RU2488832C1 - Complex diagnostic technique for infectious diseases by enzyme-linked immunosorbent assay - Google Patents
Complex diagnostic technique for infectious diseases by enzyme-linked immunosorbent assay Download PDFInfo
- Publication number
- RU2488832C1 RU2488832C1 RU2012101392/15A RU2012101392A RU2488832C1 RU 2488832 C1 RU2488832 C1 RU 2488832C1 RU 2012101392/15 A RU2012101392/15 A RU 2012101392/15A RU 2012101392 A RU2012101392 A RU 2012101392A RU 2488832 C1 RU2488832 C1 RU 2488832C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- immunosorbent
- proteins
- working surface
- markers
- hepatitis
- Prior art date
Links
Landscapes
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к способам комплексной скрининговой диагностики инфекционных заболеваний человека путем анализа сыворотки или плазмы крови, и может использоваться в медицине для выявления различных заболеваний.The invention relates to methods for complex screening diagnostics of human infectious diseases by analyzing serum or plasma, and can be used in medicine to detect various diseases.
Известны способы диагностики заболеваний путем выявления маркеров инфекционных агентов, либо маркеров начавшегося инфекционного процесса в физиологических жидкостях пациентов. Причем исследование биологических проб для выявления заболеваний проводят отдельно для каждого заболевания.Known methods for diagnosing diseases by identifying markers of infectious agents, or markers of the onset of an infectious process in physiological fluids of patients. Moreover, the study of biological samples for the detection of diseases is carried out separately for each disease.
Например, диагностику осуществляют путем выявления ДНК или РНК инфекционного агента в физиологических жидкостях человека, в том числе в сыворотке крови, методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) или методом обратной транскрипции - полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР). При этом практикуется предварительное пулирование образцов сыворотки или плазмы крови доноров для первичного скрининга методом ПЦР или ОТ-ПЦР. Для одновременной диагностики некоторых инфекционных заболеваний существует метод мультиплексного ПЦР или ОТ-ПЦР в реальном времени.For example, diagnostics are carried out by detecting DNA or RNA of an infectious agent in human physiological fluids, including serum, by polymerase chain reaction (PCR) or by reverse transcription - polymerase chain reaction (RT-PCR). At the same time, preliminary pooling of serum or plasma samples of donors for primary screening by PCR or RT-PCR is practiced. For the simultaneous diagnosis of certain infectious diseases, there is a method of multiplex PCR or RT-PCR in real time.
Существующая практика выявления заболеваний включает проведение скринингового (первичного) и подтверждающего тестирования сыворотки или плазмы крови методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) и его модификации и/или методом иммунного блоттинга. Точные алгоритмы проведения скрининга и подтверждающего тестирования закреплены в нормативных актах для медицинских учреждений и соответствующих методических рекомендациях, которые определяются типом заболевания и локальными правовыми актами.Existing disease detection practices include screening (primary) and confirmatory testing of serum or blood plasma by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and its modification and / or immuno-blotting. Exact screening and confirmatory testing algorithms are enshrined in regulatory enactments for medical institutions and relevant methodological recommendations, which are determined by the type of disease and local legal acts.
В настоящее время в широкой практике серологических скрининговых исследований методы одновременной (объединенной в одном анализе) серологической диагностики инфекционных заболеваний не применяются. При проведении серологических скрининговых тестов для каждого инфекционного заболевания отдельно определяют наличие в сыворотке или плазме крови антител или антигенов, специфичных по отношению к определенному инфекционному агенту, для чего необходимо провести несколько отдельных процедур анализа.Currently, in the widespread practice of serological screening studies, the methods of simultaneous (combined in one analysis) serological diagnosis of infectious diseases are not used. When conducting serological screening tests for each infectious disease, the presence of antibodies or antigens specific to a specific infectious agent in the serum or plasma is separately determined, for which several separate analysis procedures must be performed.
В то же время, например, выполнение анализов крови на наличие в ней инфекционных маркеров вируса гепатита В, вируса гепатита С, вируса иммунодефицита человека 1-го и 2-го типов и сифилиса является обязательным для всех доноров крови и органов в России, США и многих других странах. Кроме того, в связи с широким распространением названных инфекций такие анализы в настоящее время являются наиболее востребованными и распространенными. Наличие положительного результата по любому из серологических маркеров заболевания ВИЧ, Гепатитом В или С, сифилисом - является абсолютным противопоказанием для донорства крови, т.е. образец донорской крови, содержащий хотя бы один из названных маркеров безусловно бракуется. Таким образом, на стадии первичного скринига пациентов или доноров, целесообразно проводить один анализ, сразу на несколько маркеров разных инфекционных заболеваний, вместо нескольких независимых исследований отдельно для каждой инфекции. Все существующие подходы мультиплексной серологической диагностики в настоящее время требуют специального дорогостоящего оборудования и не применяются. Также, имеются большие сложности на пути создания объединенных диагностических систем из-за необходимости сложной оптимизации и настройки компонентов такой системы для одновременной работы в условиях объединенного метода. В настоящий момент на рынке таких продуктов не существует.At the same time, for example, blood tests for the presence of infectious markers of hepatitis B virus, hepatitis C virus, human immunodeficiency virus type 1 and type 2 and syphilis are mandatory for all blood donors and organs in Russia, the United States and many other countries. In addition, due to the wide spread of these infections, such tests are currently the most popular and common. The presence of a positive result for any of the serological markers of the disease HIV, Hepatitis B or C, syphilis is an absolute contraindication for blood donation, i.e. a sample of donated blood containing at least one of these markers is certainly defective. Thus, at the stage of the initial screening of patients or donors, it is advisable to conduct one analysis at once for several markers of different infectious diseases, instead of several independent studies separately for each infection. All existing approaches of multiplex serological diagnostics currently require special expensive equipment and are not applied. Also, there are great difficulties in creating integrated diagnostic systems due to the need for complex optimization and tuning of the components of such a system for simultaneous operation under the combined method. There are currently no such products on the market.
Известны способы диагностики путем выявления в сыворотке или плазме крови специфических иммуноглобулинов против антигенов инфекционных агентов или самих антигенов инфекционных агентов методом ИФА. Например, известно применение иммуноферментной тест-системы для идентификации спектра антител к вирусу иммунодефицита человека (ВИЧ) первого и второго типов, первого типа группы О и выявления антигена к вирусу иммунодефицита человека первого типа р24, которая включает иммуносорбент на основе антигенов вируса иммунодефицита человека представляющих собой gp41 (env ВИЧ-1 и ВИЧ-2 группы О), gp120 (env), р24 (gag), р31 (pol), gp36 (env ВИЧ-2), антител к антигену ВИЧ 1 р24, и детектирующие реагенты, при этом вышеперечисленные антигены ВИЧ и антитела ВИЧ сорбированы в разных лунках планшетов для иммуноферментного анализа, и для сорбции используют 96-луночные полистироловые разборные или неразборные планшеты [Патент РФ №2283497, МПК G01N 33/543, G01N 15/48]. При этом белки, несущие антигенные детерминанты инфекционных агентов, и/или иммуноглобулины, специфичные к маркерам одного определенного заболевания, иммобилизуют на твердой поверхности в лунках планшета. В названные лунки планшета затем вносят клинический образец сыворотки или плазмы крови. После этого, иммунохимически определяют антитела или антигены, связавшиеся с белками на твердой фазе. К его недостаткам относится необходимость отдельного проведения анализа для выявления маркеров каждого инфекционного процесса.Known diagnostic methods by detecting in serum or plasma specific immunoglobulins against antigens of infectious agents or the antigens of infectious agents themselves by ELISA. For example, it is known to use an enzyme-linked immunosorbent assay system to identify the spectrum of antibodies to human immunodeficiency virus (HIV) of the first and second types, the first type of group O, and to identify the antigen to the human immunodeficiency virus of the first type p24, which includes an immunosorbent based on the human immunodeficiency virus antigens representing gp41 (env HIV-1 and HIV-2 group O), gp120 (env), p24 (gag), p31 (pol), gp36 (env HIV-2), antibodies to the HIV antigen 1 p24, and detection reagents, while the above HIV antigens and HIV antibodies are sorbed in various in the wells of the plates for enzyme-linked immunosorbent assay, and for sorption using 96-well polystyrene collapsible or non-separable tablets [RF Patent No. 2283497, IPC G01N 33/543, G01N 15/48]. In this case, proteins that carry the antigenic determinants of infectious agents, and / or immunoglobulins specific for markers of one particular disease, are immobilized on a solid surface in the wells of the tablet. A clinical sample of serum or plasma is then added to the named wells of the plate. After that, antibodies or antigens bound to proteins on the solid phase are immunochemically determined. Its disadvantages include the need for a separate analysis to identify markers of each infection process.
