RU2729931C1 - Способ восстановления биохимических показателей периферической крови лабораторных животных с циррозом печени - Google Patents
Способ восстановления биохимических показателей периферической крови лабораторных животных с циррозом печени Download PDFInfo
- Publication number
- RU2729931C1 RU2729931C1 RU2019124348A RU2019124348A RU2729931C1 RU 2729931 C1 RU2729931 C1 RU 2729931C1 RU 2019124348 A RU2019124348 A RU 2019124348A RU 2019124348 A RU2019124348 A RU 2019124348A RU 2729931 C1 RU2729931 C1 RU 2729931C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cells
- laboratory animals
- peripheral blood
- biochemical parameters
- mmsc
- Prior art date
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/48—Reproductive organs
- A61K35/50—Placenta; Placental stem cells; Amniotic fluid; Amnion; Amniotic stem cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61M—DEVICES FOR INTRODUCING MEDIA INTO, OR ONTO, THE BODY; DEVICES FOR TRANSDUCING BODY MEDIA OR FOR TAKING MEDIA FROM THE BODY; DEVICES FOR PRODUCING OR ENDING SLEEP OR STUPOR
- A61M5/00—Devices for bringing media into the body in a subcutaneous, intra-vascular or intramuscular way; Accessories therefor, e.g. filling or cleaning devices, arm-rests
- A61M5/14—Infusion devices, e.g. infusing by gravity; Blood infusion; Accessories therefor
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
-
- G—PHYSICS
- G09—EDUCATION; CRYPTOGRAPHY; DISPLAY; ADVERTISING; SEALS
- G09B—EDUCATIONAL OR DEMONSTRATION APPLIANCES; APPLIANCES FOR TEACHING, OR COMMUNICATING WITH, THE BLIND, DEAF OR MUTE; MODELS; PLANETARIA; GLOBES; MAPS; DIAGRAMS
- G09B23/00—Models for scientific, medical, or mathematical purposes, e.g. full-sized devices for demonstration purposes
- G09B23/28—Models for scientific, medical, or mathematical purposes, e.g. full-sized devices for demonstration purposes for medicine
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Mathematical Analysis (AREA)
- Anesthesiology (AREA)
- Medical Informatics (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Mathematical Optimization (AREA)
- Mathematical Physics (AREA)
- Pure & Applied Mathematics (AREA)
- Business, Economics & Management (AREA)
- Educational Administration (AREA)
- Educational Technology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Computational Mathematics (AREA)
- Algebra (AREA)
- Theoretical Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Vascular Medicine (AREA)
- Hematology (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Pregnancy & Childbirth (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Immunology (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области медицины, в частности к экспериментальной медицине. Для восстановления биохимических показателей периферической крови лабораторных животных с циррозом печени проводят введение мультипотентных мезенхиальных стромальных клеток (ММСК), выделенных из плаценты лабораторных животных, в количестве 4 млн клеток/кг. Дополнительно вводят гемопоэтические стволовые клетки (ГСК), выделенные из плаценты, в количестве 330 тыс. клеток/кг. Способ позволяет восстановить биохимические показатели периферической крови при циррозе печени. 1 табл.
Description
Изобретение относится к области медицины и предназначено для восстановления биохимических показателей периферической крови лабораторных животных (крыс).
Известен способ восстановления лимфоидной ткани селезенки лабораторных животных путем продедения после облучения внутривенной аллогенной трансплантации мультипотентных стромальных клеток (ММСК) в дозе 6,2 млн клеток/кг и гемоплэтичных стволовых клеток (ГСК) в дозе 330 тыс клеток/кг (RU, патент №2639404, МПК G09B/23/28, А61К 35/28, опубл. 21.12.2017 бюл. №36).
Недостатком данного способа является высокая концентрация ММСК (6,2 млн клеток/кг) при их сочетанном введении с ГСК, что может вызвать нарушения гемостаза. (Ефименко А.Ю., Калинина Н.И., Макаревич П.И. Методические рекомендации по проведению доклинических исследований биомедицинских клеточных продуктов. - Москва, 2017. - С. 303.).
