RU2688169C9 - Количественная оценка hsa-miR-16-5p, hsa-miR-425-5p, hsa-miR-17-5p, hsa-miR-20a-5p, hsa-miR-101-3p, hsa-miR-30d-5p и hsa-miR-93-5p в плазме периферической крови женщин как способ неинвазивной диагностики серозных пограничных цистаденом и цистаденокарценом яичника - Google Patents
Количественная оценка hsa-miR-16-5p, hsa-miR-425-5p, hsa-miR-17-5p, hsa-miR-20a-5p, hsa-miR-101-3p, hsa-miR-30d-5p и hsa-miR-93-5p в плазме периферической крови женщин как способ неинвазивной диагностики серозных пограничных цистаденом и цистаденокарценом яичника Download PDFInfo
- Publication number
- RU2688169C9 RU2688169C9 RU2018129534A RU2018129534A RU2688169C9 RU 2688169 C9 RU2688169 C9 RU 2688169C9 RU 2018129534 A RU2018129534 A RU 2018129534A RU 2018129534 A RU2018129534 A RU 2018129534A RU 2688169 C9 RU2688169 C9 RU 2688169C9
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- mir
- hsa
- serous
- ovarian
- blood plasma
- Prior art date
Links
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 title claims abstract description 25
- 108091068840 Homo sapiens miR-101-1 stem-loop Proteins 0.000 title claims abstract description 18
- 108091065458 Homo sapiens miR-101-2 stem-loop Proteins 0.000 title claims abstract description 18
- 108091070491 Homo sapiens miR-16-1 stem-loop Proteins 0.000 title claims abstract description 18
- 108091068927 Homo sapiens miR-16-2 stem-loop Proteins 0.000 title claims abstract description 18
- 108091070489 Homo sapiens miR-17 stem-loop Proteins 0.000 title claims abstract description 18
- 108091070496 Homo sapiens miR-20a stem-loop Proteins 0.000 title claims abstract description 18
- 108091067650 Homo sapiens miR-30d stem-loop Proteins 0.000 title claims abstract description 18
- 108091032103 Homo sapiens miR-425 stem-loop Proteins 0.000 title claims abstract description 18
- 108091070377 Homo sapiens miR-93 stem-loop Proteins 0.000 title claims abstract description 18
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 title claims abstract description 8
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 title claims abstract description 8
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 title claims abstract description 7
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 21
- 238000011002 quantification Methods 0.000 title claims 2
- 230000002611 ovarian Effects 0.000 title abstract description 5
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 21
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims abstract description 13
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 claims abstract description 5
- 208000004548 serous cystadenocarcinoma Diseases 0.000 claims abstract description 5
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 claims abstract description 3
- 201000007426 ovarian cystadenocarcinoma Diseases 0.000 claims abstract 2
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 claims description 21
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 claims description 15
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 abstract description 17
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 3
- 238000003748 differential diagnosis Methods 0.000 abstract 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 36
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 33
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 26
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 24
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 24
- 108700011259 MicroRNAs Proteins 0.000 description 19
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 17
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 14
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 14
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 12
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 description 10
- 108091069017 Homo sapiens miR-140 stem-loop Proteins 0.000 description 9
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 description 8
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 7
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 7
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 7
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 7
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 6
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 6
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 6
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 6
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 6
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 5
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 5
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 5
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 5
- 108091070482 Caenorhabditis elegans miR-39 stem-loop Proteins 0.000 description 4
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 4
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 108091060382 miR-140 stem-loop Proteins 0.000 description 4
- 108091030617 miR-140-1 stem-loop Proteins 0.000 description 4
- 108091023370 miR-140-2 stem-loop Proteins 0.000 description 4
- 238000012552 review Methods 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 3
- 238000009004 PCR Kit Methods 0.000 description 3
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 3
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 3
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 3
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000009830 intercalation Methods 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 3
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 3
- 125000002264 triphosphate group Chemical class [H]OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])O* 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010053567 Coagulopathies Diseases 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 2
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 2
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 230000002146 bilateral effect Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- YTRQFSDWAXHJCC-UHFFFAOYSA-N chloroform;phenol Chemical compound ClC(Cl)Cl.OC1=CC=CC=C1 YTRQFSDWAXHJCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000035602 clotting Effects 0.000 description 2
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 2
- 238000012350 deep sequencing Methods 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 108091068974 miR-101 stem-loop Proteins 0.000 description 2
- 108091053561 miR-101-1 stem-loop Proteins 0.000 description 2
- 108091093015 miR-101-2 stem-loop Proteins 0.000 description 2
- 108091027943 miR-16 stem-loop Proteins 0.000 description 2
- 108091074057 miR-16-1 stem-loop Proteins 0.000 description 2
- 108091056204 miR-16-2 stem-loop Proteins 0.000 description 2
- 108091091751 miR-17 stem-loop Proteins 0.000 description 2
- 108091044046 miR-17-1 stem-loop Proteins 0.000 description 2
- 108091065423 miR-17-3 stem-loop Proteins 0.000 description 2
- 108091049679 miR-20a stem-loop Proteins 0.000 description 2
- 108091030817 miR-20a-1 stem-loop Proteins 0.000 description 2
- 108091086627 miR-20a-2 stem-loop Proteins 0.000 description 2
- 108091069790 miR-20a-3 stem-loop Proteins 0.000 description 2
- 108091057431 miR-30d stem-loop Proteins 0.000 description 2
- 108091090925 miR-30d-1 stem-loop Proteins 0.000 description 2
- 108091047055 miR-30d-2 stem-loop Proteins 0.000 description 2
- 108091090987 miR-425 stem-loop Proteins 0.000 description 2
- 108091082652 miR-425-1 stem-loop Proteins 0.000 description 2
- 108091048131 miR-425-2 stem-loop Proteins 0.000 description 2
- 108091032902 miR-93 stem-loop Proteins 0.000 description 2
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 2
- 239000002096 quantum dot Substances 0.000 description 2
- 238000011897 real-time detection Methods 0.000 description 2
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 2
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 2
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 2
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000005641 Adenomyosis Diseases 0.000 description 1
- 241001233887 Ania Species 0.000 description 1
- 241001156002 Anthonomus pomorum Species 0.000 description 1
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 208000005431 Endometrioid Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 201000009273 Endometriosis Diseases 0.000 description 1
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 1
- 208000031448 Genomic Instability Diseases 0.000 description 1
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 1