Известен способ иммунохимического анализа, включающий инкубацию стрипа (пластиковой подложки) с фиксированным антигеном в разведении анализируемой сыворотки, отмывку стрипа, инкубацию стрипа в растворе конъюгата вторичных антител с ферментной меткой, отмывку стрипа, инкубацию стрипа в растворе субстрата для проявления метки, отмывку стрипа, визуальный учет результатов, в котором анализ выполняется с использованием изделия, представляющего собой стрип в виде гребенки с сорбционно фиксированным на ограниченном участке его поверхности антигеном и блокированными природными или синтетическими полимерами, свободными от антигена участками, с зубцами шириной 5-12 мм, на каждый из которых в виде отдельных пятен нанесены все используемые в анализе антигены, способные эффективно связывать специфические антитела в одинаковых условиях анализа [Патент РФ №2242762, МПК G01N 33/53]. Способ позволяет одновременно определять несколько видов различных по специфичности антител.A known method of immunochemical analysis, including incubation of a strip (plastic substrate) with a fixed antigen in the dilution of the analyzed serum, washing the strip, incubation of the strip in a solution of conjugate of secondary antibodies with an enzyme label, washing of the strip, incubation of the strip in a substrate solution for developing a label, recording results in which the analysis is performed using a product that is a strip in the form of a comb with sorption adsorption on a limited area of its surface antigen and blocked natural or synthetic polymers, antigen-free areas, with teeth with a width of 5-12 mm, each of which in the form of separate spots applied all the antigens used in the analysis, capable of effectively bind specific antibodies in the same analysis conditions [RF Patent No. 2242762 IPC G01N 33/53]. The method allows you to simultaneously determine several types of different specificity antibodies.
Этот способ является ближайшим аналогом предлагаемого и принят за прототип изобретения.This method is the closest analogue of the proposed and adopted as a prototype of the invention.
Прототип обладает рядом недостатков. Так, при диагностике необходимо проводить анализы отдельно по каждому инфекционному заболеванию, что требует существенного времени и трудозатрат. Результаты анализа учитывают визуально. Технологическую платформу этого способа невозможно напрямую интегрировать в стандартные производственные циклы производителей диагностики, а для конечных пользователей он непривычен.The prototype has several disadvantages. So, when diagnosing, it is necessary to conduct tests separately for each infectious disease, which requires significant time and labor. The results of the analysis are taken into account visually. The technological platform of this method cannot be directly integrated into the standard production cycles of diagnostic manufacturers, but it is unusual for end users.
Вместе с тем, как уже было упомянуто выше, например, выполнение анализов на наличие инфекционных маркеров, например, вируса гепатита В, вируса гепатита С, вируса иммунодефицита человека 1-го и 2-го типов и сифилиса является обязательным для всех доноров крови и органов. Такие анализы являются наиболее востребованными и распространенными. Поэтому насущным требованием времени является сокращение времени на проведение анализов и снижение их сложности.However, as already mentioned above, for example, testing for the presence of infectious markers, for example, hepatitis B virus, hepatitis C virus, human immunodeficiency virus type 1 and type 2 and syphilis is mandatory for all blood donors and organs . Such analyzes are the most popular and common. Therefore, an urgent requirement of the time is to reduce the time for analysis and reduce their complexity.
Изобретение решает задачу создания такого способа проведения комплексной серологической диагностики, который позволял бы многократно сократить время и трудозатраты на проведение комплексной серологической диагностики инфекционных заболеваний, был бы простым в исполнении, не требовал дополнительного специального оборудования и был привычным для конечных пользователей.The invention solves the problem of creating such a method for conducting complex serological diagnostics, which would reduce the time and labor required to conduct complex serological diagnostics of infectious diseases, would be simple to implement, would not require additional special equipment, and would be familiar to end users.
Поставленная задача решается тем, что предлагается способ комплексной диагностики инфекционных заболеваний человека, включающий иммобилизацию на рабочей поверхности иммуносорбента по меньшей мере пары различающихся между собой белков, каждый из которых способен связывать специфичные ему маркеры соответствующего инфекционного заболевания, введение рабочей поверхности иммуносорбента в контакт с исследуемым образцом сыворотки или плазмы крови, инкубацию, последующую обработку рабочей поверхности иммуносорбента растворами коньюгатов белков, содержащих соответствующие ферментативные метки, и выявление маркеров инфекционных заболеваний, связавшихся при инкубации с рабочей поверхностью иммуносорбента в форме иммунных комплексов, в котором белки иммобилизуют на рабочей поверхности иммуносорбента в форме их смеси, а выявляют маркеры, по меньшей мере, одного инфекционного заболевания, связавшиеся при инкубации с рабочей поверхностью иммуносорбента в форме иммунных комплексов, причем названные маркеры выявляют путем измерения суммарной ферментативной активности иммуносорбента.The problem is solved in that a method for the comprehensive diagnosis of human infectious diseases is proposed, including immobilizing on the working surface of an immunosorbent at least a pair of different proteins, each of which is capable of binding specific markers of the corresponding infectious disease, bringing the immunosorbent working surface into contact with the test sample serum or plasma, incubation, subsequent processing of the working surface of the immunosorbent with conjugate solutions of proteins containing the corresponding enzymatic labels, and the identification of markers of infectious diseases associated during incubation with the working surface of the immunosorbent in the form of immune complexes, in which the proteins are immobilized on the working surface of the immunosorbent in the form of their mixture, and markers of at least one infectious disease are detected associated during incubation with the working surface of the immunosorbent in the form of immune complexes, moreover, these markers are detected by measuring the total enzymatic activity mmunosorbenta.
Инфекционными заболеваниями могут быть заболевания из ряда: вирусный гепатит В, вирусный гепатит C, ВИЧ-инфекция и сифилис.Infectious diseases can be a number of diseases: viral hepatitis B, viral hepatitis C, HIV infection and syphilis.
Для диагностики гепатита B, на рабочую поверхность иммуносорбента иммобилизуют иммуноглобулины, способные специфично связываться с антигеном HBsAg и/или белки, несущие антигенные детерминанты вируса гепатита В, по меньшей мере, входящие в состав его белковых структур HBcoreAg и/или HBeAg.For the diagnosis of hepatitis B, immunoglobulins capable of specifically binding to the HBsAg antigen and / or proteins carrying the antigenic determinants of the hepatitis B virus, at least that are part of its protein structures HBcoreAg and / or HBeAg, are immobilized on the surface of the immunosorbent.
Для диагностики гепатита C, на рабочую поверхность иммуносорбента иммобилизуют иммуноглобулины, специфичные к антигену нуклеокапсида Core названного гепатита C и/или белки, несущие антигенные детерминанты названного вируса гепатита C, по меньшей мере, входящие в состав его белковых структур Core и/или NS3 и/или NS4 и/или NS5.For the diagnosis of hepatitis C, immunoglobulins specific for the core hepatitis C nucleocapsid antigen and / or proteins carrying the antigenic determinants of the named hepatitis C virus, at least that are part of its protein structures Core and / or NS3 and / are immobilized on the surface of the immunosorbent or NS4 and / or NS5.
Для диагностики сифилиса, на рабочую поверхность иммуносорбента иммобилизую белки, несущие антигенные детерминанты бактерии Treponema Pallidum, по меньшей мере, входящие в состав ее белковых структур р17 и/или р47.To diagnose syphilis, I immobilize proteins on the working surface of the immunosorbent that carry the antigenic determinants of the Treponema Pallidum bacterium, at least that are part of its protein structures p17 and / or p47.
Перед инкубацией, сыворотку или плазму крови целесообразно разбавлять каким-либо водным буферным раствором с коэффициентом разбавления 1-100.Before incubation, serum or blood plasma, it is advisable to dilute with any aqueous buffer solution with a dilution factor of 1-100.
При инкубации сыворотку или плазму крови и/или растворы коньюгатов целесообразно активно перемешивать и термостатировать в диапазоне температур 18-44°C.During incubation, serum or blood plasma and / or conjugate solutions should be actively mixed and thermostated in the temperature range 18-44 ° C.
