RU2687061C2 - Способ выявления у микроорганизмов протективного действия на молекулу гемоглобина - Google Patents
Способ выявления у микроорганизмов протективного действия на молекулу гемоглобина Download PDFInfo
- Publication number
- RU2687061C2 RU2687061C2 RU2017124308A RU2017124308A RU2687061C2 RU 2687061 C2 RU2687061 C2 RU 2687061C2 RU 2017124308 A RU2017124308 A RU 2017124308A RU 2017124308 A RU2017124308 A RU 2017124308A RU 2687061 C2 RU2687061 C2 RU 2687061C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- methemoglobin
- microorganisms
- control
- test
- hemoglobin molecule
- Prior art date
Links
- 244000005700 microbiome Species 0.000 title claims abstract description 59
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 title claims abstract description 57
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 title claims abstract description 57
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 title claims abstract description 39
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 16
- 108010061951 Methemoglobin Proteins 0.000 claims abstract description 52
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 31
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 claims abstract description 27
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims abstract description 21
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims abstract description 20
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims abstract description 20
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims abstract description 20
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims abstract description 19
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 15
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 claims abstract description 10
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims abstract description 9
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims abstract description 8
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 7
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 6
- 239000006166 lysate Substances 0.000 claims abstract description 6
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 claims abstract description 6
- 239000013068 control sample Substances 0.000 claims abstract description 4
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 claims description 7
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 claims description 2
- 244000000010 microbial pathogen Species 0.000 abstract description 11
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 7
- 239000006041 probiotic Substances 0.000 abstract description 5
- 230000000529 probiotic effect Effects 0.000 abstract description 5
- 235000018291 probiotics Nutrition 0.000 abstract description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- DHGBAFGZLVRESL-UHFFFAOYSA-N 14-methylpentadecyl 16-methylheptadecanoate Chemical compound CC(C)CCCCCCCCCCCCCCC(=O)OCCCCCCCCCCCCCC(C)C DHGBAFGZLVRESL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 101000588145 Homo sapiens Microtubule-associated tumor suppressor 1 Proteins 0.000 description 15
- 101000588157 Homo sapiens Microtubule-associated tumor suppressor candidate 2 Proteins 0.000 description 15
- 102100031549 Microtubule-associated tumor suppressor candidate 2 Human genes 0.000 description 15
- 241000158508 Corynebacterium amycolatum Species 0.000 description 11
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 8
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 8
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 7
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 7
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 7
- 241000186245 Corynebacterium xerosis Species 0.000 description 6
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 6
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 6
- 238000011160 research Methods 0.000 description 6
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 6
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 240000001046 Lactobacillus acidophilus Species 0.000 description 4
- 241000191963 Staphylococcus epidermidis Species 0.000 description 4
- 230000000721 bacterilogical effect Effects 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 238000009631 Broth culture Methods 0.000 description 3
- 108010003320 Carboxyhemoglobin Proteins 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- 241000186660 Lactobacillus Species 0.000 description 3
- 230000009471 action Effects 0.000 description 3
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 150000003278 haem Chemical class 0.000 description 3
- 229940039696 lactobacillus Drugs 0.000 description 3
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 238000010183 spectrum analysis Methods 0.000 description 3
- 210000001215 vagina Anatomy 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 2
- 241000222122 Candida albicans Species 0.000 description 2
- 102000016899 Cytochrome-B(5) Reductase Human genes 0.000 description 2
- 108010028689 Cytochrome-B(5) Reductase Proteins 0.000 description 2
- 108010064719 Oxyhemoglobins Proteins 0.000 description 2
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 2
- 241001147691 Staphylococcus saprophyticus Species 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 2
- 208000005135 methemoglobinemia Diseases 0.000 description 2
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 2
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 2
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 1
- 235000013956 Lactobacillus acidophilus Nutrition 0.000 description 1
