RU2654228C1 - Способ активации эритропоэза лабораторных животных после лучевой нагрузки - Google Patents
Способ активации эритропоэза лабораторных животных после лучевой нагрузки Download PDFInfo
- Publication number
- RU2654228C1 RU2654228C1 RU2017104771A RU2017104771A RU2654228C1 RU 2654228 C1 RU2654228 C1 RU 2654228C1 RU 2017104771 A RU2017104771 A RU 2017104771A RU 2017104771 A RU2017104771 A RU 2017104771A RU 2654228 C1 RU2654228 C1 RU 2654228C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cells
- laboratory animals
- activating
- radiation exposure
- mmsc
- Prior art date
Links
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 title claims abstract description 14
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 14
- 238000010171 animal model Methods 0.000 title claims abstract description 11
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 title claims abstract description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 28
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 claims abstract description 22
- 230000010437 erythropoiesis Effects 0.000 claims abstract description 7
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 claims abstract description 7
- 210000001136 chorion Anatomy 0.000 claims abstract description 6
- 210000002536 stromal cell Anatomy 0.000 claims abstract description 5
- 238000011316 allogeneic transplantation Methods 0.000 claims abstract description 4
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 claims abstract description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 7
- 210000001995 reticulocyte Anatomy 0.000 abstract description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 4
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 abstract description 4
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 abstract description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 11
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 7
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 5
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 5
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 description 5
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 4
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 4
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 4
- 230000005757 colony formation Effects 0.000 description 3
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108090000397 Caspase 3 Proteins 0.000 description 2
- 102100029855 Caspase-3 Human genes 0.000 description 2
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 2
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 2
- 102000016359 Fibronectins Human genes 0.000 description 2
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 2
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000011132 hemopoiesis Effects 0.000 description 2
- 230000001744 histochemical effect Effects 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 230000002188 osteogenic effect Effects 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 2
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 2
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 2
- 108010006533 ATP-Binding Cassette Transporters Proteins 0.000 description 1
- 102000005416 ATP-Binding Cassette Transporters Human genes 0.000 description 1
- 101150084229 ATXN1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- -1 CD 54 Proteins 0.000 description 1
- 208000020446 Cardiac disease Diseases 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- 102000012422 Collagen Type I Human genes 0.000 description 1
- 108010022452 Collagen Type I Proteins 0.000 description 1
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003964 Histone deacetylase Human genes 0.000 description 1
- 108090000353 Histone deacetylase Proteins 0.000 description 1
- 101000738771 Homo sapiens Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Proteins 0.000 description 1
- 102000012355 Integrin beta1 Human genes 0.000 description 1
- 108010022222 Integrin beta1 Proteins 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- 102000007547 Laminin Human genes 0.000 description 1
- 108010085895 Laminin Proteins 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 101001065556 Mus musculus Lymphocyte antigen 6G Proteins 0.000 description 1
- NPGIHFRTRXVWOY-UHFFFAOYSA-N Oil red O Chemical compound Cc1ccc(C)c(c1)N=Nc1cc(C)c(cc1C)N=Nc1c(O)ccc2ccccc12 NPGIHFRTRXVWOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000016611 Proteoglycans Human genes 0.000 description 1
- 108010067787 Proteoglycans Proteins 0.000 description 1
- 102100037422 Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Human genes 0.000 description 1
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 1
- 238000011892 Von Kossa's method Methods 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 230000002293 adipogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 235000004251 balanced diet Nutrition 0.000 description 1
- 239000007640 basal medium Substances 0.000 description 1
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000010478 bone regeneration Effects 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000002975 chemoattractant Substances 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 229940096422 collagen type i Drugs 0.000 description 1
