RU2662654C2 - Микроорганизм для получения о-сукцинилгомосерина и способ получения о-сукцинилгомосерина с использованием указанного микроорганизма - Google Patents
Микроорганизм для получения о-сукцинилгомосерина и способ получения о-сукцинилгомосерина с использованием указанного микроорганизма Download PDFInfo
- Publication number
- RU2662654C2 RU2662654C2 RU2016116154A RU2016116154A RU2662654C2 RU 2662654 C2 RU2662654 C2 RU 2662654C2 RU 2016116154 A RU2016116154 A RU 2016116154A RU 2016116154 A RU2016116154 A RU 2016116154A RU 2662654 C2 RU2662654 C2 RU 2662654C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- microorganism
- homoserine
- gene
- succinyl
- strain
- Prior art date
Links
- GNISQJGXJIDKDJ-YFKPBYRVSA-N O-succinyl-L-homoserine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCOC(=O)CCC(O)=O GNISQJGXJIDKDJ-YFKPBYRVSA-N 0.000 title claims abstract description 48
- 244000005700 microbiome Species 0.000 title claims abstract description 46
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title abstract description 10
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims abstract description 33
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 claims abstract description 30
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 28
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 28
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 28
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 26
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 claims abstract description 26
- 108010016979 Homoserine O-succinyltransferase Proteins 0.000 claims abstract description 19
- 241000488157 Escherichia sp. Species 0.000 claims abstract description 12
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims abstract description 11
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims abstract description 4
- 101150060102 metA gene Proteins 0.000 claims description 24
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 16
- 101150072448 thrB gene Proteins 0.000 claims description 12
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 11
- 101150003180 metB gene Proteins 0.000 claims description 10
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 claims description 8
- 102000004357 Transferases Human genes 0.000 claims description 7
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 claims description 7
- 108010061618 O-succinylhomoserine (thiol)-lyase Proteins 0.000 claims description 6
- 102000004625 Aspartate Aminotransferases Human genes 0.000 claims description 4
- 108010003415 Aspartate Aminotransferases Proteins 0.000 claims description 4
- 108091000041 Phosphoenolpyruvate Carboxylase Proteins 0.000 claims description 4
- 102100033451 Thyroid hormone receptor beta Human genes 0.000 claims description 4
- 108010071598 homoserine kinase Proteins 0.000 claims description 4
- 108020004652 Aspartate-Semialdehyde Dehydrogenase Proteins 0.000 claims description 3
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 claims 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 claims 1
- 229940009098 aspartate Drugs 0.000 claims 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 40
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 38
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 33
- 101150115974 metX gene Proteins 0.000 description 30
- 229960004452 methionine Drugs 0.000 description 30
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 28
- 101150043924 metXA gene Proteins 0.000 description 26
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 24
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 24
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 24
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 24
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 24
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 19
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 19
- 101100116199 Streptomyces lavendulae dcsE gene Proteins 0.000 description 17
- 101150095438 metK gene Proteins 0.000 description 17
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 16
- 101150023641 ppc gene Proteins 0.000 description 16
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 14
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 14
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 13
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 13
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 13
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 12
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 12
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 12
- 101150005925 aspC gene Proteins 0.000 description 11
- UKAUYVFTDYCKQA-UHFFFAOYSA-N -2-Amino-4-hydroxybutanoic acid Natural products OC(=O)C(N)CCO UKAUYVFTDYCKQA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 9
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 9
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 9
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 9
- 101150086633 metAA gene Proteins 0.000 description 9
- 101150091110 metAS gene Proteins 0.000 description 9
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 9
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 8
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 8
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 8
- 101150107204 asd gene Proteins 0.000 description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 description 8
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 8
- 229960002898 threonine Drugs 0.000 description 8
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 7
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 7
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 7
- 238000012224 gene deletion Methods 0.000 description 7
- 241000588879 Chromobacterium violaceum Species 0.000 description 6
- 241000620209 Escherichia coli DH5[alpha] Species 0.000 description 6
- UKAUYVFTDYCKQA-VKHMYHEASA-N L-homoserine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCO UKAUYVFTDYCKQA-VKHMYHEASA-N 0.000 description 6
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 6
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- FCXZBWSIAGGPCB-YFKPBYRVSA-N O-acetyl-L-homoserine Chemical compound CC(=O)OCC[C@H]([NH3+])C([O-])=O FCXZBWSIAGGPCB-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 5
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 5
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 5
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 5
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 5
- 229960000268 spectinomycin Drugs 0.000 description 5
- UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N spectinomycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](NC)[C@@H](O)[C@H]([C@@H]([C@H]1O1)O)NC)[C@]2(O)[C@H]1O[C@H](C)CC2=O UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N 0.000 description 5
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 5
- 101100351124 Bacillus subtilis (strain 168) pckA gene Proteins 0.000 description 4
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 4
- 101000787195 Escherichia coli (strain K12) Aldose sugar dehydrogenase YliI Proteins 0.000 description 4
- 101000728677 Pseudomonas sp Bifunctional aspartate aminotransferase and L-aspartate beta-decarboxylase Proteins 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 4
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 4
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 4
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 4
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 4
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 3
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 3
- 241000192091 Deinococcus radiodurans Species 0.000 description 3
- 241001302584 Escherichia coli str. K-12 substr. W3110 Species 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- FFEARJCKVFRZRR-UHFFFAOYSA-N L-Methionine Natural products CSCCC(N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229930195722 L-methionine Natural products 0.000 description 3
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M Potassium hydroxide Chemical compound [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 101100492609 Talaromyces wortmannii astC gene Proteins 0.000 description 3
- 101150116772 aatA gene Proteins 0.000 description 3
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 3
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 3
- 101150100742 dapL gene Proteins 0.000 description 3
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 3
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 3
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 3
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 3
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 3
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 3
- HMUNWXXNJPVALC-UHFFFAOYSA-N 1-[4-[2-(2,3-dihydro-1H-inden-2-ylamino)pyrimidin-5-yl]piperazin-1-yl]-2-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)ethanone Chemical compound C1C(CC2=CC=CC=C12)NC1=NC=C(C=N1)N1CCN(CC1)C(CN1CC2=C(CC1)NN=N2)=O HMUNWXXNJPVALC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 2
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 2
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 235000010633 broth Nutrition 0.000 description 2
- 230000001268 conjugating effect Effects 0.000 description 2
- 238000012364 cultivation method Methods 0.000 description 2
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 2
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 2
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 2
- -1 fatty acid ester Chemical class 0.000 description 2
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N hexadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 2
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N succinic acid Chemical compound OC(=O)CCC(O)=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 2
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-IUCAKERBSA-N 2,2-dichloro-n-[(1s,2s)-1,3-dihydroxy-1-(4-nitrophenyl)propan-2-yl]acetamide Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@@H](CO)[C@@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- PAWQVTBBRAZDMG-UHFFFAOYSA-N 2-(3-bromo-2-fluorophenyl)acetic acid Chemical compound OC(=O)CC1=CC=CC(Br)=C1F PAWQVTBBRAZDMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N Ammonium bicarbonate Chemical compound [NH4+].OC([O-])=O ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004254 Ammonium phosphate Substances 0.000 description 1
- 101100382386 Arabidopsis thaliana PPC3 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100290837 Bacillus subtilis (strain 168) metAA gene Proteins 0.000 description 1
- 241000186146 Brevibacterium Species 0.000 description 1
- 241000186216 Corynebacterium Species 0.000 description 1
- YPWSLBHSMIKTPR-UHFFFAOYSA-N Cystathionine Natural products OC(=O)C(N)CCSSCC(N)C(O)=O YPWSLBHSMIKTPR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ILRYLPWNYFXEMH-UHFFFAOYSA-N D-cystathionine Natural products OC(=O)C(N)CCSCC(N)C(O)=O ILRYLPWNYFXEMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N Dioxygen Chemical compound O=O MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150067056 Epsilon gene Proteins 0.000 description 1
- 241000588698 Erwinia Species 0.000 description 1
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 1
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Natural products NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 108091029795 Intergenic region Proteins 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-HWQSCIPKSA-N L-arabinopyranose Chemical compound O[C@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-HWQSCIPKSA-N 0.000 description 1
