RU2687135C1 - Strain of heterotrophic bacteria cupriavidus gilardii - associate for producing microbial protein mass - Google Patents
Strain of heterotrophic bacteria cupriavidus gilardii - associate for producing microbial protein mass Download PDFInfo
- Publication number
- RU2687135C1 RU2687135C1 RU2018134469A RU2018134469A RU2687135C1 RU 2687135 C1 RU2687135 C1 RU 2687135C1 RU 2018134469 A RU2018134469 A RU 2018134469A RU 2018134469 A RU2018134469 A RU 2018134469A RU 2687135 C1 RU2687135 C1 RU 2687135C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- methane
- strain
- bacteria
- microorganisms
- gbs
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к микробиологической промышленности, а именно к штамму гетеротрофных бактерий Cupriavidus gilardii GBS-15-1 для получения белковой биомассы ассоциативной культурой, включающей метанокисляющие бактерии и бактерии-гетеротрофы. Микробная белковая масса может быть использована в сельском хозяйстве для кормления животных, а также в качестве сырья для глубокой переработки.The invention relates to the microbiological industry, namely to the strain of heterotrophic bacteria Cupriavidus gilardii GBS-15-1 for the production of protein biomass by an associative culture, including methane-oxidizing bacteria and heterotrophic bacteria. Microbial protein mass can be used in agriculture for feeding animals, as well as raw materials for deep processing.
На сегодняшний день общая картина в России по производству кормовых белков неблагоприятна. Согласно подписанной президентом России доктрины для обеспечения собственным продовольствием на 80-90%, дефицит кормовых продуктов может составить не менее 2 млн тонн в год.To date, the overall picture in Russia for the production of feed proteins is unfavorable. According to the 80-90% doctrine signed by the President of Russia for providing own food for 80-90%, the shortage of feed products may be at least 2 million tons per year.
Основным источником белкового продукта является соевый шрот. Однако природные условия нашей страны не подходят для выращивания сои в достаточных количествах. Специалистам приходится искать другие способы производства кормового белка.The main source of protein product is soybean meal. However, the natural conditions of our country are not suitable for growing soybeans in sufficient quantities. Professionals have to look for other ways to produce feed protein.
Среди продуцентов кормовой биомассы известны различные микроорганизмы, относящиеся к различным таксономическим группам, способные расти на различных субстратах.Among the producers of fodder biomass, various microorganisms belonging to different taxonomic groups are known that can grow on different substrates.
Использование бактерий в качестве продуцентов кормового белка является более эффективным, так как бактерии накапливают до 79% белка по массе, в то время как дрожжи - не более 60%.The use of bacteria as producers of feed protein is more efficient, since bacteria accumulate up to 79% of protein by weight, while yeast does not exceed 60%.
В качестве продуцентов белка и биомассы применяют штаммы бактерий, известные как продуценты белка на основе метанола и относящиеся к роду Acetobacter: Acetobacter methylicum ВСБ-924 ЦМПМ В-2942 (патент РФ N 116363, C12N 15/00, 1984); Acetobacter methylicum ВСБ-867 ЦМПМ В-1947 (патент РФ N 925112, C12N 15/00, 1982); Acetobacter methylovorans ВСБ-914 ЦМПМ В-2479 (патент РФ N 1070916, C12N 15/00, 1983). Все штаммы характеризуются содержанием белка - до 76% к абсолютно сухому веществу (АСВ).Bacterial strains known as protein producers based on methanol and belonging to the genus Acetobacter: Acetobacter methylicum BWA-924 CMPM B-2942 (RF patent N 116363, C12N 15/00, 1984) are used as producers of protein and biomass; Acetobacter methylicum BCB-867 CMPM B-1947 (RF patent N 925112, C12N 15/00, 1982); Acetobacter methylovorans VSB-914 CMPM B-2479 (RF patent N 1070916, C12N 15/00, 1983). All strains are characterized by a protein content of up to 76% of absolutely dry matter (DIA).
Штаммы различаются чувствительностью к типовым фагам и термоустойчивостью: оптимальный рост у Acetobacter methylicum ВСБ-867 при 28-30°С, у Acetobacter methylicum ВСБ-924 - 30-36°С и Acetobacter methylovorans ВСБ-914 при 36-40°С.The strains differ in their sensitivity to type phages and heat resistance: optimal growth in Acetobacter methylicum BCE-867 at 28-30 ° C, in Acetobacter methylicum BWA-924 - 30-36 ° C and Acetobacter methylovorans BWA-914 at 36-40 ° C.
Однако, при нестерильном культивировании в ферментере на ферментолизатах отрубей и/или муки в кислой среде при рН ниже 6,0 происходит, как показали опыты, быстрое инфицирование дрожжами и грибами и вытеснение продуцента из процесса на 30-40% и более от общего числа клеток. В результате в получаемом продукте в сильной степени снижается содержание белка.However, during non-sterile cultivation in fermenter on bran enzymes and / or flour in an acidic medium at a pH below 6.0, as shown by experiments, rapid infection with yeast and fungi and displacement of the producer from the process by 30-40% or more of the total number of cells . As a result, the protein content is greatly reduced in the resulting product.
Одним из перспективных путей получения полноценного белкового кормового продукта является использование метанокисляющих бактерий. Метанотрофные бактерии в подходящих условиях активно перерабатывают метан природного газа, быстро размножаются и наращивают биомассу, богатую ценным белком, витаминами и иными биологически активными соединениями.One of the promising ways to obtain a complete protein feed product is the use of methane-oxidizing bacteria. Under suitable conditions, methanotrophic bacteria actively process natural gas methane, multiply rapidly and increase biomass rich in valuable protein, vitamins and other biologically active compounds.
