RU2663909C1 - Method for serological diagnosis of viral diseases of salmonids by enzyme immunoassay and diagnostic set for implementing method - Google Patents
Method for serological diagnosis of viral diseases of salmonids by enzyme immunoassay and diagnostic set for implementing method Download PDFInfo
- Publication number
- RU2663909C1 RU2663909C1 RU2017108607A RU2017108607A RU2663909C1 RU 2663909 C1 RU2663909 C1 RU 2663909C1 RU 2017108607 A RU2017108607 A RU 2017108607A RU 2017108607 A RU2017108607 A RU 2017108607A RU 2663909 C1 RU2663909 C1 RU 2663909C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- ihn
- ipn
- vhs
- salmonids
- viral diseases
- Prior art date
Links
- 201000010099 disease Diseases 0.000 title claims abstract description 19
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 title claims abstract description 19
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 14
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 title claims abstract description 14
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 title claims abstract description 11
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 title claims abstract description 7
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 title claims abstract description 7
- 241000277331 Salmonidae Species 0.000 title claims abstract description 7
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 title claims abstract description 7
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 title description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 16
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 14
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 14
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 14
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims abstract description 14
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 claims abstract description 13
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims abstract description 11
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 claims abstract description 10
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 claims abstract description 8
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 claims abstract description 8
- 244000052769 pathogen Species 0.000 claims abstract description 8
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 claims abstract description 7
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims abstract description 7
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims abstract description 7
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 claims abstract description 6
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 claims abstract description 6
- 208000009663 Acute Necrotizing Pancreatitis Diseases 0.000 claims abstract description 5
- 206010058096 Pancreatic necrosis Diseases 0.000 claims abstract description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 5
- 230000003993 interaction Effects 0.000 claims abstract description 4
- 229940043517 specific immunoglobulins Drugs 0.000 claims abstract description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 20
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 9
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 claims description 8
- 239000013641 positive control Substances 0.000 claims description 7
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 claims description 6
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 6
- 239000013642 negative control Substances 0.000 claims description 5
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 4
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 claims description 3
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 claims description 3
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 claims description 3
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 claims description 3
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 2
- 239000013068 control sample Substances 0.000 claims description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 2
- 208000032969 Hemorrhagic Septicemia Diseases 0.000 claims 1
- 208000014645 Pasteurella hemorrhagic septicemia Diseases 0.000 claims 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 claims 1
- 208000001449 Viral Hemorrhagic Septicemia Diseases 0.000 abstract description 21
- 239000012620 biological material Substances 0.000 abstract description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 235000019688 fish Nutrition 0.000 description 13
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 12
- 238000011160 research Methods 0.000 description 8
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 7
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 7
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 5
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 4
- 208000010824 fish disease Diseases 0.000 description 4
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 238000009360 aquaculture Methods 0.000 description 3
- 244000144974 aquaculture Species 0.000 description 3
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 3
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 3
- 238000010079 rubber tapping Methods 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 241001125075 Acipenser baerii Species 0.000 description 2
- 241000881711 Acipenser sturio Species 0.000 description 2
- 206010017964 Gastrointestinal infection Diseases 0.000 description 2
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 2
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 2
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 2
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 2
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 2
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 2
- 238000004370 retrospective diagnosis Methods 0.000 description 2
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 2
- YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 4-[4-(dimethylamino)phenyl]-n,n-dimethylaniline Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1C1=CC=C(N(C)C)C=C1 YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000711573 Coronaviridae Species 0.000 description 1
- 208000004232 Enteritis Diseases 0.000 description 1
- 208000029433 Herpesviridae infectious disease Diseases 0.000 description 1
- XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N IDUR Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(I)=C1 XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 241001269113 Siberian sturgeon herpesvirus Species 0.000 description 1
- 206010051511 Viral diarrhoea Diseases 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 230000003602 anti-herpes Effects 0.000 description 1
- 230000002146 bilateral effect Effects 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000003653 coastal water Substances 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 210000000416 exudates and transudate Anatomy 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000000452 restraining effect Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 230000001235 sensitizing effect Effects 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 244000052613 viral pathogen Species 0.000 description 1
- 210000001835 viscera Anatomy 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56983—Viruses
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Virology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Description
Предлагаемое изобретение относится к области ветеринарной биотехнологии, вирусологии и может быть использовано для выявления антигенов возбудителей вирусных болезней рыб в биологическом материале, как для диагностики, так и для научных исследований методом иммуноферментного анализа.The present invention relates to the field of veterinary biotechnology, virology and can be used to detect antigens of viral pathogens of fish in biological material, both for diagnosis and for scientific research by enzyme immunoassay.