Для выявления связавшихся с рабочей поверхностью иммуносорбента иммунных комплексов преимущественно используют коньюгаты белков и/или иммуноглобулинов с меткой биотина и/или с пероксидазой хрена и/или с щелочной фосфатазой, при этом названные белки и/или иммуноглобулины несут антигенные детерминанты и/или способны специфически связывать антигены соответствующих инфекционных заболеваний.Conjugates of proteins and / or immunoglobulins labeled with biotin and / or with horseradish peroxidase and / or alkaline phosphatase are predominantly used to identify the immune complexes bound to the working surface of the immunosorbent, and these proteins and / or immunoglobulins carry antigenic determinants and / or are capable of specifically binding antigens of the corresponding infectious diseases.
Для выявления связавшихся с рабочей поверхностью иммуносорбента иммунных комплексов, содержащих в своем составе метку биотина, используют коньюгат белка авидина или стрептавидина или их модификаций с ферментом пероксидаза хрена или щелочная фосфатаза.To identify the immune complexes bound to the working surface of the immunosorbent that contain a biotin label, an avidin or streptavidin protein conjugate or their modifications with the horseradish peroxidase enzyme or alkaline phosphatase are used.
Связавшиеся с рабочей поверхностью иммуносорбента иммунные комплексы, содержащие пероксидазу хрена или щелочную фосфатазу, в основном выявляют по изменению оптической плотности или хемилюминесценции раствора, контактирующего с рабочей поверхностью иммуносорбента.Immune complexes containing horseradish peroxidase or alkaline phosphatase bound to the working surface of the immunosorbent are mainly detected by a change in the optical density or chemiluminescence of the solution in contact with the working surface of the immunosorbent.
Рабочая поверхность иммуносорбента может быть поверхностью полимерных или минеральных или композитных микросфер, диаметром 50 нанометров - 20 микрометров.The working surface of the immunosorbent can be the surface of polymer or mineral or composite microspheres, with a diameter of 50 nanometers - 20 micrometers.
Способ базируется на том, что результаты анализа не дискриминированы относительно того, какие из определяемых маркеров инфекционных заболеваний были выявлены в образце, а сами результаты анализа являются качественными.The method is based on the fact that the results of the analysis are not discriminated against which of the identified markers of infectious diseases were detected in the sample, and the results of the analysis themselves are qualitative.
Способ осуществляют следующим образом.The method is as follows.
Для проведения анализа готовят иммуносорбент, которым является твердая фаза, с иммобилизованными белками, несущими антигенные детерминанты инфекционных агентов или иммуноглобулины, специфичные к антигенам инфекционных агентов.For the analysis, an immunosorbent, which is the solid phase, is prepared with immobilized proteins that carry antigenic determinants of infectious agents or immunoglobulins specific for the antigens of infectious agents.
Например, иммуносорбент представляется стандартным полистирольным планшетом с 96 лунками, сгруппированными в ряды. Каждая лунка вмещает обычно до 0,4 мл жидкости.For example, an immunosorbent appears to be a standard polystyrene plate with 96 wells grouped in rows. Each well usually holds up to 0.4 ml of liquid.
Сначала в лунки вносят белки, которые будут связывать маркеры инфекционных заболеваний в виде смеси различающихся между собой белков, которые могут связывать маркеры соответствующих им нескольких разных инфекционных заболеваний. В результате они все сорбируются на поверхности лунок случайным образом.First, proteins are introduced into the wells, which will bind the markers of infectious diseases in the form of a mixture of different proteins that can bind markers of several different infectious diseases corresponding to them. As a result, they are all sorbed randomly on the surface of the wells.
Маркеры инфекционных заболеваний это: антитела, которые организм вырабатывает в ответ на инфекцию, антигены (как правило это тоже белки) самих вирусов или бактерий, т.е. их непосредственные структурные компоненты в крови.Markers of infectious diseases are: antibodies that the body produces in response to infection, antigens (usually also proteins) of the viruses or bacteria themselves, i.e. their immediate structural components in the blood.
Далее в планшет вносят образцы, например, сыворотки крови и коньюгаты, содержащие ферментативные метки. В результате разнообразнх процедур маркеры инфекционных заболеваний оказываются связанными с поверхностью ИС вместе с коньюгатами и ферментативными метками.Next, samples, for example, blood serum and conjugates containing enzymatic labels, are introduced into the plate. As a result of various procedures, markers of infectious diseases turn out to be associated with the surface of IP along with conjugates and enzymatic labels.
В качестве ферментативных меток обычно используют пероксидазу из корней обычного хрена, или щелочную фосвфатау животного происхожденияAs enzymatic labels, peroxidase from the roots of ordinary horseradish, or alkaline fosvfatau of animal origin is usually used
Для того, чтобы определить, есть или нет в образце маркеры, нужно измерить ферментативную активность поверхности ИС, т.к. в случае наличия маркеров, она будет высокая, а в случае отсутствия - низкая.In order to determine whether or not markers are present in the sample, it is necessary to measure the enzymatic activity of the IP surface, since if there are markers, it will be high, and if not, it will be low.
Для измерения оптической плотности в лунки вносят раствор субстрата, например для пероксидазы хрена - это перекись водорода, фермент активно разрушает перекись и продукты этой реакции приводят к вторичным химическим реакциям, а именно -изменению цвета раствора, либо появлению хемилюминесценции. Изменение цвета раствора происходит из-за наличия в нем, вместе с субстратом, химических веществ, способных к изменению цвета в результате химических превращений. Их общее название - Хромоген. Хромогенов существует много, и они могут давать разные цвета. Хемилюминесценция возникает в случае наличия вместо хромогена веществ, способных в результате окислительно-восстановительных реакции испускать кванты света, например, к таким веществам можно отнести люминол и его аналоги.To measure the optical density, a substrate solution is introduced into the wells, for example, for horseradish peroxidase - this is hydrogen peroxide, the enzyme actively destroys the peroxide and the products of this reaction lead to secondary chemical reactions, namely, a change in the color of the solution, or the appearance of chemiluminescence. The color change of the solution is due to the presence in it, together with the substrate, of chemicals capable of changing color as a result of chemical transformations. Their common name is Chromogen. There are many chromogens, and they can give different colors. Chemiluminescence occurs when instead of a chromogen there are substances capable of emitting light quanta as a result of redox reactions, for example, luminol and its analogues can be attributed to such substances.
Измерение интенсивности окрашивания раствора производится приборами - спектрофотометрами, которые пропускают через лунку с раствором субстрата-хромогена (снизу-вверх) луч света определенной длинны волны, специально подобранной под используемый хромоген. Спектрофотометры снабжены несколькими оптическими фильтрами, и могут проводить измерения на разных длинах волн. Если хромоген изменил цвет, то луч света от спектрофотометра при прохождении через лунку - поглощается хромогеном, а если хромоген не изменился в результате реакции - то луч не поглощается раствором. Прибор сравнивает интенсивность поданного пучка света с прошедшим через лунку пучком света. Если поглощения много - то результат положительный. Если мало - то отрицательный. Статистически выбирают "критическое значение" оптической плотности, при котором результат считается положительным.Measurement of the intensity of the staining of the solution is carried out by devices - spectrophotometers, which pass through a well with a substrate-chromogen solution (bottom-up) a beam of light of a certain wavelength, specially selected for the chromogen used. Spectrophotometers are equipped with several optical filters, and can measure at different wavelengths. If the chromogen has changed color, then the ray of light from the spectrophotometer when passing through the hole is absorbed by the chromogen, and if the chromogen has not changed as a result of the reaction, then the ray is not absorbed by the solution. The device compares the intensity of the supplied light beam with the light beam passing through the hole. If there is a lot of absorption, then the result is positive. If it’s not enough, then it’s negative. Statistically select the "critical value" of the optical density at which the result is considered positive.