- WSMYVTOQOOLQHP-UHFFFAOYSA-N Malondialdehyde Chemical compound O=CCC=O WSMYVTOQOOLQHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MWUXSHHQAYIFBG-UHFFFAOYSA-N Nitric oxide Chemical class O=[N] MWUXSHHQAYIFBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000270295 Serpentes Species 0.000 description 1
- 206010048222 Xerosis Diseases 0.000 description 1
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 229940095731 candida albicans Drugs 0.000 description 1
- 210000000748 cardiovascular system Anatomy 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003617 erythrocyte membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 1
- 102000018146 globin Human genes 0.000 description 1
- 108060003196 globin Proteins 0.000 description 1
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 1
- 108010036302 hemoglobin AS Proteins 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 229940039695 lactobacillus acidophilus Drugs 0.000 description 1
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 1
- 244000005706 microflora Species 0.000 description 1
- 150000002823 nitrates Chemical class 0.000 description 1
- 150000002826 nitrites Chemical class 0.000 description 1
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 1
- 230000036542 oxidative stress Effects 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000029058 respiratory gaseous exchange Effects 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 230000031068 symbiosis, encompassing mutualism through parasitism Effects 0.000 description 1
- 239000012085 test solution Substances 0.000 description 1
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/483—Physical analysis of biological material
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/72—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood pigments, e.g. haemoglobin, bilirubin or other porphyrins; involving occult blood
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано при выявлении протективного действия микроорганизмов на молекулу гемоглобина. Для этого исследуемую культуру микроорганизмов выращивают в жидкой питательной среде, отделяют супернатант от микробных клеток центрифугированием, параллельно с опытной пробой готовят контрольную пробу из жидкой питательной среды. Далее опытную и контрольную пробы пропускают через бактериальные фильтры и в каждую из проб добавляют эритроцитарную взвесь, затем инкубируют, центрифугируют и во все пробы добавляют супернатант условно-патогенного микроорганизма, способного к образованию метгемоглобина. Смеси инкубируют, лизируют эритроцитарную взвесь и измеряют оптическую плотность лизата при длине волны 630 нм и рассчитывают уровень образования метгемоглобина в опытной и контрольной пробах. О протективном действии исследуемого микроорганизма на молекулу гемоглобина судят по степени образования метгемоглобина в опыте по сравнению с контролем. Изобретение обеспечивает способ выявления протективного действия микроорганизмов на молекулу гемоглобина и может быть критерием отбора биотехнологически перспективных микроорганизмов для создания лекарственных и пробиотических препаратов. 2 табл., 3 пр.
Description
Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано в исследовательской работе НИИ и практической работе бактериологических лабораторий клинических учреждений, исследующих свойства микроорганизмов, взаимодействующих с эритроцитами и гемоглобином, а также как критерий отбора биотехнологически перспективных микроорганизмов, для создания лекарственных и пробиотических препаратов.
Гемоглобин эритроцитов представляет собой сложную молекулу, состоящую из небелковой части - гема, и белковой части - глобина. Основная функция гемоглобина - транспорт кислорода [Зинчук В.В. Коррекция кисло-родтранспортной функции крови при патологии сердечно-сосудистой системы / В.В. Зинчук, С.В. Гацура, К.В. Глуткина, Гродно, ГрГМУ - 2016. - 312 с.]. В процессе присоединения и отдачи кислорода железо в молекуле гемоглобина свою валентность не меняет, т.е. при присоединении кислорода или его отдаче железо не окисляется и не восстанавливается [Васильева Е.М. Биохимические особенности эритроцита. Влияние патологии // Биомедицинская химия, 2005, Т. 51, вып. 2, с. 118-126.].
При воздействии ряда факторов гемоглобин может окисляться до метгемоглобина, который не способен присоединять кислород и поэтому не может обеспечить дыхание тканей. Образование метгемоглобина происходит постоянно, ежедневно около 0,5% всего гемоглобина превращается в метгемоглобин. Метгемоглобин снова восстанавливается в гемоглобин специальным ферментом, использующим НАДН - метгемоглобинредуктазой (НАДН-цитохром Р-редуктаза). Поэтому концентрация метгемоглобина в крови в норме - меньше 2% [Фаткуллин К.В., Гильманов А.Ж., Костюков Д.В. Клиническое значении и современные методологические аспекты определения уровня карбокси- и метгемоглобина в крови // Практическая медицина, 2014, Т. 79, №3, С. 17-21.].
Однако концентрация метгемоглобина может значительно повышаться при воздействии на организм ряда факторов. Факторы, способствующие образованию метгемоглобина:
1. физические - влияние различного рода излучения [Gisele Capanema de Oliveira et al. The effect of γ-radiation on the hemoglobin of stored red blood cells: the involvement of oxidative stress in hemoglobin conformation // Ann Hematol (2013) 92:899-906];
2. химические - действие металлов переменной валентности и их оксидов [А.Н. Осипов, Г.Г. Борисенко, Ю.А. Владимиров. Биологическая роль нитрозильных комплексов гемопротеинов // Успехи биологической химии, т. 47, 2007, с. 259-292];
3. биологические - в результате нарушения ферментативной активности эритроцита и метаболизма бактерий [Глебов А.Н., Шульга Е.В., Зинчук В.В. Роль кислородсвязывающих свойств крови в развитии окислительного стресса, индуцированного липополисахаридом - Гродно, 2011, 216 с.].