- ILRYLPWNYFXEMH-WHFBIAKZSA-N L-cystathionine Chemical compound [O-]C(=O)[C@@H]([NH3+])CCSC[C@H]([NH3+])C([O-])=O ILRYLPWNYFXEMH-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- 229930182844 L-isoleucine Natural products 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- OYHQOLUKZRVURQ-HZJYTTRNSA-N Linoleic acid Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/CCCCCCCC(O)=O OYHQOLUKZRVURQ-HZJYTTRNSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 101710102974 O-acetyl transferase Proteins 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 235000021314 Palmitic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 244000046052 Phaseolus vulgaris Species 0.000 description 1
- 235000010627 Phaseolus vulgaris Nutrition 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000588768 Providencia Species 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000607720 Serratia Species 0.000 description 1
- 101100382400 Solanum tuberosum PPC1 gene Proteins 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 235000021355 Stearic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 235000019486 Sunflower oil Nutrition 0.000 description 1
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 101100112137 Zea mays PEP1 gene Proteins 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- 108020002494 acetyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001099 ammonium carbonate Substances 0.000 description 1
- 235000012501 ammonium carbonate Nutrition 0.000 description 1
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 239000000908 ammonium hydroxide Substances 0.000 description 1
- 229910000148 ammonium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019289 ammonium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 239000002518 antifoaming agent Substances 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 1
- 238000010364 biochemical engineering Methods 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 235000013877 carbamide Nutrition 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 239000004359 castor oil Substances 0.000 description 1
- 235000019438 castor oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 239000003240 coconut oil Substances 0.000 description 1
- 235000019864 coconut oil Nutrition 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N diammonium hydrogen phosphate Chemical compound [NH4+].[NH4+].OP([O-])([O-])=O MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910001882 dioxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000396 dipotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019797 dipotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 239000003925 fat Substances 0.000 description 1
- 235000019197 fats Nutrition 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 235000013312 flour Nutrition 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- ZEMPKEQAKRGZGQ-XOQCFJPHSA-N glycerol triricinoleate Natural products CCCCCC[C@@H](O)CC=CCCCCCCCC(=O)OC[C@@H](COC(=O)CCCCCCCC=CC[C@@H](O)CCCCCC)OC(=O)CCCCCCCC=CC[C@H](O)CCCCCC ZEMPKEQAKRGZGQ-XOQCFJPHSA-N 0.000 description 1
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 108010034653 homoserine O-acetyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 229910000358 iron sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L iron(2+) sulfate (anhydrous) Chemical compound [Fe+2].[O-]S([O-])(=O)=O BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 235000020778 linoleic acid Nutrition 0.000 description 1
- OYHQOLUKZRVURQ-IXWMQOLASA-N linoleic acid Natural products CCCCC\C=C/C\C=C\CCCCCCCC(O)=O OYHQOLUKZRVURQ-IXWMQOLASA-N 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N n-Pentadecanoic acid Natural products CCCCCCCCCCCCCCC(O)=O WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Natural products CCCCCCCC(C)CCCCCCCCC(O)=O OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 125000001477 organic nitrogen group Chemical group 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;potassium Chemical compound [K].OP(O)(O)=O PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 229920000151 polyglycol Polymers 0.000 description 1
- 239000010695 polyglycol Substances 0.000 description 1
- 125000001500 prolyl group Chemical group [H]N1C([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 1
- 230000004952 protein activity Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 1
- 230000003584 silencer Effects 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003549 soybean oil Substances 0.000 description 1
- 235000012424 soybean oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000008117 stearic acid Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- WPLOVIFNBMNBPD-ATHMIXSHSA-N subtilin Chemical compound CC1SCC(NC2=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C(C)CC)C(=O)NC(=C)C(=O)NC(CCCCN)C(O)=O)CSC(C)C2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C1NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C1NC(=O)C(=C/C)/NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)CNC(=O)C(NC(=O)C(NC(=O)C2NC(=O)CNC(=O)C3CCCN3C(=O)C(NC(=O)C3NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(=C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(CCCCN)NC(=O)C(N)CC=4C5=CC=CC=C5NC=4)CSC3)C(C)SC2)C(C)C)C(C)SC1)CC1=CC=CC=C1 WPLOVIFNBMNBPD-ATHMIXSHSA-N 0.000 description 1
- 239000001384 succinic acid Substances 0.000 description 1
- 125000002730 succinyl group Chemical group C(CCC(=O)*)(=O)* 0.000 description 1
- VNOYUJKHFWYWIR-ITIYDSSPSA-N succinyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)CCC(O)=O)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 VNOYUJKHFWYWIR-ITIYDSSPSA-N 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000002600 sunflower oil Substances 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 1
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/06—Alanine; Leucine; Isoleucine; Serine; Homoserine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
- C12N9/1029—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/12—Methionine; Cysteine; Cystine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y203/00—Acyltransferases (2.3)
- C12Y203/01—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
- C12Y203/01046—Homoserine O-succinyltransferase (2.3.1.46)
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
Группа изобретений относится к микроорганизму Escherichia sp., продуцирующему О-сукцинилгомосерин, и способу получения О-сукцинилгомосерина. Предложен микроорганизм Escherichia sp., содержащий полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 29. При этом указанный микроорганизм экспрессирует указанный полипептид, обладающий резистентностью к ингибированию метионином по принципу обратной связи и гомосерин-О-сукцинилтрансферазной активностью. Предложен способ получения О-сукцинилгомосерина, включающий культивирование указанного микроорганизма Escherichia sp., продуцирующего О-сукцинилгомосерин и содержащего полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 29, в среде с последующим получением О-сукцинилгомосерина из указанного микроорганизма или среды. Группа изобретений обеспечивает получение высокого уровня О-сукцинилгомосерина. 2 н. и 8 з.п. ф-лы, 5 табл., 5 пр.
Description
ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится выделенному полипептиду, обладающему резистентностью к ингибированию метионином по принципу обратной связи и гомосерин-О-сукцинилтрансферазной активностью, микроорганизму, экспрессирующему указанный полипептид, и способу получения О-сукцинилгомосерина с использованием указанного микроорганизма.
ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Известно, что большинство микроорганизмов, представленных в природе, используют О-сукцинилгомосерин или О-ацетилгомосерин в качестве промежуточного продукта биосинтеза метионина. Обычно О-сукцинилгомосерин образует гомосерин-О-сукцинилтрансфераза (MetA), конъюгирующая сукцинильную группу сукцинил-КоА с гомосерином, и О-ацетилгомосерин образует гомосерин-О-ацетилтрансфераза (MetX), конъюгирующая ацетильную группу ацетил-КоА с гомосерином. То есть, применительно к получению О-сукцинилгомосерина наряду с другими промежуточными продуктами, metA является одним из наиболее важных генов при разработке микроорганизмов, продуцирующих О-сукцинилгомосерин. В то же время известно, что, в отличие от MetA, MetX не подвержен ингибированию по принципу обратной связи и обладает высокой ферментной стабильностью.
О-сукцинилгомосерин может быть получен с использованием штамма с делецией гена metB, кодирующего цистатионин-гамма-синтазу в метаболическом пути биосинтеза метионина. Тем не менее, штамму, продуцирующему О-сукцинилгомосерин, необходим L-метионин. По этой причине происходит ингибирование активности гомосерин-О-сукцинилтрансферазы по принципу обратной связи посредством ингибирования метионином, добавленным в среду, и, в конечном счете, О-сукцинилгомосерин не может быть получен в высокой концентрации.
Соответственно, во многих предшествующих патентах первостепенное внимание было уделено исследованиям по устранению ингибирования metA по принципу обратной связи контрольной системой обратной связи. Тем не менее, для гомосерин-О-сукцинилтрансферазы, кодируемой metA, свойственны проблемы низкой стабильности самого белка дикого типа, и введение мутаций для устранения ингибирования по принципу обратной связи усугубляет нестабильность. Соответственно, для разработки штамма, продуцирующего О-сукцинилгомосерин с высокой продуктивностью, необходимо устранение ингибирования гена metA по принципу обратной связи и сохранение стабильности фермента.
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Техническая проблема
Для решения феномена ингибирования metA по принципу обратной связи и проблемы нестабильности фермента, описанной выше, авторы настоящего изобретения предприняли попытку разработать гомосерин-О-сукцинилтрансферазу с сохраненной стабильностью фермента, не подверженную, в то же время, ингибированию метионином по принципу обратной связи, и провели на предмет этого скрининг новых ферментов, обладающих указанной активностью. В результате отбора генов-кандидатов, прошедших такой скрининг, и культивирования в колбах после их введения в Escherichia sp. авторы настоящего изобретения обнаружили, что происходило образование О-сукцинилгомосерина и что отобранные таким образом гены обладали гомосерин-О-сукцинилтрансферазной активностью и резистентностью к ингибированию метионином по принципу обратной связи, завершив посредством этого настоящее изобретение.
Техническое решение
Задачей настоящего изобретения является обеспечение нового выделенного полипептида, обладающего резистентностью к ингибированию метионином по принципу обратной связи и гомосерин-О-сукцинилтрансферазной активностью.
Другой задачей настоящего изобретения является обеспечение полинуклеотида, кодирующего новый выделенный полипептид.
Еще одной задачей настоящего изобретения является обеспечение микроорганизма для получения О-сукцинилгомосерина, экспрессирующего новый выделенный полипептид.
Еще одной задачей настоящего изобретения является обеспечение способа получения О-сукцинилгомосерина с использованием указанного выше микроорганизма.
Полезные эффекты изобретения
Микроорганизм для получения О-сукцинилгомосерина, содержащий новый выделенный полипептид, обладающий резистентностью к ингибированию метионином по принципу обратной связи и гомосерин-О-сукцинилтрансферазной активностью, который может обладать резистентностью к ингибированию метионином по принципу обратной связи и продуцировать О-сукцинилгомосерин с высоким выходом и, таким образом, может быть эффективно использован для получения L-метионина, используемого им в качестве предшественника, с высоким выходом.