Измерение интенсивности хемилюминесценции производится приборами - люминометрами, способными регистрировать интенсивность излучения света в лунках планшета. В основе работы люминометра лежит фотоэлектронные умножители на основе, например, полупроводниковых фотодиодов или CCD-матриц. Прибор измеряет интенсивность поданного света, идущего из лунок планшета в результате реакций, катализируемых ферментом на поверхности иммуносорбента, и сравнивает данные с контрольным значением. Если интенсивность излучения высокая - то результат положительный, если низкая - то отрицательный. Статистически выбирают "критическое значение" интенсивности излучения, при котором результат считается положительным.The measurement of the intensity of chemiluminescence is performed by devices - luminometers capable of recording the intensity of light emission in the wells of the tablet. The luminometer is based on photoelectronic multipliers based on, for example, semiconductor photodiodes or CCD matrices. The device measures the intensity of the applied light coming from the wells of the tablet as a result of reactions catalyzed by the enzyme on the surface of the immunosorbent, and compares the data with the control value. If the radiation intensity is high, then the result is positive, if low, then negative. Statistically select the "critical value" of the radiation intensity at which the result is considered positive.
Иммобилизация белков на поверхности твердой фазы может быть осуществлена, например, химически с образованием ковалентных связей между амино- карбокси- или сульфгидрильной группой белка и материалом поверхности, например с образованием пептидной связи между карбокси-группой белка и аминогруппой поверхности. Иммобилизация белков может производиться пассивно, например, за счет гидрофобных и/или ионных взаимодействий материала твердой фазы с иммобилизуемым белком. Также, для иммобилизации могут быть использованы другие вспомогательные белки, обладающие афинностью к иммобилизуемым белкам, например протеин А, протеин G или антивидовые иммуноглобулины могут быть использованы как промежуточные соединения для иммобилизации иммуноглобулинов, специфичных, например, к антигену р24 ВИЧ или HBsAg гепатита В.Immobilization of proteins on the surface of the solid phase can be carried out, for example, chemically with the formation of covalent bonds between the amino carboxy or sulfhydryl group of the protein and the surface material, for example, with the formation of a peptide bond between the carboxy group of the protein and the amino group of the surface. Protein immobilization can be carried out passively, for example, due to hydrophobic and / or ionic interactions of the solid phase material with the immobilized protein. Also, other auxiliary proteins having affinity for immobilized proteins can be used for immobilization, for example Protein A, Protein G or antispecies immunoglobulins can be used as intermediates for immobilizing immunoglobulins specific for, for example, hepatitis B HIV or HBsAg p24 antigen.
Твердой фазой для проведения анализа может являться любая полимерная, минеральная или композитная подложка, например полистирольный иммунологический планшет, а так же полимерные, композитные или силикатные микросферы, в том числе микросферы с суперпарамагнитными свойствами.The solid phase for the analysis can be any polymer, mineral or composite substrate, for example a polystyrene immunological tablet, as well as polymer, composite or silicate microspheres, including microspheres with superparamagnetic properties.
Для диагностики гепатита В на твердой фазе иммобилизуют иммуноглобулины, специфичные к антигену HBsAg названного гепатита В и/или белки, несущие антигенные детерминанты вируса гепатита В, как минимум входящие в состав его белковых структур: HBcoreAg и/или HBeAg.For the diagnosis of hepatitis B in the solid phase, immunoglobulins specific for the HBsAg antigen of the named hepatitis B and / or proteins carrying the antigenic determinants of the hepatitis B virus, which are at least part of its protein structures: HBcoreAg and / or HBeAg, are immobilized.
Для диагностики гепатита С на твердой фазе иммобилизуют иммуноглобулины, специфичные к антигену Core названного гепатита С и/или белки, несущие антигенные детерминанты названного вируса гепатита С, как минимум входящие в состав его белковых структур: Core и/или NS3 и/или NS4 и/или NS5.For the diagnosis of hepatitis C in the solid phase, immunoglobulins specific for the Core antigen of hepatitis C and / or proteins that carry the antigenic determinants of the hepatitis C virus, which are at least part of its protein structures: Core and / or NS3 and / or NS4 and / are immobilized. or NS5.
Для диагностики ВИЧ-инфекции на твердой фазе иммобилизуют иммуноглобулины, специфичные к антигену нуклеокапсида р24 названного вируса иммунодефицита человека и/или белки, несущие антигенные детерминанты вируса иммунодефицита человека 1-го типа, по крайней мере, входящие в состав его белковых структур: gp41.To diagnose HIV infection in the solid phase, immunoglobulins specific for the p24 nucleocapsid antigen of the named human immunodeficiency virus and / or proteins that carry the antigenic determinants of the human immunodeficiency virus type 1 at least that are part of its protein structures are immobilized: gp41.
Для диагностики ВИЧ-инфекции 2-го типа на поверхности микрочастиц иммобилизуют белки, несущие антигенные детерминанты вируса иммунодефицита человека 2-го типа, по крайней мере, входящие в состав его белковой структуры gp36.For the diagnosis of type 2 HIV infection, proteins carrying the antigenic determinants of type 2 human immunodeficiency virus are immobilized on the surface of the microparticles, at least as part of its gp36 protein structure.
Для диагностики сифилиса на поверхности микрочастиц иммобилизуют белки, несущие антигенные детерминанты бактерии Treponema Pallidum, по крайней мере, входящие в состав ее белковых структур р17 и/или р47.For the diagnosis of syphilis on the surface of microparticles, proteins that carry antigenic determinants of the Treponema Pallidum bacterium are immobilized, at least that are part of its protein structures p17 and / or p47.
Перечисленные выше белки могут быть иммобилизованы на поверхность твердой фазы в любых сочетаниях.The proteins listed above can be immobilized on the surface of the solid phase in any combination.
Композиция названных белков на твердой фазе не ограничена по числу выявляемых маркеров инфекционных заболеваний человека, однако должна включать и обеспечивать выявление маркеров инфекционного процесса по, как минимум, любым из двух следующих инфекций одновременно: ВИЧ, гепатит В, гепатит С, сифилис.The composition of these proteins in the solid phase is not limited by the number of identifiable markers of human infectious diseases, but should include and ensure the identification of markers of the infectious process by at least any of the following two infections simultaneously: HIV, hepatitis B, hepatitis C, syphilis.
Иммуносорбент с иммобилизованными на твердой фазе названными белками инкубируют в контакте с исследуемым образцом сыворотки или плазмы крови человека.An immunosorbent with the immobilized solid phase named proteins is incubated in contact with a test sample of human serum or plasma.
Целесообразно проводит инкубацию образца и твердой фазы при температуре от 18 до 44 градусов Цельсия в течение не менее 15 минут.It is advisable to incubate the sample and solid phase at a temperature of from 18 to 44 degrees Celsius for at least 15 minutes.
Целесообразно сыворотку или плазму исследуемой крови разбавлять в рабочей смеси во время анализа с коэффициентом разбавления от 1 до 100.It is advisable to dilute the serum or plasma of the test blood in the working mixture during analysis with a dilution factor of 1 to 100.
Для сокращения времени инкубирования, целесообразно рабочую смесь во время инкубирования постоянно перемешивать.To reduce incubation time, it is advisable to constantly mix the working mixture during incubation.
Во время инкубации, присутствующие в исследуемом образце специфические иммуноглобулины связываются с соответствующими им антигенами, иммобилизованными на поверхности твердой фазы иммуносорбента с образованием иммунных комплексов. Аналогично, свободные антигены инфекционных агентов, при их наличии в исследуемом образце, также могут связаться с соответствующими специфическими иммуноглобулинами, иммобилизованными на поверхности твердой фазы иммуносорбента с образованием иммунных комплексов. В случае, если специфические иммуноглобулины и антигены инфекционных агентов в образце отсутствуют, то иммунные комплексы не образуются. Связавшиеся с поверхностью иммуносорбента аналиты образуют соответствующие иммунные комплексы типа антиген-иммуноглобулин или иммуноглобулин-антиген.During incubation, specific immunoglobulins present in the test sample bind to their corresponding antigens, immobilized on the surface of the solid phase of the immunosorbent with the formation of immune complexes. Similarly, free antigens of infectious agents, if present in the test sample, can also bind to the corresponding specific immunoglobulins immobilized on the surface of the solid phase of the immunosorbent to form immune complexes. If specific immunoglobulins and antigens of infectious agents are absent in the sample, then immune complexes are not formed. The analytes bound to the surface of the immunosorbent form the corresponding immune complexes such as antigen-immunoglobulin or immunoglobulin-antigen.
Целесообразно разделить процедуру анализа на от 2 до 4 стадий инкубации с промежуточными промывками твердой фазы от несвязавшихся компонентов исследуемого образца и коньюгатов.It is advisable to divide the analysis procedure into from 2 to 4 stages of incubation with intermediate washes of the solid phase from unbound components of the test sample and conjugates.