- 108010041473 complement C3e Proteins 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 1
- 229910003460 diamond Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010432 diamond Substances 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 description 1
- 208000019622 heart disease Diseases 0.000 description 1
- 230000017323 hematopoietic stem cell migration to bone marrow Effects 0.000 description 1
- 230000003832 immune regulation Effects 0.000 description 1
- 238000003365 immunocytochemistry Methods 0.000 description 1
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000005865 ionizing radiation Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 229920000609 methyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001923 methylcellulose Substances 0.000 description 1
- 230000003562 morphometric effect Effects 0.000 description 1
- 238000013425 morphometry Methods 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 230000009818 osteogenic differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 230000003169 placental effect Effects 0.000 description 1
- 210000005059 placental tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000026341 positive regulation of angiogenesis Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 102220240796 rs553605556 Human genes 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- 238000003307 slaughter Methods 0.000 description 1
- 201000003624 spinocerebellar ataxia type 1 Diseases 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 210000000225 synapse Anatomy 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 210000002993 trophoblast Anatomy 0.000 description 1
- 210000003934 vacuole Anatomy 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/44—Vessels; Vascular smooth muscle cells; Endothelial cells; Endothelial progenitor cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
- C12N5/0662—Stem cells
- C12N5/0663—Bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSC)
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Vascular Medicine (AREA)
- Virology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области ветеринарии и представляет собой способ активации эритропоэза лабораторных животных после лучевой нагрузки, отличающийся тем, что лабораторным животным проводят внутривенную аллогенную трансплантацию мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК) в количестве 5,9 млн клеток/кг и гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) в количестве 295 тыс. клеток/кг, выделенных из хориона плаценты. Изобретение обеспечивает увеличение количества ретикулоцитов в периферической крови. 1 табл.
Description
Изобретение относится к области медицины и предназначено для восстановления регенерации костного мозга лабораторных животных (мыши).
Известно использование сочетанной трансплантации мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК) и гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) для восстановления селезенки после лучевой нагрузки (Патент RU №2551937, МПК G09B 23/28, А61К 35/44, А61Р 43/00, опубл. 10.06.2015). В данном способе лабораторным мышам через час после облучения проводят внутривенную аллогенную трансплантацию ММСК в дозе 6,5 млн клеток/кг и ГСК в дозе 400 тыс. клеток/кг, полученных из плаценты самок-мышей при сроке гестации 14 дней.
Этот способ предназначен только для восстановления основных морфометрических показателей селезенки.
Наиболее близким техническим решением к заявляемому является способ активации кроветворения введением РНК в дозе 30 мкг/100 г массы животного (крысы) в условиях воздействия ионизирующего облучения в дозе 6 Гр (Геворкян Н.М. Влияние предварительного введения суммарной РНК клеток костного мозга на динамику восстановления эритропоэза у крыс после острого гамма-облучения / Н.М. Геворкян, Н.В. Тишевская, А.А. Болотов // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2016. - Т. 161, №5. - С. 670-673.) - прототип.
Данный способ используют для восстановления эритропоэза у крыс, однако количество ретикулоцитов в периферической крови недостаточно высокое.
Задачей данного изобретения является расширение арсенала средств, способных приводить к активации эритропоэза.
Технический результат, который будет получен от использования изобретения, заключается в увеличении количества ретикулоцитов в периферической крови.
Технический результат достигается путем сочетанной внутривенной аллогенной трансплантации мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК) в количестве 5,9 млн клеток/кг и гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) в количестве 295 тыс. клеток/кг, выделенных из хориона плаценты.
Сущность изобретения состоит в эффективном взаимодействии заявляемого количественного состава ММСК и ГСК, выделенных из хориона плаценты, и эффективном влиянии их на восстановление гемопоэза.
Эффективность применения ММСК в качестве котрансплантата при введении ГСК обусловлена тем, что они вырабатывают цитокины и факторы роста, необходимые для хоуминга и дифференцировки гемопоэтических стволовых клеток (Kavanagh D.J. et al., 2011, Kavanagh, D.J. Hematopoietic stem cell homing to injured tissues / D.J. Kavanagh, N. Kali // Stem Cell Revolution. - 2011. - Vol. 7. - P. 672-682.