- 239000004594 Masterbatch (MB) Substances 0.000 description 1
- 108091030146 MiRBase Proteins 0.000 description 1
- 208000037273 Pathologic Processes Diseases 0.000 description 1
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 1
- 238000012167 Small RNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 208000005718 Stomach Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 206010046798 Uterine leiomyoma Diseases 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 208000009956 adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 238000010170 biological method Methods 0.000 description 1
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 1
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000019522 cellular metabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000000205 computational method Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 208000031513 cyst Diseases 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 201000003914 endometrial carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 208000028730 endometrioid adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 201000009274 endometriosis of uterus Diseases 0.000 description 1
- 239000004744 fabric Substances 0.000 description 1
- 206010017758 gastric cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000012252 genetic analysis Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 201000010260 leiomyoma Diseases 0.000 description 1
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 1
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 201000010879 mucinous adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 231100000590 oncogenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002246 oncogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000771 oncological effect Effects 0.000 description 1
- 230000002985 oncosuppressive effect Effects 0.000 description 1
- 201000009441 ovarian cystadenoma Diseases 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 210000003101 oviduct Anatomy 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000009054 pathological process Effects 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 210000004197 pelvis Anatomy 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 230000001124 posttranscriptional effect Effects 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 201000011549 stomach cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000844 transformation Methods 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57407—Specifically defined cancers
- G01N33/57449—Specifically defined cancers of ovaries
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
- C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Pathology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области медицины, в частности к онкогинекологии, и предназначено для неинвазивной диагностики серозных пограничных цистаденом и высокой степени злокачественности цистаденокарцином яичников. Предложена количественная оценка hsa-miR-16-5p, hsa-miR-425-5p, hsa-miR-17-5p, hsa-miR-20a-5p, hsa-miR-101-3р, hsa-miR-30d-5p и hsa-miR-93-5p в плазме периферической крови женщин. Методом количественной ПЦР в реальном времени в образце плазмы крови женщины определяют уровень экспрессии семи мкРНК (hsa-miR-16-5p, hsa-miR-425-5p, hsa-miR-17-5p, hsa-miR-20a-5p, hsa-miR-101-3р, hsa-miR-30d-5p и hsa-miR-93-5p) с предпочтительным использованием стандартных ДНК для последующего расчета оценочного параметра (ОП) при построении модели PLS-DA. При значении 0<ОП<4,5 делают заключение о высокой вероятности наличия серозной опухоли яичников у женщины (серозных пограничных цистаденом и серозных цистаденокарцином высокой степени злокачественности). При значении -1,8<ОП<0 делают заключение о высокой вероятности отсутствия серозной опухоли яичников. Изобретение обеспечивает дифференциальную диагностику серозных опухолей яичников с высокой точностью и диагностической значимостью. 12 ил., 2 пр.
Description
Изобретение относится к области медицины, а именно - к онкогинекологии, к способам неинвазивной диагностики серозных пограничных цистаденом (СПЦАЯ) и высокой степени злокачественности серозных цистаденокарцином (СЦАКЯВСЗ) яичников методом количественной ОТ-ПЦР (полимеразная цепная реакция, сопряженная с обратной транскрипцией) в реальном времени. Может быть использовано для неинвазивного экспресс-анализа наличия СПЦАЯ и СЦАКЯВСЗ у женщин в рамках плановой диспансеризации, в качестве дополнительного метода исследования с целью уточнения диагноза до хирургического лечения, оценки эффективности хирургического и консервативного лечения, выявления рецидивов заболевания.
На сегодняшний день рак яичников занимает седьмое место в структуре общей онкологической заболеваемости, пятое место среди причин смерти от всех злокачественных опухолей у женщин [1] и лидирующее место среди онкогинекологических заболеваний по данным Международного агентства по изучению рака (IARC). Эпителиальный рак составляет 90% от всех случаев диагностированного рака яичников, является гетерогенной группой карцином и состоит из нескольких гистологических подгрупп, а именно: карцинома Бреннера, эндометриоидная, муцинозная и серозная карцинома, каждая характеризующаяся индивидуальными молекулярно-генетическими характеристиками [2, 3]. Среди них, на долю серозного типа приходится 75-80% эпителиальных злокачественных новообразований, и большинство серозных карцином диагностируется уже на поздних стадиях заболевания. Наибольшая летальность (около 70%) наблюдается среди пациентов с серозной карциномой яичников высокой степени злокачественности, образуемой в результате трансформации первичной опухоли в агрессивный и высоко инвазивный тип опухоли, ассоциированный со сменой эпителиального фенотипа на мезенхимальный. На сегодняшний день отсутствуют клинико-диагностические и молекулярно-биологические способы раннего выявления этих преобразований опухоли. При этом серозный рак яичников высокой степени злокачественности, как правило, характеризуется высокой гетерогенностью опухоли и соответствующей геномной нестабильностью, изменением статуса метилирования промоторов кодирующих белок генов и некодирующих участков генома, изменением уровня экспрессии как белков, так и их регуляторов на посттранскрипционном уровне (в том числе микроРНК) [4-7], что обусловливает многокомпонентный и многоуровневый патогенез рака яичников и осложняет поиск маркерных молекул для характеристики этого заболевания. Используемые в настоящий момент диагностические маркеры (в том числе СА125 и НЕ4) не обладают достаточной чувствительностью и специфичностью для выявления серозного рака яичников [8]. Известно, что ложноположительные результаты по уровню СА125 в сыворотке крови могут быть получены при эндометриозе, аденомиозе, воспалительных заболеваний в малом тазу, фиброме матки или доброкачественных кистах. Например, при проведении ретроспективного анализа образцов сыворотки 5500 женщин Швеции было выявлено повышение уровня СА125 у 175 женщин, среди которых лишь у 6 был диагностирован рак яичников, при этом у 3 женщин с нормальным уровнем СА125 был выявлен рак яичников [9].
МикроРНК (мкРНК) являются новым классом эндогенных некодирующих одноцепочечных коротких РНК длиной около 22 нуклеотидов, которые регулируют функцию мРНК путем комплементарного взаимодействия, обусловливающего снижение стабильности мРНК и/или ингибирование трансляции соответствующего белка. Использование инновационного вычислительного метода при массовом объединении данных секвенирования малых РНК позволило в 2014 году идентифицировать 2469 последовательностей мкРНК человека [10], из которых в базе данных miRBase v21 зарегистрирована 1881 мкРНК человека [http://www.mirbase.org/cgibin/mirna_summary.p1?org=has]. Известные на 2014 год мкРНК кодируются в интронных (47%), межгенных (25%) областях, в экзонах (8%), повторяющихся последовательностях (12%) и других участках (4%) генома. Одна и та же мкРНК может участвовать в регуляции сотни генов-мишеней, в то время как каждый из структурных генов является мишенью для различных мкРНК [11]. Теоретически, экспрессия 60% генов человека находится под контролем мкРНК [12]. Большинство мкРНК обладает онкогенной или онкосупрессорной активностью и могут регулировать различные биологические процессы, включая клеточный метаболизм, пролиферацию, апоптоз и химиорезистентность [13, 14]. Поскольку экспрессия мкРНК является тканеспецифичной, детектируется в крови [15] и коррелирует с клиническими проявлениями онкологического заболевания [16], мкРНК можно использовать в качестве потенциальных диагностических и прогностических онкомаркеров.