Аквакультура в России носит комплексный многоотраслевой характер, за счет использования крупнейшего в мире фонда внутренних водоемов и прибрежных акваторий морей. При этом одна из существенных проблем, сдерживающих развитие отечественной акваиндустрии - вирусные болезни выращиваемых гидробионтов, такие как: инфекционный некроз поджелудочной железы лососевых {Infectious pancreatic necrosis, IPN), инфекционный некроз гемопоэтической ткани лососевых {Infectious hematopoietic necrosis, IHN), вирусная геморрагическая септицемия {Viral haemorrhagic septicaemia, VHS).Aquaculture in Russia is complex and diversified, through the use of the world's largest fund of inland waters and coastal waters of the seas. At the same time, one of the significant problems restraining the development of the domestic aqua industry is viral diseases of cultivated aquatic organisms, such as: salmon infectious pancreatic necrosis (Infectious pancreatic necrosis, IPN), salmon hematopoietic necrosis necrosis {Infectious hematopoietic necrosis, IHN septic hematosis Viral haemorrhagic septicaemia, VHS).
Сейчас диагностика вирусных болезней рыб в лаборатории требует культивирования вируса на клетках рыб, что занимает достаточно длительное время и выполняется только в крупных научно-исследовательских институтах, имеющих профильные лаборатории. [Инструкция о мероприятиях по профилактике и ликвидации инфекционного некроза поджелудочной железы лососевых рыб; Инструкция о мероприятиях по профилактике и борьбе с инфекционным некрозом гемопоэтической ткани лососевых рыб; Инструкция о мероприятиях по борьбе с вирусной геморрагической септицемией рыб // Сборник инструкций по борьбе с болезнями рыб (часть 1), Москва, отдел маркетинга АМБ-агро, 1998, с. 87-113]. Эти методы долгие, а результат анализа напрямую зависит от таких факторов, как опыт и компетенция специалиста, проводящего работу, физиологического состояния и биологических особенностей используемой линии клеток, поэтому, применение современных методов будет, несомненно, востребовано при диагностике.Now the diagnosis of viral diseases of fish in the laboratory requires the cultivation of the virus on fish cells, which takes quite a long time and is performed only in large research institutes with specialized laboratories. [Instruction on measures for the prevention and elimination of infectious necrosis of the pancreas of salmon fish; Instruction on measures for the prevention and control of infectious necrosis of hematopoietic tissue of salmon fish; Instructions on measures to combat viral hemorrhagic septicemia of fish // Collection of instructions for combating fish diseases (part 1), Moscow, marketing department AMB-agro, 1998, p. 87-113]. These methods are long, and the result of the analysis directly depends on such factors as the experience and competence of the specialist conducting the work, the physiological state and biological characteristics of the cell line used, therefore, the use of modern methods will undoubtedly be in demand in the diagnosis.
Известен способ серологической диагностики вирусных желудочно-кишечных инфекций крупного рогатого скота методом иммуноферментного анализа, преимущественно рота-, коронавирусного энтеритов, вирусной диареи крупного рогатого скота, включающий взаимодействие антигенов с антителами, с антивидовыми антителами, меченными пероксидазой хрена, добавление субстратной смеси и учет результатов по интенсивности окраски образовавшегося комплекса, характеризующийся тем, что в реакции используют планшеты с предварительно сорбированными на них антигенами. [Патент №2472162]A known method for serological diagnosis of viral gastrointestinal infections of cattle by enzyme-linked immunosorbent assay, mainly rota-, coronavirus enteritis, viral diarrhea of cattle, including the interaction of antigens with antibodies, with antiviral antibodies labeled with horseradish peroxidase, adding a substrate mixture and recording the results of the intensity of the color of the formed complex, characterized in that the reaction uses tablets with pre-sorbed on them ntigenami. [Patent No. 2472162]
Единственным известным набором для проведения серологической диагностики вирусных болезней рыб является ТФ ИФА, который содержит специфический герпесвирусный антиген для сенсибилизации планшет, специфическую герпесвирусную и нормальную сыворотки в качестве положительного и отрицательного контроля, антивидовой пероксидазный конъюгат к иммуноглобулину сибирского осетра для выявления комплекса антиген-антитело, используемые для выявления противогерпетических антител в сыворотке осетровых рыб, разработанный во ВНИИВВиМ в 2012 году, который предлагается использовать в научно-исследовательских и ветеринарных лабораториях для ретроспективной диагностики герпесвирусной болезни сибирского осетра (SbSHV). Однако, поиск антител - это ретроспективная диагностика, которая актуальна только при подозрении на герпесвирусную инфекцию осетровых рыб в межэпизоотический период, и непригодна для выявления антигенов возбудителей