ММСК синтезируют компоненты матрикса, в том числе фибронектин, ламинин, коллаген и протеогликаны. При этом ММСК способны дифференцироваться в клетки стромы, которая обеспечивает синтез экстрацеллюлярного матрикса, формирующего микроокружение, необходимое для пролиферации и дифференцировки стволовых клеток (Chow A. et al., 2011; Jones Е. et al., 2011, Chow, A. Bone marrow CD169 macrophages promote the retention of hematopoietic stem and progenitor cells in the mesenchymal stem cell niche / A. Chow, D. Lucas, A. Hidalgo, S. Mendez-Ferrer, D. Hashimoto, C. Scheiermann // Journal of Experimental Medicine. - 2011. - Vol. 208. - P. 261-271; Jones, E. Mesenchymal stem cells and bone regeneration: current status / E. Jones, X. Yang // Injury. - 2011. - Vol. 42. - P. 562-568).
Кроме того, ММСК обладают свойством продуцировать противовоспалительные цитокины, а также обеспечивать стимуляцию ангиогенеза (Kavanagh Н. et al., 2011; Kidd S. et al., 2010).
Способность ММСК оказывать иммуносупрессивное действие может обеспечить приживление аллогенного трансплантата (Aldinucci A. et al., 2010; Gebler A. et al., 2012; Han Z. et al., 2012, Aldinucci, A. Inhibition of immune synapse by altered dendritic cell actin distribution: a new pathway of mesenchymal stem cell immune regulation / A. Aldinucci, L. Rizzetto, L. Pieri // Journal of Immunology. - 2010. - Vol. - 185, №9. - P. 5102-5110).
Выделение ММСК хемоаттрактантов для ГСК обеспечивает направленный хоуминг ГСК, а формирование соответствующего микроокружения дополнительно улучшает приживление трансплантированных аллогенных ГСК (Zhang Y. et al., 2004, Jorgensen С. et al., 2010).
Из анализа научно-технической и патентной литературы эффективного влияния на активацию эритропоэза заявляемой совокупности признаков нами не выявлено, что позволяет сделать вывод о соответствии заявляемого технического решения критериям «новизна» и «изобретательский уровень».
Изобретение осуществляется следующим образом.
Эксперименты выполнены на 20 зрелых лабораторных мышах-самцах в возрасте 6-8 месяцев с массой 20-22 г. Животные содержались в стандартных условиях лабораторного вивария при естественном освещении и сбалансированном рационе.
Лабораторные животные были разделены на две группы: опытную и контрольную. Лабораторным животным опытной группы внутривенно вводились ММСК и ГСК соответственно в дозе 5,9 млн. клеток/кг и 295 тыс. клеток/кг, суспендированных в 0,2 мл 0,9% NaCl. Животным контрольной подгруппы вводили 0,2 мл 0,9% NaCl внутривенно. Забой лабораторных животных осуществлялся на 7 сутки трансплантации клеток.
Клеточные культуры
Получение клеточной культуры ММСК и ГСК производилось из хориона плаценты лабораторных животных. При этом мононуклеарная фракция клеток была получена путем последовательной механической и ферментативной (раствор аккутазы (Millipore, США, Kidder В. L.HDAC1 regulates pluripotency and lineage specific transcriptional networks in embryonic and trophoblast stem cells / B.L. Kidder, S. Palmer // Nucleic Acids Res. - 2011. - P. 1-15) обработки ткани плаценты.
Выделение ГСК осуществлялось методом позитивной иммуномагнитной сепарации по антигенам SCA-1 (StemCell Technologies, США) и CD 117 (StemCell Technologies, США) (Uchida, N. ABC transporter activities of murine hematopoietic stem cells vary according to their developmental and activation status / N. Uchida, B. Dykstra, K. Lyons, F. Leung, M. Kristiansen, C. Eaves // Blood. - 2004. - Vol. 103, №12. - P. 4487-4495).