В качестве прототипа предлагаемого метода взят способ, описанный в [17], согласно которому методом количественной ПЦР в реальном времени возможно определить содержание РНК в ткани или биологической жидкости организма посредством циклической реакции амплификации кДНК, являющейся копией РНК и синтезируемой в ходе реакции обратной транскрипции.
Количественное определение мкРНК методом ОТ-ПЦР в реальном времени включает в себя три этапа: 1) синтез кДНК в ходе сопряженных реакций полиаденилирования и обратной транскрипции мкРНК с олиго(дТ), сцепленного с универсальным праймером; 2) амплификацию последовательности кДНК путем цикличной реакции денатурации ДНК, отжига специфичного для мкРНК смыслового праймера и универсального антисмыслового праймера, удлинения праймеров ДНК-полимеразой с одновременной детекцией флуоресценции интеркалирующего в двухцепочечную ДНК красителя SYBRgreen после каждого цикла реакции; 3) анализ полученных результатов и определение относительного количества кДНК в образце. Количество специфической кДНК в образце зависит от концентрации мкРНК в биологическом материале, степени деградации анализируемой РНК, эффективности выделения РНК, реакции обратной транскрипции, которая крайне чувствительна к примесям контаминирующих агентов в образце [18], эффективности ПЦР. Для того, чтобы учесть влияние вышеперечисленных факторов на количественную оценку специфической кДНК в каждом из образцов анализируют количество нормировочной эндогенной мкРНК, уровень экспрессии которой не меняется при развитии исследуемого патологического процесса. Для оценки эффективностей выделения РНК и реакции обратной транскрипции используют нормировочную экзогенную мкРНК, например, cel-miR-39 (miScript Primer Assay, Ce_miR-39_1, Qiagen, Germany), которую добавляют в обработанные фенольной смесью анализируемые образцы в одинаковом количестве на этапе выделения РНК из данных образцов.
В настоящем изобретении выбор нормировочной эндогенной мкРНК осуществляется по схожести ее количественного профиля с таковым нормировочной экзогенной мкРНК во всех анализируемых образцах.
Как правило, относительный уровень экспрессии кДНК определяют по уравнению (1): (M0s1/M0s2)=2-ΔΔCt, где M0s1 и M0s2 - исходные количества кДНК в образцах s1 и s2, ΔΔCt=(Cts1-Ctnorm1)-(Cts2-Ctnorm2), Ct - значение цикла амплификации в точке пересечения кинетической кривой накопления продукта амплификации с линией порогового уровня флуоресценции, который определяется автоматически программным обеспечением амплификатора; Cts1 и Cts2 - значение порогового цикла амплификации кДНК анализируемой мкРНК в двух сравниваемых образцах s1 и s2; Ctnorm1 и Ctnorm2 - значение порогового цикла амплификации кДНК нормировочной эндогенной или экзогенной мкРНК в двух сравниваемых образцах s1 и s2. Использование метода ΔΔCt возможно при условии, что эффективности реакций амплификации кДНК анализируемой и нормировочной мкРНК равны и близки к 100%. Невыполнение этого условия приводит к значительным ошибкам в результатах.
Для учета эффективности ПЦР проводят амплификацию исследуемой кДНК во всех анализируемых образцах и стандартной ДНК известной концентрации, взятой в реакцию в различных количествах. По калибровочной кривой зависимости Ct стандартной ДНК от десятичного логарифма исходных концентраций стандартной ДНК в реакционной смеси вычисляют исходную концентрацию исследуемой кДНК, исходя из значения Ct для данной кДНК. Стандартом для каждой исследуемой кДНК служит продукт ее амплификации, очищенный смесью фенол-хлороформ, осажденный 70% этиловым спиртом в присутствии 78 мМ ацетата натрия и промытый 80% этиловым спиртом. Концентрацию стандарта измеряют спектрофлуорометрическим способом, например, используя флуориметр Qubit 3.0 (Invitrogen™, USA), гомогенность стандартной ДНК оценивают по кривым плавления по окончании реакции амплификации.
Задача, решаемая предложенным изобретением, заключается в создании неинвазивного достоверного количественного метода определения маркеров СПЦАЯ и СЦАКЯВСЗ в плазме крови женщин, а именно: hsa-miR-16-5p, hsa-miR-425-5p, hsa-miR-17-5p, hsa-miR-20a-5p, hsa-miR-101-3р, hsa-miR-30d-5p, hsa-miR-93-5p. Предложенный метод применим в том числе и в клинической практике в рамках плановой диспансеризации, в качестве дополнительного метода исследования с целью уточнения диагноза до хирургического лечения, оценки эффективности хирургического и консервативного лечения, выявления рецидивов заболевания.
Предложенный способ определения концентрации hsa-miR-16-5p, hsa-miR-425-5p, hsa-miR-17-5p, hsa-miR-20a-5p, hsa-miR-101-3р, hsa-miR-30d-5p, hsa-miR-93-5p в плазме крови женщин методом количественной ОТ-ПЦР с детекцией результатов в режиме реального времени предполагает: 1) выделение РНК из образцов плазмы периферической крови колоночным способом, например, набором Serum Plasma kit (Qiagen, Germany), в течение 1 часа; 2) синтез кДНК в ходе реакции обратной транскрипции мкРНК, например, набором miScript® II RT Kit protocol (Qiagen, Germany) в течение 1 часа 30 минут; 3) амплификацию кДНК с помощью ПНР в реальном времени, например, набором miScript SYBR Green PCR Kit (Qiagen, Germany) и специфичных для мкРНК смысловых праймеров, например, на приборе StepOnePlus™ thermocycler (Applied Biosystems, USA) в течение 5 часов, которая включает детекцию флуоресцентного сигнала с интеркалирующего в двухцепочечный продукт реакции красителя SYBRGreen в режиме реального времени, построение кривых плавления продуктов реакции, обработку данных и их представление в графическом виде с помощью специального программного обеспечения. Применение ПЦР с детекцией результатов в режиме реального времени позволяет уменьшить риск контаминации и автоматизировать процесс диагностики.
