
<210> 4
<211> 4463
<212> DNA
<213> Homo Sapiens
<400> 4
cgtgaggctc cggtgcccgt cagtgggcag agcgcacatc gcccacagtc cccgagaagt 60
tggggggagg ggtcggcaat tgaaccggtg cctagagaaa gtggcgcggg gtaaactggg 120
aaagtgatgt cgtgtactgg ctccgccttt ttcccgaggg tgggggagaa ccgtatataa 180
gtgcagtagt cgccgtgaac gttctttttc gcaacgggtt tgccgccaga acacaggtaa 240
gtgccgtgtg tggttcccgc gggcctggcc tctttacggg ttatggccct tgcgtgcctt 300
gaattacttc cacgcccctg gctgcagtac gtgattcttg atcccgagct tcgggttgga 360
agtgggtggg agagttcgag gccttgcgct taaggagccc cttcgcctcg tgcttgagtt 420
gaggcctggc ttgggcgctg gggccgccgc gtgcgaatct ggtggcacct tcgcgcctgt 480
ctcgctgctt tcgataagtc tctagccatt taaaattttt gatgacctgc tgcgacgctt 540
tttttctggc aagatagtct tgtaaatgcg ggccaagatc tgcacactgg tatttcggtt 600
tttggggccg cgggcggcga cggggcccgt gcgtcccagc gcacatgttc ggcgaggcgg 660
ggcctgcgag cgcggccacc gagaatcgga cgggggtagt ctcaagctgg ccggcctgct 720
ctggtgcctg gcctcgcgcc gccgtgtatc gccccgccct gggcggcaag gctggcccgg 780
tcggcaccag ttgcgtgagc ggaaagatgg ccgcttcccg gccctgctgc agggagctca 840
aaatggagga cgcggcgctc gggagagcgg gcgggtgagt cacccacaca aaggaaaagg 900
gcctttccgt cctcagccgt cgcttcatgt gactccacgg agtaccgggc gccgtccagg 960
cacctcgatt agttctcgag cttttggagt acgtcgtctt taggttgggg ggaggggttt 1020
tatgcgatgg agtttcccca cactgagtgg gtggagactg aagttaggcc agcttggcac 1080
ttgatgtaat tctccttgga atttgccctt tttgagtttg gatcttggtt cattctcaag 1140
cctcagacag tggttcaaag tttttttctt ccatttcagg tgtcgtgaaa actaccccta 1200
aaagccagct agcgtagagc cggcgcgatg cacgtgcgct cactgcgagc tgcggcgccg 1260
cacagcttcg tggcgctctg ggcacccctg ttcctgctgc gctccgccct ggccgacttc 1320
agcctggaca acgaggtgca ctcgagcttc atccaccggc gcctccgcag ccaggagcgg 1380
cgggagatgc agcgcgagat cctctccatt ttgggcttgc cccaccgccc gcgcccgcac 1440
ctccagggca agcacaactc ggcacccatg ttcatgctgg acctgtacaa cgccatggcg 1500
gtggaggagg gcggcgggcc cggcggccag ggcttctcct acccctacaa ggccgtcttc 1560
agtacccagg gcccccctct ggccagcctg caagatagcc atttcctcac cgacgccgac 1620
atggtcatga gcttcgtcaa cctcgtggaa catgacaagg aattcttcca cccacgctac 1680
caccatcgag agttccggtt tgatctttcc aagatcccag aaggggaagc tgtcacggca 1740
gccgaattcc ggatctacaa ggactacatc cgggaacgct tcgacaatga gacgttccgg 1800
atcagcgttt atcaggtgct ccaggagcac ttgggcaggg aatcggatct cttcctgctc 1860
gacagccgta ccctctgggc ctcggaggag ggctggctgg tgtttgacat cacagccacc 1920
agcaaccact gggtggtcaa tccgcggcac aacctgggcc tgcagctctc ggtggagacg 1980
ctggatgggc agagcatcaa ccccaagttg gcgggcctga ttgggcggca cgggccccag 2040
aacaagcagc ccttcatggt ggctttcttc aaggccacgg aggtccactt ccgcagcatc 2100
cggtccacgg ggagcaaaca gcgcagccag aaccgctcca agacgcccaa gaaccaggaa 2160
gccctgcgga tggccaacgt ggcagagaac agcagcagcg accagaggca ggcctgtaag 2220
aagcacgagc tgtatgtcag cttccgagac ctgggctggc aggactggat catcgcgcct 2280
gaaggctacg ccgcctacta ctgtgagggg gagtgtgcct tccctctgaa ctcctacatg 2340
aacgccacca accacgccat cgtgcagacg ctggtccact tcatcaaccc ggaaacggtg 2400
cccaagccct gctgtgcgcc cacgcagctc aatgccatct ccgtcctcta cttcgatgac 2460
agctccaacg tcatcctgaa gaaatacaga aacatggtgg tccgggcctg tggctgccac 2520
tagaagcttg gtaccgaatt ccctgtgacc cctccccagt gcctctcctg gccctggaag 2580
ttgccactcc agtgcccacc agccttgtcc taataaaatt aagttgcatc attttgtctg 2640
actaggtgtc cttctataat attatggggt ggaggggggt ggtatggagc aaggggcaag 2700
ttgggaagac aacctgtagg gcctgcgggg tctattggga accaagctgg agtgcagtgg 2760