за счет длительного времени образования антител в живом организме. [Shchelkunov I. et. al. 2012]The only known kit for conducting serological diagnostics of fish viral diseases is TF ELISA, which contains a specific herpes virus antigen for sensitizing a tablet, a specific herpes virus and normal serum as a positive and negative control, an anti-species peroxidase conjugate to Siberian sturgeon immunoglobulin to detect the antigen-antibody complex used for the detection of antiherpetic antibodies in the serum of sturgeon fish, developed in VNIIVViM in 2012, Otori proposed for use in research and veterinary laboratories of the Siberian sturgeon (SbSHV) for the retrospective diagnosis of herpes disease. However, the search for antibodies is a retrospective diagnosis, which is relevant only when a sturgeon infection is suspected of having a herpes virus infection in the interepizootic period, and is unsuitable for identifying pathogen antigens due to the long formation of antibodies in a living organism. [Shchelkunov I. et. al. 2012]
При диагностике вирусных инфекций лососевых рыб важна оперативная информация, на ранних этапах развития заболевания и для быстрого подтверждения диагноза во время эпизоотии, поэтому необходимо анализировать наличие в организме рыб антигена возбудителя для своевременного принятия карантинных мер и профилактических мероприятий. Сведения по использованию комбинированного иммуноферментного анализа и существованию диагностических наборов для выявления вирусных болезней рыб в аналогичном формате в современной литературе отсутствуют.When diagnosing viral infections of salmonids, operational information is important, in the early stages of the development of the disease and for quick confirmation of the diagnosis during epizootics, therefore, it is necessary to analyze the presence of the pathogen antigen in the body of fish for timely quarantine measures and preventive measures. Information on the use of combined enzyme-linked immunosorbent assay and the existence of diagnostic kits for detecting viral diseases of fish in a similar format are not available in modern literature.
В задачу исследований входило - разработать чувствительный и эффективный способ серодиагностики наиболее распространенных вирусных болезней лососевых рыб: инфекционного некроза поджелудочной железы (IPN), инфекционного некроза гемопоэтической ткани (IHN), вирусной геморрагической септицемии (VHS) и сократить время на постановку диагноза за счет одновременного исследования образцов биоматериала на три заболевания.The research objective was to develop a sensitive and effective method for serodiagnosis of the most common viral diseases of salmonids: infectious pancreatic necrosis (IPN), hematopoietic tissue infectious necrosis (IHN), viral hemorrhagic septicemia (VHS) and reduce the time for diagnosis due to simultaneous research samples of biomaterial for three diseases.
Сущность предполагаемого изобретения состоит в использовании диагностического набора, включающего все необходимые компоненты для проведения иммуноферментного анализа, позволяющего выявлять антигены IPN, IHN и VHS одновременно в образцах биологического материала от рыб на ранней стадии развития болезни с высокой специфичностью и чувствительностью. Принцип способа заключается в следующем: специфические иммуноглобулины к вирусам-возбудителям IPN, IHN и VHS, иммобилизованные на поверхности лунок одного полистиролового микропланшета, связываются с гомологичными антигенами, если они присутствуют в исследуемом материале, образуя комплекс антиген-антитело. Полученный иммунный комплекс выявляется путем взаимодействия с иммуноферментным конъюгатом, фермент которого, после добавления субстрата, вызывает разложение субстрат-индикаторного раствора и образование окрашенного продукта. Интенсивность окраски в лунке микропланшета пропорциональна содержанию специфического антигена в испытуемом образце, результаты учитывают по общепринятой формуле.The essence of the alleged invention consists in the use of a diagnostic kit that includes all the necessary components for enzyme-linked immunosorbent assay, which allows detecting IPN, IHN and VHS antigens simultaneously in samples of biological material from fish at an early stage of the disease with high specificity and sensitivity. The principle of the method is as follows: specific immunoglobulins to the pathogen viruses IPN, IHN and VHS, immobilized on the surface of the holes of one polystyrene microplate, bind to homologous antigens, if they are present in the test material, forming an antigen-antibody complex. The resulting immune complex is detected by interaction with an enzyme immunoassay conjugate, the enzyme of which, after adding the substrate, causes decomposition of the substrate-indicator solution and the formation of a colored product. The color intensity in the microplate well is proportional to the specific antigen content in the test sample, the results are taken into account according to the generally accepted formula.