Наилучший вариант осуществления изобретения
Для решения указанных выше задач в одном аспекте согласно настоящему изобретению предложен новый выделенный полипептид, обладающий резистентностью к ингибированию метионином по принципу обратной связи и гомосерин-О-сукцинилтрансферазной активностью.
Использованный здесь термин «гомосерин-О-сукцинилтрансферазная активность» относится к активности по превращению гомосерина в О-сукцинилгомосерин в процессе биосинтеза метионина.
Использованный здесь термин «ингибирование по принципу обратной связи» относится к ингибированию активности гомосерин-О-сукцинилтрансферазы метионином в процессе биосинтеза метионина.
Полипептид по настоящему изобретению характеризуется тем, что он имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 29, обладающую гомосерин-О-сукцинилтрансферазной активностью и резистентностью к ингибированию метионином по принципу обратной связи. Любой полипептид, последовательность которого на 80% или более, конкретно на 90% или более, конкретнее на 95% или более и еще конкретнее на 97% или более гомологична указанному выше полипептиду, также включен в объем настоящего изобретения, с учетом того, что полипептид обладает гомосерин-О-сукцинилтрансферазной активностью и резистентностью к ингибированию метионином по принципу обратной связи, предложенными в настоящем изобретении. Гомология может быть определена с использованием BLAST 2.0, являющегося эталонным алгоритмом, или FASTA по Pearson [Methods Enzymol., 183, 63(1990), ниже]. На основе алгоритма BLAST разработаны программы, называемые BLASTN и BLASTX [www.ncbi.nlm.nih.gov, ниже].
В другом аспекте согласно настоящему изобретению предложен выделенный полинуклеотид, кодирующий указанный выше полипептид. Конкретно, полипептид может быть кодирован полинуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 36. Ввиду вырожденности кодонов объем настоящего изобретения также включает, без ограничения, полинуклеотиды, последовательность которых по меньшей мере на 80%, конкретно на 90% или более, конкретнее на 95% или более и еще конкретнее на 97% или более гомологична указанной выше последовательности.
В еще одном аспекте согласно настоящему изобретению предложен вектор, содержащий функциональный полинуклеотид.
Использованный здесь термин «вектор» относится к ДНК-конструкции, содержащей нуклеотидную последовательность полинуклеотида, кодирующего интересующий белок, где интересующий белок функционально связан с подходящей регуляторной последовательностью, таким образом, что интересующий белок может быть экспрессирован в подходящем хозяине. Регуляторная последовательность может содержать промотор, способный инициировать транскрипцию, любую операторную последовательность для регуляции транскрипции, последовательность, кодирующую подходящий домен связывания рибосом на мРНК, и последовательность, регулирующую терминацию транскрипции и трансляции. После трансформации подходящего хозяина вектор может быть реплицирован, или может функционировать независимо от генома хозяина, или может быть интегрирован в сам геном хозяина.
Относительно вектора, используемого в настоящем изобретении, может не быть существенных ограничений, при условии, что вектор может быть реплицирован у хозяина, и может быть использован любой вектор, известный в данной области.
В еще одном аспекте согласно настоящему изобретению предложен микроорганизм, продуцирующий О-сукцинилгомосерин, экспрессирующий полипептид, обладающий резистентностью к ингибированию метионином по принципу обратной связи и гомосерин-О-сукцинилтрансферазной активностью.
Использованный здесь термин «микроорганизм, продуцирующий О-сукцинилгомосерин», может относиться к микроорганизму, способному продуцировать О-сукцинилгомосерин и хранить его внутриклеточно и внеклеточно.
Микроорганизм для получения О-сукцинилгомосерина включает штаммы прокариотических и эукариотических микроорганизмов, например, без ограничения, штаммы микроорганизмов, принадлежащие к роду Escherichia, роду Erwinia, роду Serratia, роду Providencia, роду Corynebacterium и роду Brevibacterium. Конкретно, микроорганизм может представлять собой микроорганизм, принадлежащий к роду Escherichia, например, Escherichia coli.
Микроорганизм, продуцирующий О-сукцинилгомосерин, может быть получен с использованием штаммов микроорганизмов, продуцирующих L-лизин, L-треонин или L-изолейцин, и, конкретно, с использованием штамма, продуцирующего L-треонин. Поскольку штамм, продуцирующий L-треонин, представляет собой штамм, способный синтезировать L-треонин и гомосерин в качестве предшественника О-сукцинилгомосерина, с использованием этого штамма может быть синтезировано большое количество предшественников метионина, то есть О-сукцинилгомосерина.
В настоящем изобретении экспрессия полипептида может быть достигнута трансформацией рекомбинантным вектором, содержащим функциональный ген, кодирующий полипептид, или введением полинуклеотида, кодирующего полипептид, в хромосому, однако методы не ограничены указанными выше.
Использованный здесь термин «трансформация» относится к процессу введения вектора, содержащего полинуклеотид, кодирующий целевой белок, в клетку-хозяина, что позволяет экспрессировать полинуклеотид, кодируемый белком, в клетке-хозяине. Неважно, введен ли полинуклеотид, используемый для трансформации, в хромосому клетки-хозяина, будучи расположен в ней, или расположен вне хромосомы, при условии что он может быть экспрессирован в клетке-хозяине. Полинуклеотид может быть введен в любой форме, с учетом того, что он может быть введен в клетку-хозяина и экспрессирован в ней. Например, полинуклеотид может быть введен в клетку-хозяина в форме экспрессионной кассеты, представляющей собой полинуклеотидную конструкцию, содержащую все основные элементы, необходимые для самостоятельной экспрессии. Обычно экспрессионная кассета может содержать промотор, функционально связанный с открытой рамкой считывания (далее - «ORF») гена, сигнал терминации транскрипции, домен связывания рибосом и сигнал терминации трансляции.
Относительно промотора, используемого в настоящем изобретении, может не быть существенных ограничений, при условии, что он способен инициировать транскрипцию полинуклеотида, кодирующего целевой белок, в клетке-хозяине с высокой частотой, и может быть использован любой промотор, известный в данной области. Конкретно, могут быть использованы промотор T7, промотор trc, промотор tac, промотор CJ1 (патент Кореи №0620092) и так далее.
В типичном воплощении настоящего изобретения ген metB, кодирующий цистатионин-гамма-синтазу, у микроорганизма может быть дополнительно удален или ослаблен.
В типичном воплощении настоящего изобретения ген thrB, кодирующий гомосеринкиназу, и ген metA, кодирующий гомосерин-О-сукцинилтрансферазу, у микроорганизма могут быть дополнительно удалены или ослаблены.
Кроме того, в типичном воплощении микроорганизм может представлять собой Escherichia sp. с дополнительно усиленными фосфоенолпируваткарбоксилазой, аспартатаминотрансферазой и аспартатполуальдегиддегидрогеназой.
В настоящем изобретении последовательности генов могут быть получены из баз данных, таких как Национальный центр биотехнологической информации (National Center for Biotechnology Information, NCBI).
Использованный здесь термин «делеция» относится к типу удаления из хромосомы части или всей области нуклеотидной последовательности целевого гена, начиная с нуклеотидной последовательности, соответствующей инициирующему кодону, до нуклеотидной последовательности, соответствующей терминирующему кодону, или части или всей области нуклеотидной последовательности его регуляторной области.
Использованный здесь термин «ослабление» относится к устранению или снижению внутриклеточной активности по меньшей мере одного фермента, кодируемого соответствующим полинуклеотидом, у штамма микроорганизма. Например, экспрессия белка может быть ослаблена модификацией последовательности регуляции экспрессии или нуклеотидной последовательности 5'--UTR (5'--нетранслируемой области) гена, или активность белка может быть ослаблена заменой инициирующего кодона или введением мутации в область ORF соответствующего гена.
Использованный здесь термин «усиление» относится к повышению внутриклеточной активности фермента, кодируемого соответствующим полинуклеотидом. Усиление внутриклеточной активности фермента может быть достигнуто сверхэкспрессией гена или введением модификации в саму полинуклеотидную последовательность.
Сверхэкспрессия полинуклеотида может представлять собой модификацию посредством замены последовательности регуляции экспрессии, или модификацию посредством мутации, замены инициирующего кодона, дополнительного введения полинуклеотида в хромосому или увеличения числа копий посредством введения с использованием вектора, или их комбинацию.
Последовательность регуляции экспрессии представляет собой последовательность, контролирующую экспрессию полинуклеотида, функционально связанного с ней, например, промотор, терминатор, энхансер, сайленсер, последовательность Шайна-Дальгарно и так далее. Инициирующий кодон, состоящий из TTG или GTG, может быть заменен на ATG для повышения ферментативной активности соответствующего гена или снижения ферментативной активности соответствующего гена посредством противоположной замены. Полинуклеотид может представлять собой полинуклеотид, число копий которого увеличено посредством его введения в определенный сайт на хромосоме. Этот определенный сайт может включать, например, транспозон или межгенную область. Кроме того, полинуклеотид может представлять собой полинуклеотид, введенный в вектор экспрессии, который был снова введен в клетку-хозяина, посредством чего число его копий было увеличено.