Для выявления связавшихся с твердой фазой иммунных комплексов, целесообразно использовать биотинилированные иммуноглобулины против антигена нуклеокапсида р24 ВИЧ; и/или биотинилированные иммуноглобулины против антигена HBsAg гепатита B; и/или биотинилированные белки, несущие антигенные детерминанты вируса гепатита B, по крайней мере входящие в состав его белковых структур HBcoreAg и/или HBeAg; и/или биотинилированные белки, несущие антигенные детерминанты вируса иммунодефицита человека 1-го типа, по крайней мере, входящие в состав его белковой структуры gp41; и/или биотинилированные белки, несущие антигенные детерминанты вируса иммунодефицита человека 2-го типа, по крайней мере, входящие в состав его белковой структуры gp36; и/или биотинилированные белки, несущие антигенные детерминанты бактерии Treponema Pallidum, по крайней мере, входящие в состав ее белковых структур р17 и/или р47; и/или биотинилированные иммуноглобулины, специфичные к антигену нуклеокапсида Core названного гепатита С; и/или биотинилированные белки, несущие антигенные детерминанты названного вируса гепатита С, по крайней мере, входящие в состав его белковых структур Core и/или NS3 и/или NS4 и/или NS5.To identify solid-phase bound immune complexes, it is advisable to use biotinylated immunoglobulins against HIV nucleocapsid p24 antigen; and / or biotinylated immunoglobulins against hepatitis B HBsAg antigen; and / or biotinylated proteins that carry the antigenic determinants of hepatitis B virus, at least part of its protein structures HBcoreAg and / or HBeAg; and / or biotinylated proteins that carry antigenic determinants of type 1 human immunodeficiency virus, at least as part of its gp41 protein structure; and / or biotinylated proteins that carry the antigenic determinants of type 2 human immunodeficiency virus, at least as part of its gp36 protein structure; and / or biotinylated proteins that carry the antigenic determinants of the Treponema Pallidum bacterium, at least as part of its protein structures p17 and / or p47; and / or biotinylated immunoglobulins specific for a core hepatitis C nucleocapsid antigen; and / or biotinylated proteins that carry antigenic determinants of the hepatitis C virus, at least included in its protein structures Core and / or NS3 and / or NS4 and / or NS5.
Во время инкубации твердой фазы, образца и коньюгатов, на твердой фазе иммуносорбента названные биотинилированные белки образуют иммунные комплексы типа «антиген - атитело - биотинилированный антиген» и/или «иммуноглобулин - антиген - биотинилированный иммуноглобулин».During the incubation of the solid phase, sample and conjugates, on the solid phase of the immunosorbent, these biotinylated proteins form immune complexes of the type "antigen - antibody - biotinylated antigen" and / or "immunoglobulin - antigen - biotinylated immunoglobulin".
Для выявления связанных с твердой фазой биотинилированных иммуноглобулинов и/или антигенов целесообразно использовать коньюгат белка авидина или стрептавидина с ферментативной меткой, например пероксидазой хрена или щелочной фосфатазой.To identify biotinylated immunoglobulins and / or antigens associated with the solid phase, it is advisable to use an avidin or streptavidin protein conjugate with an enzymatic label, such as horseradish peroxidase or alkaline phosphatase.
Названные биотинилированные иммуноглобулины или антигены могут быть заменены на соответствующие прямые коньюгаты этих иммуноглобулинов или антигенов с пероксидазой хрена или щелочной фосфатазой, например, коньюгат пероксидазы хрена с белками, несущими антигенные детерминанты бактерии Treponema Pallidum, входящие в состав ее белковых структур р17 и/или р47, или, например, коньюгат пероксидазы хрена с белками несущими антигенные детерминанты вируса иммунодефицита человека 1-го и 2-го типа, входящими в состав его белковых структур gp41 и gp36.The aforementioned biotinylated immunoglobulins or antigens can be replaced by the corresponding direct conjugates of these immunoglobulins or antigens with horseradish peroxidase or alkaline phosphatase, for example, horseradish peroxidase conjugate with proteins that contain antigenic determinants of the Treponema Pallidum bacterium that are contained in p or, for example, a horseradish peroxidase conjugate with proteins bearing the antigenic determinants of type 1 and type 2 human immunodeficiency virus, which are part of its protein structures gp41 and gp36.
Комбинации и наименования используемых антигенов и/или иммуноглобулинов на твердой фазе или в составе коньюгатов могут быть дополнены и другими антигенными детерминантами ифекционных агентов и/или специфическими к их антигенам иммуноглобулинами, не являющихся основными и достаточными для диагностики на основании общепринятой мировой практики производства, например в композицию на твердой фазе могут быть введены белки, несущие антигенные детерминанты вируса иммунодефицита человека 1-го типа, входящие в состав его белковой структуры gp120, и/или белки, несущие антигенные детерминанты бактерии Treponema Pallidum, входящие в состав ее белковых структуры tmpA.The combinations and names of the used antigens and / or immunoglobulins on the solid phase or as part of conjugates can be supplemented with other antigenic determinants of infectious agents and / or immunoglobulins specific to their antigens that are not basic and sufficient for diagnosis based on generally accepted world production practice, for example, the composition on the solid phase can be introduced proteins that carry antigenic determinants of the human immunodeficiency virus type 1, which are part of its protein structure gp120, and / or proteins that carry the antigenic determinants of the Treponema Pallidum bacterium, which are part of its protein structure tmpA.
Введение в композицию твердой фазы или коньюгатов других белков, дополняющих спектр определяемых маркеров, расширение спектра исследуемых инфекционных заболеваний в анализе, а также изменения в процедуре анализа не изменяют суть настоящего изобретения.The introduction into the composition of the solid phase or conjugates of other proteins that complement the spectrum of detectable markers, the expansion of the spectrum of the investigated infectious diseases in the analysis, as well as changes in the analysis procedure do not change the essence of the present invention.
Наличие содержания любого из названных маркеров инфекционных заболеваний определяется по наличию и интенсивности ферментативной активности, связанной с твердой фазой в составе иммунных комплексов по окончанию всех инкубации и финальной отмывки твердой фазы.The presence of the content of any of the indicated markers of infectious diseases is determined by the presence and intensity of enzymatic activity associated with the solid phase in the immune complexes at the end of all incubation and final washing of the solid phase.
Ферментативная активность пероксидазы и/или щелочной фосфатазы определяется либо калориметрическими методами по изменению оптической плотности раствора хромогена, например 3,3',5,5'-тетраметилбензидина, или при помощи измерения хемилюминесценции таких соединений как, например люминол или его аналогов.The enzymatic activity of peroxidase and / or alkaline phosphatase is determined either by calorimetric methods by changing the optical density of a chromogen solution, for example, 3.3 ', 5.5'-tetramethylbenzidine, or by measuring the chemiluminescence of compounds such as, for example, luminol or its analogues.
Интенсивность нарастания оптической плотности раствора хромогена или интенсивность хемилюминесценции напрямую связана с концентрацией специфических аналитов-маркеров инфекционных процессов в исследуемом образце.The intensity of the increase in the optical density of a chromogen solution or the intensity of chemiluminescence is directly related to the concentration of specific analyte markers of infectious processes in the test sample.
Положительный результат такого анализа не дискриминирован, т.е. положительный результат говорит о том, что исследуемый образец является положительным, то есть содержит, по крайней мере, один из исследуемых маркеров названных инфекционных заболеваний. Для подтверждения и дискриминации положительного результата могут потребоваться дополнительные исследования образца. Но, например, для принятия решения о донорстве крови, результат этого теста является достаточным.The positive result of such an analysis is not discriminated, i.e. a positive result indicates that the test sample is positive, that is, it contains at least one of the studied markers of these infectious diseases. Confirmation and discrimination of a positive result may require additional sample testing. But, for example, to make a decision about blood donation, the result of this test is sufficient.
Отрицательные результаты такого анализа могут говорить об отсутствии детектируемых количеств любого из исследуемых маркеров названных инфекционных заболеваний.Negative results of such an analysis may indicate the absence of detectable amounts of any of the studied markers of these infectious diseases.
Таким образом, предлагаемое изобретение позволяет одновременно выполнять комплексную скрининговую диагностику различных инфекционных заболеваний человека, например, гепатита В, гепатита С, ВИЧ-инфекции, сифилиса, но не ограничено только ими. Способ позволяет кратно сократить стоимость, время и трудозатраты на проведение анализов. Способ может быть полностью автоматизирован.Thus, the present invention allows simultaneous screening diagnostics of various human infectious diseases, for example, hepatitis B, hepatitis C, HIV infection, syphilis, but is not limited to them. The method allows to reduce the cost, time and labor costs for the analysis. The method can be fully automated.
