RU2738671C1 - Способ получения и очистки биологически активного вещества, продуцируемого бифидобактериями - Google Patents

Способ получения и очистки биологически активного вещества, продуцируемого бифидобактериями Download PDF

Info

Publication number
RU2738671C1
RU2738671C1 RU2020108321A RU2020108321A RU2738671C1 RU 2738671 C1 RU2738671 C1 RU 2738671C1 RU 2020108321 A RU2020108321 A RU 2020108321A RU 2020108321 A RU2020108321 A RU 2020108321A RU 2738671 C1 RU2738671 C1 RU 2738671C1
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
bifidobacteria
biologically active
active substance
producing
separation
Prior art date
Application number
RU2020108321A
Other languages
English (en)
Inventor
Андрей Сергеевич Сухих
Юлия Викторовна Захарова
Татьяна Вячеславовна Котова
Екатерина Юрьевна Плотникова
Григорий Валерьевич Вавин
Original Assignee
Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Кемеровский медицинский университет" (ФГБОУ ВО КемГМУ)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Кемеровский медицинский университет" (ФГБОУ ВО КемГМУ) filed Critical Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Кемеровский медицинский университет" (ФГБОУ ВО КемГМУ)
Priority to RU2020108321A priority Critical patent/RU2738671C1/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2738671C1 publication Critical patent/RU2738671C1/ru

Links

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20Bacteria; Culture media therefor
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205Bacterial isolates
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12RINDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales

Abstract

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ получения и очистки биологически активного вещества, продуцируемого бифидобактериями. Способ включает культивирование определенного вида бифидобактерий, отделение микробной массы с последующей обработкой супернатанта на холоду диметилкетоном, отделением осадка, его растворением в буферном растворе и хроматографией на сефадексе Sephadex LH-20 с рехроматографией на аффинном сорбенте. Способ обеспечивает эффективность разделения, селективность очистки биологически активных веществ, продуцируемых бифидобактериями. 1 пр.