Предлагается количественное определение семи мкРНК (hsa-miR-16-5p, hsa-miR-425-5p, hsa-miR-17-5p, hsa-miR-20a-5p, hsa-miR-101-3р, hsa-miR-30d-5p, hsa-miR-93-5p) для неинвазивной диагностики СПЦАЯ и СЦАКЯВСЗ, выявленных авторами настоящего изобретения методом глубокого секвенирования мкРНК образцов СЦАКЯВСЗ при сопоставлении как с тканью серозной доброкачественной цистаденомы яичников (СДЦАЯ), так и с нормальной тканью фимбриального отдела маточной трубы (Фиг. 1). Определение относительной исходной концентрации кДНК hsa-miR-16-5p, hsa-miR-425-5p, hsa-miR-17-5p, hsa-miR-20a-5p, hsa-miR-101-3р, hsa-miR-30d-5p, hsa-miR-93-5p в реакционной ПЦР-смеси осуществляют либо методом AACt, используя нормировочную эндогенную мкРНК hsa-miR-140-3р, либо по калибровочным кривым соответствующих ДНК-стандартов, построенных в виде зависимости Ct стандарта от десятичного логарифма исходных концентраций стандарта в реакционной смеси. Каждый из стандартов известной концентрации добавляют в реакционную ПЦР-смесь в шести последовательно убывающих трехкратных разведениях. Полученные результаты по концентрации кДНК каждой из hsa-miR-16-5p, hsa-miR-425-5p, hsa-miR-17-5p, hsa-miR-20a-5p, hsa-miR-101-3р, hsa-miR-30d-5p, hsa-miR-93-5p нормируют на концентрацию hsa-miR-140-3р, вычисленную так же по калибровочной кривой ДНК-стандарта.
Осуществление Изобретения.
Пример 1.
Материалом исследования являются образцы периферической крови практически здоровых женщин (возраст - 30±4 года, n=13), пациенток с СПЦАЯ (возраст - 51±14 лет, n=3) и СЦАКЯВСЗ (возраст - 48±10 лет, n=8), Фиг. 2. Взятие образцов периферической крови объемом 5 мл осуществляют в пробирки VACUETTE®, содержащие 0,1М раствор ЭДТА (антикоагулянт, препятствующий свертыванию крови). Образцы центрифугируют в течение 20 минут при 300 g (4°С), отбирают плазму, которую повторно центрифугируют в течение 10 минут при 14500 g (4°С). РНК выделяют из 200 мкл плазмы крови набором Serum Plasma kit (Qiagen, Germany) с предварительным добавлением в каждый образец 5,6×108 копий экзогенной нормировочной мкРНК cel-miR-39 (Qiagen, Germany) после обработки фенол-содержащей смесью Qiazol (Qiagen, Germany). Семь из четырнадцати микролитров РНК-содержащего элюата колонки набора Serum Plasma kit конвертируют в кДНК в реакционной смеси (20 мкл), содержащей буфер (1x Hispec buffer), смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов (1x Nucleics mix) и обратную транскриптазу (miScript RT) в соответствии с протоколом miScript® II RT Kit (Qiagen, Germany); по окончании реакции объем образца доводят деионизованной водой до 200 мкл.
Синтезированную кДНК (2 мкл) используют в качестве матрицы для ПЦР в реальном времени с применением смысловых праймеров, специфичных для hsa-miR-16-5p (5'-TAGCAGCACGTAAATATTGGCG, Tm=62°C), hsa-miR-425-5p (5'-AATGACACGATCACTCCCGTTGA, Tm=60°C), hsa-miR-17-5p (5'-CAAAGTGCTTACAGTGCAGGTAG, Tm=55°C), hsa-miR-20a-5p (5'-TAAAGTGCTTATAGTGCAGGTAG, Tm=52°C), hsa-miR-101-3р (5'-TACAGTACTGTGATAACTGAA, Tm=55°C), hsa-miR-30d-5p (5'-TGTAAACATCCCCGACTGGAAG, Tm=55°C), hsa-miR-93-5p (5'-CAAAGTGCTGTTCGTGCAGGTAG, Tm=55°C), hsa-miR-140-3р (5'-TACCACAGGGTAGAACCACGG, Tm=55°C), cel-miR-39 (miScript Primer Assay, Ce_miR-39_1, Qiagen, Germany, Tm=55°C) и 1x реакционную смесь (SYBR PCR Master Mix) с добавленным lx универсальным антисмысловым праймером (miScript Universal Primer) из набора miScript SYBR Green PCR Kit (Qiagen, Germany). Протокол амплификации следующий: (1) денатурация ДНК в течение 15 мин при 95°С, (2) 40 циклов амплификации: денатурация ДНК при 94°С в течение 15 сек, отжиг смыслового и антисмыслового праймеров при оптимизированной температуре (52-62°С) в течение 30 сек, удлинение праймеров при 70°С в течение 30 сек с детекцией флуоресцентного сигнала после каждого цикла реакции, (3) построение кривых плавления продукта ПЦР (нагревание реакционной смеси с 65°С до 95°С с шагом 0,1°С, сопровождающееся детекцией флуоресцентного сигнала на каждом шаге) в амплификаторе StepOnePlus™ thermocycler (Applied Biosystems, USA). Специфичность амплификации проверяют при анализе кривых плавления продукта ПЦР.
Относительный уровень экспрессии кДНК вычисляют по разнице пороговых циклов амплификации кДНК анализируемой мкРНК (hsa-miR-16-5р, hsa-miR-425-5p, hsa-miR-17-5p, hsa-miR-20a-5p, hsa-miR-101-3р, hsa-miR-30d-5p, hsa-miR-93-5p) и нормировочной эндогенной мкРНК (hsa-miR-140-3р) в одном и том же образце (Фиг. 3). Анализ значимости различий ΔCt мкРНК в группах женщин с серозными опухолями яичников и практически здоровых женщин выполняют с использованием двустороннего теста Вилкоксона-Манна-Уитни (Фиг. 4). Медиану ΔCt каждой из исследуемых мкРНК в группах СПЦАЯ и СЦАКЯВСЗ сопоставляют с таковой в группе практических здоровых женщин (Фиг. 5). Полученные данные ΔCt каждой из исследуемых мкРНК в образце используют для построения модели дискриминантного анализа методом частных наименьших квадратов (PLS-DA) и разработки оценочного параметра (ОП), позволяющего выявить различия между образцами плазмы женщин из группы серозных опухолей яичников (СПЦАЯ, СЦАКЯВСЗ; 1<ОП<8) и образцами плазмы практически здоровых женщин (-7<ОП<1). Результаты применения PLS-DA представлены на Фиг. 6. Вклад семи мкРНК в дифференциацию образцов по наличию или отсутствию СПЦАЯ и СПАКЯВСЗ характеризуют значения параметра важности переменной в проекции (variable importance in projection - VIP), где наибольший вклад имеет miR-16-5p (VIP=1,19), наименьший - miR-30d-5p (VIP=0,53), а промежуточный - miR-17-5p (VIP=1,14), miR-93-5p (VIP=1,04), miR-20a-5p (VIP=1,03), miR-425-5p (VIP=0,97), miR-101-3р (VIP=0,92).