Известен механизм образования метгемоглобина при взаимодействии микроорганизмов с клетками крови, на примере микроорганизмов кишечника [Трухина М. Нитраты, нитриты и пути снижения их содержания в овощах // Химия, 2001, №31, С. 35-37.].
В результате воздействия различных факторов на организм человека содержание метгемоглобина в крови может повышаться до 40% от всего гемоглобина [Фаткуллин К.В., Гильманов А.Ж., Костюков Д.В. Клиническое значении и современные методологические аспекты определения уровня карбокси- и метгемоглобина в крови // Практическая медицина, 2014, Т. 79, №3, С. 17-21.], что способствует резкому нарушению снабжения тканей кислородом и может привести к летальному исходу.
Известны способы восстановления метгемоглобина в гемоглобин в результате воздействия метгемоглобинредуктазы мембраны эритроцита, глута-тиона [Фаткуллин К.В., Гильманов А.Ж., Костюков Д.В. Клиническое значении и современные методологические аспекты определения уровня карбокси-и метгемоглобина в крови / Практическая медицина, 2014, Т. 79, №3, С. 17-21.], аскорбиновой кислоты [Казанец Е.Г. Метгемоглобинемии // Детская больница, 2009, №1, С. 38-42.], малонового альдегида [Герман С.В. Метгемоглобинемии: особенности патогенеза и клиники // Клиническая медицина, 1999, Т. 77, №4, С. 9-12.].
Задачей заявляемого технического решения является создание способа выявления у микроорганизмов протективного действия на молекулу гемоглобина.
Для решения указанной технической задачи в заявляемом способе выявления у микроорганизмов протективного действия на молекулу гемоглобина исследуемую культуру микроорганизмов выращивают в жидкой питательной среде, отделяют супернатант от микробных клеток центрифугированием, параллельно с опытной пробой готовят контрольную пробу из жидкой питательной среды, опытную и контрольную пробы пропускают через бактериальные фильтры, в каждую из проб добавляют эритроцитарную взвесь, инкубируют, центрифугируют, затем во все пробы добавляют супернатант условно-патогенного микроорганизма, способного к образованию метгемоглобина, инкубируют, лизируют эритроцитарную взвесь в опытной и контрольной пробах, замеряют оптическую плотность лизата при длине волны 630 нм, характерной для максимального пика поглощения метгемоглобина, затем рассчитывают уровень образования метгемоглобина в опытной и контрольной пробах по формуле:
Ра=[(ОДк-ОДоп)/ОДк]×100%,
где Ра - уровень протективной активности исследуемого микроорганизма (%);
ОДоп, (отн.е.) - оптическая плотность метгемоглобина в опыте,
ОДк (отн.е.) - оптическая плотность метгемоглобина в контроле.
О наличии или отсутствии протективного действия исследуемого микроорганизма на молекулу гемоглобина судят по степени образования метгемоглобина в опыте по сравнению с контролем.
Достигаемый технический результат при осуществлении изобретения состоит в создании способа выявления у микроорганизмов протективного действия на молекулу гемоглобина, который позволяет выявить новое свойство микроорганизмов - способность предотвращать образование метгемоглобина из гемоглобина, которое может быть использовано в исследовательской работе НИИ и практической работе бактериологических лабораторий клинических учреждений, исследующих свойства микроорганизмов, взаимодействующих с эритроцитами и гемоглобином, а также как критерий отбора биотехнологически перспективных микроорганизмов для создания лекарственных и пробиотических препаратов.
Аналогов изобретения в патентной и научно-технической литературе не обнаружено.
Авторами экспериментально установлено новое свойство микроорганизмов - способность предотвращать образование метгемоглобина из гемо-глобина.
Ранее был определен уровень образования метгемоглобина при воздействии условно-патогенных микроорганизмов на эритроциты [Щуплова Е.А., Фадеев С.Б. Спектральный анализ гемоглобина под действием микроорганизмов с разным уровнем антигемоглобиновой активности // Современные проблемы науки и образования. 2013. №2; URL: www.science-education.ru/108-8791]. В результате работы было обнаружено, что исследуемые условно-патогенные микроорганизмы (Staphylococcus epidermidis, Escherichia coli, S. saprophyticus и другие) способны окислять молекулу гемоглобина до метгемоглобина с разным уровнем его образования.
Для выявления протективного действия микроорганизмов на молекулу гемоглобина были проведены следующие исследования.