В другом аспекте согласно настоящему изобретению предложен способ получения О-сукцинилгомосерина, включающий культивирование микроорганизма в среде для получения О-сукцинилгомосерина и получение О-сукцинилгомосерина из микроорганизма или среды.
Культивирование штамма микроорганизма для получения О-сукцинилгомосерина, полученного выше, может быть проведено в соответствии с подходящей средой и условиями культивирования, известными в данной области. Способ культивирования может быть легко адаптирован специалистом в данной области для применения в соответствии с выбранным штаммом. Конкретно, культура может представлять собой, без ограничения, периодическую культуру, непрерывную культуру и адаптированную культуру (fetch culture). Эти различные способы культивирования раскрыты, например, в приведенной ссылке (“Biochemical Engineering” by James M. Lee, Prentice-Hall International Editions, pp 138-176).
Среды, используемые для культивирования, должны подходящим образом соответствовать требованиям для определенных штаммов. Примеры сред для различных микроорганизмов раскрыты, например, в приведенной ссылке (“Manual of Methods for General Bacteriology” by the American Society for Bacteriology, Washington D.C., USA, 1981). Среды могут содержать различные источники углерода, источники азота и микроэлементы. Примеры источников углерода для включения в среды могут включать углеводы, такие как глюкоза, сахароза, лактоза, фруктоза, мальтоза, крахмал и целлюлоза; жиры, такие как соевое масло, подсолнечное масло, касторовое масло и кокосовое масло; жирные кислоты, такие как пальмитиновая кислота, стеариновая кислота и линолевая кислота; спирты, такие как глицерин и этанол; и органические кислоты, такие как уксусная кислота. Эти источники углерода могут быть использованы по отдельности или в комбинации. Примеры источников азота для включения в среды могут включать органические источники азота, такие как пептон, дрожжевой экстракт, мясной бульон, солодовый экстракт, жидкий кукурузный экстракт (CSL) и бобовую муку; и неорганические источники азота, такие как мочевина, сульфат аммония, хлорид аммония, фосфат аммония, карбонат аммония и нитрат аммония. Эти источники азота могут быть использованы по отдельности или в комбинации. В качестве источника фосфора среды могут содержать дигидрофосфат калия, гидроортофосфат калия и соответствующие натрий-содержащие соли. В дополнение, культуральные среды могут содержать металлы, такие как сульфат магния и сульфат железа. Кроме того, могут быть включены аминокислоты, витамины, подходящие предшественники и так далее. Эти культуральные среды или предшественники могут быть добавлены в культуру в форме периодической культуры или непрерывной культуры.
В дополнение, во время культивирования рН культуры можно подходящим образом корректировать добавлением такого соединения, как гидроксид аммония, гидроксид калия, аммиак, фосфорная кислота и серная кислота. Кроме того, образование пузырьков во время культивирования можно предотвращать с использованием пеногасителя, такого как полигликолевый сложный эфир жирной кислоты. В дополнение, в культуру может быть добавлен газообразный кислород или газ, содержащий газообразный кислород (например, воздух), для поддержания в культуре аэробных условий. Температура культуры может входить в диапазон от 20°С до 45°С и, конкретно, от 25°С до 40°С. Культивирование можно продолжать до получения желаемого количества продукта О-сукцинилгомосерина и, конкретно, от 10 часов до 160 часов.
О-сукцинилгомосерин, полученный способом по настоящему изобретению, может быть превращен в метионин цистатионин-гамма-синтазой или О-сукцинилгомосеринсульфгидрилазой. Кроме того, возможно получение янтарной кислоты в качестве побочного продукта, в дополнение к L-метионину, посредством взаимодействия O-сукцинил-L-гомосерина, полученного способом по настоящему изобретению, с CH3SH.
В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к применению полипептида, обладающего резистентностью к ингибированию метионином по принципу обратной связи и гомосерин-О-сукцинилтрансферазной активностью, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 29. Было подтверждено, что новый выделенный полипептид по настоящему изобретению обладает резистентностью к ингибированию метионином по принципу обратной связи и способен продуцировать О-сукцинилгомосерин с высоким выходом, и, таким образом, указанный полипептид может быть использован для получения О-сукцинилгомосерина.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Далее настоящее изобретение будет описано более подробно со ссылкой на следующие Примеры. Тем не менее, эти Примеры приведены лишь в иллюстративных целях, и изобретение не следует ограничивать этими Примерами.
Пример 1: Получение штамма, продуцирующего треонин, на основе исходного штамма
(1) Делеция гена metB
Для описания субстратной специфичности и активности гена metX получали штамм, способный накапливать гомосерин и имеющий делецию по утилизации ацилгомосерина. Штамм конструировали на основе FTR2533 (КССМ 10541), штамма, продуцирующего треонин, раскрытого в международной заявке на патент №WO 05/075625.
Делецию гена metB, кодирующего цистатионинсинтазу, у штамма FTR2533 (КССМ 10541), продуцирующего треонин, проводили методом делеции «FRT-one-step-PCR» {PNAS (2000) vol 97: Р 6640-6645). Делеционную кассету конструировали посредством ПЦР (полимеразной цепной реакции) с использованием праймеров SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2 и вектора pKD3 (PNAS (2000) vol 97: P 6640-6645) в качестве матрицы. ПЦР проводили на протяжении 30 циклов в следующих условиях: денатурация при 94°С в течение 30 с, отжиг при 55°С в течение 30 с и полимеризация при 72°С в течение 1 мин.
Полученный продукт ПЦР подвергали электрофорезу в 1,0%-м агарозном геле и 1,2 т.п.о. полосу ДНК, полученную из него, очищали. Полученный фрагмент ДНК электропорировали в штамм FTR2533, уже трансформированный вектором pKD46 (PNAS (2000) vοl97: Р6640-6645).
Для электропорации штамм FTR2533, трансформированный pKD46, культивировали в среде LB, содержащей 100 мкг/л ампициллина и 5 мМ L-арабинозы, при 30°С до достижения OD600 0,6. Полученный штамм промывали два раза стерильной дистиллированной водой и затем для использования промывали один раз 10%-м глицерином. Электропорацию проводили при 2500 В.
Полученный штамм высевали на чашки со средой LB, содержащей 25 мкг/л хлорамфеникола, культивировали при 37°С в течение ночи и отбирали штамм, резистентный к хлорамфениколу. Отобранный штамм подвергали ПЦР с использованием тех же праймеров и штамма в качестве матрицы и делецию гена metB подтверждали, наблюдая присутствие 1,2 т.п.о. полосы гена в 1,0%-м агарозном геле. Подтвержденный таким образом штамм снова трансформировали вектором рСР20 (PNAS (2000) vol 97: Р6640-6645) и культивировали в среде LB, и снова конечный штамм с делецией гена metB, имеющего уменьшенный размер 150 п. о., подтвержденный в 1,0%-м агарозном геле, конструировали, проводя ПЦР в тех же условиях, и подтверждали удаление хлорамфениколового маркера из штамма. Конструированный таким образом штамм был назван «CJMA1».
(2) Делеция гена thrB
Делецию гена thrB, кодирующего гомосеринкиназу, у конструированного таким образом штамма CJMA1 проводили методом делеции «FRT-one-step-PCR», как в случае с делецией гена metB.
Делеционную кассету thrB конструировали посредством ПЦР с использованием праймеров SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4 и вектора pKD4 (PNAS (2000) vol 97: Ρ 6640-6645) в качестве матрицы. ПЦР проводили на протяжении 30 циклов в следующих условиях: денатурация при 94°С в течение 30 с, отжиг при 55°С в течение 30 с и удлинение при 72°С в течение 1 мин.
Полученный продукт ПЦР подвергали электрофорезу в 1,0%-м агарозном геле и 1,6 т.п.о. полосу ДНК, полученную из него, очищали. Полученный фрагмент ДНК электропорировали в штамм CJMA1, уже трансформированный вектором pKD46. Полученный штамм высевали на чашки со средой LB, содержащей 50 мкг/л канамицина, культивировали при 37°С в течение ночи и отбирали штамм, резистентный к канамицину. Отобранный штамм подвергали ПЦР в тех же условиях с использованием праймеров SEQ ID NO: 3 и 4 и делецию гена thrB подтверждали, наблюдая присутствие 1,6 т.п.о. полосы гена в 1,0%-м агарозном геле. Подтвержденный таким образом штамм снова трансформировали вектором рСР20 и культивировали в среде LB, и конечный штамм с делецией гена thrB, имеющего уменьшенный размер 150 п. о., подтвержденный в 1,0%-м агарозном геле, конструировали, проводя ПЦР в тех же условиях, и подтверждали удаление канамицинового маркера из штамма. Конструированный таким образом штамм был назван «CJMA2».