cacaatcttg gctcactgca atctccgcct cctgggttca agcgattctc ctgcctcagc 2820
ctcccgagtt gttgggattc caggcatgca tgaccaggct cagctaattt ttgttttttt 2880
ggtagagacg gggtttcacc atattggcca ggctggtctc caactcctaa tctcaggtga 2940
tctacccacc ttggcctccc aaattgctgg gattacaggc gtgaaccact gctcccttcc 3000
ctgtccttac gcgtagaatt ggtaaagaga gtcgtgtaaa atatcgagtt cgcacatctt 3060
gttgtctgat tattgatttt tggcgaaacc atttgatcat atgacaagat gtgtatctac 3120
cttaacttaa tgattttgat aaaaatcatt aactagtcca tggctgcctc gcgcgtttcg 3180
gtgatgacgg tgaaaacctc tgacacatgc agctcccgga gacggtcaca gcttgtctgt 3240
aagcggatgc cgggagcaga caagcccgtc agggcgcgtc agcgggtgtt ggcgggtgtc 3300
ggggcgcagc catgacccag tcacgtagcg atagcggagt gtatactggc ttaactatgc 3360
ggcatcagag cagattgtac tgagagtgca ccatatgcgg tgtgaaatac cgcacagatg 3420
cgtaaggaga aaataccgca tcaggcgctc ttccgcttcc tcgctcactg actcgctgcg 3480
ctcggtcgtt cggctgcggc gagcggtatc agctcactca aaggcggtaa tacggttatc 3540
cacagaatca ggggataacg caggaaagaa catgtgagca aaaggccagc aaaaggccag 3600
gaaccgtaaa aaggccgcgt tgctggcgtt tttccatagg ctccgccccc ctgacgagca 3660
tcacaaaaat cgacgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg acaggactat aaagatacca 3720
ggcgtttccc cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg 3780
atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt tctcatagct cacgctgtag 3840
gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg aaccccccgt 3900
tcagcccgac cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc cggtaagaca 3960
cgacttatcg ccactggcag cagccactgg taacaggatt agcagagcga ggtatgtagg 4020
cggtgctaca gagttcttga agtggtggcc taactacggc tacactagaa gaacagtatt 4080
tggtatctgc gctctgctga agccagttac cttcggaaaa agagttggta gctcttgatc 4140
cggcaaacaa accaccgctg gtagcggtgg tttttttgtt tgcaagcagc agattacgcg 4200
cagaaaaaaa ggatctcaag aagatccttt gatcttttct acggggtctg acgctcagtg 4260
gaacgaaaac tcacgttaag ggattttggt catgagatta tcaaaaagga tcttcaccta 4320
gatcctttta aattaaaaat gaagttttaa atcaatctaa agtatatatg agtaaacttg 4380
gtctgacagt taccaatgct taatcagtga ggcacctatc tcagcgatct gtctatttcg 4440
<---
Перечень последовательностей олигонулеотидов:
(1) Олигонуклеотид BMP2_F ACAGCTAGCCTCCTAAAGGTCCACCATGGT
(2) Олигонуклеотид BMP2_R TATAAGCTTCTAGCGACACCCACAACCCT
(3) Олигонуклеотид BMP2_SF ATGCAAGCAGGTGGGAAAGT
(4) Олигонуклеотид BMP2_SR GGGAGCCACAATCCAGTCAT
(5) Олигонуклеотид BMP7_F TCAGCTAGCGTAGAGCCGGCGCGATGCA
(6) Олигонуклеотид BMP7_R TATAAGCTTCTAGTGGCAGCCACAGGC
(7) Олигонуклеотид BMP7_SF GCTGGCTGGTGTTTGACATC
(8) Олигонуклеотид BMP7_SR TGGTGGCGTTCATGTAGGAG
(9) Олигонуклеотид COL1A1_F CCAGCTAGCGTCTAGGGTCTAGACATGTTC
(10) Олигонуклеотид COL1A1_R TATAAGCTTCTACAGGAAGCAGACAGGGCCAAC
(11) Олигонуклеотид COL1A1_SF TGACGAGACCAAGAACTGCC
(12) Олигонуклеотид COL1A1_SR GCACCATCATTTCCACGAGC
(13) Олигонуклеотид COL1A2_F CCAGCTAGCGTCTAAGTGCTAGACATGCTC
(14) Олигонуклеотид COL1A2_R CGAAGCTTTTATTTGAAACAGACTGGGCCA
(15) Олигонуклеотид COL1A2_SF CTGGTGAAGCTGGTCGTGAT
(16) Олигонуклеотид COL1A2_SR CGGATACAGGTTTCGCCAGT
Claims (29)