Проточная цитометрия была проведена на цитометре FACS Calibur (BD Bioscienses, США). В суспензии трансплантируемых клеток оценивалось содержание ГСК с иммунофенотипом положительных по CD117, Sca-1 и отрицательных по Lin-(CD45, С3е, Ly-6G, M1/70, Ter-119).
В качестве изотипического контроля для антител при проведении позитивной иммуномагнитной сепарации по SCA-1 и CD117 были использованы антитела РЕ labeled Rat IgG2a, kappa isotype control (BD Bioscienses). С целью определения Lin антигенов на поверхности клеток был использован набор антител - FITC anti-mouse Lineage Coctail with isotype control (Biolegend, США).
Проведенные исследования позволили установить, что содержание клеток после иммуномагнитной сепарации с иммунофенотипом CD117+ (рис. 1), Sca-1+, Lin- составило 70-93%.
Тест колониеобразования. С целью определения функциональной способности клеток, выделенных с помощью позитивной иммуномагнитной сепарации (Sca1+, CD 117+, Lin-), был проведен стандартный тест колониеобразования в метилцеллюлозной среде MethoCult (StemCell Technologies, Канада). Данный тест позволяет установить способность полученных клеток формировать различные типы гемопоэтических колоний. Образование колоний было зарегистрировано под инвертированным микроскопом Unico (США).
Культура ММСК. С целью получения первичной культуры ММСК осуществлялся пассаж мононуклеарной фракции клеток, выделенной из хориона плаценты, в специализированной среде для культивирования ММСК в чашки Петри в концентрации 1×106 клеток на 1 см2. Культивирование ММСК проводилось в условиях СО2 - инкубатора при температуре 37°С с содержанием углекислого газа 5% и влажностью 90%. Через 24-48 часов инкубации не прикрепленные к дну чашки Петри клетки аспирировали. Среду для культивирования ММСК добавляли к прикрепленным к пластику клеткам. Замена среды проводилась каждые 3-4 сутки до достижения клетками 70-80% конфлюэнтности. При формировании соответствующего монослоя осуществлялся пересев клеток.
При трансплантации лабораторным животным была использована культура ММСК третьего пассажа.
Иммуноцитохимия. Для подтверждения принадлежности культуры к ММСК производилась окраска клеток с помощью набора антител Mesenchymal Stem Cell Characterization Kit (Millipore, США), содержащего позитивные (антитела к integrin β1, CD 54, collagen type I и fibronectin) и негативные маркеры (антитела к CD 14, CD 45).
Производилась дифференцировка полученной культуры в адипоцитарном и остеогенном направлениях. Состав среды, индуцирующей дифференцировку: MesenCult™ Osteogenic Stimulatory Supplement («StemCell Technologies», Канада) / MesenCult™ Adipogenic Stimulatory Supplement («StemCell Technologies», Канада) и MesenCult™ MSC Basal Medium (Mouse) («StemCell Technologies», Канада) в соотношении 1:4, 2 ммоль раствора L-глутамина («StemCell Technologies», Канада). Факт остеогенной дифференцировки подтвержден гистохимическим методом регистрации увеличения экспрессии щелочной фосфатазы, а также с помощью окраски von Kossa, выявляющей наличие минерализованного фосфата кальция. Способность клеток дифференцироваться в адипоцитарном направлении подтверждена гистохимическим методом регистрации липидных вакуолей, окрашивающихся красителем Oil Red О (J.J. Minguell et al., 2004, Minguell, J.J. Mesenchymal stem cells and the treatment of cardiac disease / J.J. Minguell, A. Erices // Experimental Biology and Medicine. - 2006. - Vol. 231, №1. - P. 39-49
Подсчет и определение жизнеспособности клеток. Жизнеспособность клеток была определена с помощью суправитальной окраски раствором трипанового синего. Подсчет клеток производился в 5 больших квадратах камеры Горяева (или ≥100 клеток). Жизнеспособность выделенных клеток перед трансплантацией составляла 95-97%.