Диагностический набор для выявления вирусов-возбудителей IPN, IHN и VHS содержит: планшет полистироловый 96-луночный, сенсибилизированный иммуноглобулинами к IPN, IHN и VHS; положительный контрольный образец IPN, инактивированный (IPN К+); положительный контрольный образец IHN, инактивированный (IHN К+); положительный контрольный образец VHS, инактивированный (VHS К+); отрицательный контрольный образец, инактивированный (К-); конъюгат 1, представляющий собой анти-IPN антитела, меченные пероксидазой хрена; конъюгат 2, представляющий собой анти-IHN антитела, меченные пероксидазой хрена; конъюгат 3, представляющий собой анти-VHS антитела, меченные пероксидазой хрена; раствор для разведения конъюгата (РК); промыватель - концентрат фосфатно-солевого буферного раствора с твином-80 (ФСБ-Тх25); субстрат - раствор тетраметилбензидина (ТМБ); стоп-реагент; ванночка для реагентов. Компоненты набора расфасованы в пластиковые флаконы разного объема с завинчивающимися крышками и упакованы в коробки.The diagnostic kit for the detection of pathogens IPN, IHN and VHS contains: a 96-well polystyrene plate sensitized with immunoglobulins to IPN, IHN and VHS; positive control IPN inactivated (IPN K + ); positive control IHN inactivated (IHN K + ); positive inactivated VHS control sample (VHS K + ); negative control sample, inactivated (K - ); conjugate 1, which is an anti-IPN antibody labeled with horseradish peroxidase; conjugate 2, which is an anti-IHN antibody labeled with horseradish peroxidase; conjugate 3, which is an anti-VHS antibody labeled with horseradish peroxidase; conjugate dilution solution (PK); the washer is a concentrate of phosphate-saline buffer solution with tween-80 (FSB-Th25); substrate - a solution of tetramethylbenzidine (TMB); stop reagent; bath for reagents. The components of the kit are packaged in plastic bottles of different volumes with screw caps and packed in boxes.
ПРИМЕР 1.EXAMPLE 1
1. Подготовка исследуемого материала1. Preparation of the test material
Для обнаружения антигенов IPN, IHN и VHS в качестве испытуемого используют биопсийный материал внутренних органов (почка, печень, селезенка), экссудат и/или вируссодержащую надосадочную жидкость культур клеток. Для получения 10%-ной суспензии биоматериал гомогенизируют до получения однородной массы на ФСБ (рН7,2-7,4). Полученную суспензию сливают в стерильную посуду и используют для исследования.For the detection of IPN, IHN and VHS antigens, biopsy material of internal organs (kidney, liver, spleen), exudate and / or virus-containing supernatant of cell cultures are used as a test subject. To obtain a 10% suspension, the biomaterial is homogenized until a homogeneous mass is obtained on the FSB (pH 7.2-7.4). The resulting suspension is poured into a sterile dish and used for research.
2. Подготовка компонентов для постановки реакции2. Preparation of components for the formulation of the reaction
Для промывания планшетов, при постановке реакции, готовят содержащий твин-80 фосфатно-солевой буфер: размешивают содержимое флакона с ФСБ-Т*25, при выпадении в концентрате осадка прогревают его до полного растворения солей, и разводят дистиллированной водой до 700 мл. Хранят при 4°С до 5 суток.To wash the plates, when setting up the reaction, a phosphate-buffered saline containing Tween-80 is prepared: the contents of the vial with FSB-T * 25 are mixed, when precipitated in a concentrate, it is heated until the salts are completely dissolved, and diluted with distilled water to 700 ml. Store at 4 ° C for up to 5 days.
Растворы конъюгатов 1, 2, 3 в рабочем разведении готовят непосредственно перед использованием, к 0,05 мл концентрированного раствора добавляют 15 мл раствора для разведения конъюгата (РК), тщательно перемешивают.Solutions of conjugates 1, 2, 3 in working dilution are prepared immediately before use, 15 ml of conjugate dilution solution (RK) is added to 0.05 ml of concentrated solution, and they are thoroughly mixed.
Раствор ТМБ готов к применению, непосредственно перед использованием отбирают в пластиковую ванночку 12 мл. Остатки раствора ТМБ из ванночки нельзя сливать во флакон с исходным раствором ТМБ. Хранят при 4°С в течение всего срока годности набора.The TMB solution is ready for use, immediately before use, 12 ml are taken into a plastic bath. The remains of the TMB solution from the bath cannot be poured into a bottle with the initial TMB solution. Store at 4 ° C for the entire shelf life of the kit.