Использование метана природного газа для получения белка одноклеточных имеет ряд преимуществ по сравнению с жидкими углеводородами и другими субстратами, а именно: большие запасы природного газа, хорошая его транспортабельность, возможность получения кормового продукта без дополнительной очистки от субстрата.The use of methane of natural gas for the production of single-cell protein has several advantages compared with liquid hydrocarbons and other substrates, namely: large reserves of natural gas, good transportability, the possibility of obtaining a feed product without further purification from the substrate.
Учитывая, что в России большие газовые запасы недр, по некоторым данным они составляют до 40% мировых, внедрение микробиологического производства белка одноклеточных на российских предприятиях сулит не только экономический эффект, но и способно обеспечить продовольственную безопасность страны.Considering that in Russia large gas reserves of the subsoil, according to some data, they make up to 40% of the world’s, the introduction of single-cell microbiological production of protein in Russian enterprises promises not only an economic effect, but also is capable of ensuring the country's food security.
Облигатные метанокисляющие бактерии, содержат фермент метанмонооксигеназу, который не является субстратспецифичным и может окислять не только метан, но и гомологи метана (например, этан, пропан и бутан), содержащиеся в природном газе.Obligate methane-oxidizing bacteria contain the enzyme methane monooxygenase, which is not a substrate-specific and can oxidize not only methane, but also homologues of methane (for example, ethane, propane and butane) contained in natural gas.
В зависимости от состава природного газа, видовых особенностей метанокисляющих бактерий и условий культивирования среди продуктов неполного окисления метана и его гомологов могут присутствовать в разных соотношениях в среде культивирования метанол, формальдегид, формиат, этанол, ацетальдегид, ацетат, пропионовый альдегид, пропионовая кислота, масляный альдегид. Данные продукты при их накоплении в среде культивирования в определенной концентрации оказывают ингибирующее воздействие на метанокисляющую культуру, на окисление метана.Depending on the composition of natural gas, the specific characteristics of methane-oxidizing bacteria and the cultivation conditions among the products of incomplete oxidation of methane and its homologues may be present in different ratios in the cultivation medium methanol, formaldehyde, formate, ethanol, acetaldehyde, acetate, propionaldehyde, propionic acid, oily aldehyde . These products in their accumulation in the culture medium at a certain concentration have an inhibiting effect on the methane-oxidizing culture, on the oxidation of methane.
Известен штамм Methylococcus capsulatus ВСБ-874 - продуцент кормовой биомассы. Штамм хранится в коллекции культур института «ВНИИГенетика» под коллекционным номером ЦМПМ В-1743 (авт. свид. СССР №770200). В качестве источника углерода и энергии штамм использует метан, как чистый, так и в составе природного газа. Недостатком данного штамма является его чувствительность к продуктам, образующимся при соокислении гомологов метана, которые неизменно, в большем или меньшем количестве, присутствуют в природном газе. Образующиеся продукты ингибируют рост продуцента.A known strain of Methylococcus capsulatus BWA-874 - producing fodder biomass. The strain is stored in the collection of cultures of the Institute "VNIIGenetika" under the collection number CMPM B-1743 (auth. Mon. USSR. No. 770200). The strain uses methane, both pure and as a component of natural gas, as a source of carbon and energy. The disadvantage of this strain is its sensitivity to products formed during the co-oxidation of methane homologs, which are invariably, in greater or lesser quantity, present in natural gas. The resulting products inhibit the growth of the producer.
Известен штамм Cupriavidus eutrophus ВКПМ В-10646 - продуцент полигидроксиалканоатов (патент RU2439143). В качестве ростового субстрата штамм использует глюкозу или фруктозу, или 3-масляную кислоту, или газовую смесь - водород, кислород и двуокись углерода.A known strain Cupriavidus eutrophus VKPM B-10646 - producing polyhydroxyalkanoates (patent RU2439143). As a growth substrate, the strain uses glucose or fructose, or 3-butyric acid, or a gas mixture — hydrogen, oxygen, and carbon dioxide.
Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату является штамм метанокисляющих бактерий Methylococcus capsulatus ГБС-15, регистрационный номер ВКПМ В-12549 во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (патент РФ 2613365).The closest in technical essence and the achieved result is the strain of methane-oxidizing bacteria Methylococcus capsulatus GBS-15, registration number VKPM B-12549 in the All-Russian Collection of Industrial Microorganisms (RF patent 2613365).
Целью изобретения является повышение производительности и высокой продуктивности при культивировании метанокисляющих бактерий в присутствии гетеротрофных бактерий в качестве ассоцианта продуцента микробной белковой массы.The aim of the invention is to increase productivity and high productivity during the cultivation of methane-oxidizing bacteria in the presence of heterotrophic bacteria as an associate producer of microbial protein mass.
Техническим результатом изобретения является выявление нового штамма, который является ассоциантом метанокисляющих бактерий и способен использовать продукты соокисления гомологов метана, присутствующие в природном газе.The technical result of the invention is the identification of a new strain that is an associant of methane-oxidizing bacteria and is able to use the products of co-oxidation of methane homologs present in natural gas.
Технический результат достигнут при использовании штамма гетеротрофных бактерий Cupriavidus gilardii GBS-15-1, депонированного во Всероссийской коллекции микроорганизмов при Институте биохимии и физиологии микроорганизмов Г.К Скрябина РАН под регистрационным номером VKM B-3265D, в качестве компонента ассоциативной культуры метанокисляющих бактерий для получения микробной белковой массы.The technical result was achieved using the Cupriavidus gilardii GBS-15-1 heterotrophic bacteria strain, deposited in the All-Russian Collection of Microorganisms at the Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms GK Scriabin RAS under the registration number VKM B-3265D, as a component of the associative culture of methane-oxidizing bacteria for the production of microbial bacteria protein mass.