1. Генотерапевтический ДНК-вектор на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17 для лечения заболеваний, характеризующихся нарушением процессов остеогенеза, формирования и регенерации костной и хрящевой ткани, обусловленных дерегуляцией роста, дифференцировки и апоптоза различных типов клеток, включая остеобласты, хондробласты, замедлением дифференцировки мезенхимальных стволовых клеток в хондробласты и остеобласты, снижением синтеза коллагена, активности щелочной фосфатазы, синтеза остеокальцина, синтеза внеклеточного матрикса и его последующей минерализации в том числе при переломах костей, повышенной хрупкости костей, снижении минерализации костей, для повышения остеоиндуктивности костных имплантатов, путем повышения уровня экспрессии целевого гена COL1A1 в организме человека и животных, при этом генотерапевтический ДНК-вектор содержит кодирующую часть целевого гена COL1A1, клонированную в генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17, с получением генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-COL1A1, с нуклеотидной последовательностью SEQ ID №1.
2. Генотерапевтический ДНК-вектор на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17 для лечения заболеваний, характеризующихся нарушением процессов остеогенеза, формирования и регенерации костной и хрящевой ткани, обусловленных дерегуляцией роста, дифференцировки и апоптоза различных типов клеток, включая остеобласты, хондробласты, замедлением дифференцировки мезенхимальных стволовых клеток в хондробласты и остеобласты, снижением синтеза коллагена, активности щелочной фосфатазы, синтеза остеокальцина, синтеза внеклеточного матрикса и его последующей минерализации в том числе при переломах костей, повышенной хрупкости костей, снижении минерализации костей, для повышения остеоиндуктивности костных имплантатов, а также в качестве альтернативы лекарственным средствам на основе рекомбинантных остеогенных факторов с целью снижения риска гетеротопической оссификации, путем повышения уровня экспрессии целевого гена COL1A2 в организме человека и животных, при этом генотерапевтический ДНК-вектор содержит кодирующую часть целевого гена COL1A2, клонированную в генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17, с получением генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-COL121, с нуклеотидной последовательностью SEQ ID №2.
3. Генотерапевтический ДНК-вектор на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17 для лечения заболеваний, характеризующихся нарушением процессов остеогенеза, формирования и регенерации костной и хрящевой ткани, обусловленных дерегуляцией роста, дифференцировки и апоптоза различных типов клеток, включая остеобласты, хондробласты, замедлением дифференцировки мезенхимальных стволовых клеток в хондробласты и остеобласты, снижением синтеза коллагена, активности щелочной фосфатазы, синтеза остеокальцина, синтеза внеклеточного матрикса и его последующей минерализации в том числе при переломах костей, повышенной хрупкости костей, снижении минерализации костей, для повышения остеоиндуктивности костных имплантатов, а также в качестве альтернативы лекарственным средствам на основе рекомбинантных остеогенных факторов с целью снижения риска гетеротопической оссификации, путем повышения уровня экспрессии целевого гена ВМР2 в организме человека и животных, при этом генотерапевтический ДНК-вектор содержит кодирующую часть целевого гена ВМР2, клонированную в генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17, с получением генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-BMP2, с нуклеотидной последовательностью SEQ ID №3.