Description

Изобретение относится к медицине, а именно к микробиологии и биотехнологии.
Известно, что качественные и количественные изменения микрофлоры сопутствуют многим патологическим состояниям [1]. Фундаментальные и трансляционные исследования за последние два десятилетия совершили революцию в понимании роли микрофлоры кишечника в здоровье человека. Стало очевидным, что микробы-резиденты биополостей человека включаются в патофизиологию широкого диапазона заболеваний и состояний. Из этого, естественно, следует, что терапевтическая модификация микробиоты кишечника может обеспечить изменение развития и течения многих хронических заболеваний (сахарный диабет, ожирение, атеросклероз сосудов) и предупредить развитие некоторых форм рака. От состояния микробиоты зависит продолжительность жизни, репродуктивная функция человека, особенности протекания нейрофизиологических процессов, что, в конечном итоге, определяет поведение и успешность.
Известно, что онтогенез микрофлоры заканчивается формированием относительно стабильного микробиоценоза. Однако, изменение состояния окружающей среды, культуры питания, темпа жизни, появление новых технологий в пищевой промышленности, бесконтрольный прием антибиотиков – все это изменяет нашу микрофлору, что влечет за собой снижение иммунологической реактивности макроорганизма и увеличение заболеваемости населения в целом. Так же, изменение микробиоценозов является пусковым фактором старения. Существует два принципиальных подхода для сохранения эубиоза микрофлоры – это введение пробиотиков и трансплантация фекальной микробиоты – донорских или аутоштаммов.
Предлагаемый подход в свете персонализованной медицины становится актуальным и востребованным. Возможно, человечество научится лечить еще немало заболеваний посредством управления микробиотой.
В заявляемом способе рассматривается выделение, накопление и селективная очистка веществ, продуцируемых представителями рода Bifidobacterium.
В качестве источника получения бифидобактерий, могут быть использованы штаммы, выделенные от конкретного пациента и обладающие определенными биологическими свойствами и характеристиками.
Известен способ получения плазмидной ДНК микроорганизмов А.С. SU 1124033 [2]. Способ включает в себя лизис бактериальных клеток с использованием щелочного раствора додецилсульфата натрия. Использование щелочного раствора может негативно сказываться на нативных свойствах целевого компонента, а применение додецилсульфата натрия в некоторых случаях может потребовать дополнительной стадии очистки.
В качестве прототипа принят способ получения продуктов метаболизма бифидобактерий для лечения комбинированного радиационно-термического поражения организма и способ лечения комбинированного радиационно-термического поражения организма RU 2 627 669. Для получения продуктов метаболизма по данному способу бифидобактерии выращивают во флаконах емкостью 400-500 см3 со средой Блаурокка в течение 3-4 суток. Определяют концентрацию микробов со стандартизацией их количества до 1×108 КОЕ/см3. Смесь бифидобактерий с продуктами их метаболизма в культуральной жидкости тщательно взбалтывают, переливают в центрифужные пробирки емкостью 50-100 см3, центрифугируют при 5000 об/мин в течение 30 мин. Полученный супернатант декантируют, определяют содержание сухого вещества и доводят его физиологическим раствором до концентрации 10-15 мг/см3, стерилизуют фильтрацией, разливают во флаконы и хранят в холодильнике при температуре 4-6°С.
Однако данный способ предполагает использовать суммарный супернатант, содержащий компоненты питательной среды, и метаболиты, относящиеся к различным классам соединений. Это делает затруднительным использование веществ с разной биологической активностью, содержащихся в супернатантах бифидобактерий, а также возможность стандартизации как готового продукта, так и продукта в процессе хранения.
Техническим результатом заявляемого способа является повышение эффективности разделения, селективной очистки, выделения и накопления биологически активных веществ, продуцируемых представителями рода Bifidobacterium.
Предлагаемый способ получения и очистки биологически активного вещества, продуцируемого бифидобактериями, может быть использован в фармакологических, бактериологических и биохимических исследованиях и заключается в следующем:
Вначале проводят накопление чистой культуры бифидобактерий с последующим разделением культуральной среды и бактериальной массы. Для этого выращивают культуру определенного вида бифидобактерий на жидкой Бифидум-среде (г. Оболенск). Культивирование проводят при 37 °C в течение 48 часов, что позволяет получить биомассу с содержанием бифидобактерий около 108 КОЕ/см3. Затем биомассу переносят в стерильные центрифужные пробирки и осуществляют центрифугирование при 3 000-4 000 об/мин с последующим отделением бактериальной массы.