Обозначение штамма, присвоенное депозитором GBS-15-1The designation of the strain assigned by the depositor GBS-15-1
Штамм Cupriavidus gilardii GBS-15-1 используется в качестве компонента ассоциативной культуры метанокисляющих бактерий для промышленного получения на основе природного газа кормовой биомассы для кормления животных, а также в качестве сырья для глубокой переработки.The Cupriavidus gilardii strain GBS-15-1 is used as a component of an associative culture of methane-oxidizing bacteria for industrial production of fodder biomass for feeding animals on the basis of natural gas, and also as a raw material for deep processing.
Заявляемый гетеротрофный штамм Cupriavidus gilardii GBS-15-1 выделен из ассоциации, включающей метанокисляющие бактерии Methylococcus capsulatus ГБС-15. Для селекции быстрорастущей смешанной культуры бактерий была использована смесь активных накопительных культур, выделенных из подземных вод ряда газо- и нефтеносных районов Российской Федерации. В результате проведенной селекции получен штамм, который при культивировании метанокисляющих бактерий в промышленных условиях на природном газе может быть использован как индивидуально, так в составе различных ассоциаций.The inventive heterotrophic strain Cupriavidus gilardii GBS-15-1 was isolated from an association comprising the methane-oxidizing bacteria Methylococcus capsulatus GBS-15. For the selection of a rapidly growing mixed culture of bacteria, a mixture of active storage cultures isolated from the groundwater of a number of gas and oil bearing regions of the Russian Federation was used. As a result of the selection, a strain was obtained which, when cultivated with methane-oxidizing bacteria under industrial conditions on natural gas, can be used both individually and as part of various associations.
При ферментации штамм растет как ассоциант основного продуцента метанокисляющих бактерий на минеральной среде и при физико-химических условиях оптимальных для продуцента потребляет продукты соокисления гомологов метана, присутствующие в природном газе, а также продукты метаболизма основного продуцента.During fermentation, the strain grows as an associant of the main producer of methane-oxidizing bacteria on the mineral medium and under physico-chemical conditions optimal for the producer consumes the products of co-oxidation of methane homologs present in natural gas, as well as metabolic products of the main producer.
Штамм не является генетически модифицированным.The strain is not genetically modified.
Вид Cupriavidus gilardii не значится в списках 1-4 групп патогенности (Приложение 1 «Классификация микроорганизмов - возбудителей инфекционных заболеваний…» к Санитарно-эпидемиологическим правилам СП 1.3.2322-08 «Безопасность работы с микроорганизмами», в ред. Дополнений и изменений N 2, утв. Постановлением Главного государственного санитарного врача РФ от 29.06.2011N 86).Cupriavidus gilardii species does not appear in the lists of 1-4 pathogenicity groups (Appendix 1 "Classification of microorganisms - infectious diseases causative agents ..." to the Sanitary and Epidemiological Rules SP 1.3.2322-08 "Safety of work with microorganisms", as amended by Additions and Changes N 2 , approved by the Resolution of the Chief State Sanitary Doctor of the Russian Federation of June 29, 2011N 86).
Штамм Cupriavidus gilardii GBS--15-1 является авирулентным, не токсигенным, не токсичным и безвредным.The strain Cupriavidus gilardii GBS - 15-1 is avirulent, non-toxigenic, non-toxic and harmless.
Полученный гетеротрофный штамм Cupriavidus gilardii GBS-15-1 характеризуется следующими признаками:The resulting heterotrophic strain Cupriavidus gilardii GBS-15-1 is characterized by the following features:
Культурально-морфологические: Грамотрицательный. На питательном агаре (рН 7,0-7,2) формирует непрозрачные округлые колонии, светло-кремовые, с ровным краем, ∅ 2-4 мм, консистенция мягкая, легко снимаются с агара. По форме клетки представляют собой палочки размером 0,3-0,5×0,9-1,2 мкм, неспорообразующие.Cultural-morphological: Gram-negative. On nutrient agar (pH 7.0-7.2) forms opaque rounded colonies, light cream, with a smooth edge, 2-4 mm, soft consistency, easily removed from the agar. The shape of the cells are sticks with a size of 0.3-0.5 × 0.9-1.2 μm, non-spore.
Физиолого-биохимические: Штамм растет в диапазоне температур 30-47°С, оптимальная температура роста 32-35°С. Границы физиологического действия рН в диапазоне 5,0-7,2. Оптимальный диапазон рН 6,8-7,0. Облигатный аэроб. Стабильно сохраняет свои характеристики при варьировании условий культивирования и сред - замена источника углерода, низкие или высокие значения активной реакции среды, повышение температуры, изменение скорости протока (0,15-0,42 ч-1). Обладает широким потенциалом. Использует в качестве источника углерода сахара, аминокислоты, органические кислоты, спирты. В качестве источника азота использует нитраты, соли аммония, аминокислоты. Специфических факторов роста не требует.Physiological and biochemical: The strain grows in the temperature range of 30-47 ° C, the optimum temperature of growth is 32-35 ° C. The boundaries of the physiological action of pH in the range of 5.0-7.2. The optimum pH range is 6.8-7.0. Obligate aerobic. Stably retains its characteristics when varying cultivation conditions and media - replacement of the carbon source, low or high values of the active reaction medium, temperature increase, change in flow rate (0.15-0.42 h -1 ). It has great potential. Uses as a carbon source sugar, amino acids, organic acids, alcohols. As a source of nitrogen uses nitrates, ammonium salts, amino acids. Specific growth factors are not required.