Пример 2.
Материалом исследования являются образцы периферической крови практически здоровых женщин (возраст - 30±4 года, n=13), пациенток с СПЦАЯ (возраст - 51±14 лет, n=3) и СЦАКЯВСЗ (возраст - 48±10 лет, n=8), Фиг. 2. Взятие образцов периферической крови объемом 5 мл осуществляют в пробирки VACUETTE®, содержащие 0,1М раствор ЭДТА (антикоагулянт, препятствующий свертыванию крови). Образцы центрифугируют в течение 20 минут при 300 g (4°С), отбирают плазму, которую повторно центрифугируют в течение 10 минут при 14500 g (4°С). РНК выделяют из 200 мкл плазмы крови набором Serum Plasma kit (Qiagen, Germany) с предварительным добавлением в каждый образец 5,6×108 копий экзогенной нормировочной мкРНК cel-miR-39 (Qiagen, Germany) после обработки фенол-содержащей смесью Qiazol (Qiagen, Germany). Семь из четырнадцати микролитров РНК-содержащего элюата колонки набора Serum Plasma kit конвертируют в кДНК в реакционной смеси (20 мкл), содержащей буфер (1x Hispec buffer), смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов (1x Nucleics mix) и обратную транскриптазу (miScript RT) в соответствии с протоколом miScript® II RT Kit (Qiagen, Germany); по окончании реакции объем образца доводят деионизованной водой до 200 мкл.
Определение относительной исходной концентрации кДНК hsa-miR-16-5р, hsa-miR-425-5p, hsa-miR-17-5p, hsa-miR-20a-5p, hsa-miR-101-3р, hsa-miR-30d-5p, hsa-miR-93-5p в реакционной ПЦР-смеси осуществляют по калибровочным кривым соответствующих ДНК-стандартов в виде зависимости Ct стандарта от десятичного логарифма исходных концентраций стандарта в реакционной смеси. Стандартом для каждой исследуемой кДНК служит продукт ее амплификации в 50 мкл реакционной смеси, содержащей один из смысловых праймеров, специфичных для hsa-miR-16-5p (5'-TAGCAGCACGTAAATATTGGCG, Tm=62°C), hsa-miR-425-5p (5'-AATGACACGATCACTCCCGTTGA, Tm=60°C), hsa-miR-17-5p (5'-CAAAGTGCTTACAGTGCAGGTAG, Tm=55°C), hsa-miR-20a-5p (5'-TAAAGTGCTTATAGTGCAGGTAG, Tm=52°C), hsa-miR-101-3р (5'-TACAGTACTGTGATAACTGAA, Tm=55°C), hsa-miR-30d-5p (5'-TGTAAACATCCCCGACTGGAAG, Tm=55°C), hsa-miR-93-5p (5'-CAAAGTGCTGTTCGTGCAGGTAG, Tm=55°C), hsa-miR-140-3р (5'-TACCACAGGGTAGAACCACGG, Tm=55°C), 1x универсальный антисмысловой праймер (miScript Universal Primer) из набора miScript SYBR Green PCR Kit (Qiagen, Germany), 1x буфер (TaqTurbo buffer, Евроген) без флуоресцентного интеркалирующего красителя, lx смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов (Евроген) и 5 единиц HS Taq ДНК-полимеразы (Евроген). Протокол амплификации следующий: (1) денатурация ДНК в течение 15 мин при 95°С, (2) 40 циклов амплификации: денатурация ДНК при 94°С в течение 15 сек, отжиг смыслового и антисмыслового праймеров при оптимизированной температуре (52-62°С) в течение 30 сек, удлинение праймеров при 70°С в течение 30 сек. Синтезированные стандарты очищают смесью фенол-хлороформ, осаждают 70% этиловым спиртом в присутствии 78 мМ ацетата натрия и линейного акриламида, осадок промывают 80% этиловым спиртом и растворяют в 20 мкл деионизированной воды. Концентрацию стандарта измеряют спектрофлуорометрическим способом в флуориметре Qubit 3.0 (Invitrogen™, USA).
Амплификацию синтезированных кДНК (2 мкл) проводят наряду с амплификацией соответствующей стандартной ДНК в шести последовательно убывающих трехкратных разведениях в реакционных смесях, содержащих один из смысловых праймеров, специфичных для hsa-miR-16-5p (5'-TAGCAGCACGTAAATATTGGCG, Tm=62°C), hsa-miR-425-5p (5'-AATGACACGATCACTCCCGTTGA, Tm=60°C), hsa-miR-17-5p (5'-CAAAGTGCTTACAGTGCAGGTAG, Tm=55°C), hsa-miR-20a-5p (5'-TAAAGTGCTTATAGTGCAGGTAG, Tm=52°C), hsa-miR-101-3p (5'-TACAGTACTGTGATAACTGAA, Tm=55°C), hsa-miR-30d-5p (5'-TGTAAACATCCCCGACTGGAAG, Tm=55°C), hsa-miR-93-5p (5'-CAAAGTGCTGTTCGTGCAGGTAG, Tm=55°C), hsa-miR- 140-3p (5'-TACCACAGGGTAGAACCACGG, Tm=55°C), 1x реакционную смесь (SYBR PCR Master Mix) с добавленным 1x универсальным антисмысловым праймером (miScript Universal Primer) из набора miScript SYBR Green PCR Kit (Qiagen, Germany). Протокол амплификации следующий: (1) денатурация ДНК в течение 15 мин при 95°С, (2) 40 циклов амплификации: денатурация ДНК при 94°С в течение 15 сек, отжиг смыслового и антисмыслового праймеров при оптимизированной температуре (52-62°С) в течение 30 сек, удлинение праймеров при 70°С в течение 30 сек с детекцией флуоресцентного сигнала после каждого цикла реакции, (3) построение кривых плавления продукта ПЦР (нагревание реакционной смеси с 65°С до 95°С с шагом 0,1°С, сопровождающееся детекцией флуоресцентного сигнала на каждом шаге) в амплификаторе StepOnePlus™ thermocycler (Applied Biosystems, USA). Специфичность амплификации проверяют при анализе кривых плавления продукта ПЦР. На Фиг. 7 приведены кривые увеличения интенсивности флуоресценции реакционной смеси при амплификации последовательно уменьшающихся в три раза концентраций стандартной ДНК для miR-140-3р в зависимости от числа циклов ПЦР.