Культуры Corynebacterium amycolatum ICIS 53, Corynebacterium xerosis ICIS 99, Lactobacillus spp., S.aureus из коллекции Института клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН выращивали в жидкой питательной среде (для каждого вида микроорганизма использовали соответствующий тип питательной среды) в течение 24 ч при 37°C. Бульонные культуры микроорганизмов центрифугировали при 9000 g в течение 15 мин, супернатанты отделяли от микробных клеток.
Параллельно готовили контрольные пробы - жидкие питательные среды (для каждой пробы соответствующий тип питательной среды). Опытные и контрольные пробы пропускали через бактериальные фильтры (0,22 μм, Millipore). В опытные пробирки вносили 2 мл приготовленных стерильных супернатантов исследуемых микроорганизмов, в контрольные - 2 мл стерильной жидкой питательной среды и добавляли по 0,5 мл эритроцитарной взвеси в концентрации 106 эр/мл (способ приготовления взвеси: 2 мл эритроцитарной взвеси трехкратно отмывали в стерильном фосфатно-солевом буфере (ФСБ) (рН=7,4) центрифугированием в течение 5 минут при 1000 g. Далее эритроцитарную взвесь фильтровали через крупнопористые фильтры для грубых крупнодисперсных осадков и добавляли к осадку 18 мл ФСБ для получения 5% эритроцитарной взвеси (или 106 эр/мл)).
Полученные образцы инкубировали в течение 24 часов при 37°C. Далее образцы осаждали центрифугированием при 1000 g в течение 5 мин. Осадок в контрольных и опытных пробах дважды отмывали стерильным фосфатно-солевым буфером (рН=7,4) и добавляли по 2 мл супернатанта условно-патогенных микроорганизмов (S. epidermidis, Е. coli, S.saprophyticus и Candida albicans), способных к образованию метгемоглобина, предварительно пропущенных через бактериальные фильтры (0,22 μм, Millipore), инкубировали в течение 24 часов при 37°C.
Затем в опытные и контрольные образцы добавляли по 2,5 мл стерильной дистиллированной воды для получения лизата и замеряли оптическую плотность исследуемых растворов с помощью сканирующего спектрофотометра «Genesys 6» (США) в диапазоне 450-700 нм, характерного для гемовой части гемоглобина.
Для спектрального анализа молекулы гемоглобина рассчитывали показатели оптической плотности, которые строили относительно модельного спектра, содержащего оксигемоглобин. Для нивелирования разницы, обусловленной разной концентрацией гемоглобина в исследуемых пробах, спектры строили по нормированным данным, относительно поглощения оптической плотности при длине волны 576 нм [Михайлюк И.К., Разживин А.П. Метод разложения спектров на полосы по исходному спектру и набору его производных // Биофизика, - 2003 - Т. 48, вып. 3, с. 405-410.].
Учитывали значения оптической плотности молекулы гемоглобина в опытных и контрольных пробах при длине волны 630 нм, характерной для максимального пика поглощения метгемоглобина.
Результаты исследований приведены в таблице 1.
Как видно из таблицы 1, значения оптической плотности гемоглобина под действием условно-патогенных микроорганизмов (контроль) при длине волны 630 нм варьировали от 0,129 до 0,368 отн.е.
В опыте наблюдали существенное снижение значений оптической плотности молекулы гемоглобина после предварительной обработки эритроцитов супернатантами исследуемых микроорганизмов: С. amycolatum ICIS 53, С. xerosis ICIS 99 и Lactobacillus spp., S. aureus.
Показатели оптической плотности молекулы гемоглобина в опыте по сравнению с контролем снизились в 1,1-4,2 раза, что соответствует значениям оптической плотности в диапазоне от 0,088 до 0,323 отн.е. Необходимо отметить, что у S.aureus наблюдали повышение значений оптической плотности до 0,419 отн.е.
Далее рассчитывали уровень протективной активности (Ра) исследуемых микроорганизмов на молекулу гемоглобина по формуле:
Ра=[(ОДк-ОДоп)/ОДк]×100%,
где Ра - уровень протективной активности исследуемого микроорганизма (%);
ОДоп (отн.е.) - оптическая плотность метгемоглобина в опыте;
ОДк (отн.е.) - оптическая плотность метгемоглобина в контроле.
О наличии или отсутствии протективного действия исследуемого микроорганизма на молекулу гемоглобина судят по степени образования метгемоглобина в опыте по сравнению с контролем.
Полученные результаты представлены в таблице 2.
Как видно из таблицы 2, уровень протективной активности на молекулу гемоглобина у исследуемых микроорганизмов варьировал от -13,9 до 72,8%.