4. Генотерапевтический ДНК-вектор на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17 для лечения заболеваний, характеризующихся нарушением процессов остеогенеза, формирования и регенерации костной и хрящевой ткани, обусловленных дерегуляцией роста, дифференцировки и апоптоза различных типов клеток, включая остеобласты, хондробласты, замедлением дифференцировки мезенхимальных стволовых клеток в хондробласты и остеобласты, снижением синтеза коллагена, активности щелочной фосфатазы, синтеза остеокальцина, синтеза внеклеточного матрикса и его последующей минерализации в том числе при переломах костей, повышенной хрупкости костей, снижении минерализации костей, для повышения остеоиндуктивности костных имплантатов, а также в качестве альтернативы лекарственным средствам на основе рекомбинантных остеогенных факторов с целью снижения риска гетеротопической оссификации, путем повышения уровня экспрессии целевого гена ВМР7 в организме человека и животных, при этом генотерапевтический ДНК-вектор содержит кодирующую часть целевого гена ВМР7, клонированную в генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17, с получением генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-BMP7, с нуклеотидной последовательностью SEQ ID №. 4.
5. Генотерапевтический ДНК-вектор на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, несущий целевой ген COL1A1, COL1A2, ВМР2, ВМР7 по пп. 1-3 или 4, отличающийся тем, что каждый из созданных генотерапевтических ДНК-векторов: VTvaf17-COL1A1, или VTvaf17-COL1A2, или ВМР2, или VTvaf17-ВМР7 по пп. 1-3 или 4, за счет ограниченного размера векторной части VTvaf17, не превышающей 3200 п.н., обладает способностью эффективно проникать в клетки человека и животных и экспрессировать клонированный в него целевой ген COL1A1, или COL1A2, или ВМР2, или ВМР7.
6. Генотерапевтический ДНК-вектор на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, несущий целевой ген COL1A1, COL1A2, ВМР2, ВМР7 по пп. 1-3 или 4, отличающийся тем, что в составе каждого из созданных генотерапевтических ДНК-векторов: VTvaf17-COL1A1, или VTvaf17-COL1A2, или ВМР2, или VTvaf17-ВМР7 по пп. 1-3 или 4, в качестве структурных элементов используют нуклеотидные последовательности, не являющиеся генами антибиотикорезистентности, вирусными генами и регуляторными элементами вирусных геномов, обеспечивая возможность его безопасного применения для генетической терапии человека и животных.
7. Способ получения генотерапевтического ДНК-вектора на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, несущего целевой ген COL1A1, или COL1A2, или ВМР2, или ВМР7 по пп. 1-3 или 4, заключающийся в том, что каждый из генотерапевтических ДНК-векторов: VTvaf17-COL1A1, или VTvaf17-COL1A2, или VTvaf17-ВМР2, или VTvaf17-ВМР7 получают следующим образом: кодирующую часть целевого гена COL1A1, или COL1A2, или ВМР2, или ВМР7 по пп. 1-3 или 4 клонируют в генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17 и получают генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-COL1A1, SEQ ID №1, или VTvaf17-COL1A2, SEQ ID №2, или VTvaf17-BMP2, SEQ ID №3, или VTvaf17-BMP7, SEQ ID №4, соответственно, при этом кодирующую часть целевого гена COL1A1, или COL1A2, или ВМР2, или ВМР7 получают путем выделения суммарной РНК из биологического образца ткани человека с последующим проведением реакции обратной транскрипции и ПЦР-амплификации с использованием созданных олигонуклеотидов и расщеплением продукта амплификации соответствующими эндонуклеазами рестрикции, причем клонирование в генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17 проводят по сайтам рестрикции Nhel и Hindlll, причем селекцию проводят без антибиотиков, при этом при получении генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-COL1A1, SEQ ID №1 для проведения реакции обратной транскрипции и ПЦР-амплификации, в качестве созданных для этого олигонуклеотидов используют олигонуклеотиды
COL1A1_F CCAGCTAGCGTCTAGGGTCTAGACATGTTC
COL1A1_R TATAAGCTTCTACAGGAAGCAGACAGGGCCAAC,
а расщепление продукта амплификации и клонирование кодирующей части гена COL1A1 в генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17 проводят с использованием эндонуклеаз рестрикции Nhel и Hindlll,
причем при получении генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-COL1A2, SEQ ID №2 для проведения реакции обратной транскрипции и ПЦР-амплификации, в качестве созданных для этого олигонуклеотидов используют олигонуклеотиды
COL1A2_F CCAGCTAGCGTCTAAGTGCTAGACATGCTC
COL1A2_R CGAAGCTTTTATTTGAAACAGACTGGGCCA,
а расщепление продукта амплификации и клонирование кодирующей части гена COL1A2 в генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17 проводят с использованием эндонуклеаз рестрикции Nhel и Hindlll,
причем при получении генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-BMP2, SEQ ID №3 для проведения реакции обратной транскрипции и ПЦР-амплификации, в качестве созданных для этого олигонуклеотидов используют олигонуклеотиды
BMP2_F ACAGCTAGCCTCCTAAAGGTCCACCATGGT
BMP2_R TATAAGCTTCTAGCGACACCCACAACCCT,