(3) Делеция гена metA
Для описания субстратной специфичности и активности гена metX, имеющего происхождение от Chromobacterium violaceum, у штамма CJMA2, у штамма FTR2533 (КССМ 10541) проводили делецию исходного гена metA на хромосоме на основе штамма CJMA2 с удаленными генами metB и thrB. Делецию гена metA проводили методом делеции «FRT-one-step-PCR».
Делеционную кассету metA конструировали посредством ПЦР с использованием праймеров SEQ ID NO: 5 и 6 и вектора pKD3 (PNAS (2000) vol 97: Р6640-6645) в качестве матрицы. ПЦР проводили на протяжении 30 циклов в следующих условиях: денатурация при 94°С в течение 30 с, отжиг при 55°С в течение 30 с и удлинение при 72°С в течение 1 мин.
Полученный продукт ПЦР подвергали электрофорезу в 1,0%-ном агарозном геле и 1,2 т.п.о. полосу ДНК, полученную из него, очищали. Полученный фрагмент ДНК электропорировали в штамм CJMA2, уже трансформированный вектором pKD46. Полученный штамм высевали на чашки со средой LB, содержащей хлорамфеникол, культивировали при 37°С в течение ночи и отбирали штамм, резистентный к хлорамфениколу.
Отобранный штамм подвергали ПЦР в тех же условиях с использованием праймеров SEQ ID NO: 5 и 6 и делецию гена metA подтверждали, наблюдая присутствие 1,1 т.п.о. полосы гена в 1,0%-ном агарозном геле. Подтвержденный таким образом штамм снова трансформировали вектором рСР20 и культивировали в среде LB, и конечный штамм с делецией гена thrB, имеющего уменьшенный размер 100 п. о., подтвержденный в 1,0%-ном агарозном геле, конструировали, проводя ПЦР в тех же условиях, и подтверждали удаление хлорамфениколового маркера из штамма. Конструированный таким образом штамм был назван «CJM2».
Штамм CJM2 способен накапливать избыточное количество гомосерина и продуцировать О-ацетилгомосерин или О-сукцинилгомосерин, в зависимости от субстратной специфичности metX во введенной плазмиде.
Пример 2: Отбор полипептидов, обладающих новой О-сукцинилтрансферазной активностью
Для сохранения стабильности и устранения контроля гена metA по принципу обратной связи отбирали 10 типов ортологов, названных metX на интернет-сайте KEGG (//www.genome.jp/kegg/), и клонировали их в вектор pCL1920_PCJ1. Штамм CJM2, полученный в Примере 1, трансформировали векторами 10-ти различных типов.
Полученные таким образом штаммы 10-ти различных типов оценивали методом культивирования в колбах, описанным в Примере 5-(2) ниже. CJM2 представляет собой штамм, способный накапливать гомосерин. При введении гена гомосеринсукцинилтрансферазы в pCL1920 в качестве конечного продукта может быть получен О-сукцинилгомосерин, в то время как при введении гена гомосеринацетилтрансферазы в pCL1920 в качестве конечного продукта может быть получен О-ацетилгомосерин. В этом отношении, ген, представляющий собой ген metX, кодирующий гомосеринсукцинилтрансферазу, получали из уже оцененных 10-ти различных типов. Ген представляет собой ген metX, имеющий происхождение от Chromobacterium violaceum, для которого характерно образование О-сукцинилгомосерина с высоким выходом (аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 29, и нуклеотидная последовательность SEQ ID NO: 36), и авторы настоящего изобретения подтвердили, что указанная выше активность является новой активностью, о которой никогда не сообщалось ранее.
Пример 3: Конструирование плазмид
3-1. Конструирование плазмиды, экспрессирующей ген metA, имеющий происхождение от Е. соli дикого типа
Проводили ПЦР с использованием хромосомы E.coliW3110 (регистрационный номер: АТСС 9637), полученной из Американской коллекции типовых культур (American Type Culture Collection, АТСС), в качестве матрицы с праймерами SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 8, амплифицируя ген metA, кодирующий гомосерин-О-сукцинилтрансферазу.
Праймеры, использованные при ПЦР, были получены на основе нуклеотидной последовательности хромосомы Е. coli (NC_000913), зарегистрированной в GenBank Национальных институтов здравоохранения (NIH GenBank), и праймеры SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 8 имеют сайт рестрикции EcoRV и сайт рестрикции HindIII, соответственно.
ПЦР проводили посредством денатурации при 94°С в течение 3 мин; 30 циклов денатурации при 94°С в течение 30 с, отжига при 56°С в течение 30 с и полимеризации при 68°С в течение 2 мин; и полимеризации при 68°С в течение 10 мин.
Плазмиду pCL1920, содержащую полученный таким образом ПЦР-продукт и промотор СJ1 (патент Кореи №0620092), клонировали после обработки EcoRV и HindIII, соответственно. Клонированной плазмидой трансформировали Е. coli DH5α и получали плазмиду, отбирая трансформированные Е. coli DH5α из чашек с LB, содержащей спектиномицин (50 мкг/мл). Полученная таким образом плазмида была названа pCL_Pcj1_metA (wt).
3-2. Конструирование плазмиды, экспрессирующей ген metA, резистентный к обратной связи
Ген metA (metA #11), резистентный к действию метионина по принципу обратной связи, конструировали с использованием набора для сайт-направленного мутагенеза (Stratagene, USA) на основе pCL_Pcj1_metA (wt), полученной в Примере 3-1, в качестве матрицы.
Конкретно, в соответствии с описанием международной заявки на патент №WO 2008/127240, 29-ю аминокислоту, серии, заменяли на пролин (S29P) с использованием праймеров SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 10; 114-ю аминокислоту, глутаминовую кислоту, заменяли на глицин (E114G) с использованием праймеров SEQ ID NO:11 и SEQ ID NO: 12; 140-ю аминокислоту, фенилаланин, заменяли на серин (F140S) с использованием праймеров SEQ ID NO: 13 и SEQ ID NO: 14. Нуклеотидные последовательности использованных праймеров показаны ниже.
Конструировали плазмиду, содержащую ген metA (#11), в который были последовательно введены все три типа модификаций, и она была названа pCL_Pcj1_metA #11.
3-3. Конструирование плазмиды, экспрессирующей ген metX, имеющий происхождение от Deinococcus radiodurans
Проводили ПЦР с использованием хромосомы Deinococcus radiodurans (регистрационный номер: АТСС BAA-816D), полученной из Американской коллекции типовых культур (АТСС), в качестве матрицы с праймерами SEQ ID NO:15 и SEQ ID NO:16, амплифицируя ген metX, кодирующий гомосерин-О-ацетилтрансферазу.
Праймеры, использованные при ПЦР, были получены на основе нуклеотидной последовательности хромосомы (АЕ000513), зарегистрированной в NIH GenBank, и праймеры SEQ ID NO:15 и SEQ ID NO: 16 имеют сайт рестрикции ЕсоРV и сайт рестрикции HindIII, соответственно.
ПЦР проводили посредством денатурации при 94°С в течение 3 мин; 30 циклов денатурации при 94°С в течение 30 с, отжига при 56°С в течение 30 с и полимеризации при 68°С в течение 5 мин; и полимеризации при 68°С в течение 7 мин.
Плазмиду pCL1920, содержащую полученный таким образом ПЦР-продукт и промотор CJ1 (патент Кореи №0620092), клонировали после обработки EcoRV и HindIII, соответственно. Клонированной плазмидой трансформировали Е. coli DH5α и получали плазмиду, отбирая трансформированные Е. coli DH5α из чашек с LB, содержащей спектиномицин (50 мкг/мл). Полученная таким образом плазмида была названа pCL_Pcj1_dra metX.
3-4. Конструирование плазмиды, экспрессирующей ген metX, имеющий происхождение от Chromobacterium violaceum
Проводили ПЦР с использованием хромосомы Chromobacterium violaceum (регистрационный номер: АТСС 12472), полученной из Американской коллекции типовых культур (АТСС), в качестве матрицы с праймерами SEQ ID NO: 17 и SEQ ID NO: 18, амплифицируя ген metX, имеющий происхождение от Chromobacterium violaceum.
Праймеры, использованные при ПЦР, были получены на основе нуклеотидной последовательности хромосомы Chromobacterium violaceum (NC_005085), зарегистрированной в NIH GenBank, и праймеры SEQ ID NO: 17 и SEQ ID NO: 18 имеют сайт рестрикции EcoRV и сайт рестрикции HindIII, соответственно.
ПЦР проводили посредством денатурации при 94°С в течение 3 мин; 30 циклов денатурации при 94°С в течение 30 с, отжига при 56°С в течение 30 с и полимеризации при 68°С в течение 2 мин; и полимеризации при 68°С в течение 10 мин.
Плазмиду pCL1920, содержащую полученный таким образом ПЦР-продукт и промотор СЛ (патент Кореи №0620092), клонировали после обработки EcoRW и HindIII, соответственно. Клонированной плазмидой трансформировали Е. coli DH5α и получали плазмиду, отбирая трансформированные Е. coli DH5α из чашек с LB, содержащей спектиномицин (50 мкг/мл). Полученная таким образом плазмида была названа pCL_Pcj1_cvi metX.