ПримерExample
Комплексная серологическая диагностика ВИЧ инфекции, гепатита В и сифилиса путем твердофазного иммуноферментного анализа.Comprehensive serological diagnosis of HIV infection, hepatitis B and syphilis by means of enzyme-linked immunosorbent assay.
Стадия 1. Подготовка твердой фазы иммуносорбента.Stage 1. Preparation of the solid phase of the immunosorbent.
Растворяют в 50 мМ карбонатном буфере в деионизованной воде, pH 10, следующие белки: иммуноглобулины класса IgG против антигена р24 ВИЧ в концентрации 2 мкг/мл, иммуноглобулины класса IgG против антигена HBsAg в концентрации 3 мкг/мл, рекомбинантный белок массой 40 кДа, содержащий антигенные детерминанты белка gp41 ВИЧ 1-го типа в концентрации 1 мкг/мл, рекомбинантный антиген молекулярной массой 30 кДа, содержащий антигенные детерминанты белка gp36 ВИЧ 2-го типа в концентрации 0,5 мкг/мл, рекомбинантный антиген, содержащий антигенные детерминанты белка р17 и р47 бактерии Treponema Pallidum в концинтрациях 1 мкг/мл каждый. Концентрации белков могут быть изменены в зависимости от типа и качества сырья, молекулярной массы белков, или изменения требований к анализу. Перемешивают полученный раствор белков и внесят в лунки стандартного полистирольного 96-луночного планшета в количестве 200 мкл раствора в каждую лунку. Инкубируют планшет при температуре 15-28°С в течение 16 часов. По окончании инкубации раствор удаляют и заполняют лунки раствором 0,1% казеината натрия и 1% сахарозы в деионизованной воде в количестве 200 мкл в каждую лунку. Инкубируют планшет 2 часа, после чего жидкость из лунок тщательно удаляют, планшет высушивают на столе.Dissolve in 50 mM carbonate buffer in deionized water, pH 10, the following proteins: immunoglobulins of the IgG class against the HIV p24 antigen at a concentration of 2 μg / ml, IgG class immunoglobulins against the HBsAg antigen at a concentration of 3 μg / ml, recombinant protein weighing 40 kDa, containing HIV type 1 gp41 antigenic determinants at a concentration of 1 μg / ml, recombinant antigen with a molecular weight of 30 kDa, containing HIV type 2 gp36 antigenic determinants at a concentration of 0.5 μg / ml, recombinant antigen containing p17 protein antigenic determinants and p47 Bacteria Treponema Pallidum at a concentration of 1 μg / ml each. Protein concentrations can be changed depending on the type and quality of the raw materials, the molecular weight of the proteins, or changes in the analysis requirements. Stir the resulting protein solution and add 200 μl of the solution to each well in the wells of a standard polystyrene 96-well plate. Incubate the tablet at a temperature of 15-28 ° C for 16 hours. At the end of the incubation, the solution is removed and the wells are filled with a solution of 0.1% sodium caseinate and 1% sucrose in deionized water in an amount of 200 μl per well. The plate is incubated for 2 hours, after which the liquid from the wells is carefully removed, the tablet is dried on a table.
Стадия 2. Подготовка рабочих растворов.Stage 2. Preparation of working solutions.
Готовят раствор для разведения коньюгатов №1, для этого в деионизованной воде растворяют 100 мМ трис-гидроксиметил-аминометан, 100 мМ NaCL, 1% TritonX100, 1,5 М мочевину, 30 мМ EDTA,Prepare a solution for diluting conjugates No. 1, for this, 100 mM Tris-hydroxymethyl-aminomethane, 100 mM NaCL, 1% TritonX100, 1.5 M urea, 30 mM EDTA are dissolved in deionized water
Готовят рабочий раствор коньюгатов №1, для этого в раствор для разведения коньюгатов №1 вносят коньюгаты: биотинилированные иммуноглобулины против антигена нуклеокапсида р24 ВИЧ в концентрации 0,1 мкг/мл; биотинилированные иммуноглобулины против антигена HBsAg гепатита В в концентрации 0,1 мкг/мл; биотинилированный белок с молекулярной массой 40 кДа, несущий антигенные детерминанты вируса иммунодефицита человека 1-го типа, входящие в состав его белковой структуры gp41 в концентрации 0,05 мкг/мл; биотинилированный белок молекулярной массой 4 кДа, несущий антигенные детерминанты вируса иммунодефицита человека 2-го типа, входящие в состав его белковой структуры gp36 в концентрации 0,01 мкг/мл. Концентрации коньюгатов белков с биотином могут быть изменены в широком диапазоне значений в зависимости от молекулярной массы белков и качества сырья.A working solution of conjugates No. 1 is prepared; for this, conjugates are introduced into the solution for diluting conjugates No. 1: biotinylated immunoglobulins against HIV nucleocapsid p24 antigen at a concentration of 0.1 μg / ml; biotinylated immunoglobulins against hepatitis B HBsAg antigen at a concentration of 0.1 μg / ml; a biotinylated protein with a molecular weight of 40 kDa that carries the antigenic determinants of the human immunodeficiency virus type 1, which are part of its protein structure gp41 at a concentration of 0.05 μg / ml; biotinylated protein with a molecular weight of 4 kDa that carries the antigenic determinants of human immunodeficiency virus type 2, which are part of its protein structure gp36 at a concentration of 0.01 μg / ml. Concentrations of protein conjugates with biotin can be changed over a wide range of values depending on the molecular weight of the proteins and the quality of the feed.
Готовят раствор для разведения коньюгатов №2, для этого растворяют в деионизованной воде 100 мМ трис-гидроксиметил-аминометан, 100 мМ NaCL, 0,1% TritonX100, 0,25% казеината натрия, довести pH раствора до 8.0 при помощи концентрированной соляной кислоты.A solution for diluting conjugates No. 2 was prepared; for this, 100 mM Tris-hydroxymethyl-aminomethane, 100 mM NaCL, 0.1% TritonX100, 0.25% sodium caseinate were dissolved in deionized water, adjusted to pH 8.0 with concentrated hydrochloric acid.
Готовят рабочий раствор для разведения коньюгатов №2, для чего в раствор для разведения коньюгатов №2 вносят коньюгаты: коньюгат рекомбинантных белков, несущих антигенные детерминанты бактерии Treponema Pallidum, входящие в состав ее белковых структур р17 и/или р47, с пероксидазой хрена в концентрации 5 мкг/мл; коньюгат пероксидазы хрена со стрептавидином в концентрации 0,5 мкг мл/мл.A working solution is prepared for diluting conjugates No. 2, for which conjugates are added to a solution for diluting conjugates No. 2: a conjugate of recombinant proteins carrying antigenic determinants of the Treponema Pallidum bacterium, which are part of its protein structures p17 and / or p47, with horseradish peroxidase at a concentration of 5 μg / ml; horseradish peroxidase conjugate with streptavidin at a concentration of 0.5 μg ml / ml.
Готовят промывочный раствор, для чего в деионизованной воде растворить 10 мМ фосфат натрия однозамещенный, 150 мМ NaCl, 0,05% Твин 20, доводят pH раствора до 7,0-7,5.A wash solution is prepared, for which 10 mM monosubstituted sodium phosphate, 150 mM NaCl, 0.05% Tween 20 are dissolved in deionized water, the pH of the solution is adjusted to 7.0-7.5.
Готовят раствор субстрата, для чего в 50 мМ фосфат-цитратном буфере, pH 5.0-6.0 растворяют гидроперит до 0,2(±0,1) грамм на литр.A substrate solution is prepared, for which hydroperite is dissolved in 50 mM phosphate-citrate buffer, pH 5.0-6.0 to 0.2 (± 0.1) grams per liter.
Готовят раствор концентрата хромогена, для чего растворяют 0,5 грамма 3,3',5,5'-тетраметилбензидина в 100 мл диметилсульфоксиде.A solution of a chromogen concentrate is prepared, for which 0.5 grams of 3.3 ', 5.5'-tetramethylbenzidine are dissolved in 100 ml of dimethyl sulfoxide.