На основании полученных результатов, авторами был сделан вывод о наличии протективного действии на молекулу гемоглобина исследуемых культур микороорганизмов С. amycolatum ICIS 53, С. xerosis ICIS 99 и Lactobacillus spp. и отсутствии его у S. aureus.
С практической точки зрения, наблюдение эффекта снижения образования метгемоглобина под воздействием супернатантов условно-патогенных микроорганизмов после предварительной обработки эритроцитов суперна-тантами исследуемых микроорганизмов может быть использовано в исследовательской работе НИИ и практической работе бактериологических лабораторий клинических учреждений, исследующих свойства микроорганизмов, взаимодействующих с эритроцитами и гемоглобином, а также как критерий отбора биотехнологически перспективных микроорганизмов для создания лекарственных и пробиотических препаратов.
Способ осуществляется следующим образом:
1. Исследуемую культуру микроорганизма выращивают в 3 мл жидкой питательной среды (для каждого вида микроорганизма используется соответствующий тип питательной среды) в течение 24 часов при 37°C.
2. Бульонную культуру центрифугируют (9000 g в течение 15 минут), супернатант отделяют от микробных клеток.
3. Параллельно готовят контрольную пробу - жидкую питательную среду (для каждого вида микроорганизма соответствующий тип питательной среды).
4. Опытную и контрольную пробы пропускают через бактериальные фильтры (0,22 им, Millipore).
5. В опытную пробирку вносят 2 мл приготовленного стерильного супернатанта исследуемого микроорганизма, в контрольную - 2 мл стерильной жидкой питательной среды.
6. В опытную и контрольную пробы добавляют по 0,5 мл 5% эритроцитарной взвеси (способ приготовления взвеси: 2 мл эритроцитарной взвеси трехкратно отмывают стерильным фосфатно-солевым буфером (ФСБ) (рН=7,4) центрифугированием в течение 5 минут при 1000 g, далее эритроцитарную взвесь фильтруют через крупнопористые фильтры для грубых крупнодисперсных осадков и добавляют к осадку 18 мл ФСБ для получения 5% эритроцитарной взвеси (или 106 эр/мл)).
7. Опытную и контрольную пробы инкубируют в течение 24 ч при 37°C.
8. После инкубации опытную и контрольную пробы центрифугируют (1000g в течение 5 минут), затем осадок дважды отмывают стерильным фосфатно-солевым буфером (рН=7,4) центрифугированием (1000g в течение 5 минут).
9. В каждую из проб объемом 0,5 мл добавляют по 2 мл супернатанта условно-патогенного микроорганизма, способного образовывать метгемоглобин, предварительно пропущенного через бактериальный фильтр (0,22 μм, Millipore) и инкубируют в течение 24 ч при 37°C.
10. После инкубации в опытную и контрольную пробы добавляют по 2,5 мл стерильной дистиллированной воды для получения лизата.
11. Измеряют оптическую плотность исследуемых растворов с помощью сканирующего спектрофотометра «Genesys 6» (США) в диапазоне 450-700 нм, характерного для гемовой части гемоглобина, затем рассчитывают нормированные спектры оптической плотности молекулы гемоглобина.
12. Учитывают значения оптической плотности молекулы гемоглобина в опытной и контрольной пробах при длине волны 630 нм, характерной для максимального пика поглощения метгемоглобина.
13. Рассчитывают уровень образования метгемоглобина в опытной и контрольной пробах по формуле:
Ра=[(ОДк-ОДоп)/ОДк]×100%,
где Ра - уровень протективной активности исследуемого микроорганизма (%);
ОДоп (отн.е.) - оптическая плотность метгемоглобина в опыте;
ОДк (отн.е.) - оптическая плотность метгемоглобина в контроле.
О наличии или отсутствии протективного действия исследуемого микроорганизма на молекулу гемоглобина судят по степени образования метгемоглобина в опыте по сравнению с контролем.
Примеры конкретного выполнения способа:
Пример 1.
Из влагалища здоровой женщины выделен представитель нормофлоры Corynebacterium amycolatum ICIS 53. Для выявления у выделенной культуры микроорганизма протективного действия на молекулу гемоглобина ее выращивали в жидкой питательной среде (мясо-пептонном бульоне, Hi Media) в течение 24 часов при 37°C. Бульонную культуру С. amycolatum ICIS 53 центрифугировали при 9000 g в течение 15 мин, супернатант отделяли от микробных клеток. Параллельно готовили контроль - жидкую питательную среду (мясо-пептонный бульон, Hi Media). Опытную и контрольную пробы пропускали через бактериальные фильтры (0,22 дм, Millipore). В опытную пробирку вносили 2 мл приготовленного стерильного супернатанта С. amycolatum ICIS 53, в контрольную - 2 мл стерильной жидкой питательной среды. В опытную и контрольную пробы добавляли по 0,5 мл 5% взвеси эритроцитов (способ приготовления взвеси: 2 мл эритроцитарной взвеси трехкратно отмывали в стерильном фосфатно-солевом буфере (ФСБ) (рН=7,4) центрифугированием в течение 5 минут при 1000 g. Далее эритроцитарную взвесь фильтровали через крупнопористые фильтры для грубых крупнодисперсных осадков и добавляли к осадку 18 мл ФСБ для получения 5% взвеси эритроцитов (или 106 эр/мл)).