Среда и условия культивирования:Wednesday and cultivation conditions:
Вариант 1: Минеральная средаOption 1: Mineral environment
Состав минеральной среды (г/л): (NH4)2SO4 - 0,52; MgSO4 - 0,02; K2SO4 - 0,06; NH4H2PO4 - 1,53. Раствор микроэлементов (готовится отдельно) (г/л): ZnSO4 - 0,43; MnSO4 - 0,88; CuSO4 - 0,78; Н3ВО3 - 0,4; Na2MoO4×2H2O - 0,25; CoSO4×7H2O - 0,25; FeSO4×7H2O - 4,97. 1 мл приготовленного раствора микроэлементов добавить на 1000 мл минеральной среды.The composition of the mineral medium (g / l): (NH 4 ) 2 SO 4 - 0.52; MgSO 4 - 0.02; K 2 SO 4 - 0.06; NH 4 H 2 PO 4 - 1.53. The solution of trace elements (prepared separately) (g / l): ZnSO 4 - 0.43; MnSO 4 - 0.88; CuSO 4 - 0.78; H 3 BO 3 - 0.4; Na 2 MoO 4 × 2H 2 O — 0.25; CoSO 4 × 7H 2 O — 0.25; FeSO 4 × 7H 2 O - 4.97. Add 1 ml of the prepared trace element solution to 1000 ml of mineral medium.
Стерилизовать при температуре 121°С в течение 15 мин. рН доводят до 6.0-6,2. В качестве субстрата (источника углерода и энергии) могут быть использованы - метанол, пропанол или этанол (0,5-1,0%). Температура культивирования 32-35°С; аэробные условия.Sterilize at 121 ° C for 15 minutes. The pH is adjusted to 6.0-6.2. Methanol, propanol or ethanol (0.5-1.0%) can be used as a substrate (carbon and energy source). Cultivation temperature 32-35 ° C; aerobic conditions.
Вариант 2: Питательный бульон или питательный агар.Option 2: Nutrient broth or nutrient agar.
Питательный агар, состав (в пересчете на 1 л готовой среды): гидролизат ферментативный белковый, сухой - 10,5 г; пептон ферментативный, сухой - 10,5 г; экстракт автолизированных дрожжей осветленный - 2,0 г; натрий хлористый - 5,0 г; агар микробиологический - 12,0 г. Стерилизовать при температуре 121°С в течение 15 мин.Nutrient agar, composition (in terms of 1 l of the prepared medium): enzymatic protein hydrolyzate, dry - 10.5 g; enzymatic peptone, dry - 10.5 g; clarified autolyzed yeast extract - 2.0 g; sodium chloride - 5.0 g; Microbiological agar - 12.0 g. Sterilize at 121 ° С for 15 min.
Питательный бульон, состав (в пересчете на 1 л готовой среды): гидролизат фермативный белковый, сухой - 9,1 г; пептон ферментативный сухой - 9,9 г; экстракт автолизированных дрожжей осветленный - 4,7 г; натрия хлористый - 5,0 г; натрий углекислый - 0,3 гNutrient broth, composition (in terms of 1 l of the prepared medium): hydrolyzed fermentative proteinaceous, dry - 9.1 g; enzymatic dry peptone - 9.9 g; extract autolyzed yeast clarified - 4.7 g; sodium chloride - 5.0 g; sodium carbonate - 0.3 g
Штамм хранят на питательном агаре при температуре 4±2°С, пересевы осуществляются 1 раз в 3 месяца, возможно хранение штамма в лиофильно высушенном состоянии, а также в жидком азоте.The strain is stored on nutrient agar at a temperature of 4 ± 2 ° C, reseeding is carried out 1 time in 3 months, it is possible to store the strain in a lyophilized state, as well as in liquid nitrogen.
Для заявляемого штамма характерны:For the claimed strain characteristic:
- устойчивый продуктивный рост на средах различного состава;- sustainable productive growth in environments of different composition;
- способность длительно сохранять активность в лиофилизированном состоянии;- ability to maintain activity for a long time in a lyophilized state;
- отсутствие вирулентности, токсигенности, токсичности и безвредность.- lack of virulence, toxigenicity, toxicity and harmlessness.
Область применения штамма - производство белково-витаминных концентратов на основе метанокисляющих бактерий, растущих на природном газе.The scope of the strain is the production of protein-vitamin concentrates based on methane-oxidizing bacteria growing on natural gas.
Гетеротрофные бактерии Cupriavidus gilardii GBS-X5-X выращивают совместно с метанокисляющими бактериями Methylococcus capsulatus ГБС-15 на минеральной питательной среде с метаном природного газа, при этом метанокисляющие бактерии используют метан природного газа в качестве единственного источника углерода и энергии. Одновременно метанокисляющие бактерии осуществляют соокисление гомологов метана (С2, С3, С4) с образованием продуктов, ингибирующих рост метанотрофа. Гетеротрофные бактерии Cupriavidus gilardii GBS--15-1 используют образующиеся продукты (метанол, этанол, пропанол) в качестве источника углерода, тем самым снимая ингибирующее действие на основной продуцент. Кроме того, гетеротроф может использовать белки, аминокислоты и полисахариды, выделяющиеся в процессе лизиса основного продуцента.Heterotrophic bacteria Cupriavidus gilardii GBS-X5-X is grown together with methane-oxidizing bacteria Methylococcus capsulatus GBS-15 on a mineral nutrient medium with natural gas methane, while methane-oxidizing bacteria use natural gas methane as the sole carbon and energy source. At the same time, methane-oxidizing bacteria co-oxidize methane homologues (C 2 , C 3 , C 4 ) to form products that inhibit the growth of methanotroph. Heterotrophic bacteria Cupriavidus gilardii GBS - 15-1 use the resulting products (methanol, ethanol, propanol) as a carbon source, thereby removing the inhibitory effect on the main producer. In addition, the heterotroph can use proteins, amino acids and polysaccharides released in the process of lysis of the main producer.