Готовят рабочий раствор хромогена, для чего вносят 400 мкл раствора концентрата хромогена в 12 мл раствора субстрата.A working chromogen solution is prepared, for which 400 μl of a chromogen concentrate solution in 12 ml of a substrate solution is added.
Готовят стоп реагент, для чего растворяют 50 мл концентрированной серной кислоты в одном литре деионизованной воды.A stop reagent is prepared, for which 50 ml of concentrated sulfuric acid is dissolved in one liter of deionized water.
Стадия 3. Проведение анализа.Stage 3. The analysis.
В лунки планшета вносят по 150 мкл исследуемых сывороток или плазмы крови человека, а так же положительные и отрицательные контрольные образцы: в лунку А1 вносят образец сыворотки крови человека, содержащий антитела к антигенам ВИЧ 1-го типа; в лунку В1 вносят образец сыворотки крови человека, содержащий антитела к антигенам ВИЧ 2-го типа, в лунку С1 вносят образец сыворотки крови человека; содержащий антитела к антигенам Treponema Pallidum, в лунку D1 вносят образец сыворотки крови человека, содержащий свободный антиген р24 ВИЧ в концентрации 20 пикограмм в миллилитре; в лунку Е1 вносят образец сыворотки крови человека, содержащий свободный антиген HBsAg гепатита В в концентрации 100 пикограмм в миллилитре; в лунку F1 вносят образец сыворотки крови человека, одновременно содержащий свободный антиген р24 ВИЧ в концентрации 20 пикограмм в миллилитре и антиген HBsAg гепатита В в концентрации 100 пикограмм в миллилитре; в лунку G1 вносят образец сыворотки крови человека, одновременно содержащий антитела к антигенам ВИЧ 1-го типа и антитела к антигенам Treponema Pallidum; в лунку HI вносят образец, содержащий одновременно свободный антиген р24 ВИЧ в концентрации 20 пикограмм в миллилитре, антиген HBsAg гепатита В в концентрации 100 пикограмм в миллилитре, антитела к антигенам ВИЧ 1-го типа и антитела к антигенам Treponema Pallidum; в лунки с А2 по Н3 вносят исследуемые неизвестные образцы (образец №1-16); в лунки с А4 по С4 вносят контрольный отрицательный образец; в лунки с D4 до H12 вносят образцы здоровых доноров.150 μl of the tested human serum or plasma are added to the wells of the tablet, as well as positive and negative control samples: a human blood serum sample containing antibodies to type 1 HIV antigens is introduced into well A1; a human blood serum sample containing antibodies to type 2 HIV antigens is introduced into well B1, a human blood serum is introduced into well C1; containing antibodies to Treponema Pallidum antigens, a human blood serum sample containing free HIV p24 antigen at a concentration of 20 picograms per milliliter is added to well D1; a human serum sample containing free hepatitis B HBsAg antigen at a concentration of 100 picograms per milliliter is added to well E1; a human blood serum sample was added to well F1, simultaneously containing free HIV p24 antigen at a concentration of 20 picograms per milliliter and hepatitis B antigen HBsAg at a concentration of 100 picograms per milliliter; a human serum sample is added to well G1, simultaneously containing antibodies to type 1 HIV antigens and antibodies to Treponema Pallidum antigens; a sample containing simultaneously free HIV p24 antigen at a concentration of 20 picograms per milliliter, hepatitis B HBsAg antigen at a concentration of 100 picograms per milliliter, antibodies to type 1 HIV antigens and antibodies to Treponema Pallidum antigens are added to the HI well; tested unknown samples are added to wells A2 through H3 (sample No. 1-16); a negative control sample was added to wells A4 through C4; Samples of healthy donors are added to wells from D4 to H12.
Схема постановки приведена ниже:The layout is shown below:
Готовят рабочий раствор коньюгатов №1 и вносят его по 50 мкл в каждую лунку планшета. Помещают планшет в термошейкер с частотой вращения 500-800 оборотов в минуту при температуре 37°С. Инкубируют планшет 60 минут. Удаляют содержимое лунок планшета, промывают лунки планшета от несвязавшихся с твердой фазой реагентов промывочным раствором не менее 5 раз, полностью наполняя и опорожняя лунки планшета. По завершению промывки, вносят в лунки планшета по 200 мкл свежеприготовленного рабочего раствора коньюгатов №2. Помещают планшет в термошейкер с частотой вращения 500-800 оборотов в минуту при температуре 37°С. Инкубируют планшет 20 минут. Удаляют содержимое лунок планшета, промывают лунки планшета от несвязавшихся с твердой фазой реагентов промывочным раствором не менее 5 раз, полностью наполняя и опорожняя лунки планшета. Вносят в лунки планшета свежеприготовленный рабочий раствор хромогена. Инкубируют планшет 15 минут при температуре +37°С в термостате. Вносят в лунки планшета по 50 мкл стоп реагента. Измеряют оптическую плотность раствора в лунках планшета на автоматическом планшетном спектрофотометре, на длине волны 450 нм с референс-фильтром на 620 нм, калибровку нуля осуществляют по воздуху. Анализируют результаты.Prepare a working solution of conjugates No. 1 and add it to 50 μl in each well of the tablet. Place the tablet in a thermal shaker with a rotation speed of 500-800 rpm at a temperature of 37 ° C. Incubate the tablet for 60 minutes. The contents of the plate wells are removed, the plate wells are washed from reagents that are not bound to the solid phase by the washing solution at least 5 times, completely filling and emptying the plate wells. Upon completion of the washing, 200 μl of freshly prepared working solution of conjugates No. 2 are introduced into the wells of the plate. Place the tablet in a thermal shaker with a rotation speed of 500-800 rpm at a temperature of 37 ° C. Incubate the tablet for 20 minutes. The contents of the plate wells are removed, the plate wells are washed from reagents that are not bound to the solid phase by the washing solution at least 5 times, completely filling and emptying the plate wells. Freshly prepared chromogen working solution is added to the wells of the plate. Incubate the tablet for 15 minutes at a temperature of + 37 ° C in a thermostat. Add 50 μl stop reagent to the wells. Measure the optical density of the solution in the wells of the tablet on an automatic tablet spectrophotometer, at a wavelength of 450 nm with a reference filter at 620 nm, zero calibration is carried out by air. Analyze the results.
Стадия 4. Представление и анализ результатов.Stage 4. Presentation and analysis of the results.
Результаты анализа представлены в виде следующей таблицы в соответствии со схемой внесения исследуемых образцов, данные приведены в виде оптической плотности:The results of the analysis are presented in the form of the following table in accordance with the scheme of making the test samples, the data are presented in the form of optical density:
Для интерпретации результатов определяют критическое значение оптической плотности ОП критическая, которая равна среднему значению оптической плотности отрицательного контрольного образца, увеличенному на величину К, по формуле:To interpret the results, the critical value of the optical density of the OD is determined critical, which is equal to the average optical density of the negative control sample, increased by K, according to the formula:
ОП крит.=(ОПК-ср.)+(К),OD crit. = (OPK-cf.) + (K),
где (ОПК-ср.) - среднее значение оптической плотности отрицательного контрольного образца по трем (двум) лункам, (К) - статистически установленная величина, зависящая от характеристик метода и требований к специфичности анализа. Исследуемый образец расценивается как положительный, т.е. содержащий по крайней мере антитела к ВИЧ-1, и/или к ВИЧ-2, и/или антиген р24 ВИЧ-1, и/или антиген HBsAg вируса гепатита В, и/или антитела к антигенам Treponema Pallidum, если ОП образца больше или равна ОПкрит. Исследуемую сыворотку расценивают как отрицательную, т.е. не содержащую названных маркеров инфекционных заболеваний, если ОП сыворотки ниже ОПкрит. Отрицательные результаты анализа не гарантируют отсутствие инфекционного процесса, а лишь указывают на отсутствие достаточных для выявления настоящим методом количеств маркеров инфекционных заболеваний в образце.where (CPK-cf.) is the average optical density of the negative control sample over three (two) wells, (K) is the statistically determined value, depending on the characteristics of the method and the requirements for the specificity of the analysis. The test sample is regarded as positive, i.e. containing at least antibodies to HIV-1 and / or HIV-2, and / or HIV-1 p24 antigen, and / or hepatitis B virus HBsAg antigen, and / or antibodies to Treponema Pallidum antigens, if the OD of the sample is greater than or equal to Opcrit. The test serum is regarded as negative, i.e. not containing the indicated markers of infectious diseases if the serum OD is lower than OPcrit. Negative results of the analysis do not guarantee the absence of an infectious process, but only indicate the absence of sufficient quantities of markers of infectious diseases in the sample to detect this method.