Опытную и контрольную пробы инкубировали в течение 24 часов при 37°C. Инкубированные смеси центрифугировали (1000 g в течение 5 минут), затем осадок дважды отмывали стерильным фосфатно-солевым буфером (рН=7,4).
К эритроцитарной взвеси добавляли по 2 мл супернатанта условно-патогенного микроорганизма - S. epidermidis, способного к образованию метгемоглобина, предварительно пропущенного через бактериальный фильтр (0,22 μм, Millipore).
Инкубировали в течение 24 часов при 37°C, периодически перемешивая. Затем в опытную и контрольную пробы добавляли по 2,5 мл стерильной дистиллированной воды для получения лизата и измеряли оптическую плотность исследуемых растворов с помощью сканирующего спектрофотометра «Genesys 6» (США) в диапазоне 450-700 нм, характерного для гемовой части гемоглобина. Для спектрального анализа молекулы гемоглобина рассчитывали показатели оптической плотности, которые строили относительно модельного спектра, содержащего оксигемоглобин. Для нивелирования разницы, обусловленной разной концентрацией гемоглобина в исследуемых пробах, спектры строили по нормированным, относительно поглощения оптической плотности при длине волны 576 нм. В опытной и контрольной пробах учитывали значения оптической плотности молекулы гемоглобина при длине волны 630 нм, характерной для максимального пика поглощения метгемоглобина. Рассчитывали уровень образования метгемоглобина в опытной и контрольной пробах по формуле:
Ра=[(ОДк-ОДоп)/ОДк]×100%,
где Ра - уровень протективной активности исследуемого микроорганизма (%);
ОДоп (отн.е.) - оптическая плотность метгемоглобина в опыте;
ОДк (отн.е.) - оптическая плотность метгемоглобина в контроле.
ОДоп=0,088
ОДк=0,323
Ра=[(0,323-0,088)/0,323]×100%=72,8%
Уровень протективной активности С. amycolatum ICIS 53 составил 72,8%. На основании полученных данных сделан вывод о наличии у исследуемой культуры С. amycolatum ICIS 53 протективного действия на молекулу гемоглобина.
Пример 2.
Со слизистой верхних дыхательных путей здорового мужчины выделен представитель нормофлоры С xerosis ICIS 99. Для выявления у выделенной культуры микроорганизма протективного действия на молекулу гемоглобина были проведены исследования согласно заявляемому способу, аналогично примеру 1.
Использовали супернатант условно-патогенного микроорганизма - Е. coli.
Результаты расчетов уровня протективной активности (Ра) исследуемого микроорганизма С. xerosis ICIS 99 следующие:
ОДоп=0,117
ОДк=0,236
Ра=[(0,236-0,117)/0,236]×100%=50,4%
Уровень протективной активности С. xerosis ICIS 99 составил 50,4%.
На основании полученных данных сделан вывод о наличии у исследуемой культуры С. xerosis ICIS 99 протективного действия на молекулу гемоглобина.
Пример 3.
Из влагалища здоровой женщины выделен представитель нормофлоры - Lactobacillus acidophilus. Для выявления у выделенной культуры микроорганизма протективного действия на молекулу гемоглобина были проведены исследования согласно заявляемому способу, аналогично примеру 1.
Использовали супернатант условно-патогенного микроорганизма - С. albicans.
Результаты расчетов уровня протективной активности (Ра) исследуемого микроорганизма L. acidophilus следующие:
ОДоп=0,117
ОДк=0,129
Ра=[(0,129-0,117)/0,129]×100%=9,3%
Уровень протективной активности L. acidophilus составил 9,3%.
На основании полученных данных сделан вывод о наличии у исследуемой культуры L. acidophilus протективного действия на молекулу гемоглобина.
Пример 4.
Из влагалища здоровой женщины выделен представитель нормофлоры - С. amycolatum. Для выявления у выделенной культуры микроорганизма протективного действия на молекулу гемоглобина были проведены исследования согласно заявляемому способу, аналогично примеру 1.