Выращивание осуществляют преимущественно непрерывным способом при аэрировании среды смесью природного газа и кислородсодержащего газа, оптимальных значениях рН 5,6-5,8 и температуре 42-45°С. В среду для выращивания вводят гетеротрофные бактерии Cupriavidus gilardii GBS-15-1 в количестве 0,1-15% от общего числа клеток. Содержание метанокисляющих бактерий Methylococcus capsulatus ГБС-15 в ассоциативной культуре составляет 85-99,9% при постоянной концентрации биомассы до 32 г/л. Метанокисляющие бактерии развиваются за счет метана природного газа, а другой компонент ассоциативной культуры - за счет продуктов соокисления гомологов метана в природном газе и за счет продуктов жизнедеятельности метанотрофа.The cultivation is carried out mainly in a continuous manner by aerating the medium with a mixture of natural gas and oxygen-containing gas, the optimum pH values of 5.6-5.8 and the temperature of 42-45 ° C. Heterotrophic bacteria Cupriavidus gilardii GBS-15-1 is introduced into the growth medium in an amount of 0.1-15% of the total number of cells. The content of methane-oxidizing bacteria Methylococcus capsulatus GBS-15 in associative culture is 85-99.9% with a constant biomass concentration up to 32 g / l. Methane-oxidizing bacteria develop due to methane of natural gas, and another component of associative culture is due to the products of co-oxidation of homologues of methane in natural gas and due to the products of methanotroph activity.
Метанокисляющие бактерии и гетеротрофные бактерии, не использующие метан, предварительно полученные раздельно обычными способами, предусмотренными для выращивания засевного материала, вносят в питательную среду одновременно. При этом количество засеваемых гетеротрофов, не окисляющих метан, может варьировать в пределах 0,1-15% от общего числа клеток. В процессе совместного выращивания их содержание независимо от величины засева находится на уровне, определяемом количеством используемых продуктов, образующихся в результате соокисления газообразных гомологов метана, находящихся в природном газе, так как на минеральной среде эти продукты являются единственным доступным источником углерода для не использующего метан компонента ассоциативной культуры. В результате такой саморегуляции культур в процессе выращивания начальное соотношение клеток культур в засевном материале не имеет существенного значения, но рекомендуется вносить не окисляющих метан микроорганизмов не менее 0,1% и не более 15% от общего числа клеток. Отклонение от этих значений в ту или иную сторону может привести в первом случае к задержке развития метанокисляющих бактерий, а во втором к задержке роста гетеротрофных бактерий. В смеси с подобранными не использующими метан бактериями выход биомассы увеличивается в 3-5 раз по сравнению с чистой культурой метанокисляющих бактерий. Таким образом, добавление к метанокисляющим бактериям подобранных не использующих метан гетеротрофов, растущих за счет продуктов соокисления гомологов метана, может повысить выход биомассы на метане. Добавление не окисляющих метан гетеротрофных бактерий не влияет на качество биомассы, так как даже при введении в высокой концентрации гетеротрофов, не использующих метан, их содержание в растущей культуре ограничивается количеством доступного источника углерода, которым являются продукты соокисления гомологов метана, и обычно не превышает 1-15% от общего числа клеток.Methane-oxidizing bacteria and heterotrophic bacteria that do not use methane, previously obtained separately by the usual methods provided for growing seed material, are introduced into the nutrient medium simultaneously. Moreover, the number of seeded heterotrophs that do not oxidize methane may vary in the range of 0.1–15% of the total number of cells. In the process of co-cultivation, their content, regardless of the seeding size, is at the level determined by the number of products used, resulting from the co-oxidation of gaseous methane homologs in natural gas, since in the mineral medium these products are the only available carbon source for the non-methane associative component culture. As a result of such self-regulation of cultures in the process of growing, the initial ratio of the cells of the cultures in the seed material is not significant, but it is recommended that microorganisms not oxidizing methane be introduced at least 0.1% and no more than 15% of the total number of cells. Deviation from these values in one direction or another can lead in the first case to a delay in the development of methane-oxidizing bacteria, and in the second to a delay in the growth of heterotrophic bacteria. In a mixture with selected bacteria that do not use methane, the biomass yield increases by a factor of 3-5 compared with the pure culture of methane-oxidizing bacteria. Thus, the addition of selected heterotrophs that do not use methane to methane-oxidizing bacteria, growing due to the co-oxidation products of methane homologs, can increase the biomass yield on methane. The addition of heterotrophic bacteria not oxidizing methane does not affect the quality of the biomass, since even with the introduction of heterotrophs that do not use methane in high concentrations, their content in the growing culture is limited by the amount of available carbon source, which are the products of co-oxidation of methane homologs, and usually does not exceed 1- 15% of the total number of cells.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами.The invention is illustrated by the following examples.
Пример 1. Штамм Cupriavidus gilardii GBSA5-X (VKM-3265D) выращивают на жидкой минеральной среде, содержащей (г/л): (NH4)2SO4 - 0,52; MgSO4 - 0,02; K2SO4 - 0,06; NH4H2PO4 - 1,53.Example 1. The strain Cupriavidus gilardii GBSA5-X (VKM-3265D) is grown on a liquid mineral medium containing (g / l): (NH 4 ) 2 SO 4 - 0.52; MgSO 4 - 0.02; K 2 SO 4 - 0.06; NH 4 H 2 PO 4 - 1.53.