Для каждой анализируемой мкРНК в образце при помощи программного обеспечения прибора определяют величину порогового цикла (Ct), при котором значение флуоресценции реакционной смеси достигает «порогового» уровня (Т), одинакового для данной мкРНК во всех сравниваемых образцах, включая стандартную ДНК. Исходную концентрацию кДНК (М0) в анализируемом образце вычисляют по уравнению калибровочной кривой:
Lg(M0)=a-b*Ct, где a=1g(T), b=1g(1+Eff), Eff - эффективность ПЦР. Коэффициенты а и b уравнения вычисляют при построении калибровочной кривой. На Фиг. 8 приведены графики калибровочных кривых, определяющих зависимость значений Ct, полученных при амплификации шести разведений стандартной ДНК, и значений десятичного логарифма исходных концентраций стандартной ДНК 1g(M0). По калибровочным кривым, представленным на Фиг. 8, вычисляют исходную концентрацию исследуемой кДНК hsa-miR-16-5р, hsa-miR-425-5p, hsa-miR-17-5р, hsa-miR-20a-5p, hsa-miR-101-3р, hsa-miR-30d-5p, hsa-miR-93-5p, hsa-miR-140-3р, исходя из значения Ct для данной кД НК. Полученные результаты по концентрации кДНК каждой из исследуемых мкРНК (hsa-miR-16-5р, hsa-miR-425-5p, hsa-miR-17-5р, hsa-miR-20а-5р, hsa-miR-101-3р, hsa-miR-30d-5p, hsa-miR-93-5p) нормируют на концентрацию hsa-miR-140-3р (Фиг. 9). Анализ значимости различий относительного уровня экспрессии мкРНК в плазме крови в группах женщин с серозными опухолями яичников и практически здоровых женщин выполняют с использованием двустороннего теста Вилкоксона-Манна-Уитни (Фиг. 10). Медиану относительного уровня экспрессии мкРНК в группах СПЦАЯ и СЦАКЯВСЗ сопоставляют с таковой в группе практических здоровых женщин (Фиг. 11).
Полученные данные относительного уровня экспрессии каждой из исследуемых мкРНК в образце используют для построения модели дискриминантного анализа методом частных наименьших квадратов (PLS-DA) и разработки оценочного параметра (ОП), позволяющего выявить различия между образцами плазмы женщин из группы серозных опухолей яичников (СПЦАЯ, СЦАКЯВСЗ; 0<ОП<4,5) и образцами плазмы практически здоровых женщин (-1,8<ОП<0). Результаты применения PLS-DA представлены на Фиг. 12. Вклад семи мкРНК в дифференциацию образцов по наличию или отсутствию СПЦАЯ и СПАКЯВСЗ характеризуют значения параметра важности переменной в проекции (variable importance in projection -VIP), где наибольший вклад имеет miR-16-5p (VIP=1,96), наименьший - miR-30d-5p (VIP=0,34), а промежуточный - miR-20a-5p (VIP=0,98), miR-101-3р (VIP=0,75), miR-93-5p (VIP=0,75), miR-17-5p (VIP=0,69), miR-425-5p (VIP=0,65). Высокое значение Q2, равное 0,70, для модели PLS-DA указывает на то, что разделение образцов групп здоровых женщин и женщин с серозными опухолями яичников по профилям экспрессии вышеперечисленных семи мкРНК является качественным и надежным.
Фиг. 1. Сравнительный анализ уровня экспрессии мкРНК в образцах ткани фимбриального отдела маточной трубы, СДЦАЯ, СЦАКЯВСЗ по данным глубокого секвенирования мкРНК.
Фиг. 2. Клинические характеристики пациенток, взятых в исследование.
Фиг. 3. Относительный уровень экспрессии кДНК анализируемых мкРНК методом ΔCt.
Фиг. 4. Результаты статистического анализа показателей уровней экспрессии кДНК анализируемых мкРНК методом ΔCt.
Фиг. 5. Сравнительный анализ уровня экспрессии мкРНК в группах СПЦАЯ, СЦАКЯВСЗ и контрольной группе (норма) методом количественной ПЦР. На бокс-диаграмме представлены медианы значений ΔCt, 25% и 75% квартилей.
Фиг. 6. Модель PLS-DA, построенная с использованием ОТ-ПЦР данных по экспрессии семи мкРНК в плазме крови в виде значений ΔCt в группах здоровых женщин, СПЦАЯ и СПАКЯВСЗ.
Фиг. 7. Кривые ПЦР в реальном времени трехкратных разведений стандартной ДНК для miR-140-3р. Стрелками обозначен уровень флуоресценции реакционной смеси, одинаковый для всех сравниваемых образцов, при котором определяется значение Ct.
Фиг. 8. Калибровочные кривые зависимости Ct стандартной ДНК от десятичного логарифма исходных концентраций стандартной ДНК для количественной оценки hsa-miR-16-5р, hsa-miR-425-5p, hsa-miR-17-5р, hsa-miR-20a-5p, hsa-miR-101-3р, hsa-miR-30d-5p, hsa-miR-93-5p, hsa-miR-140-3р в плазме крови женщин исследуемых групп.
Фиг. 9. Относительный уровень экспрессии кДНК в образцах групп здоровых женщин, СПЦАЯ и СПАКЯВСЗ.
Фиг. 10. Результаты статистического анализа относительного уровня экспрессии кДНК анализируемых мкРНК, вычисленного по калибровочным кривым с использованием стандартных ДНК.
Фиг. 11. Сравнительный анализ уровня экспрессии мкРНК в группах СПЦАЯ, СЦАКЯВСЗ и контрольной группе (норма) методом количественной ПНР с использованием калибровочных кривых стандартных ДНК. На бокс-диаграмме представлены медианы значений ΔCt, 25% и 75% квартилей.
Фиг. 12. Модель PLS-DA, построенная с использованием ОТ-ПЦР данных по экспрессии семи мкРНК в плазме крови в виде относительных концентраций, рассчитанных по калибровочным кривым стандартных ДНК, в группах здоровых женщин, СПЦАЯ и СПАКЯВСЗ.