Использовали супернатант условно-патогенного микроорганизма - S. saprophytics.
Результаты расчетов уровня протективной активности (Ра) исследуемого микроорганизма С. amycolatum следующие:
ОДоп=0,102
ОДк=0,323
Ра=[(0,323-0,102)/0,323]×100%=68,4%
Уровень протективной активности С. amycolatum составил 68,4%.
На основании полученных данных сделан вывод о наличии у исследуемой культуры С. amycolatum протективного действия на молекулу гемоглобина.
Пример 5.
Со слизистой верхних дыхательных путей здорового мужчины выделен представитель микрофлоры S. aureus. Для выявления у выделенной культуры микроорганизма протективного действия на молекулу гемоглобина были проведены исследования согласно заявляемому способу, аналогично примеру 1.
Использовали супернатант условно-патогенного микроорганизма - S. epidermidis.
Результаты расчетов уровня протективной активности (Ра) исследуемого микроорганизма S. aureus следующие:
ОДоп=0,419
ОДк=0,368
Ра=[(0,368-0,419)/0,368]×100%=-13,9%
Уровень протективной активности S. aureus составил -13,9%.
На основании полученных данных сделан вывод об отсутствии у исследуемой культуры S. aureus протективного действия на молекулу гемоглобина.
Таким образом, использование предлагаемого способа позволяет выявить новое свойство микроорганизмов - способность предотвращать образование метгемоглобина из гемоглобина, которое может быть использовано в исследовательской работе НИИ и практической работе бактериологических лабораторий клинических учреждений, исследующих свойства микроорганизмов, взаимодействующих с эритроцитами и гемоглобином, а также как критерий отбора биотехнологически перспективных микроорганизмов для создания лекарственных и пробиотических препаратов.
Claims (1)
- Способ выявления у микроорганизмов протективного действия на молекулу гемоглобина, заключающийся в том, что исследуемую культуру микроорганизмов выращивают в жидкой питательной среде, отделяют супернатант от микробных клеток центрифугированием, параллельно с опытной пробой готовят контрольную пробу из жидкой питательной среды, опытную и контрольную пробы пропускают через бактериальные фильтры, в каждую из проб добавляют эритроцитарную взвесь, инкубируют, центрифугируют, затем во все пробы добавляют супернатант условно-патогенного микроорганизма, способного к образованию метгемоглобина, инкубируют, лизируют эритроцитарную взвесь в опытной и контрольной пробах, замеряют оптическую плотность лизата при длине волны 630 нм, характерной для максимального пика поглощения метгемоглобина, затем рассчитывают уровень образования метгемоглобина в опытной и контрольной пробах; о наличии или отсутствии протективного действия исследуемого микроорганизма на молекулу гемоглобина судят по степени образования метгемоглобина в опыте по сравнению с контролем.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017124308A RU2687061C2 (ru) | 2017-07-07 | 2017-07-07 | Способ выявления у микроорганизмов протективного действия на молекулу гемоглобина |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017124308A RU2687061C2 (ru) | 2017-07-07 | 2017-07-07 | Способ выявления у микроорганизмов протективного действия на молекулу гемоглобина |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2017124308A3 RU2017124308A3 (ru) | 2019-01-09 |
| RU2017124308A RU2017124308A (ru) | 2019-01-09 |
| RU2687061C2 true RU2687061C2 (ru) | 2019-05-07 |
Family
ID=64977415
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2017124308A RU2687061C2 (ru) | 2017-07-07 | 2017-07-07 | Способ выявления у микроорганизмов протективного действия на молекулу гемоглобина |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2687061C2 (ru) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2262705C2 (ru) * | 2004-05-27 | 2005-10-20 | Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН | Способ определения антигемоглобиновой активности микроорганизмов |
| RU2279079C2 (ru) * | 2004-08-09 | 2006-06-27 | Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН | Способ выявления у микроорганизмов протективного действия в эффекте фентона |
| RU2517155C1 (ru) * | 2013-03-15 | 2014-05-27 | Белорусский Государственный Университет (Бгу) | Способ определения концентраций производных гемоглобина в биологических тканях |
-
2017