а расщепление продукта амплификации и клонирование кодирующей части гена ВМР2 в генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17 проводят с использованием эндонуклеаз рестрикции Nhel и Hindlll,
причем при получении генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-BMP7, SEQ ID №4 для проведения реакции обратной транскрипции и ПЦР-амплификации, в качестве созданных для этого олигонуклеотидов используют олигонуклеотиды
BMP7_F TCAGCTAGCGTAGAGCCGGCGCGATGCA
BMP7_R TATAAGCTTCTAGTGGCAGCCACAGGC,
а расщепление продукта амплификации и клонирование кодирующей части гена ВМР7 в генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17 проводят с использованием эндонуклеаз рестрикции Nhel и Hindlll.
8. Способ применения генотерапевтического ДНК-вектора на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, несущего целевой ген COL1A1, или COL1A2, или ВМР2, или ВМР7 по пп. 1-3 или 4, для лечения заболеваний, характеризующихся нарушением процессов остеогенеза, формирования и регенерации костной и хрящевой ткани, обусловленных дерегуляцией роста, дифференцировки и апоптоза различных типов клеток, включая остеобласты, хондробласты, замедлением дифференцировки мезенхимальных стволовых клеток в хондробласты и остеобласты, снижением синтеза коллагена, активности щелочной фосфатазы, синтеза остеокальцина, синтеза внеклеточного матрикса и его последующей минерализации в том числе при переломах костей, повышенной хрупкости костей, снижении минерализации костей, для повышения остеоиндуктивности костных имплантатов, а также в качестве альтернативы лекарственным средствам на основе рекомбинантных остеогенных факторов с целью снижения риска гетеротопической оссификации, путем повышения уровня экспрессии целевого гена COL1A1, или COL1A2, или ВМР2, или ВМР7 в организме человека и животных, заключающийся в трансфекции выбранным генотерапевтическим ДНК-вектором, несущим целевой ген на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, или несколькими выбранными генотерапевтическими ДНК-векторами, несущими целевые гены на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, из созданных генотерапевтических ДНК-векторов, несущих целевые гены на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, клеток органов и тканей пациента или животного, и/или во введении в органы и ткани пациента или животного аутологичных клеток этого пациента или животного, трансфицированных выбранным генотерапевтическим ДНК-вектором, несущим целевой ген на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, или несколькими выбранными генотерапевтическими ДНК-векторами, несущими целевые гены на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, из созданных генотерапевтических ДНК-векторов, несущих целевые гены на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, и/или во введении в органы и ткани пациента или животного выбранного генотерапевтического ДНК-вектора, несущего целевой ген на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, или нескольких выбранных генотерапевтических ДНК-векторов, несущих целевые гены на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, из созданных генотерапевтических ДНК-векторов, несущих целевые гены на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, или в сочетании обозначенных способов.
9. Способ получения штамма для производства генотерапевтического ДНК-вектора по пп. 1-3 или 4 для лечения заболеваний, характеризующихся нарушением процессов остеогенеза, формирования и регенерации костной и хрящевой ткани, обусловленных дерегуляцией роста, дифференцировки и апоптоза различных типов клеток, включая остеобласты, хондробласты, замедлением дифференцировки мезенхимальных стволовых клеток в хондробласты и остеобласты, снижением синтеза коллагена, активности щелочной фосфатазы, синтеза остеокальцина, синтеза внеклеточного матрикса и его последующей минерализации в том числе при переломах костей, повышенной хрупкости костей, снижении минерализации костей, для повышения остеоиндуктивности костных имплантатов, а также в качестве альтернативы лекарственным средствам на основе рекомбинантных остеогенных факторов с целью снижения риска гетеротопической оссификации, путем повышения уровня экспрессии целевого гена COL1A1, или COL1A2, или ВМР2, или ВМР7 в организме человека и животных, заключающийся в получении электрокомпетентных клеток штамма Escherichia coliSCS110-AF с последующим проведением электропорации этих клеток генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-COL1A1, или ДНК-вектором VTvaf17-COL1A2, или ДНК-вектором VTvaf17-ВМР2, или ДНК-вектором VTvaf17-ВМР7, после чего клетки высеивают на чашки Петри с агаризованной селективной средой, содержащей дрожжевой экстракт, пептон, 6% сахарозы, а также 10 мкг/мл хлорамфеникола с получением в результате штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-COL1A1, или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-COL1A2, или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-BMP2, или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-BMP7.