3-5. Плазмида для конструирования штамма с 2-мя копиями гена для усиления биосинтеза
(1) Конструирование вектора pSG76c для введения гена ррс
В настоящем Примере конструировали pSG76c-2ppc, представляющий собой вектор для введения хромосомной ДНК Е. coli, содержащей ген ррс, кодирующий фосфоенолпируваткарбоксилазу.
Информацию о нуклеотидной последовательности гена ррс получали на основе базы данных NIH GenBank (NCBI Reg. No. gi: 89110074) и на основании этой информации синтезировали праймеры (SEQ ID NO: 19 и SEQ ID NO: 20), содержащие ORF ррс и сайты рестрикции EcoRI и Sad в положении -200 гена ррс, и праймеры (SEQ ID NO: 21 и SEQ ID NO: 22), содержащие сайты рестрикции SacI и КрnI.
Проводили ПЦР с использованием хромосомы Е. coli W3110 в качестве матрицы с праймерами SEQ ID NO: 19 и 20 и SEQ ID NO: 21 и 22. В качестве полимеразы использовали высокоточную ДНК-полимеразу PfuUltra™ (Stratagene) и ПЦР проводили посредством денатурации при 94°С в течение 3 мин; 30 циклов денатурации при 94°С в течение 30 с, отжига при 56°С в течение 30 с и полимеризации при 68°С в течение 5 мин; и полимеризации при 68°С в течение 7 мин. В результате получали амплифицированный ген ррс размером приблизительно 3,1 т.п.о., содержащий сайты рестрикции EcoRI и SacI и сайты рестрикции SacI и КрnI.
После обработки конца гена ррс, полученного посредством ПЦР, рестриктазами EcoRI и SacI, а также SacI и КрnI, полученный ген ррс лигировали с вектором pSG76c (J Bacteriol. 1997 Jul; 179 (13): 4426 - 8), уже обработанным EcoRI и KpnI, и в итоге конструировали рекомбинантный вектор pSG76c-2ppc с двумя клонированными копиями гена ррс.
(2) Конструирование вектора pSG76c для введения aspC
В настоящем Примере конструировали pSG76c-2aspC, представляющий собой вектор для введения хромосомной ДНК Е. coli, содержащей ген aspC, кодирующий аспартатаминотрансферазу.
Информацию о нуклеотидной последовательности гена aspC получали на основе базы данных NIH GenBank (NCBI Reg. No. gi: 85674274) и на основании этой информации синтезировали праймеры (SEQ ID NO: 23 и SEQ ID NO: 24), содержащие ORF aspC и сайт рестрикции SacI в положении -200 гена aspC.
Проводили ПЦР с использованием хромосомы Е. coli W3110 в качестве матрицы с олигонуклеотидными праймерами SEQ ID NO: 23 и 24. В качестве полимеразы использовали высокоточную ДНК-полимеразу PfuUltra™ (Stratagene) и ПЦР проводили посредством денатурации при 94°С в течение 3 мин; 30 циклов денатурации при 94°С в течение 30 с, отжига при 56°С в течение 30 с и полимеризации при 68°С в течение 2 мин; и полимеризации при 68°С в течение 7 мин. В результате получали амплифицированный ген aspC размером приблизительно 1,5 т.п.о., содержащий сайт рестрикции ВаmНI.
После обработки конца гена aspC, полученного посредством ПЦР, рестриктазой ВаmНI, полученный ген aspC лигировали с вектором pSG76c (J Bacterid. 1997 Jul; 179 (13): 4426 - 8), уже обработанным ВаmНI, и в итоге конструировали рекомбинантный вектор pSG76c-2aspC с двумя клонированными копиями гена aspC.
(3) Конструирование вектора pSG76c для введения asd
В настоящем Примере конструировали pSG76c-2asd, представляющий собой вектор для введения хромосомной ДНК Е. coli, содержащей ген asd, кодирующий аспартатполуальдегиддегидрогеназу.
Информацию о нуклеотидной последовательности гена asd получали на основе базы данных NIH GenBank (NCBI Reg. No. gi: 89110578) и на основании этой информации синтезировали праймеры (SEQ ID NO: 25 и SEQ ID NO: 26), содержащие ORF asd и сайты рестрикции ЕсоRI и XbaI в положении -200 гена asd, и праймеры (SEQ ID NO: 27 и SEQ ID NO: 28), содержащие сайты рестрикции XbaI и ЕсоRI.
Проводили ПЦР с использованием хромосомы Е. coli W3110 в качестве матрицы с олигонуклеотидными праймерами SEQ ID NO: 25 и 26 и SEQ ID NO: 27 и 28. В качестве полимеразы использовали высокоточную ДНК-полимеразу PfuUltra™ (Stratagene) и ПЦР проводили на протяжении 30 циклов, состоящих из денатурации при 96°С в течение 30 с, отжига при 50°С в течение 30 с и полимеризации при 68°С в течение 2 мин. В результате получали амплифицированный ген asd размером приблизительно 1,5 т.п.о., содержащий сайты рестрикции ЕсоRI и XbaI и сайты рестрикции XbaI и ЕсоRI.
После обработки конца гена asd, полученного посредством ПЦР, рестриктазами ЕсоRI и XbaI, полученный ген asd лигировали с вектором pSG76c, уже обработанным ЕсоRI, и в итоге конструировали рекомбинантный вектор pSG76c-2asd с двумя клонированными копиями гена asd.
Пример 4: Конструирование исходного штамма на основе штамма дикого типа
(1) Усиление генов ррс, aspC и asd
E.coli W3110 (регистрационный номер: АТСС 9637), полученный из Американской коллекции типовых культур (АТСС), трансформировали векторами pSG76c-2ppc, pSG76c-2aspC и pSG76c-2asd, полученными в Примере 3-5, высевали на чашки со средой LB-Cm (10 г/л дрожжевого экстракта, 5 г/л NaCl, 10 г/л триптона, 25 мкг/л хлорамфеникола и 15 г/л агара) и отбирали колонии, резистентные к хлорамфениколу. Отобранные трансформанты представляли собой штаммы, в ррс-часть генома которых сначала был введен вектор pSG76c-2ppc.
Полученный таким образом штамм с 2-мя введенными копиями гена ррс трансформировали вектором pST76-AsceP, экспрессирующим I-SceI, являющуюся рестриктазой, расщепляющей часть I-SeeI, присутствующую в векторе pSG76c, и высевали на чашки со средой LB-Ap (10 г/л дрожжевого экстракта, 5 г/л NaCl, 10 г/л триптона, 100 мкг/л ампициллина и 15 г/л агара) и отбирали штаммы, которые росли при 30°С.
Выращенные таким образом штаммы могли быть в состоянии, где ген ррс был амплифицирован до 2-х копий или возвращен к одной копии. Штаммы с 2-мя копиями гена ррс с увеличенным размером гена 6,5 т.п.о. отбирали в ходе электрофореза в 1%-м агарозном геле после проведения ПЦР с использованием праймеров SEQ ID NO: 30 и SEQ ID NO: 31. В результате описанного выше процесса происходит дополнительное ведение гена ррс и удаление вектора pSG76c.
Описанным выше способом конструировали штаммы W3110 с амплифицированными копиями генов ррс, asd и aspC, последовательно используя векторы pSG76c-2aspC и pSG76c-2asd. В процессе, конструирование штамма с 2-мя копиями гена aspC подтверждали, идентифицируя ген с увеличенным размером 3,2 т.п.о. электрофорезом в 1%-м агарозном геле после проведения ПЦР с использованием праймеров SEQ ID NO: 32 и SEQ ID NO: 33, в то время как конструирование штамма с 2-мя копиями гена asd подтверждали, идентифицируя ген с увеличенным размером 3,2 т.п.о. в ходе электрофореза в 1%-м агарозном геле после проведения ПЦР с использованием праймеров SEQ ID NO: 34 и SEQ ID NO: 35. Конструированный таким образом штамм был назван CJW2.
(2) Делеция генов metB, thrB и metA
Штамм с делецией генов metB, thrB и metA конструировали таким же образом, как в Примере 3-1, с использованием штамма CJW2, и полученный штамм был назван CJW2H. Штамм CJW2H представляет собой штамм, способный накапливать избыточное количество гомосерина и продуцировать О-ацетилгомосерин или О-сукцинилгомосерин, в зависимости от субстратной специфичности metX во введенной плазмиде.
Пример 5: Конструирование экспериментальных штаммов
(1) Конструирование штаммов
Из штаммов E. coli CJM2 и CJW2H, конструированных в Примерах 1-(3) и 4-(2), соответственно, получали компетентные клетки и посредством электропорации вводили в них плазмиды четырех различных типов: pCL_Pcj1_metA (wt), pCL_Pcj1_metA#11, pCL_Pcj1_dra metX и pCL_Pcj1_cvi metX, конструированные в Примерах 3-1, 3-2, 3-3 и 3-4, соответственно.