- 2017-07-07 RU RU2017124308A patent/RU2687061C2/ru not_active IP Right Cessation
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2262705C2 (ru) * | 2004-05-27 | 2005-10-20 | Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН | Способ определения антигемоглобиновой активности микроорганизмов |
| RU2279079C2 (ru) * | 2004-08-09 | 2006-06-27 | Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН | Способ выявления у микроорганизмов протективного действия в эффекте фентона |
| RU2517155C1 (ru) * | 2013-03-15 | 2014-05-27 | Белорусский Государственный Университет (Бгу) | Способ определения концентраций производных гемоглобина в биологических тканях |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| ФАДЕЕВ С.Б. и др. Образование метгемоглобина при эритроцитарно-бактериальных взаимодействиях, Вестник ОГУ, 2014, 13, 174, стр. 128-133, найдено 21.05.2018 в Интернете [on-line] на сайте https://cyberleninka.ru/article/v/obrazovanie-metgemoglobina-pri-eritrotsitarno-bakterialnyh-vzaimodeystviyah-eksperimentalnoe-issledovanie. * |
| ФАДЕЕВ С.Б. и др. Образование метгемоглобина при эритроцитарно-бактериальных взаимодействиях, Вестник ОГУ, 2014, 13, 174, стр. 128-133, найдено 21.05.2018 в Интернете [on-line] на сайте https://cyberleninka.ru/article/v/obrazovanie-metgemoglobina-pri-eritrotsitarno-bakterialnyh-vzaimodeystviyah-eksperimentalnoe-issledovanie. ЩУПЛОВА Е.А. и др. Спектральный анализ гемоглобина под действием микроорганизмов с разным уровнем антигемоглобиновой активности, Современные проблемы науки и образования, 2013, 2., стр. 1-9, найдено 21.05.2018 в Интернете [on-line] https://science-education.ru/ru/article/view?id=8791. * |
| ЩУПЛОВА Е.А. и др. Спектральный анализ гемоглобина под действием микроорганизмов с разным уровнем антигемоглобиновой активности, Современные проблемы науки и образования, 2013, 2., стр. 1-9, найдено 21.05.2018 в Интернете [on-line] https://science-education.ru/ru/article/view?id=8791. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2017124308A3 (ru) | 2019-01-09 |
| RU2017124308A (ru) | 2019-01-09 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Lunec et al. | c-erbB-2 amplification and identical p53 mutations in concomitant transitional carcinomas of renal pelvis and urinary bladder | |
| CN109054824A (zh) | 特异性识别Cr6+和维生素C的荧光碳点的制备方法及其应用 | |
| CN110241071A (zh) | 一种人正常肾小管原代细胞及其体外分离培养和应用 | |
| Sun et al. | Antimicrobial activity and mechanism of PDC213, an endogenous peptide from human milk | |
| CN110003888B (zh) | 一种荧光纳米探针及其制备方法 | |
| RU2040932C1 (ru) | Препарат, влияющий на тканевой обмен и применение штамма гриба fusarium sambucinum fuckel var ossicolum (berk.et curf) bilai для его получения | |
| RU2687061C2 (ru) | Способ выявления у микроорганизмов протективного действия на молекулу гемоглобина | |
| JP2023552837A (ja) | 皮膚分類のためのマーカーの組み合わせおよびその使用 | |
| CN110305193B (zh) | 一种抗牙龈卟啉单胞菌多肽及应用 | |
| Affronti et al. | Serodiagnostic test for tuberculosis | |
| Liu et al. | Multi-modal multi-spectral intravital macroscopic imaging of signaling dynamics in real time during tumor–immune interactions | |
| O'Hagan | Boophilus microplus: digestion of hemoglobins by the engorged female tick | |
| RU2738671C1 (ru) | Способ получения и очистки биологически активного вещества, продуцируемого бифидобактериями | |
| Eley et al. | Growth of Aeromonas spp. at 4 C and related toxin production | |
| RU2766346C1 (ru) | Способ определения противомикробной активности пептидов | |
| CN110305194B (zh) | 一种抗菌多肽及应用 | |
| Eyre | Asylum dysentery in relation to B. dysenteriae | |
| Baldock et al. | Further studies on respiratory rates of freshwater amoebae (Rhizopoda, Gymnamoebia) | |
| Stern et al. | Response of Campylobacter jejuni to combinations of ferrous sulphate and cadmium chloride | |
| CN110272472B (zh) | 一种抗牙龈卟啉单胞菌及具核酸杆菌多肽及应用 | |
| Alexander et al. | Mechanism of emergence of resistance to streptomycin of H. pertussis and H. parapertussis during treatment with this antibiotic | |
| CN110317247B (zh) | 一种抗口腔致病菌多肽及应用 | |
| CN116590192B (zh) | 一种幽门螺杆菌固体分离培养基及其制备方法和应用 | |
| Leonov et al. | Iron-dependent synthesis of hemolysins by Staphylococcus aureus | |
| Cardimino et al. | A Simplified Fluid Dynamics Model of Ultrafiltration: PO0305 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20200708 |