10. Штамм Escherichia coliSCS110-AFA/Tvaf17-COL1A1, полученный способом по п. 9, несущий генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-COL1A1, для его наработки с возможностью селекции без использования антибиотиков при получении генотерапевтического ДНК-вектора для лечения заболеваний, характеризующихся нарушением процессов остеогенеза, формирования и регенерации костной и хрящевой ткани, обусловленных дерегуляцией роста, дифференцировки и апоптоза различных типов клеток, включая остеобласты, хондробласты, замедлением дифференцировки мезенхимальных стволовых клеток в хондробласты и остеобласты, снижением синтеза коллагена, активности щелочной фосфатазы, синтеза остеокальцина, синтеза внеклеточного матрикса и его последующей минерализации в том числе при переломах костей, повышенной хрупкости костей, снижении минерализации костей, для повышения остеоиндуктивности костных имплантатов, а также в качестве альтернативы лекарственным средствам на основе рекомбинантных остеогенных факторов с целью снижения риска гетеротопической оссификации.
11. Штамм Escherichia coliSCS110-AF/VTvaf17-COL1A2, полученный способом по п. 9, несущий генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-COL1A2, для его наработки с возможностью селекции без использования антибиотиков при получении генотерапевтического ДНК-вектора для лечения заболеваний, характеризующихся нарушением процессов остеогенеза, формирования и регенерации костной и хрящевой ткани, обусловленных дерегуляцией роста, дифференцировки и апоптоза различных типов клеток, включая остеобласты, хондробласты, замедлением дифференцировки мезенхимальных стволовых клеток в хондробласты и остеобласты, снижением синтеза коллагена, активности щелочной фосфатазы, синтеза остеокальцина, синтеза внеклеточного матрикса и его последующей минерализации в том числе при переломах костей, повышенной хрупкости костей, снижении минерализации костей, для повышения остеоиндуктивности костных имплантатов, а также в качестве альтернативы лекарственным средствам на основе рекомбинантных остеогенных факторов с целью снижения риска гетеротопической оссификации.
12. Штамм Escherichia coliSCS110-AF/VTvaf17-BMP2, полученный способом по п. 9, несущий генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17- ВМР2, для его наработки с возможностью селекции без использования антибиотиков при получении генотерапевтического ДНК-вектора для лечения заболеваний, характеризующихся нарушением процессов остеогенеза, формирования и регенерации костной и хрящевой ткани, обусловленных дерегуляцией роста, дифференцировки и апоптоза различных типов клеток, включая остеобласты, хондробласты, замедлением дифференцировки мезенхимальных стволовых клеток в хондробласты и остеобласты, снижением синтеза коллагена, активности щелочной фосфатазы, синтеза остеокальцина, синтеза внеклеточного матрикса и его последующей минерализации в том числе при переломах костей, повышенной хрупкости костей, снижении минерализации костей, для повышения остеоиндуктивности костных имплантатов, а также в качестве альтернативы лекарственным средствам на основе рекомбинантных остеогенных факторов с целью снижения риска гетеротопической оссификации.
13. Штамм Escherichia coliSCS110-AFA/Tvaf17-BMP7, полученный способом по п. 9, несущий генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-ВМР7, для его наработки с возможностью селекции без использования антибиотиков при получении генотерапевтического ДНК-вектора для лечения заболеваний, характеризующихся нарушением процессов остеогенеза, формирования и регенерации костной и хрящевой ткани, обусловленных дерегуляцией роста, дифференцировки и апоптоза различных типов клеток, включая остеобласты, хондробласты, замедлением дифференцировки мезенхимальных стволовых клеток в хондробласты и остеобласты, снижением синтеза коллагена, активности щелочной фосфатазы, синтеза остеокальцина, синтеза внеклеточного матрикса и его последующей минерализации в том числе при переломах костей, повышенной хрупкости костей, снижении минерализации костей, для повышения остеоиндуктивности костных имплантатов, а также в качестве альтернативы лекарственным средствам на основе рекомбинантных остеогенных факторов с целью снижения риска гетеротопической оссификации.