Наиболее близким техническим решением к заявляемому является способ восстановления биохимических показателей периферической крови лабораторных животных (крыс) с циррозом печени введением аутогенных ММСК из костного мозга бедренной кости в дозе 2 млн на 100 г (2 млн на кг) Цирроз печени моделировали путем подкожного введения четыреххлористого углерода (CCl4) в виде 50% масляного раствора из расчета 0,3 мл/100 г массы животного, дважды в неделю в течение 12 недель. (Экспериментальное исследование аутогенных мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток в лечении цирроза печени / Б.А. Агаев, P.M. Агаев, А.Г. Попандопуло, Р.Э. Джафарли // Гены и клетки, Том IX, №1. - 2014. С. 58-63.
Недостатком данного способа является высокая концентрация ММСК (6,2 млн клеток/кг) при их сочетанном введении с ГСК, что может вызвать нарушения гемостаза.
Задачей данного изобретения является расширение арсенала средств, способных приводить к восстановлению биохимических показателей периферической крови лабораторных животных с циррозом печени.
Технический результат, который будет получен от использования изобретения, заключается в восстановлении уровня в крови показателей, характеризующих цитолиз гепатоцитов - алананаминотрансфераза (ACT), аспартатаминотрансфераза (ACT), лактатдегидрогенызы (ЛДГ), а также показателей, характеризующих белковый обмен - общий белок, содержание альбуминов.
Технический результат достигается за счет сочетанной внутривенной аллогенной трансплантации мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК), выделенных из плаценты лабораторных животных, в количестве 4 млн. клеток/кг и гемопоэтических стволовых клеток (ГСК), выделенные из плаценты, в количестве 330 тыс. клеток/кг.
Способ позволяет обеспечить восстановление биохимических показателей периферической крови при циррозе печени.
Сущность изобретения обеспечена проведением сочетанной трансплантации лабораторным животным плацентарных ММСК и ГСК в количестве 4 млн. клеток/кг и 330 тыс. клеток/кг соответственно.
Учитывая способность ММСК к выработке фактора роста стволовой клетки (SCF), который через увеличение количества звездчатых клеток печени Ито, обеспечивает увеличение количества гепатоцитов, а также способность ММСК к выработке противовоспалительных цитокинов (ИЛ-10, трансформирующий фактор роста - β), представляется перспективным изучение возможностей активации регенерации печени после ее повреждения с использованием данного вида клеток.
В то же время известно, что ММСК, выделенные из плаценты, обладают большей пролиферативной активностью и большим пролиферативным потенциалом по сравнению с ММСК, выделенными из других источников. Способность ММСК к выработке иммуносупрессивных факторов определяет возможность проведения аллогенной трансплантации.
Заявляемая дозировка подобрана эксперементальным путем и способствует активации регенерации печени.
Из анализа научно-технической и патентной литературы использования плацентарных ММСК и ГСК для восстановления биохимических показателей периферической крови лабораторных животных с циррозом печени не выявлено, что позволяет сделать вывод о соответствии заявляемого технического решения критериям «новизна» и «изобретательский уровень».
Изобретение осуществляется следующим образом.
Эксперименты выполнены на 20 зрелых лабораторных крысах-самцах в возрасте 6-8 месяцев с массой 150-180 г. Животные содержались в стандартных условиях лабораторного вивария при естественном освещении и сбалансированном рационе.
Лабораторные животные были разделены на две группы: опытную и контрольную. Лабораторным животным опытной группы внутривенно вводились ММСК и ГСК соответственно в дозе 4 млн. клеток/кг и 330 тыс. клеток/кг, суспендированные в 0,2 мл 0,9% NaCl. Животным контрольной подгруппы вводили 0,2 мл 0,9% NaCl внутривенно (в портальную вену). Забой лабораторных животных осуществлялся на 8 неделе после трансплантации клеток.
Клеточные культуры
Получение клеточной культуры ММСК и ГСК производилось из хориона плаценты лабораторных животных. При этом мононуклеарная фракция клеток была получена путем последовательной механической и ферментативной (раствор аккутазы (Millipore, США)) обработки ткани плаценты.