Трехкратную обработку супернатанта проводят при пониженных температурах (+4°С) избытком диметилкетона (ацетона х.ч.). Осадок отделяют, далее растворяют в буферном растворе и хроматографируют на сефадексе (Sephadex) LH-20. Выделенная фракция олигомеров подвергается рехроматографии на аффинном сорбенте промышленного производства, например, Affi-Gel Protein A (Bio-Rad) или иные аффинные сорбенты с иммобилизоваными лектинами или гликопротеинами.
Пример 1. Выделен и идентифицирован по генетическим, морфологическим, тинкториальным, культуральным и биохимическим свойствам микроорганизм Bifidobacterium spp. штамм 74. Для накопления и выделения ДНК предварительно готовили жидкую Бифидум-среду (г. Оболенск), в которую затем помещали 1 колонию Bifidobacterium spp. Культивирование проводили при 37°C в течение 48 часов. Для определения количественного содержания бактерий в 1 см3 среды проводили титрование в стерильном физиологическом растворе от 10-1 до 10-9 КОЕ/см3 с последующим высевом по 0,1 см3 на плотную Бифидум-среду (г. Оболенск) и культивированием в анаэробных условиях. Количественные посевы показали, что содержание бифидобактерий в среде накопления составило около 108 КОЕ/ см3. Затем биомассу переносили в стерильные центрифужные пробирки и центрифугировали при 3 000-4 000 об/мин, отделяя клеточную массу. Супернатант фильтровали через мембранный фильтр. Далее к охлажденному до +4°С супернатанту, добавляли трехкратный объем диметилкетона (ацетона х.ч.) и оставляли на 24 часа в темном месте при +4°С. После чего проводили трехкратно отделение осадка с последующим растворением и переосаждением из диметилкетона. Осадок растворяли в фосфатном буферном растворе с рН = 7,2. В режиме колоночной хроматографии на хроматографе низкого давления BioLogic (BioRad) осуществляли эксклюзионную хроматографию на сефадексе (Sephadex) LH-20. Выделенную фракцию олигомеров обрабатывали аффинным сорбентом Affi-Gel Protein A в режиме бэтч-метода. Супернатанты подвергали лиофилизации.
Фармакологическое исследование проводили на 100 аутбредных крысах-самках массой 250-300 г. Все манипуляции осуществлялись в соответствии с Правилами Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иных научных целей. Животных содержали в стандартных климатических условиях на стандартном рационе питания. Острый формалиновый отек вызывали субплантарным введением экзометаболитов (под подошвенный апоневроз) в заднюю правую лапу мыши 0,2 см3 2% водного раствора формалина.
Все исследуемые образцы вводили принудительно через зонд в желудок. Предварительно дозу вещества разводили в 2-х см3 воды очищенной. Интактному контролю животных и контролю с моделью острого иммобилизованного стресса вводили по 2 см3 воды очищенной.
Оценка влияния исследуемого образца на развитие острого воспаления показала выраженное уменьшение флогогенного действия формалина на животных основной группы под влиянием экзометаболита штамма № 74 Bifidobacterium spp. по сравнению с контрольной группой животных, получавших диклофенак натрия. Это говорит о высокой противовоспалительной активности данного штамма (U = 2,7; p = 0,001).
Заявленный технический результат характеризуется повышением эффективности разделения, селективной очистки, выделения и накопления веществ, продуцируемых представителями рода Bifidobacterium, который достигается за счет обработки супернатанта диметилкетоном, с последующей жидкостной хроматографией и применения сефадекса LH-20 и аффинного сорбента.
Источники информации
1. Шендеров, Б. А. Медицинская микробная экология и функциональное питание. Т. 3. Пробиотики и функциональное питание / Б. А. Шендеров. – М.: Грантъ, 2001. – 288 с.
2. Пат. А.С. SU 1124033 СССР, (51) МПК. Способ получения плазмидной ДНК / Зилбере А. М., Шафранский А. Б., Хартмане Я. Я., Ансберга С. Э., Муйжниекс И. О., Камрадзе А. А.; Латвийский государственный университет им. П. Стучки. – заявка № 3555304; заявл. 16.02.1983; опубл. 15.11.1984. ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий. – [Электронный ресурс]. Режим доступа: https://www.fips.ru/registers-doc-view/fips_servlet?DB=RUPAT&rn=283&DocNumber=1124033&TypeFile=pdf.
3. Пат. RU 2 627 669 (51) МПК А61К Способ получения продуктов метаболизма бифидобактерий для лечения комбинированного радиационно-термического поражения организма и способ лечения комбинированного радиационно-термического поражения организма / Никитин А.И. (RU), Низамов Р.Н. (RU), Конюхов Г.В. (RU), Василевский Н. М. (RU), Тухфатуллов М. З. (RU), Шарифуллина Д.Т. (RU), Юнусов И.Р. (RU), Гайнутдинов Т.Р. Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности» (ФГБНУ «ФЦТРБ-ВНИВИ») Заявка: 2016129773, 20.07.2016 Опубл.: 09.08.2017 Бюл. №22 Режим доступа: https://www.fips.ru/registers-doc-view/fips_servlet.