Морфологическое исследование крови
Кровь для исследования брали у мышей из хвостовой вены. Подсчет количества эритроцитов проводили в счетной камере Горяева (Кост Е.А. Справочник по клиническим лабораторным методам исследования. - 2-е изд., испр. и доп. - М.: Медицина, 1975. - 360 с.).
При определении числа ретикулоцитов их подсчитывали в окрашенных бриллиант - крезил - блау мазках крови на 2000 эритроцитов. (Кост Е.А. Справочник по клиническим лабораторным методам исследования. - 2-е изд., испр. и доп. - М.: Медицина, 1975. - 360 с.).
Препараты были исследованы с помощью микроскопа Micros МС-50 (Австрия), фоторегистрацию осуществляли цифровой камерой cam V400.
Статистический анализ
Для каждого ряда значений показателя вычисляли среднюю арифметическую, стандартную ошибку среднего. Достоверность отличий в сравниваемых выборках проведено по критерию Манна-Уитни (U). Статистическая обработка данных проведена с помощью программного пакета SPSS Statistics (версия 17.0). Вероятность различий считалась достоверной при значениях р<0,05.
Как видно из таблицы, на 7 сутки по заявляемому способу содержание ретикулоцитов в периферической крови существенно выше, чем в прототипе. Таким образом выявлено, что трансплантация плацентарных ММСК и ГСК по заявляемому способу обеспечивает активацию эритропоэза в существенно большей степени, чем способ по прототипу.
Claims (1)
- Способ активации эритропоэза лабораторных животных после лучевой нагрузки, отличающийся тем, что лабораторным животным проводят внутривенную аллогенную трансплантацию мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК) в количестве 5,9 млн клеток/кг и гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) в количестве 295 тыс. клеток/кг, выделенных из хориона плаценты.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017104771A RU2654228C1 (ru) | 2017-02-14 | 2017-02-14 | Способ активации эритропоэза лабораторных животных после лучевой нагрузки |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017104771A RU2654228C1 (ru) | 2017-02-14 | 2017-02-14 | Способ активации эритропоэза лабораторных животных после лучевой нагрузки |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2654228C1 true RU2654228C1 (ru) | 2018-05-17 |
Family
ID=62153028
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2017104771A RU2654228C1 (ru) | 2017-02-14 | 2017-02-14 | Способ активации эритропоэза лабораторных животных после лучевой нагрузки |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2654228C1 (ru) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2551937C1 (ru) * | 2013-12-26 | 2015-06-10 | Государственное бюджетное учреждение здравоохранения Свердловской области "Центр организации специализированных видов медицинской помощи "Институт медицинских клеточных технологий" (ГБУЗСО Институт медицинских клеточных технологий) | Способ восстановления селезенки после лучевой нагрузки |
-
2017
- 2017-02-14 RU RU2017104771A patent/RU2654228C1/ru active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2551937C1 (ru) * | 2013-12-26 | 2015-06-10 | Государственное бюджетное учреждение здравоохранения Свердловской области "Центр организации специализированных видов медицинской помощи "Институт медицинских клеточных технологий" (ГБУЗСО Институт медицинских клеточных технологий) | Способ восстановления селезенки после лучевой нагрузки |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| MEULEMAN N. et al. Mesenchymal stromal cells: exvivo amplification and clinical application in hematopoietic stem cell transplantation. Belg J Hematol. 2010, (1): 35-38 стр. 36. * |