Среду стерилизуют при температуре 121°С в течение 15 мин.The medium is sterilized at 121 ° C for 15 minutes.
Раствор микроэлементов (готовят и стерилизуют отдельно) (г/л): ZnSO4 - 0,43; MnSO4 - 0,88; CuSO4 - 0,78; H2BO3 - 0,4; Na2MoO4×2H2O - 0,25; CoSO4×7H2O - 0,25; FeSO4×7H2O - 4,97. 1 мл приготовленного раствора микроэлементов добавляют на 1000 мл минеральной среды. рН доводят до 6.0-6,2.В качестве субстрата (источника углерода и энергии) используют метанол - 0,5%.The solution of trace elements (prepared and sterilized separately) (g / l): ZnSO 4 - 0.43; MnSO 4 - 0.88; CuSO 4 - 0.78; H 2 BO 3 - 0.4; Na 2 MoO 4 × 2H 2 O — 0.25; CoSO 4 × 7H 2 O — 0.25; FeSO 4 × 7H 2 O - 4.97. 1 ml of the prepared solution of trace elements is added to 1000 ml of mineral medium. The pH is adjusted to 6.0-6.2. Methanol is used as the substrate (carbon and energy source) - 0.5%.
Культивирование штамма проводят в периодическом режиме в колбах из термостойкого стекла, объемом 1 л при коэффициенте заполнения 0,3-0,4 в термостатируемой качалке. Культивирование проводят в течение 48 ч при 35°С и рН 6,8. По окончании культивирования концентрация сухих веществ 2-2,5 г АСВ/л. Полученную культуру используют в качестве инокулята для последующего выращивания бактерий в автоматизированном ферментационном комплексе объемом 10 л (рабочий объем 7 л) или в ферментере эжекционного типа объемом 40 л (рабочий объем 28 л).The cultivation of the strain is carried out in a periodic mode in flasks of heat-resistant glass, with a volume of 1 l with a fill factor of 0.3-0.4 in a thermostatted shaker. Cultivation is carried out for 48 hours at 35 ° C and pH 6.8. At the end of cultivation, the concentration of solids 2-2.5 g DIA / l. The resulting culture is used as an inoculum for the subsequent cultivation of bacteria in an automated fermentation complex of 10 l (working volume 7 l) or in an ejection-type fermenter of 40 l (working volume 28 l).
Пример 2.Культивирование штамма Cupriavidus gilardii GBSA5A проводят аналогично Примеру 1, но в качестве источника углерода и энергии используют этанол - 0,8%, а в качестве питательной среды бульон состава (в пересчете на 1 л готовой среды): гидролизат ферментативный белковый, сухой - 9,1 г; пептон ферментативный сухой - 9,9 г; экстракт автолизированных дрожжей осветленный - 4,7 г; натрия хлористый - 5,0 г; натрий углекислый - 0,3 г. Физико-химические условия и время культивирования те же, концентрация сухих веществ - 4 г АСВ/л.Example 2. Cultivation of the Cupriavidus gilardii GBSA5A strain is carried out similarly to Example 1, but ethanol is used as the source of carbon and energy - 0.8%, and the broth of the composition (in terms of 1 l of the prepared medium) is used as a nutrient medium: enzymatic hydrolyzate protein, dry - 9.1 g; enzymatic dry peptone - 9.9 g; extract autolyzed yeast clarified - 4.7 g; sodium chloride - 5.0 g; sodium carbonate - 0.3 g. The physicochemical conditions and cultivation time are the same, the concentration of dry substances is 4 g DIA / l.
Пример 3. Штамм Cupriavidus gilardii GBS-15-1 выращивают на питательном бульоне, в который добавляют пропанол в концентрации 0,5% об. Культивирование штамма проводят в периодическом режиме в колбах из термостойкого стекла, объемом 1 л при коэффициенте заполнения 0,3-0,4 в термостатируемой качалке. Культивирование проводят в течение 48 ч при 35°С и рН 6,8. По окончании культивирования концентрация сухих веществ 2,5-3,0 г АСВ/л. Полученную суспензию центрифугируют 7 минут при 8000g. Затем осадок ресуспендируют в небольшом количестве физиологического раствора и используют в качестве инокулята для последующего выращивания бактерий в автоматизированном ферментационном комплексе объемом 10 л (рабочий объем 7 л) или в ферментере эжекционного типа объемом 40 л (рабочий объем 28 л).Example 3. The strain Cupriavidus gilardii GBS-15-1 grown in nutrient broth, which add propanol at a concentration of 0.5% vol. The cultivation of the strain is carried out in a periodic mode in flasks of heat-resistant glass, with a volume of 1 l with a fill factor of 0.3-0.4 in a thermostatted shaker. Cultivation is carried out for 48 hours at 35 ° C and pH 6.8. At the end of cultivation, the concentration of dry substances of 2.5-3.0 g DIA / l. The resulting suspension is centrifuged for 7 minutes at 8000g. Then the precipitate is resuspended in a small amount of saline and used as an inoculum for the subsequent cultivation of bacteria in an automated fermentation complex of 10 l (working volume 7 l) or in an ejection-type fermenter of 40 l (working volume 28 l).