Claims (1)

  1. Способ получения и очистки биологически активного вещества, продуцируемого бифидобактериями, включающий культивирование определенного вида бифидобактерий, отделение микробной массы с последующей обработкой супернатанта на холоду диметилкетоном, отделением осадка, его растворением в буферном растворе и хроматографией на сефадексе Sephadex LH-20 с рехроматографией на аффинном сорбенте.
RU2020108321A 2020-02-26 2020-02-26 Способ получения и очистки биологически активного вещества, продуцируемого бифидобактериями RU2738671C1 (ru)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2020108321A RU2738671C1 (ru) 2020-02-26 2020-02-26 Способ получения и очистки биологически активного вещества, продуцируемого бифидобактериями

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2020108321A RU2738671C1 (ru) 2020-02-26 2020-02-26 Способ получения и очистки биологически активного вещества, продуцируемого бифидобактериями

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RU2738671C1 true RU2738671C1 (ru) 2020-12-15

Family

ID=73834923

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2020108321A RU2738671C1 (ru) 2020-02-26 2020-02-26 Способ получения и очистки биологически активного вещества, продуцируемого бифидобактериями

Country Status (1)

Country Link
RU (1) RU2738671C1 (ru)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2553513C2 (ru) * 2013-05-20 2015-06-20 Андрей Сергеевич Сухих Способ получения бифидогенного фактора
RU2627669C1 (ru) * 2016-07-20 2017-08-09 федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности" (ФГБНУ "ФЦТРБ-ВНИВИ") Способ получения продуктов метаболизма бифидобактерий для лечения комбинированного радиационно-термического поражения организма и способ лечения комбинированного радиационно-термического поражения организма

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2553513C2 (ru) * 2013-05-20 2015-06-20 Андрей Сергеевич Сухих Способ получения бифидогенного фактора
RU2627669C1 (ru) * 2016-07-20 2017-08-09 федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности" (ФГБНУ "ФЦТРБ-ВНИВИ") Способ получения продуктов метаболизма бифидобактерий для лечения комбинированного радиационно-термического поражения организма и способ лечения комбинированного радиационно-термического поражения организма

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ПЕТРОВ Д.Г. и др. "Методы выделения и очистки ДНК из лизатов клеток. Обзор".//Научное приборостроение, 2019, том 29, N 4, с.28-50. СОММА З.М. "Анализ образцов пищевых продуктов на присутствие генетически модифицированных организмов. Сессия 4. Выделение и очистка ДНК".//Методические рекомендации, ВОЗ, 2010, с. 1-20. HIROMATSU Y. et al., "Bifidobacterium components have immunomodulatory characteristics dependent on the method of preparation".//Cytotechnology, 2007, N 55.79-87. *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
d'Herelle et al. The bacteriophage, its role in immunity
Avery et al. Studies on the chemical nature of the substance inducing transformation of pneumococcal types. Inductions of transformation by a desoxyribonucleic acid fraction isolated from pneumococcus type III.
Collart et al. Significance of spiral organisms found, after treatment, in late human and experimental syphilis
Hockett et al. Bacteraemia in asymptomatic human subjects
Ikari et al. Interaction in the germfree mouse intestine of colicinogenic and colicin-sensitive microorganisms
Fairbrother et al. A Text-book of Bacteriology
McLaughlin et al. Studies in marine biology. II. In vitro culture of zooxanthellae.
RU2738671C1 (ru) Способ получения и очистки биологически активного вещества, продуцируемого бифидобактериями
Ravi et al. Isolation and biomedical screening of the tissue extracts of two marine gastropods Hemifusus pugilinus (Born, 1778) and Natica didyma (Roding, 1798)
Mellon A STUDY OF THE DIPHTHEROID GROUP OF ORGANISMS WITH SPECIAL REFERENCE TO THEIR RELATION TO THE STREPTOCOCCI PART I. CHARACTERISTICS OF A PECULIAR PLEOMORPHIC DIPHTHEROID
CN109182164B (zh) 一株罗伊氏乳杆菌及其在蜜蜂养殖过程中的应用
CN109055268B (zh) 一种复合微生态制剂及其在蜜蜂养殖过程中的应用
CN107927441B (zh) 一种适用于冷水鱼虹鳟类的微生态制剂
Choyce et al. A System of Surgery
Rogers et al. The recognition of material present in horse muscle affecting the formation of α-toxin by a strain of Clostridium welchii
Tedeschi et al. Cocci and diphtheroids in blood cultures from patients in various pathological situations
Eyre Asylum dysentery in relation to B. dysenteriae
Jansson et al. Search for mycoplasma in rheumatoid arthritis.
RU2605543C1 (ru) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СПОРОВОЙ КУЛЬТУРЫ НА ОСНОВЕ БАКТЕРИАЛЬНОГО ШТАММА Bacillus sp. 1839
Blenk et al. Activity of erythromycin against chlamydiae in vitro and in vivo, and its use in genital Chlamydia infections
Keeney et al. Rapid chemical changes in reconstituted dry milk
Raju et al. Isolation, Characterization and Sequencing of Lactobacillus from the Oral and Fecal Samples of Healthy Dogs
Ishola et al. Evaluation of Acha (Digitaria exilis) Grain Fermented with Lactobacillus Species as a Probiotic Food
JP2819041B2 (ja) アマチャ由来抗変異原性作用剤
Shulga et al. Pathogenic properties of enterobacteria isolated from calves in the Far Eastern Federal District