Список литературы
1. Reid ВМ, Permuth JB, Sellers ТА. Epidemiology of ovarian cancer: a review. Cancer Biol Med. 2017 Feb; 14(1):9-32.
2. Seidman JD, Kurman RJ. Pathology of ovarian carcinoma. Hematol Oncol Clin North Am. 2003 Aug; 17(4):909-25, vii. Review
3. Shih IeM, Kurman RJ. Ovarian tumorigenesis: a proposed model based on morphological and molecular genetic analysis. Am J Pathol. 2004 May; 164(5):1511-8. Review
4. Levanon K, Crum C, Drapkin R. New insights into the pathogenesis of serous ovarian cancer and its clinical impact. J Clin Oncol. 2008 Nov 10;26(32):5284-93.
5. Cancer Genome Atlas Research Network. Integrated genomic analyses of ovarian carcinoma. Nature. 2011 Jun 29;474(7353):609-15.
6. Kanchi KL, Johnson KJ, Lu C, McLellan MD, Leiserson MD, Wendl MC, Zhang Q, Koboldt DC, Xie M, Kandoth C, McMichael JF, Wyczalkowski MA, Larson DE, Schmidt HK, Miller CA, Fulton RS, Spellman PT, Mardis ER, Druley ТЕ, Graubert ТА, Goodfellow PJ, Raphael BJ, Wilson RK, Ding L. Integrated analysis of germline and somatic variants in ovarian cancer. Nat Commun. 2014;5:3156.
7. Yang D, Sun Y, Hu L, Zheng H, Ji P, Pecot CV, Zhao Y, Reynolds S, Cheng H,Rupaimoole R, Cogdell D, Nykter M, Broaddus R, Rodriguez-Aguayo C, Lopez-Berestein G, Liu J, Shmulevich I, Sood AK, Chen K, Zhang W. Integrated analyses identify a master microRNA regulatory network for the mesenchymal subtype in serous ovarian cancer. Cancer Cell. 2013 Feb 11;23(2): 186-99.
8. Sturgeon CM, Duffy MJ, Stenman UH, Lilja H, Briinner N, Chan DW, Babaian R,Bast RC Jr, Dowell B, Esteva FJ, Haglund C, Harbeck N, Hayes DF, Holten-Andersen M, Klee GG, Lamerz R, Looijenga LH, Molina R, Nielsen HJ, Rittenhouse H, Semjonow A, Shih IeM, Sibley P, Soletormos G, Stephan C, Sokoll L, Hoffman BR, Diamandis EP; National Academy of Clinical Biochemistry. National Academy of Clinical Biochemistry laboratory medicine practice guidelines for use of tumor markers in testicular, prostate, colorectal, breast, and ovarian cancers. Clin Chem. 2008 Dec;54(12):ell-79.
9. Einhorn N, Sjovall K, Knapp RC, Hall P, Scully RE, Bast RC Jr, Zurawski VR Jr. Prospective evaluation of serum С A 125 levels for early detection of ovarian cancer. Obstet Gynecol. 1992 Jul;80(l):14-8.
10. Friedlander MR, Lizano E, Houben AJ, Bezdan D, Banez-Coronel M, Kudla G, Mateu-Huertas E, Kagerbauer B, Gonzalez J, Chen КС, LeProust EM, Marti E, Estivill X. Evidence for the biogenesis of more than 1,000 novel human microRNAs. Genome Biol. 2014 Apr 7;15(4):R57.
11. Gerstein M. Genomics: ENCODE leads the way on big data. Nature. 2012 Sep 13;489(7415):208
12. Sayed D, Abdellatif M. MicroRNAs in development and disease. Physiol Rev. 2011 Jul;91(3):827-87
13. Calin GA, Croce CM. MicroRNA signatures in human cancers. Nat Rev Cancer. 2006 Nov;6(l l):857-66; Wang F, Fu XD, Zhou Y, Zhang Y. Down-regulation of the cyclin El oncogene expression by microRNA-16-1 induces cell cycle arrest in human cancer cells. BMB Rep. 2009 Nov 30;42(11):725-30.
14. Wang F, Song X, Li X, Xin J, Wang S, Yang W, Wang J, Wu K, Chen X, Liang J, Tian J, Cao F. Noninvasive visualization of microRNA-16 in the chemoresistance of gastric cancer using a dual reporter gene imaging system. PLoS One. 2013 Apr 17;8(4):e61792.
15. Resnick KE, Alder H, Hagan JP, Richardson DL, Croce CM, Cohn DE. The detection of differentially expressed microRNAs from the serum of ovarian cancer patients using a novel real-time PCR platform. Gynecol Oncol. 2009 Jan;112(l):55-9.
16. Yu SL, Chen HY, Chang GC, Chen CY, Chen HW, Singh S, Cheng CL, Yu CJ, Lee YC, Chen HS, Su TJ, Chiang CC, Li HN, Hong QS, Su HY, Chen CC, Chen WJ, Liu CC, Chan WK, Chen WJ, Li КС, Chen JJ, Yang PC. MicroRNA signature predicts survival and relapse in lung cancer. Cancer Cell. 2008 Jan;13(1):48-57.
17. Saunders NA. Real-time PCR. Methods Mol Biol. 2004;266:191-211
18. Freeman WM, Walker SJ, Vrana KE. Quantitative RT-PCR: pitfalls and potential. Biotechniques. 1999 Jan;26(l):l 12-22, 124-5. Review.