| ГРЕБНЕВ Д. Ю. Влияние стволовых клеток на процессы регенерации быстрообновляющихся тканей при старении и после воздействия экстремальных факторов Автореф. дисс. доктора мед. наук. Екатеринбург, 2015 [Найдено] [он-лайн]. Найдено из Интернет, научная библиотека диссертаций и автоов disserCat: URL: http://medical-diss.com/medicina/vliyanie-stvolovyh-kletok-na-protsessy-regeneratsii-bystroobnovlyayuschihsya-tkaney-pri-starenii-i-posle-vozdeystviya-eks#ixzz4vOKihe7u весь документ. * |
| ГРЕБНЕВ Д. Ю. Влияние стволовых клеток на процессы регенерации быстрообновляющихся тканей при старении и после воздействия экстремальных факторов Автореф. дисс. доктора мед. наук. Екатеринбург, 2015 [Найдено] [он-лайн]. Найдено из Интернет, научная библиотека диссертаций и авторефератов disserCat: URL: http://medical-diss.com/medicina/vliyanie-stvolovyh-kletok-na-protsessy-regeneratsii-bystroobnovlyayuschihsya-tkaney-pri-starenii-i-posle-vozdeystviya-eks#ixzz4vOKihe7u весь документ. ЛАНГЕ К. Мезенхимальные стромальные клетки защищают от острой лучевой болезни: понимание возможных механизмов. Университетский госпиталь Гамбург-Эппендорф. 2015, стр. 58-70 весь документ. MEULEMAN N. et al. Mesenchymal stromal cells: exvivo amplification and clinical application in hematopoietic stem cell transplantation. Belg J Hematol. 2010, (1): 35-38 стр. 36. * |
| ЛАНГЕ К. Мезенхимальные стромальные клетки защищают от острой лучевой болезни: понимание возможных механизмов. Университетский госпиталь Гамбург-Эппендорф. 2015, стр. 58-70 весь документ. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP6548714B2 (ja) | 放射線照射または化学物質による傷害を治療するための方法 | |
| Zlotoff et al. | Hematopoietic progenitor migration to the adult thymus | |
| Fiegel et al. | Characterization of cell types during rat liver development | |
| BRPI0709349A2 (pt) | métodos para expansão celular e usos de células e de meios condicionados produzidos através deles para terapia | |
| Tiwari et al. | Impact of oxygen levels on human hematopoietic stem and progenitor cell expansion | |
| Howell et al. | Hematopoietic potential of murine skeletal muscle–derived CD45− Sca-1+ c-kit− cells | |
| US20150329827A1 (en) | Muse cells isolation and expansion | |
| JPWO2020066991A1 (ja) | アカルボース又はスタキオースを含む哺乳動物細胞保存用液 | |
| KR101380561B1 (ko) | 말과동물 양수 유래 다분화능 줄기세포 및 그 제조방법 | |
| Ghasemzadeh et al. | Comparable osteogenic capacity of mesenchymal stem or stromal cells derived from human amnion membrane and bone marrow | |
| TWI642781B (zh) | 具優異細胞保護及免疫調節之ｑｕａｄｒｉ－正之基質細胞 | |
| US9650604B2 (en) | Equine amniotic membrane-derived mesenchymal stem cells | |
| RU2639404C1 (ru) | Способ восстановления лимфоидной ткани селезенки лабораторных животных | |
| CN102282251A (zh) | 用于长期造血种群恢复的方法和组合物 | |
| RU2654228C1 (ru) | Способ активации эритропоэза лабораторных животных после лучевой нагрузки | |
| RU2729931C1 (ru) | Способ восстановления биохимических показателей периферической крови лабораторных животных с циррозом печени | |
| US20150353897A1 (en) | Method of generating multilineage potential cells | |
| RU2628092C1 (ru) | Способ получения МСК-ассоциированных недифференцированных гемопоэтических клеток-предшественников с фенотипов CD34+/CD133+ | |
| Pavlović et al. | Animal and plant stem cells | |
| Rao et al. | Structural and functional characterization of deceased donor stem cells: a viable alternative to living donor stem cells | |
| Davydova | Stem cells in human amniotic fluid | |
| CN101506353A (zh) | 外周造血干细胞的处理方法 | |
| KR20200141447A (ko) | Ipsc-유래 세포 조성물, 및 연골 수복을 위한 관련된 시스템 및 방법 | |
| Filip et al. | Homing of lin−/CD117+ hematopoietic stem cells | |
| RU2739855C1 (ru) | Способ восстановления биохимических показателей периферической крови лабораторных животных с токсическим гепатитом |