3. Постановка реакции3. Statement of reaction
Перед началом анализа лунки планшета промывают один раз промывочным раствором. В каждую лунку вносят по 300 мкл раствора, через пять минут после заполнения лунок раствор аккуратно удаляют. Остатки влаги из лунок тщательно удаляют, постукивая перевернутым планшетом по фильтровальной бумаге.Before starting the analysis, the wells of the plate are washed once with a washing solution. 300 μl of the solution is added to each well; five minutes after filling the wells, the solution is carefully removed. Residual moisture from the wells is carefully removed by tapping an inverted plate on filter paper.
В первые лунки рядов планшета сенсибилизированных иммуноглобулинами к IPN, IHN и VHS вносят по 100 мкл специфических положительных антигенов (IPN К+, IHN К+, VHS К+). Во вторые лунки каждого ряда вносят 100 мкл отрицательного антигена. Во все остальные лунки по 100 мкл исследуемых образцов (желательно делать 2-3 повторности). Лунки на планшете сенсибилизированы следующим образом: иммуноглобулинами к IPN (1, 4, 7, 10 ряды), IHN (2, 5, 8, 11 ряды), VHS (3, 6, 9, 12 ряды). Внесение материала в плашку сопровождают тщательным перемешиванием пипетированием в течение 5-7 секунд. Планшет инкубируют при комнатной температуре (21-25°С) 60 минут.100 μl of specific positive antigens (IPN K + , IHN K + , VHS K + ) are added to the first wells of the rows of the tablet of immunoglobulin sensitized to IPN, IHN and VHS. 100 μl of negative antigen are added to the second wells of each row. In all other wells, 100 μl of test samples (preferably 2-3 repetitions). Wells on the plate are sensitized as follows: immunoglobulins to IPN (1, 4, 7, 10 rows), IHN (2, 5, 8, 11 rows), VHS (3, 6, 9, 12 rows). The introduction of the material into the plate is followed by thorough mixing by pipetting for 5-7 seconds. The plate is incubated at room temperature (21-25 ° C) for 60 minutes.
Растворы конъюгатов №1,2,3 в рабочем разведении готовят за пять-десять минут до окончания инкубации.Solutions of conjugates No. 1,2,3 in working dilution are prepared five to ten minutes before the end of incubation.
По окончании инкубации планшет отмывают четыре раза ФСБ-Т от несвязавшихся антигенов, после чего удаляют влагу постукивая перевернутым планшетом по фильтровальной бумаге.At the end of the incubation, the plate is washed four times with FSB-T from unbound antigens, and then moisture is removed by tapping the inverted plate on filter paper.
В лунки рядов 1, 4, 7, 10 планшета вносят по 100 мкл раствора конъюгата 1 (IPN) в рабочем разведении. В лунки рядов 2, 5, 8, 11 планшета вносят по 100 мкл раствора конъюгата 2 (IHN) в рабочем разведении. В лунки рядов 3,6,9,12 планшета вносят по 100 мкл раствора конъюгата 3 (VHS) в рабочем разведении. Планшет инкубируют при комнатной температуре (21-25°С) 60 минут. По окончании инкубации планшет отмывают четыре раза ФСБ-Т после чего удаляют влагу постукиванием.In the wells of rows 1, 4, 7, 10 of the tablet contribute 100 μl of a solution of conjugate 1 (IPN) in working dilution. In the wells of rows 2, 5, 8, 11 of the tablet contribute 100 μl of a solution of conjugate 2 (IHN) in working dilution. In the wells of rows 3,6,9,12 tablets contribute 100 μl of a solution of conjugate 3 (VHS) in working dilution. The plate is incubated at room temperature (21-25 ° C) for 60 minutes. At the end of the incubation, the plate is washed four times with FSB-T and then moisture is removed by tapping.
Во все использованные лунки планшета вносят по 100 мкл раствора ТМБ. Для внесения раствора ТМБ используют пластиковую ванночку, входящую в состав набора. Планшет инкубируют при комнатной температуре, в защищенном от света месте, 25-30 минут.100 μl of TMB solution is added to all used wells of the plate. To add a solution of TMB use a plastic bath, which is part of the kit. The tablet is incubated at room temperature, in a dark place, 25-30 minutes.
Реакцию заканчивают добавлением во все лунки 100 мкл стоп-реагента.The reaction is completed by adding 100 μl of stop reagent to all wells.