Выделение ГСК осуществлялось методом позитивной иммуномагнитной сепарации по антигенам SCA-1 (StemCell Technologies, США) и CD 117 (StemCell Technologies, США) (X. Muniraetal., 2009).
Проточная цитометрия была проведена на цитометре FACS Calibur (BD Bioscienses, США). В суспензии трансплантируемых клеток оценивалось содержание ГСК с иммунофенотипом положительных по CD 117, Sca-1 и отрицательных по Lin- (CD45, С3е, Ly-6G, M1/70, Ter-119).
В качестве изотипического контроля для антител при проведении позитивной иммуномагнитной сепарации по SCA-1 и CD117 были использованы антитела РЕ labeled Rat IgG2a, kappa isotype control (BD Bioscienses). С целью определения Lin антигенов на поверхности клеток был использован набор антител - FITC anti-mouse Lineage Coctail with isotype control (Biolegend, США).
Проведенные исследования позволили установить, что содержание клеток после иммуномагнитной сепарации с иммунофенотипом CD117+ (рис. 1), Sca-1+, Lin- составило 70-93%.
Тест колониеобразования. С целью определения функциональной способности клеток, выделенных с помощью позитивной иммуномагнитной сепарации (Sca1+, CD 117+, Lin-) был проведен стандартный тест колониеобразования в метилцеллюлозной среде MethoCult (StemCell Technologies, Канада). Данный тест позволяет установить способность полученных клеток формировать различные типы гемопоэтических колоний. Образование колоний было зарегистрировано под инвертированным микроскопом Unico (США).
Культура ММСК. С целью получения первичной культуры ММСК осуществлялся пассаж мононуклеарной фракции клеток, выделенной из ткани плаценты, в специализированной среде для культивирования ММСК в чашки Петри в концентрации 1×106 клеток на 1 см2. Культивирование ММСК проводилось в условиях CO2-инкубатора при температуре 37°С с содержанием углекислого газа 5% и влажностью 90%. Через 24-48 часов инкубации не прикрепленные к дну чашки Петри клетки аспирировали. Среду для культивирования ММСК добавляли к прикрепленным к пластику клеткам. Замена среды проводилась каждые 3-4 сутки до достижения клетками 70-80% конфлюэнтности. При формировании соответствующего монослоя осуществлялся пересев клеток.
При трансплантации лабораторным животным была использована культура ММСК третьего пассажа.
Иммуноцитохимия. Для подтверждения принадлежности культуры к ММСК производилась окраска клеток с помощью набора антител MesenchymalStemCellCharacterizationKit (Millipore, США), содержащего позитивные (антитела к integrin β1, CD 54, collagentypeI и fibronectin) и негативные маркеры (антитела к CD 14, CD 45).
Производилась дифференцировка полученной культуры в адипоцитарном и остеогенном направлениях. Состав среды, индуцирующей дифференцировку: MesenCult™ Osteogenic Stimulatory Supplement («StemCell Technologies», Канада) / MesenCult™ Adipogenic Stimulatory Supplement («StemCell Technologies», Канада) и MesenCult™ MSC Basal Medium (Mouse) («StemCellT echnologies», Канада) в соотношении 1:4, 2 ммоль раствора L-глутамина («StemCell Technologies», Канада). Факт остеогенной дифференцировки подтвержден гистохимическим методом регистрации увеличения экспрессии щелочной фосфатазы, а также с помощью окраски vonKossa, выявляющей наличие минерализованного фосфата кальция. Способность клеток дифференцироваться в адипоцитарном направлении подтверждена гистохимическим методом регистрации липидных вакуолей, окрашивающихся красителем Oil RedO (J. J. Minguelletal., 2004).
Подсчет и определение жизнеспособности клеток. Жизнеспособность клеток была определена с помощью суправитальной окраски раствором трипанового синего. Подсчет клеток производился в 5 больших квадратах камеры Горяева (или ≥100 клеток). Жизнеспособность выделенных клеток перед трансплантацией составляла 95-97%.