Например, если положить К, равным 0,1 оптических единиц, тогда ОПкрит = 0,15 оптических единиц. Таким образом, все контрольные образцы, с заведомо известным содержанием маркеров инфекционных заболеваний определены как положительные, при этом, из результатов видно, что в образцах, содержащих несколько инфекционных маркеров, сигнал по каждому из маркеров суммируется. Исследуемые неизвестные образцы №5, 6, 13, 14 и 15, содержат как минимум один из маркеров ВИЧ инфекции и/или гепатита В и/или сифилиса или комбинацию из любых двух. Образцы №1-4, 7-12 и 16 определены как отрицательные. Специфичность анализа определяется как процент ложноположительных результатов, получаемых при помощи метода на заведомо отрицательных образцах. В настоящем примере, все отрицательные образцы здоровых доноров определены как отрицательные, таким образом, специфичность метода можно принять за 100%, однако более точные значения этого параметра требуют изучения большего количества отрицательных образцов и статистической обработки данных.For example, if we put K equal to 0.1 optical units, then OPcrit = 0.15 optical units. Thus, all control samples with a known content of markers of infectious diseases were identified as positive, and it can be seen from the results that in samples containing several infectious markers, the signal for each marker is summed. Test unknown samples No. 5, 6, 13, 14 and 15, contain at least one of the markers of HIV infection and / or hepatitis B and / or syphilis, or a combination of any two. Samples No. 1-4, 7-12 and 16 are defined as negative. The specificity of the analysis is defined as the percentage of false-positive results obtained using the method on obviously negative samples. In the present example, all negative samples of healthy donors are defined as negative, so the specificity of the method can be taken as 100%, however, more accurate values of this parameter require the study of more negative samples and statistical processing of data.
Для выяснения того, какой маркер, или сочетание маркеров инфекционных заболеваний послужило причиной положительного результата образцов №5, 6, 13, 14 и 15, необходимо проводить отдельный анализ по каждому из маркеров, например тест на антитела к антигенам ВИЧ, или тест на антиген HBsAg гепатита В, или тест на антитела к антигенам Treponema Pallidum.To find out which marker or combination of markers of infectious diseases caused the positive result of samples No. 5, 6, 13, 14 and 15, it is necessary to conduct a separate analysis for each of the markers, for example, a test for antibodies to HIV antigens, or a test for HBsAg antigen hepatitis B, or a test for antibodies to Treponema Pallidum antigens.
Claims (12)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2012101392/15A RU2488832C1 (en) | 2012-01-13 | 2012-01-13 | Complex diagnostic technique for infectious diseases by enzyme-linked immunosorbent assay |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2012101392/15A RU2488832C1 (en) | 2012-01-13 | 2012-01-13 | Complex diagnostic technique for infectious diseases by enzyme-linked immunosorbent assay |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2488832C1 true RU2488832C1 (en) | 2013-07-27 |
Family
ID=49155733
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2012101392/15A RU2488832C1 (en) | 2012-01-13 | 2012-01-13 | Complex diagnostic technique for infectious diseases by enzyme-linked immunosorbent assay |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2488832C1 (en) |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1327885A1 (en) * | 2001-08-17 | 2003-07-16 | Shanghai Health Digit Limited | A kit for the simultaneous diagnosis of a plurality of infectious diseases and a method for preparation of it |
| US20040072267A1 (en) * | 2002-05-10 | 2004-04-15 | Francois Rieunier | Method for simultaneously detecting an antigen of, and and antibody against, an infectious microorganism |
| US20060014145A1 (en) * | 2002-04-26 | 2006-01-19 | Miller Brian S | Methods and articles for high throughput analysis of biomolecular interactions |
| US20060263837A1 (en) * | 2004-06-17 | 2006-11-23 | Liu George D | Immunoassay system and method for detection of antigens |
| RU2327170C2 (en) * | 2006-02-27 | 2008-06-20 | Закрытое акционерное общество "ДиТест" | Method of complex diagnostics of viral hepatitis type b, viral hepatitis type c, hiv and syphilis |
| US7723044B2 (en) * | 2004-04-15 | 2010-05-25 | Allied Biotech, Inc. | Methods and apparatus for detection of viral infection |
-
2012
- 2012-01-13 RU RU2012101392/15A patent/RU2488832C1/en active IP Right Revival
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1327885A1 (en) * | 2001-08-17 | 2003-07-16 | Shanghai Health Digit Limited | A kit for the simultaneous diagnosis of a plurality of infectious diseases and a method for preparation of it |
| US20060014145A1 (en) * | 2002-04-26 | 2006-01-19 | Miller Brian S | Methods and articles for high throughput analysis of biomolecular interactions |
| US20040072267A1 (en) * | 2002-05-10 | 2004-04-15 | Francois Rieunier | Method for simultaneously detecting an antigen of, and and antibody against, an infectious microorganism |
| US7723044B2 (en) * | 2004-04-15 | 2010-05-25 | Allied Biotech, Inc. | Methods and apparatus for detection of viral infection |
| US20060263837A1 (en) * | 2004-06-17 | 2006-11-23 | Liu George D | Immunoassay system and method for detection of antigens |
| RU2327170C2 (en) * | 2006-02-27 | 2008-06-20 | Закрытое акционерное общество "ДиТест" | Method of complex diagnostics of viral hepatitis type b, viral hepatitis type c, hiv and syphilis |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| ГИЛЯРОВ М.С. Биологический энциклопедический словарь, Советская энциклопедия, 1986. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US11255854B2 (en) | Signal amplification in lateral flow and related immunoassays | |
| CN109709317B (en) | Homogeneous phase immunoassay kit without matrix effect and analysis method and application thereof | |
| KR20000071894A (en) | Multipurpose diagnostic systems using protein chips | |
| JP4197393B2 (en) | Test method for IgA nephropathy | |
| WO2009084369A1 (en) | Reagent for detecting hiv-1 antigen and detection method | |
| CA2944708C (en) | Controls for implementing multiplex analysis methods | |
| RU2488832C1 (en) | Complex diagnostic technique for infectious diseases by enzyme-linked immunosorbent assay | |
| JP2000055918A (en) | Antibody assay device | |
| KR20100063089A (en) | Infectious disease testing of menstrual fluid, endometrial/menstrual cells, amniotic fluid, umbilical cord blood or other smaples | |
| US20020110842A1 (en) | Photochemical amplified immunoassay | |
| CA1339006C (en) | Self-contained multi-immunoassay diagnostic system | |
| JPH11507635A (en) | Peptides for detecting HIV | |
| KR20150111391A (en) | Immunochromatography Analysis Device | |
| RU2800607C1 (en) | Elisa test system for the detection of antibodies to blv in blood serum and milk of cattle | |
| CN112904018B (en) | Kit and method for detecting virus neutralizing antibody and application | |
| US20230358746A1 (en) | METHODS AND KITS FOR DETERMINING SEROSTATUS OF SARS-CoV-2 | |
| JPH07507634A (en) | Immunoassay method | |
| RU2712149C1 (en) | Kit for differentiated detection of blood serum markers at all stages of infectious disease by multiparametric dot-immunoassay | |
| Rocks et al. | Detection of antibodies to the human immunodeficiency virus by a rapid fluorescence-labelled immunosorbent assay | |
| CN117347624A (en) | Fluorescence quenching immunochromatography test strip and preparation method thereof | |
| Chauhan | Basic Principles of Enzyme Linked Immunosorbent Assay and Related Techniques | |
| Dewar et al. | Principles and Procedures of Human Immunodeficiency Virus Serodiagnosis | |
| JPH04258766A (en) | Simple immunity diagnostic method processing many objects |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20140114 |
|
| NF4A | Reinstatement of patent |
Effective date: 20141110 |
|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20170114 |
|
| NF4A | Reinstatement of patent |
Effective date: 20171016 |
|
| QB4A | Licence on use of patent |
Free format text: PLEDGE FORMERLY AGREED ON 20200121 Effective date: 20200121 |
|
| QB4A | Licence on use of patent |
Free format text: LICENCE FORMERLY AGREED ON 20200122 Effective date: 20200122 |
|
| PC41 | Official registration of the transfer of exclusive right |
Effective date: 20200429 |