4. Учет результатов4. Profitability analysis
Результаты реакции учитывают через 2-3 минуты после добавления стоп-реагента, проводя измерение оптической плотности (ОП) в каждой лунке на спектрофотометре с вертикальным лучом света при длине волны 450 нм или визуально. Результаты исследований учитывают только при соблюдении следующих условий:The reaction results are taken into account 2-3 minutes after adding the stop reagent, by measuring the optical density (OD) in each well on a spectrophotometer with a vertical light beam at a wavelength of 450 nm or visually. Research results are taken into account only under the following conditions:
- значение ОП в лунке с отрицательным контролем не более 0,30 о.е.- the value of the OD in the hole with a negative control of not more than 0.30 p.u.
- значение ОП в лунке с положительным контролем не менее 0,62 о.е. Реакцию оценивают по формуле и выражают в виде процента реактивности:- the value of OD in the well with a positive control of at least 0.62 p.u. The reaction is evaluated by the formula and expressed as a percentage of reactivity:
процент реактивности (%) = (ОП-ОПК-)/(ОПК+-ОПК-)Х100%,reactivity percentage (%) = (OP-OPK - ) / (OPK + -OPK - ) X100%,
где ОП - оптическая плотность образца, ОПК+ - оптическая плотность положительного контроля, ОПК- - оптическая плотность отрицательного контроля.where OP is the optical density of the sample, OPK + is the optical density of the positive control, OPK - is the optical density of the negative control.
Границы пороговых значений: при величине % >22% реакция считается положительной, значение % <10% - реакция отрицательная, а диапазон % от 10% до 22% - сомнительные результаты реакции.The limits of the threshold values: at%> 22%, the reaction is considered positive, the value% <10% is the negative reaction, and the% range from 10% to 22% is the dubious results of the reaction.
ПРИМЕР 2.EXAMPLE 2
Подготовку исследуемого материала, подготовку компонентов для постановки реакции, постановку реакции осуществляют аналогично описанному в примере 1, но инкубацию планшета после внесения положительных, отрицательных и исследуемых образцов проводят в течение 4-6 часов при температуре 4°С (в холодильнике), после чего работу и учет результатов продолжают по стандартной схеме. Получают результаты аналогичные таковым в примере 1.Preparation of the test material, preparation of components for the reaction, the reaction is carried out similarly as described in example 1, but the incubation of the tablet after making positive, negative and test samples is carried out for 4-6 hours at 4 ° C (in the refrigerator), after which the work and the results are continued according to the standard scheme. The results are similar to those in example 1.
Предложенный способ и набор позволяют в течение трех часов с достоверностью 98% определять в образцах биологического материала наличие возбудителей вирусных болезней лососевых рыб. Использование «холодной инкубации» (в течение 4-6 часов при температуре 4°С, в холодильнике) позволяет получать достоверные, аналогичные результаты в течение одного дня, с перерывом для оператора в ходе работы, что по разным причинам также может быть удобно. Лунки на планшете сенсибилизированы следующим образом: иммуноглобулинами к IPN (1, 4, 7, 10 ряды), IHN (2, 5, 8, 11 ряды), VHS (3, 6, 9, 12 ряды). В один планшет можно разместить от 2-х образцов биоматериала в трех повторностях до 24 образцов без повторений. Планшет может быть использован весь одновременно или в 4 приема, для чего использованные ранее ряды высушивают промывателем и заклеивают пленкой, или просто помечают маркером.The proposed method and kit allow for three hours with a 98% confidence to determine the presence of pathogens of viral diseases of salmon fish in the samples of biological material. The use of "cold incubation" (for 4-6 hours at a temperature of 4 ° C, in the refrigerator) allows you to get reliable, similar results for one day, with a break for the operator during work, which for various reasons can also be convenient. Wells on the plate are sensitized as follows: immunoglobulins to IPN (1, 4, 7, 10 rows), IHN (2, 5, 8, 11 rows), VHS (3, 6, 9, 12 rows). In one tablet, you can place from 2 samples of biomaterial in triplicate to 24 samples without repetition. The tablet can be used all at once or in 4 doses, for which the previously used rows are dried with a washer and sealed with a film, or simply marked with a marker.
Диагностический набор разработан и апробирован с положительным результатом в лаборатории ихтиопатологии ФГБНУ ВИЭВ имени Я.Р. Коваленко в период октябрь 2015 - декабрь 2016 года.The diagnostic kit was developed and tested with a positive result in the laboratory of ichthyopathology of the Ya.R. Kovalenko from October 2015 to December 2016.