Claims (1)
- Количественная оценка hsa-miR-16-5p, hsa-miR-425-5p, hsa-miR-17-5p, hsa-miR-20a-5p, hsa-miR-101-3р, hsa-miR-30d-5p и hsa-miR-93-5p в плазме периферической крови женщин как способ неинвазивной диагностики серозных пограничных цистаденом и высокой степени злокачественности цистаденокарцином яичников, отличающийся тем, что методом количественной ПЦР в реальном времени в образце плазмы крови женщины определяют уровень экспрессии семи мкРНК (hsa-miR-16-5p, hsa-miR-425-5p, hsa-miR-17-5p, hsa-miR-20a-5p, hsa-miR-101-3р, hsa-miR-30d-5p и hsa-miR-93-5p) с предпочтительным использованием стандартных ДНК для последующего расчета оценочного параметра (ОП) при построении модели PLS-DA: при значении 0<ОП<4,5 делают заключение о высокой вероятности наличия серозной опухоли яичников у женщины (серозных пограничных цистаденом и серозных цистаденокарцином высокой степени злокачественности), при значении -1,8<ОП<0 делают заключение о высокой вероятности отсутствия серозной опухоли яичников.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2018129534A RU2688169C9 (ru) | 2018-08-14 | 2018-08-14 | Количественная оценка hsa-miR-16-5p, hsa-miR-425-5p, hsa-miR-17-5p, hsa-miR-20a-5p, hsa-miR-101-3p, hsa-miR-30d-5p и hsa-miR-93-5p в плазме периферической крови женщин как способ неинвазивной диагностики серозных пограничных цистаденом и цистаденокарценом яичника |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2018129534A RU2688169C9 (ru) | 2018-08-14 | 2018-08-14 | Количественная оценка hsa-miR-16-5p, hsa-miR-425-5p, hsa-miR-17-5p, hsa-miR-20a-5p, hsa-miR-101-3p, hsa-miR-30d-5p и hsa-miR-93-5p в плазме периферической крови женщин как способ неинвазивной диагностики серозных пограничных цистаденом и цистаденокарценом яичника |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2688169C1 RU2688169C1 (ru) | 2019-05-20 |
| RU2688169C9 true RU2688169C9 (ru) | 2019-07-08 |
Family
ID=66578810
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2018129534A RU2688169C9 (ru) | 2018-08-14 | 2018-08-14 | Количественная оценка hsa-miR-16-5p, hsa-miR-425-5p, hsa-miR-17-5p, hsa-miR-20a-5p, hsa-miR-101-3p, hsa-miR-30d-5p и hsa-miR-93-5p в плазме периферической крови женщин как способ неинвазивной диагностики серозных пограничных цистаденом и цистаденокарценом яичника |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2688169C9 (ru) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2818356C1 (ru) * | 2022-11-30 | 2024-05-02 | федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Ульяновский государственный университет" | Способ оценки резистентности опухоли плоскоклеточного рака горла к радиационной терапии и набор тестов для его реализации |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2325118C1 (ru) * | 2007-06-05 | 2008-05-27 | Анастасия Альлеровна Герасимова | Способ дифференциальной диагностики опухолеподобных образований и опухолей яичников у беременных |
| WO2018129535A1 (en) * | 2017-01-09 | 2018-07-12 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Circulating microrna signatures for ovarian cancer |
-
2018
- 2018-08-14 RU RU2018129534A patent/RU2688169C9/ru active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2325118C1 (ru) * | 2007-06-05 | 2008-05-27 | Анастасия Альлеровна Герасимова | Способ дифференциальной диагностики опухолеподобных образований и опухолей яичников у беременных |
| WO2018129535A1 (en) * | 2017-01-09 | 2018-07-12 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Circulating microrna signatures for ovarian cancer |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| CLOONAN N. et al. The miR-17-5p microRNA is a key regulator of the G1/S phase cell cycle transition. Genome Biol. 2008; 9(8): R127. * |
| CLOONAN N. et al. The miR-17-5p microRNA is a key regulator of the G1/S phase cell cycle transition. Genome Biol. 2008; 9(8): R127. SAUNDERS N.A. Real-time PCR. Methods Mol Biol. 2004; 266: 191-211. * |
| SAUNDERS N.A. Real-time PCR. Methods Mol Biol. 2004; 266: 191-211. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2818356C1 (ru) * | 2022-11-30 | 2024-05-02 | федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Ульяновский государственный университет" | Способ оценки резистентности опухоли плоскоклеточного рака горла к радиационной терапии и набор тестов для его реализации |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2688169C1 (ru) | 2019-05-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20220356528A1 (en) | Microrna assay for detection and management of pancreatic cancer precursors | |
| Li et al. | Method for microRNA isolation from clinical serum samples | |
| Sourvinou et al. | Quantification of circulating miRNAs in plasma: effect of preanalytical and analytical parameters on their isolation and stability | |
| Shen et al. | Circulating miR-148b and miR-133a as biomarkers for breast cancer detection | |
| AU2018202963B2 (en) | Biomarkers useful for detection of types, grades and stages of human breast cancer | |
| Basati et al. | Elevated level of microRNA-21 in the serum of patients with colorectal cancer | |
| Tian et al. | Up-regulation of miR-21 expression predicate advanced clinicopathological features and poor prognosis in patients with non-small cell lung cancer | |
| Al‑Sheikh et al. | Expression profiling of selected microRNA signatures in plasma and tissues of Saudi colorectal cancer patients by qPCR | |
| Xiong et al. | A genetic variant in pre-miR-27a is associated with a reduced cervical cancer risk in southern Chinese women | |
| Zhang et al. | Identification of a novel microRNA signature associated with intrahepatic cholangiocarcinoma (ICC) patient prognosis | |
| Kim et al. | Genome-wide identification of OTP gene as a novel methylation marker of breast cancer | |
| Rao et al. | Identification of plasma exosomes long non-coding RNA HAGLR and circulating tumor cells as potential prognosis biomarkers in non-small cell lung cancer | |
| CN107299129B (zh) | 循环核酸作为乳腺癌生物标志物的应用 | |
| US20150247202A1 (en) | Microrna based method for diagnosis of colorectal tumors and of metastasis | |
| US20160258028A1 (en) | METHODS AND COMPOSITIONS FOR DETECTING COLORECTAL CANCER USING MICRO RNAs | |
| RU2688169C9 (ru) | Количественная оценка hsa-miR-16-5p, hsa-miR-425-5p, hsa-miR-17-5p, hsa-miR-20a-5p, hsa-miR-101-3p, hsa-miR-30d-5p и hsa-miR-93-5p в плазме периферической крови женщин как способ неинвазивной диагностики серозных пограничных цистаденом и цистаденокарценом яичника | |
| Suárez‑Arriaga et al. | A proposed method for the relative quantification of levels of circulating microRNAs in the plasma of gastric cancer patients Corrigendum in/10.3892/ol. 2017.7626 | |
| CN109563548B (zh) | 用于鉴定胰腺癌或胰腺导管内乳头状粘液性瘤的体外方法 | |
| Zhang et al. | The association between differentially expressed micro RNAs in breast cancer cell lines and the micro RNA‑205 gene polymorphism in breast cancer tissue | |
| CN111518914B (zh) | 用于检测乳腺癌的miRNA标记物组合、试剂盒和方法 | |
| CN108315415A (zh) | CYP1B1rs162549在制备预测前列腺癌根治术后生化复发风险的试剂中的应用 | |
| CN110241255B (zh) | 一种用于HBV miR-3荧光定量PCR的检测材料及试剂盒 | |
| US20150080229A1 (en) | Plasma microribonucleic acids as biomarkers for endometriosis and endometriosis-associated ovarian cancer | |
| Forder | Evaluation of circulating miRNA signatures as a blood test for the early detection of nasopharyngeal carcinoma | |
| CN117587124A (zh) | 诊断胰腺癌的检测试剂和试剂盒及应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| TH4A | Reissue of patent specification | ||
| TK4A | Correction to the publication in the bulletin (patent) |
Free format text: CORRECTION TO CHAPTER -FG4A- IN JOURNAL 14-2019 FOR INID CODE(S) (54) |