(2) Эксперимент с культивированием в колбах
Затем проводили эксперимент в колбах для сравнения типов предшественников метионина и количество продукта, продуцируемое каждым из штаммов, в которые были введены плазмиды четырех типов, соответственно. Эксперимент в колбах проводили следующим образом: каждый штамм высевали штрихом на чашку со средой LB, культивировали в инкубаторе при 31°С в течение 16 часов и отдельные колонии засевали в 3 мл среды LB и культивировали в инкубаторе при 31°С и 200 об/мин в течение 16 часов.
В колбу объемом 250 мл добавляли 25 мл среды для получения предшественников метионина, показанной в Таблице 1, и затем добавляли по 500 мкл каждого из культуральных бульонов, полученных ранее, соответственно. Затем колбы культивировали в инкубаторе при 31°С и 200 об/мин в течение 40 часов и сравнивали типы и количество предшественников метионина, полученных с использованием каждого из штаммов с каждой из введенных плазмид. Результаты показаны в Таблицах 2 и 3 ниже.
В результате, согласно Таблицам 2 и 3, было подтверждено, что штаммы CJM2 pCL_Pcj1_metA (wt), CJM2 pCL_Pcj1_metA #11, CJW2H pCL_Pcj1_metA (wt) и CJW2H pCL_Pcj1_metA #11, содержащие, соответственно, ген metA Е. coli дикого типа и ген metA#11, резистентный к обратной связи, продуцировали О-сукцинилгомосерин, в то время как штаммы CJM2 pCL_Pcj1_dra metX и CJW2H pCL_Pcj1_dra metX, содержащие, соответственно, ген metX, имеющий происхождение от Deinococcus radiodurans, продуцировали О-ацетилгомосерин.
В случае гена metX, имеющего происхождение от Chrome-bacterium violaceum, ген имеет высокую гомологию с другими гомологичными генами metX (ортологами), по сравнению с ортологами гена metA. Тем не менее, по субстратной специфичности этот ген представляет собой гомосеринсукцинилтрансферазу, образующую сукцинилгомосерин, в отличие от большинства сообщений о гене metX.
Кроме того, в случае введения гена metA Ε. coli дикого типа (metA (wt)) происходило образование О-сукцинилгомосерина в количестве приблизительно 1 г/л из-за феномена ингибирования метионином, добавленным в среду в концентрации 0,3 г/л, по принципу обратной связи, в то время как в случае введения гена metX, имеющего происхождение от Chromobacterium violaceum, образование О-сукцинилгомосерина происходило без феномена ингибирования метионином, добавленным в среду, по принципу обратной связи, даже при использовании дикого типа самого по себе, без введения в ген каких-либо модификаций.
Штамм CJM2 с введенной pCL_Pcj1_cvi metX (CJM2 pCL_Pcj1_cvi metX) был депонирован в Корейском центре культур микроорганизмов (Korean Culture Center of Microorganisms, KCCM), расположенном по адресу 361 - 221, Hongje-1-dong, Seodaemun-gu, Seoul, Korea, являющемся дочерней структурой Корейской федерации коллекций культур (Korean Federation of Culture Collections, KFCC) и признанном международным органом по депонированию согласно Будапештскому соглашению, 20 июня 2013 г. под регистрационным номером КССМ11433Р.
(3) Эксперимент с культивированием в большом ферментере
Для крупномасштабного получения О-сукцинилгомосерина, предшественника метионина, с использованием штаммов CJM2 pCL_Pcj1_cvi metX и CJW2H pCL_Pcj1_cvi metX проводили культивирование в ферментере объемом 5 л.
Штаммы CJM2 pCL_Pcj1_cvi metX и CJW2H pCL_Pcj1_cvi metX высевали на чашки со средой LB, содержащей антибиотик спектиномицин, и культивировали при 31°С в течение ночи. Затем отдельные колонии засевали в 10 мл среды LB, содержащей спектиномицин, культивировали при 31°С в течение 5 часов и 2 мл культуры снова засевали в колбу Эрленмейера объемом 1000 мл, содержащую 200 мл посевной среды. Затем полученную культуру культивировали в инкубаторе при 31°С и 200 об/мин в течение 3-10 часов, 255 мл посевной культуры засевали в 1,7 л основной среды в ферментере объемом 5 л, используя 1,3 л посевной среды, методом подпитываемой культуры, и проводили культивирование в течение 50-100 часов.
Подробный состав среды показан в Таблице 4 ниже. Концентрацию в культивированной таким образом ферментационной жидкости анализировали посредством HPLC (высокоэффективная жидкостная хроматография), и результаты показаны в Таблице 5 ниже.
Как показано в Таблице 5 выше, было подтверждено, что штамм CJM2 pCL_Pcj1_cvi metX, в который был введен ген metX, имеющий происхождение от Chrome-bacterium violaceum, на основе штамма, продуцирующего треонин, в качестве исходного штамма, накапливает высокие уровни О-сукцинилгомосерина.
Специалистам в данной области будет ясно, что настоящее изобретение может быть воплощено в других конкретных формах без выхода за рамки его сущности или основных признаков. Описанные воплощения следует рассматривать во всех отношениях только как иллюстративные и не ограничивающие. Таким образом, объем настоящего изобретения определен приложенной формулой изобретения, но не предшествующим описанием. Все изменения в рамках значения и диапазона эквивалентности формулы изобретения следует рассматривать как включенные в объем настоящего изобретения.
Claims (12)
1. Микроорганизм Escherichia sp., продуцирующий О-сукцинилгомосерин, содержащий полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 29, где указанный микроорганизм экспрессирует указанный полипептид, обладающий резистентностью к ингибированию метионином по принципу обратной связи и гомосерин-О-сукцинилтрансферазной активностью.
2. Микроорганизм Escherichia sp. по п. 1, представляющий собой Escherichia coli.
3. Микроорганизм Escherichia sp. по п. 1, где ген metB, кодирующий цистатионин-гамма-синтазу, дополнительно удален или ослаблен.
4. Микроорганизм Escherichia sp. по п. 1, где ген thrB, кодирующий гомосеринкиназу, и ген metA, кодирующий гомосерин-О-сукцинилтрансферазу, дополнительно удалены или ослаблены.
5. Микроорганизм Escherichia sp. по п. 1, где фосфоенолпируваткарбоксилаза, аспартатаминотрансфераза и аспартатполуальдегиддегидрогеназа дополнительно усилены.
6. Способ получения О-сукцинилгомосерина, включающий:
а) культивирование микроорганизма Escherichia sp., продуцирующего О-сукцинилгомосерин, содержащего полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 29, в среде, причем указанный микроорганизм экспрессирует указанный полипептид, обладающий резистентностью к ингибированию метионином по принципу обратной связи и гомосерин-О-сукцинилтрансферазной активностью; и
б) получение О-сукцинилгомосерина из указанного микроорганизма или среды.
7. Способ по п. 6, где микроорганизм Escherichia sp. представляет собой Escherichia coli.
8. Способ по п. 6, где ген metB, кодирующий цистатионин-гамма-синтазу, дополнительно удален или ослаблен в указанном микроорганизме.
9. Способ по п. 6, где ген thrB, кодирующий гомосеринкиназу, и ген metA, кодирующий гомосерин-О-сукцинилтрансферазу, дополнительно удалены или ослаблены в указанном микроорганизме.