Предложенный способ найдет применение в системе мониторинга, проводимого органами ветеринарной службы страны, что позволит контролировать распространение вирусных болезней рыб и сохранять здоровье культивируемых рыб, а также в научных исследованиях для тестирования существующих и новых клеточных линий, в селекционно-племенной работе, для получения информации о закономерностях циркуляции вирусов-возбудителей IPN, IHN и VHS в аквакультуре России и диких популяциях рыб.The proposed method will find application in a monitoring system conducted by the country's veterinary services, which will allow to control the spread of viral diseases of fish and maintain the health of cultivated fish, as well as in scientific research for testing existing and new cell lines, in breeding and breeding, to obtain information about patterns of circulation of viruses pathogens IPN, IHN and VHS in aquaculture of Russia and wild fish populations.
Источники информацииInformation sources
1. Инструкция о мероприятиях по профилактике и ликвидации инфекционного некроза поджелудочной железы лососевых рыб// Сборник инструкций по борьбе с болезнями рыб (часть 1), Москва, отдел маркетинга АМБ-агро, 1998, с. 96-104.1. Instructions on measures for the prevention and elimination of infectious necrosis of the pancreas of salmon fish // Collection of instructions for combating fish diseases (part 1), Moscow, marketing department AMB-agro, 1998, p. 96-104.
2. Инструкция о мероприятиях по профилактике и борьбе с инфекционным некрозом гемопоэтической ткани лососевых рыб// Сборник инструкций по борьбе с болезнями рыб (часть 1), Москва, отдел маркетинга АМБ-агро, 1998, с. 87-95.2. Instruction on measures for the prevention and control of infectious necrosis of hematopoietic tissue of salmon fish // Collection of instructions for combating fish diseases (part 1), Moscow, marketing department AMB-agro, 1998, p. 87-95.
3. Инструкция о мероприятиях по борьбе с вирусной геморрагической септицемией рыб// Сборник инструкций по борьбе с болезнями рыб (часть 1), Москва, отдел маркетинга АМБ-агро, 1998, с. 105-113.3. Instructions on measures to combat viral hemorrhagic septicemia of fish // Collection of instructions for combating fish diseases (part 1), Moscow, marketing department AMB-agro, 1998, p. 105-113.
4. Патент №2472162 Способ серологической диагностики вирусных желудочно-кишечных инфекций крупного рогатого скота методом иммуноферментного анализа.4. Patent No. 2472162 Method for serological diagnosis of viral gastrointestinal infections of cattle by enzyme immunoassay.
5. Shchelkunov I. Further virus characterization, diagnostics and prevention of Siberian sturgeon herpesvirus disease / Igor Shchelkunov, Andor Doszpoly, Tatiana Shchelkunova, Inna Prokaeva, Fatima Kalabekova, Ismail Kalabekov, Dmitry Kurenkov // USA-Russia Bilateral Workshop On Aquaculture and FishHealth USGS Western Fisheries Research Center, Seattle, WA, USA October, 2012, pp. 1-5.5. Shchelkunov I. Further virus characterization, diagnostics and prevention of Siberian sturgeon herpesvirus disease / Igor Shchelkunov, Andor Doszpoly, Tatiana Shchelkunova, Inna Prokaeva, Fatima Kalabekova, Ismail Kalabekov, Dmitry Kurenkov // USA-Russia Bilateral Workshop On Aquaculture Fish and Western Fisheries Research Center, Seattle, WA, USA October, 2012, pp. 1-5.