Пример 4. Ассоциативную культуру, состоящую из метанокисляющих бактерий Methylococcus capsulatus ГБС-15 и гетеротрофных бактерий Cupriavidus gilardii GBS-15-1 выращивают в автоматизированном ферментационном комплексе объемом 10 л (рабочий объем 7 л) на минеральной среде следующего состава (г/л):H3PO4 (80%) - 17,2; K2SO4 - 5,0; MgSO4×7H2O - 4,0; FeSO×7H2O - 0,21; CuSO4 - 0,78; MnSO4×4H2O - 0,38; ZnSO4×7H2O - 0,06; Н3ВО3 - 0,25; Na2MoO4×2H2O - 0,009; CoSO4×7H2O - 0,0095.Example 4. An associative culture consisting of methane-oxidizing bacteria Methylococcus capsulatus GBS-15 and heterotrophic bacteria Cupriavidus gilardii GBS-15-1 is grown in an automated fermentation complex of 10 l (working volume 7 l) on the mineral medium of the following composition (g / l): H 3 PO 4 (80%) - 17.2; K 2 SO 4 - 5.0; MgSO 4 × 7H 2 O — 4.0; FeSO × 7H 2 O — 0.21; CuSO 4 - 0.78; MnSO 4 × 4H 2 O — 0.38; ZnSO 4 × 7H 2 O — 0.06; H 3 BO 3 - 0,25; Na 2 MoO 4 × 2H 2 O — 0.009; CoSO 4 × 7H 2 O - 0.0095.
В качестве источника азота и титрующего агента подают аммиачную воду. Процесс ведут при температуре 40-45°С, рН 5,0-6,0 и непрерывной подаче газовой смеси, содержащей метан и кислород. При достижении концентрации биомассы 10 г АСВ/л переходят на непрерывный процесс культивирования с коэффициентом разбавления среды D=0,25 ч-1. Доминирование метанокисляющих бактерий Methylococcus capsulatus ГБС-15 составляло 90% при концентрации биомассы 15 г АСВ/л.Ammonia water is supplied as a nitrogen source and titrating agent. The process is carried out at a temperature of 40-45 ° C, pH 5.0-6.0 and continuous supply of a gas mixture containing methane and oxygen. When reaching a biomass concentration of 10 g DIA / l, they are transferred to a continuous cultivation process with a dilution factor D = 0.25 h -1 . The dominance of methane-oxidizing bacteria Methylococcus capsulatus GBS-15 was 90% at a biomass concentration of 15 g DIA / l.
Claims (1)
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2018134469A RU2687135C1 (en) | 2018-10-02 | 2018-10-02 | Strain of heterotrophic bacteria cupriavidus gilardii - associate for producing microbial protein mass |
| EA201900121A EA036192B1 (en) | 2018-10-02 | 2019-03-22 | Cupriavidus gilardii gbs-15-1 heterotrophic bacteria strain - associate for obtaining microbial protein mass |
| JP2019115161A JP6966096B2 (en) | 2018-10-02 | 2019-06-21 | Symbiotic Bacteria for Obtaining Microbial Proteins Heterotrophic Bacteria Cupriavidus guilardii GBS-15-1 Strain |
| PCT/RU2019/050161 WO2020071967A1 (en) | 2018-10-02 | 2019-10-01 | Cupriavidus gilardii strain for producing a microbial biomass |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2018134469A RU2687135C1 (en) | 2018-10-02 | 2018-10-02 | Strain of heterotrophic bacteria cupriavidus gilardii - associate for producing microbial protein mass |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2687135C1 true RU2687135C1 (en) | 2019-05-07 |
Family
ID=66430605
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2018134469A RU2687135C1 (en) | 2018-10-02 | 2018-10-02 | Strain of heterotrophic bacteria cupriavidus gilardii - associate for producing microbial protein mass |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP6966096B2 (en) |
| EA (1) | EA036192B1 (en) |
| RU (1) | RU2687135C1 (en) |
| WO (1) | WO2020071967A1 (en) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2021015648A3 (en) * | 2019-07-22 | 2021-05-14 | Общество с ограниченной ответственностью "ГИПРОБИОСИНТЕЗ" | Protein feed additive for livestock animals and fish |
| RU2781287C1 (en) * | 2021-12-30 | 2022-10-11 | Общество с ограниченной ответственностью "ГИПРОБИОСИНТЕЗ" | Method for obtaining microbial protein from microbial biomass of a producer of methane-oxidizing bacteria by an enzymatic method |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR102251757B1 (en) * | 2020-09-03 | 2021-05-13 | 주식회사 본초호미 | Method for preparing ginseng extract with enhanced ginsenoside Rg3 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3930947A (en) * | 1973-12-26 | 1976-01-06 | Ajinomoto Co., Inc. | Method of producing microbial cells from methane |
| SU770200A1 (en) * | 1979-05-15 | 1987-03-07 | Всесоюзный научно-исследовательский институт биосинтеза белковых веществ | Methylococcus capsulatus vsb-874 strain - producer of biomass |
| CN104774792B (en) * | 2015-04-13 | 2017-12-19 | 中国科学院天津工业生物技术研究所 | The Methyldmonas of one plant of enduring high-concentration methanol and its application |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SU908085A1 (en) * | 1979-12-24 | 1983-08-07 | Всесоюзный научно-исследовательский институт биосинтеза белковых веществ | Method for preparing biomass |
| GB0209007D0 (en) * | 2002-04-19 | 2002-05-29 | Norferm Da | Product |
| US20150017694A1 (en) * | 2008-11-06 | 2015-01-15 | Kiverdi, Inc. | Engineered CO2-Fixing Chemotrophic Microorganisms Producing Carbon-Based Products and Methods of Using the Same |
| BR112012006801A2 (en) * | 2009-09-27 | 2018-04-10 | Opx Biotechnologies Inc | method for production of 3-hydroxypropionic acid and other products |
| CZ2012571A3 (en) * | 2012-08-27 | 2013-12-11 | Vysoké ucení technické v Brne | Process for preparing polyhydroxyalkanoates (PHA) on oil substrate |