14. Способ производства в промышленных масштабах генотерапевтического ДНК-вектора на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, несущего целевой ген COL1A1, или COL1A2, или ВМР2, или ВМР7 по пп. 1-3 или 4, для лечения заболеваний, характеризующихся нарушением процессов остеогенеза, формирования и регенерации костной и хрящевой ткани, обусловленных дерегуляцией роста, дифференцировки и апоптоза различных типов клеток, включая остеобласты, хондробласты, замедлением дифференцировки мезенхимальных стволовых клеток в хондробласты и остеобласты, снижением синтеза коллагена, активности щелочной фосфатазы, синтеза остеокальцина, синтеза внеклеточного матрикса и его последующей минерализации в том числе при переломах костей, повышенной хрупкости костей, снижении минерализации костей, для повышения остеоиндуктивности костных имплантатов, а также в качестве альтернативы лекарственным средствам на основе рекомбинантных остеогенных факторов с целью снижения риска гетеротопической оссификации, заключающийся в том, что генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-COL1A1, или генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-COL1A2, или генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-ВМР2, или генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-BMP7 получают путем того, что засевают в колбу с приготовленной средой затравочную культуру, выбранную из штамма Escherichia coliSCS110-AF/VTvaf17-COL1A1, или штамма Escherichia coliSCS110-AF/VTvaf17-COL1A2, или штамма Escherichia coliSCS110-AF/VTvaf17-BMP2, или штамма Escherichia coliSCS110-AF/VTvaf17-ВМР7, затем инкубируют затравочную среду в шейкере-инкубаторе и переносят ее в промышленный ферментер, после чего растят до достижения стационарной фазы, затем выделяют фракцию, содержащую целевой ДНК-продукт, многостадийно фильтруют и очищают хроматографическими методами.
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2018131708A RU2707537C9 (ru) | 2018-09-04 | Генотерапевтический ДНК-вектор на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, несущий целевой ген, выбранный из группы генов COL1A1, COL1A2, BMP2, BMP7, для повышения уровня экспрессии этих целевых генов, способ его получения и применения, штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17- COL1A1 или Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17- COL1A2 или Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17- BMP2 или Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17- BMP7, несущий генотерапевтический ДНК-вектор, способ его получения, способ производства в промышленных масштабах генотерапевтического ДНК-вектора | |
| CN201980073044.8A CN112996914A (zh) | 2018-09-04 | 2019-08-14 | 基于载体VTvaf17的基因治疗 |
| US17/272,730 US11352639B2 (en) | 2018-09-04 | 2019-08-14 | Gene therapy based on vector VTVAF17 |
| PCT/RU2019/000576 WO2020050744A1 (en) | 2018-09-04 | 2019-08-14 | Gene therapy based on vector vtvaf17 |
| EP19857463.4A EP3847259A4 (en) | 2018-09-04 | 2019-08-14 | VTVAF17 VECTOR-BASED GENE THERAPY |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2018131708A RU2707537C9 (ru) | 2018-09-04 | Генотерапевтический ДНК-вектор на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, несущий целевой ген, выбранный из группы генов COL1A1, COL1A2, BMP2, BMP7, для повышения уровня экспрессии этих целевых генов, способ его получения и применения, штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17- COL1A1 или Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17- COL1A2 или Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17- BMP2 или Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17- BMP7, несущий генотерапевтический ДНК-вектор, способ его получения, способ производства в промышленных масштабах генотерапевтического ДНК-вектора |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2707537C1 RU2707537C1 (ru) | 2019-11-27 |
| RU2707537C9 true RU2707537C9 (ru) | 2024-06-14 |
Family
ID=