Claims (2)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017108607A RU2663909C1 (en) | 2017-03-15 | 2017-03-15 | Method for serological diagnosis of viral diseases of salmonids by enzyme immunoassay and diagnostic set for implementing method |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017108607A RU2663909C1 (en) | 2017-03-15 | 2017-03-15 | Method for serological diagnosis of viral diseases of salmonids by enzyme immunoassay and diagnostic set for implementing method |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2663909C1 true RU2663909C1 (en) | 2018-08-13 |
Family
ID=63177246
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2017108607A RU2663909C1 (en) | 2017-03-15 | 2017-03-15 | Method for serological diagnosis of viral diseases of salmonids by enzyme immunoassay and diagnostic set for implementing method |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2663909C1 (en) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2489735A1 (en) * | 2009-10-16 | 2012-08-22 | National University Corporation Tokyo University of Marine Science and Technology | Aptamer capable of binding to viral hemorrhagic septicemia virus |
| WO2015051456A1 (en) * | 2013-10-08 | 2015-04-16 | University Of Prince Edward Island | Multiplex diagnostic assay for detecting salmonid pathogens |
-
2017
- 2017-03-15 RU RU2017108607A patent/RU2663909C1/en active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2489735A1 (en) * | 2009-10-16 | 2012-08-22 | National University Corporation Tokyo University of Marine Science and Technology | Aptamer capable of binding to viral hemorrhagic septicemia virus |
| WO2015051456A1 (en) * | 2013-10-08 | 2015-04-16 | University Of Prince Edward Island | Multiplex diagnostic assay for detecting salmonid pathogens |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| COLLET B., Innate immune responses of salmonid fish to viral infections.Dev Comp Immunol. 2014 Apr;43(2):160-73. doi: 10.1016/j.dci.2013.08.017. Epub 2013 Aug 24. * |
| COLLET B., Innate immune responses of salmonid fish to viral infections.Dev Comp Immunol. 2014 Apr;43(2):160-73. doi: 10.1016/j.dci.2013.08.017. Epub 2013 Aug 24. FALK K., et al., Characterization and applications of a monoclonal antibody against infectious salmon anaemia virus.Dis Aquat Organ. 1998 Oct 8;34(2):77-85. * |
| FALK K., et al., Characterization and applications of a monoclonal antibody against infectious salmon anaemia virus.Dis Aquat Organ. 1998 Oct 8;34(2):77-85. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Waner et al. | Comparison of a clinic-based ELISA test kit with the immunofluorescence test for the assay of Ehrlichia canis antibodies in dogs | |
| AU738964C (en) | Bovine viral diarrhea virus serum antigen capture immunoassay | |
| CN111474340B (en) | Enzyme-labeled antigen for novel coronavirus detection, preparation method, kit and application | |
| Yu et al. | Development and application of a colloidal gold test strip for detection of avian leukosis virus | |
| CN110261623A (en) | A kind of detection sheep echinococcosis granulosa antibody indirect ELISA detection kit and its application | |
| Ljungström | Immunodiagnosis in man | |
| JPH11148936A (en) | Immunoassay and kit for performing the same | |
| RU2663909C1 (en) | Method for serological diagnosis of viral diseases of salmonids by enzyme immunoassay and diagnostic set for implementing method | |
| US4814269A (en) | Diagnostic testing for antibodies against microorganisms | |
| RU2595883C1 (en) | METHOD FOR SERUM DIAGNOSIS OF SALMON FISH YERSINIOSIS CAUSED BY Yersinia ruckeri BY ENZYME IMMUNOASSAY AND DIAGNOSTIC SET FOR IMPLEMENTING METHOD | |
| US6756043B2 (en) | Compositions and methods for detecting adult Taenia solium | |
| US20100159488A1 (en) | Method for the multiplex serological diagnosis in vitro of spirochete infections | |
| RU2472162C1 (en) | Method of serologic diagnosis of viral gastrointestinal infections in cattle by method of enzyme-immunoassay | |
| RU2306567C2 (en) | Method for differential diagnostics of viral gastro-intestinal infections in cattle due to immunoenzymatic assay | |
| RU2329507C1 (en) | Method of acute bacterial enteric infections express-diagnostics | |
| AU2021105824A4 (en) | Visual Rapid Detection Kit for O-type Foot-and-Mouth Disease Virus and Preparation Method Thereof | |
| CN103675283A (en) | Enzyme-linked immuno sorbent assay detection method of Skeletonema costatum | |
| Shuxratovna | Determination of Igg Antibody Against Leukemia Virus in Cattle Using Immunoenzyme Assay | |
| RU2152035C1 (en) | Method of brucellosis diagnosis | |
| Alsaad et al. | Diagnosis of Giardia Species by Comparison of Two Enzyme-Linked Immuno-Sorbent Tests | |
| RU2488832C1 (en) | Complex diagnostic technique for infectious diseases by enzyme-linked immunosorbent assay | |
| SU1718119A1 (en) | Method of determination of antigens in solutions | |
| Hammami et al. | Detection of rotavirus in fecal samples from calves by a cell culture indirect immunofluorescence, an Ag-capture ELISA, a tissue culture ELISA, and a commercial Ag-capture ELISA | |
| RU2337647C2 (en) | Method for life-time diagnostics of larval hydatidosis (echinococcosis) in sheep | |
| RU2614256C2 (en) | Method of detecting of cell culture contamination with viruses by immunoperoxidase method |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| RH4A | Copy of patent granted that was duplicated for the russian federation |
Effective date: 20190410 |
|
| PD4A | Correction of name of patent owner |