| CN104099274B (en) * | 2014-07-15 | 2016-12-07 | 大连理工大学 | The greedy copper bacterium of one strain aerobic degradation indole and application thereof |
| AU2017236795A1 (en) * | 2016-03-19 | 2018-09-27 | Kiverdi, Inc. | Microorganisms and artificial ecosystems for the production of protein, food, and useful co-products from C1 substrates |
| EA201891926A1 (en) * | 2017-02-03 | 2019-04-30 | Киверди, Инк. | MICROORGANISMS AND ARTIFICIAL ECOSYSTEMS FOR THE PRODUCTION OF PROTEINS, FOOD PRODUCTS AND USEFUL BY-PRODUCTS FROM SUBSTRATES C1 |
-
2018
- 2018-10-02 RU RU2018134469A patent/RU2687135C1/en active IP Right Revival
-
2019
- 2019-03-22 EA EA201900121A patent/EA036192B1/en active IP Right Revival
- 2019-06-21 JP JP2019115161A patent/JP6966096B2/en active Active
- 2019-10-01 WO PCT/RU2019/050161 patent/WO2020071967A1/en active Application Filing
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3930947A (en) * | 1973-12-26 | 1976-01-06 | Ajinomoto Co., Inc. | Method of producing microbial cells from methane |
| SU770200A1 (en) * | 1979-05-15 | 1987-03-07 | Всесоюзный научно-исследовательский институт биосинтеза белковых веществ | Methylococcus capsulatus vsb-874 strain - producer of biomass |
| CN104774792B (en) * | 2015-04-13 | 2017-12-19 | 中国科学院天津工业生物技术研究所 | The Methyldmonas of one plant of enduring high-concentration methanol and its application |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| ВИНАРОВ А.Ю. "Биореакторное оформление процесса ферментации при получении кормового белка из природного газа".//Современные тенденции развития науки и технологий. Мат-лы ХХIII международной научно-практической конференции, г.Белгород, 28.02.2017. * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2021015648A3 (en) * | 2019-07-22 | 2021-05-14 | Общество с ограниченной ответственностью "ГИПРОБИОСИНТЕЗ" | Protein feed additive for livestock animals and fish |
| RU2781287C1 (en) * | 2021-12-30 | 2022-10-11 | Общество с ограниченной ответственностью "ГИПРОБИОСИНТЕЗ" | Method for obtaining microbial protein from microbial biomass of a producer of methane-oxidizing bacteria by an enzymatic method |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EA201900121A1 (en) | 2020-04-30 |
| JP6966096B2 (en) | 2021-11-10 |
| JP2020054334A (en) | 2020-04-09 |
| WO2020071967A1 (en) | 2020-04-09 |
| EA036192B1 (en) | 2020-10-13 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2613365C1 (en) | Strain of methane-oxidizing bacteria methylococcus capsulatus gbs-15 for obtaining of microbial protein mass | |
| CN112226373B (en) | Strain for producing protein and application thereof | |
| US8592198B2 (en) | Method for culturing microorganisms on a growth substrate comprising biomass obtained from methanotrophic bacteria | |
| RU2687136C1 (en) | Heterotrophic bacteria strain stenotrophomonas acidaminiphila gbs-15-2 as associate for producing microbial protein mass | |
| RU2687135C1 (en) | Strain of heterotrophic bacteria cupriavidus gilardii - associate for producing microbial protein mass | |
| US3930947A (en) | Method of producing microbial cells from methane | |
| RU2706074C1 (en) | Methylococcus capsulatus concept-8 bacteria strain - producer of protein biomass | |
| RU2687137C1 (en) | Strain of heterotrophic bacteria klebsiella pneumonia is an associate for producing a microbial protein mass | |
| US3996105A (en) | Mixed methane-utilizing cultures for production of micro-organisms | |
| RU2745093C1 (en) | Methylococcus capsulatus bf 19-07 methane-oxidizing bacteria strain - producer for obtaining microbial protein mass | |
| RU2720121C1 (en) | Method of producing microbial protein based on hydrocarbon material | |
| SU974817A1 (en) | Method of producing l-treonin | |
| RU2773502C1 (en) | Strain of methanol-oxidizing bacteria acidomonas methanolica bf 21-05m is a producer for obtaining microbial protein mass | |
| SU908092A1 (en) | Method of obtaining riboflavin | |
| US4707449A (en) | Pichia pastoris yeast strains of enhanced tryptophan content | |
| US4048013A (en) | Process for producing single-cell protein from methanol using methylomonas sp. DSM 580 | |
| RU2793472C1 (en) | Association of bacterial strains to obtain microbial protein biomass (options) | |
| CN114672437B (en) | Bacillus subtilis G-1 for producing organic acid and application thereof | |
| US20060270004A1 (en) | Fermentation processes with low concentrations of carbon-and nitrogen-containing nutrients | |
| RU2796376C1 (en) | Methylobacterium extorquens strain вкпм в-14231 as producer of microbial protein mass | |
| USRE30965E (en) | Fermentation of oxygenated hydrocarbon compounds with thermophilic microorganisms and microorganisms therefor | |
| Tsymbal et al. | Study of the scaling possibility of the process of obtaining feed protein from natural gas | |
| SU659609A1 (en) | Method of obtaining citric acid | |
| Rafique et al. | Optimization of fermentation parameters for enhanced aphe production from streptomyces griseocarneus through submerged fermentation | |
| SU1068479A1 (en) | Strain bacillus subtilis 81-og production neutral protease |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20201003 |
|
| NF4A | Reinstatement of patent |
Effective date: 20211006 |