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2016101664A (ru) * | 2016-01-20 | 2017-07-24 | Селл энд Джин Терапи Лтд | Линейка биологически активных генно-терапевтических субстанций на основе гена col1a1 для коррекции патологических состояний клеток органов и тканей и органов и тканей человека, способ получения и использования |
| RU2016101660A (ru) * | 2016-01-20 | 2017-07-25 | Селл энд Джин Терапи Лтд | Средство для коррекции патологических состояний клеток органов и тканей и/или органов и тканей человека на основе гена col1a2, связанных с количественным снижением белка альфа-2 цепи коллагена i типа |
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2016101664A (ru) * | 2016-01-20 | 2017-07-24 | Селл энд Джин Терапи Лтд | Линейка биологически активных генно-терапевтических субстанций на основе гена col1a1 для коррекции патологических состояний клеток органов и тканей и органов и тканей человека, способ получения и использования |
| RU2016101660A (ru) * | 2016-01-20 | 2017-07-25 | Селл энд Джин Терапи Лтд | Средство для коррекции патологических состояний клеток органов и тканей и/или органов и тканей человека на основе гена col1a2, связанных с количественным снижением белка альфа-2 цепи коллагена i типа |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| OLIVEIRA P.H. et al. Marker-free plasmids for biotechnological applications-implications and perspectives. Trends in biotechnology, 2013. HARDEE C.L. et al. Advances in non-viral DNA vectors for gene therapy. Genes, 2017. LUKE J. et al. Improved antibiotic-free DNA vaccine vectors utilizing a novel RNA based plasmid selection system. Vaccine, 2009. ЕФРЕМОВ А.М. и др. Невирусная регенеративная генотерапия повреждений кожных покровов млекопитающих. Цитология, 2010. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| AU2019203955B2 (en) | Multipartite signaling proteins and uses thereof | |
| KR102648489B1 (ko) | Crispr/cas-매개 유전자 조절을 위한 화학적으로 변형된 가이드 rna | |
| KR101666228B1 (ko) | 생물치료학적 분자를 발현시키기 위한 치료학적 유전자-스위치 작제물 및 생물반응기, 및 이의 용도 | |
| KR20200005596A (ko) | 세포를 엔지니어링하기 위한 물질 및 방법, 및 면역-종양학에서의 그의 용도 | |
| CN107405357A (zh) | 多重shRNAs及其应用 | |
| CN111107880A (zh) | 用于恢复致心律失常性右室心肌病中的电性和心脏功能以及心脏结构的基因疗法策略 | |
| CN103223177A (zh) | 通过针对脂质转运和代谢基因的天然反义转录物的抑制治疗脂质转运和代谢基因相关疾病 | |
| US20190225667A1 (en) | Inducible caspases and methods for use | |
| KR20220098384A (ko) | 폼페병 및 리소좀 장애를 치료하기 위한 간-특이적 프로모터를 포함하는 치료적 아데노-관련 바이러스 | |
| AU2017224111A1 (en) | Transposon system and methods of use | |
| JP2024037917A (ja) | 組換えｔ細胞受容体遺伝子を用いて細胞ベースの治療薬を製造するための技法 | |
| AU2019260687B2 (en) | Rapamycin resistant cells | |
| KR20220002910A (ko) | 효율적인 rna 트랜스-스플라이싱을 위한 삼중 나선 종결인자 | |
| KR20220121844A (ko) | 유전자의 발현을 동시에 조절하기 위한 조성물 및 방법 | |
| KR20210105382A (ko) | 단백질을 코딩하는 rna | |
| IL292351A (en) | Methods for producing chimeric antigen receptor t cells | |
| US20210069249A1 (en) | Methods and compositions of cytotoxic t cell depletion | |
| KR20240037185A (ko) | 키메라 공동자극 수용체, 케모카인 수용체, 및 세포 면역치료에서의 이의 용도 | |
| KR20230010231A (ko) | 생체내 형질도입을 위한 벡터 및 방법 | |
| EP4028033A1 (en) | Compositions and methods for tcr reprogramming using fusion proteins | |
| RU2707537C9 (ru) | Генотерапевтический ДНК-вектор на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, несущий целевой ген, выбранный из группы генов COL1A1, COL1A2, BMP2, BMP7, для повышения уровня экспрессии этих целевых генов, способ его получения и применения, штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17- COL1A1 или Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17- COL1A2 или Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17- BMP2 или Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17- BMP7, несущий генотерапевтический ДНК-вектор, способ его получения, способ производства в промышленных масштабах генотерапевтического ДНК-вектора | |
| CN112996914A (zh) | 基于载体VTvaf17的基因治疗 | |
| KR20220157396A (ko) | 면역 세포에서 아르기닌 수준을 조정하기 위한 방법 및 조성물 | |
| US20190185820A1 (en) | Compositions and Methods for Inhibiting Stem Cell Aging | |
| CN114836442A (zh) | 艾比湖病毒的核酸组合物及其应用 |