10. Способ по п. 6, где фосфоенолпируваткарбоксилаза, аспартатаминотрансфераза и аспартатполуальдегиддегидрогеназа дополнительно усилены в указанном микроорганизме.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020130126602A KR101565213B1 (ko) | 2013-10-23 | 2013-10-23 | Ｏ-숙시닐호모세린 생산 미생물 및 이를 이용한 ｏ-숙시닐호모세린의 생산방법 |
| KR10-2013-0126602 | 2013-10-23 | ||
| PCT/KR2014/009970 WO2015060649A1 (ko) | 2013-10-23 | 2014-10-22 | O-숙시닐호모세린 생산 미생물 및 이를 이용한 o-숙시닐호모세린의 생산방법 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2018121333A Division RU2756104C2 (ru) | 2013-10-23 | 2014-10-22 | Микроорганизмы для получения О-сукцинилгомосерина и способ получения О-сукцинилгомосерина с использованием указанных микроорганизмов |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2016116154A RU2016116154A (ru) | 2017-11-28 |
| RU2662654C2 true RU2662654C2 (ru) | 2018-07-26 |
Family
ID=52993174
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2016116154A RU2662654C2 (ru) | 2013-10-23 | 2014-10-22 | Микроорганизм для получения о-сукцинилгомосерина и способ получения о-сукцинилгомосерина с использованием указанного микроорганизма |
| RU2018121333A RU2756104C2 (ru) | 2013-10-23 | 2014-10-22 | Микроорганизмы для получения О-сукцинилгомосерина и способ получения О-сукцинилгомосерина с использованием указанных микроорганизмов |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2018121333A RU2756104C2 (ru) | 2013-10-23 | 2014-10-22 | Микроорганизмы для получения О-сукцинилгомосерина и способ получения О-сукцинилгомосерина с использованием указанных микроорганизмов |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US10221434B2 (ru) |
| EP (1) | EP3061814B1 (ru) |
| JP (1) | JP6388935B2 (ru) |
| KR (1) | KR101565213B1 (ru) |
| CN (1) | CN105829529B (ru) |
| BR (1) | BR112016009089B1 (ru) |
| ES (1) | ES2717939T3 (ru) |
| MY (2) | MY195206A (ru) |
| PL (1) | PL3061814T3 (ru) |
| RU (2) | RU2662654C2 (ru) |
| WO (1) | WO2015060649A1 (ru) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP6946479B2 (ja) * | 2017-06-30 | 2021-10-06 | シージェイ チェイルジェダング コーポレイション | 新規なｏ−スクシニルホモセリントランスフェラーゼ変異体及びこれを用いたｏ−スクシニルホモセリンの製造方法 |
| RU2747493C1 (ru) * | 2017-06-30 | 2021-05-05 | СиДжей ЧеилДжеданг Корпорейшн | Новый вариант О-сукцинилгомосеринтрансферазы и способ получения О-сукцинилгомосерина с использованием этого варианта |
| CN108949661B (zh) * | 2018-07-27 | 2021-06-08 | 浙江工业大学 | 一种产o-琥珀酰-l-高丝氨酸重组大肠杆菌及其应用 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2280687C2 (ru) * | 2003-02-06 | 2006-07-27 | Консорциум фюр электрохемише Индустри ГмбХ | Клетка микроорганизма, плазмидный вектор, способ создания клетки микроорганизма и способ получения l-метионина |
| US7851180B2 (en) * | 2008-04-04 | 2010-12-14 | Cj Cheiljedang Corporation | Microorganism producing L-methionine precursor and the method of producing L-methionine precursor using the microorganism |
| US20110053253A1 (en) * | 2009-08-28 | 2011-03-03 | Cj Cheiljedang Corporation | Microorganism producing o-acetyl-homoserine and the method of producing o-acetyl-homoserine using the microorganism |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7029893B2 (en) * | 2003-02-28 | 2006-04-18 | Ajinomoto Co., Inc. | Polynucleotides encoding polypeptides involved in amino acid biosynthesis in methylophilus methylotrophus |
| KR100576342B1 (ko) | 2004-02-05 | 2006-05-03 | 씨제이 주식회사 | ｇａｌＲ 유전자가 불활성화된 Ｌ-쓰레오닌 생성 미생물,그를 제조하는 방법 및 상기 미생물을 이용한Ｌ-쓰레오닌의 제조방법 |
| KR100620092B1 (ko) | 2004-12-16 | 2006-09-08 | 씨제이 주식회사 | 코리네박테리움 속 세포로부터 유래된 신규한 프로모터서열, 그를 포함하는 발현 카세트 및 벡터, 상기 벡터를포함하는 숙주 세포 및 그를 이용하여 유전자를 발현하는방법 |
| KR100905381B1 (ko) * | 2006-07-28 | 2009-06-30 | 씨제이제일제당 (주) | Ｌ-메치오닌 전구체 생산 균주 및 상기 ｌ-메치오닌전구체로부터의 ｌ-메치오닌 및 유기산의 생산방법 |
| EP2132306B1 (en) * | 2007-04-11 | 2012-12-19 | CJ CheilJedang Corporation | Compositions and methods of producing methionine |
| KR101136248B1 (ko) * | 2008-04-04 | 2012-04-20 | 씨제이제일제당 (주) | Ｌ-메치오닌 전구체 생산 균주 및 이를 이용한 ｌ-메치오닌 전구체의 생산 방법 |
| US8609396B2 (en) * | 2009-08-28 | 2013-12-17 | Cj Cheiljedang Corporation | Microorganism producing O-acetyl-homoserine and the method of producing O-acetyl-homoserine using the microorganism |
| WO2012087039A2 (ko) * | 2010-12-21 | 2012-06-28 | 씨제이제일제당 (주) | 호모세린 아세틸 트랜스퍼라제 활성을 가지는 변이형 폴리펩티드 및 이를 발현하는 미생물 |
-
2013
- 2013-10-23 KR KR1020130126602A patent/KR101565213B1/ko active IP Right Grant
-
2014
- 2014-10-22 US US15/031,707 patent/US10221434B2/en active Active
- 2014-10-22 MY MYPI2018704183A patent/MY195206A/en unknown
- 2014-10-22 JP JP2016525939A patent/JP6388935B2/ja active Active
- 2014-10-22 CN CN201480070310.9A patent/CN105829529B/zh active Active
- 2014-10-22 RU RU2016116154A patent/RU2662654C2/ru active
- 2014-10-22 ES ES14855796T patent/ES2717939T3/es active Active
- 2014-10-22 BR BR112016009089-6A patent/BR112016009089B1/pt active IP Right Grant
- 2014-10-22 WO PCT/KR2014/009970 patent/WO2015060649A1/ko active Application Filing
- 2014-10-22 MY MYPI2016701452A patent/MY193748A/en unknown
- 2014-10-22 RU RU2018121333A patent/RU2756104C2/ru active
- 2014-10-22 PL PL14855796T patent/PL3061814T3/pl unknown
- 2014-10-22 EP EP14855796.0A patent/EP3061814B1/en active Active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2280687C2 (ru) * | 2003-02-06 | 2006-07-27 | Консорциум фюр электрохемише Индустри ГмбХ | Клетка микроорганизма, плазмидный вектор, способ создания клетки микроорганизма и способ получения l-метионина |
| US7851180B2 (en) * | 2008-04-04 | 2010-12-14 | Cj Cheiljedang Corporation | Microorganism producing L-methionine precursor and the method of producing L-methionine precursor using the microorganism |
| US20110053253A1 (en) * | 2009-08-28 | 2011-03-03 | Cj Cheiljedang Corporation | Microorganism producing o-acetyl-homoserine and the method of producing o-acetyl-homoserine using the microorganism |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| база данных EMBL-EBI: AAQ58462, 07.04.2007 * |
| база данных UniProtKB - Q7NZY3, 15.03.2005. * |
| база данных UniProtKB - Q7NZY3, 15.03.2005. база данных EMBL-EBI: * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| MY193748A (en) | 2022-10-27 |
| MY195206A (en) | 2023-01-11 |
| RU2016116154A (ru) | 2017-11-28 |
| EP3061814B1 (en) | 2019-02-27 |
| RU2018121333A (ru) | 2019-03-05 |
| EP3061814A4 (en) | 2017-06-07 |
| KR101565213B1 (ko) | 2015-11-03 |
| CN105829529B (zh) | 2019-11-08 |
| CN105829529A (zh) | 2016-08-03 |
| JP6388935B2 (ja) | 2018-09-12 |
| US20160304920A1 (en) | 2016-10-20 |
| RU2018121333A3 (ru) | 2020-12-15 |
| KR20150047665A (ko) | 2015-05-06 |
| BR112016009089B1 (pt) | 2023-03-28 |
| BR112016009089A2 (pt) | 2017-09-19 |
| US10221434B2 (en) | 2019-03-05 |
| PL3061814T3 (pl) | 2019-08-30 |
| JP2016533730A (ja) | 2016-11-04 |
| WO2015060649A1 (ko) | 2015-04-30 |
| EP3061814A1 (en) | 2016-08-31 |
| RU2756104C2 (ru) | 2021-09-28 |
| ES2717939T3 (es) | 2019-06-26 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP5536496B2 (ja) | Ｏ−アセチル−ホモセリン生産菌株およびこれを用いてｏ−アセチチル−ホモセリンを生産する方法 | |
| KR101335841B1 (ko) | 호모세린 아세틸 트랜스퍼라제 활성을 가지는 변이형 폴리펩티드 및 이를 발현하는 미생물 | |
| JP6607974B2 (ja) | Ｏ−アセチルホモセリンを生産する微生物及びそれを用いてｏ−アセチルホモセリンを生産する方法 | |
| RU2676137C2 (ru) | Микроорганизм для продуцирования О-ацетилгомосерина и способ получения О-ацетилгомосерина с использованием этого микроорганизма | |
| RU2662654C2 (ru) | Микроорганизм для получения о-сукцинилгомосерина и способ получения о-сукцинилгомосерина с использованием указанного микроорганизма | |
| RU2651519C2 (ru) | Микроорганизмы для получения о-сукцинилгомосерина и способ получения о-сукцинилгомосерина с использованием указанных микроорганизмов | |
| RU2651517C2 (ru) | Микроорганизмы для получения О-сукцинилгомосерина и способ получения О-сукцинилгомосерина с использованием указанных микроорганизмов | |
| JP2017516488A (ja) | Ｏ−スクシニルホモセリンまたはコハク酸の生産能を有する微生物、及びそれを利用したコハク酸またはｏ−スクシニルホモセリンの生産方法 |