Моделирование цирроза печени
Цирроз печени моделировали путем подкожного введения четыреххлористого углерода (CCl4) в виде 50% масляного раствора из расчета 0,3 мл/100 г массы животного, дважды в неделю в течение 12 недель. Цирроз печени был верифицирован по биохимическим и морфологическим критериям (фиброз с формированием соединительнотканных септ и ложных долек, дистрофия и некроз гепатоцитов).
Трансплантация ММСК и ГСК
Трансплантацию плацентарных ММСК и ГСК осуществляли в портальную вену.
Производилась оценка биохимических показателей периферической крови на автоматическом биохимическом и иммуноферментном анализаторе Chem Well 2910 (Combi) после трансплантации клеток. Изучались следующие биохимические показатели: альбумин, общий белок, аспартатаминотрансфераза (ACT), аланинаминотрансфераза (АЛТ), лактатдегидрогеназа (ЛДГ).
Достоверность отличий в сравниваемых выборках проведено с применением непараметрического (рангового) метода Манна-Уитни. Статистическая обработка данных проведена с помощью программного пакета SPSS Statistics (версия 17,0).
Как видно из таблицы №1, по заявляемому способу биохимические показатели периферической крови, отражающие степень выраженности цитолиза гепатоцитов существенно ниже (АЛТ, ACT, ЛДГ), чем в прототипе. При этом показатели белкового обмена (общий белок, альбумины) увеличились и достоверно отличаются от прототипа. Таким образом, полученные биохимические данные периферической крови свидетельствуют о снижении цитолиза в печени и восстановлении до значений нормы белок синтетической функции печени. Анализ полученных данных позволяет сделать вывод, что сочетанная трансплантация плацентарных ММСК и ГСК способствует восстановлению биохимических показателей периферической крови при циррозе печени в большей степени, чем трансплантация аутогенных ММСК.
Claims (1)
- Способ восстановления биохимических показателей периферической крови лабораторных животных с циррозом печени, включающий введение мультипотентных мезенхиальных стромальных клеток (ММСК), отличающийся тем, что используют ММСК, выделенные из плаценты лабораторных животных, в количестве 4 млн клеток/кг и дополнительно вводят гемопоэтические стволовые клетки (ГСК), выделенные из плаценты, в количестве 330 тыс. клеток/кг.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2019124348A RU2729931C1 (ru) | 2019-07-29 | 2019-07-29 | Способ восстановления биохимических показателей периферической крови лабораторных животных с циррозом печени |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2019124348A RU2729931C1 (ru) | 2019-07-29 | 2019-07-29 | Способ восстановления биохимических показателей периферической крови лабораторных животных с циррозом печени |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2729931C1 true RU2729931C1 (ru) | 2020-08-13 |
Family
ID=72086280
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2019124348A RU2729931C1 (ru) | 2019-07-29 | 2019-07-29 | Способ восстановления биохимических показателей периферической крови лабораторных животных с циррозом печени |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2729931C1 (ru) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2765912C1 (ru) * | 2021-07-29 | 2022-02-04 | Государственное автономное учреждение здравоохранения Свердловской области "Центр специализированных видов медицинской помощи "Институт медицинских клеточных технологий" | Способ выделения звездчатых клеток печени |
RU2802673C1 (ru) * | 2022-11-07 | 2023-08-30 | Государственное автономное учреждение здравоохранения Свердловской области "Центр специализированных видов медицинской помощи "Институт медицинских клеточных технологий" (ГАУЗ СО "ИМКТ") | Способ лечения фиброза печени аллогенной трансплантацией мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК) лабораторных животных |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2368384C2 (ru) * | 2007-08-24 | 2009-09-27 | Федеральное государственное учреждение "Научный Центр акушерства, гинекологии и перинатологии Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи" | Биотрансплантат, способ лечения хронических заболеваний печени и способ лечения цирроза печени и портальной гипертензии |
RU2639404C1 (ru) * | 2016-08-24 | 2017-12-21 | Государственное автономное учреждение здравоохранения Свердловской области "Центр специализированных видов медицинской помощи "Институт медицинских клеточных технологий" | Способ восстановления лимфоидной ткани селезенки лабораторных животных |
-
2019
- 2019-07-29 RU RU2019124348A patent/RU2729931C1/ru active
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2368384C2 (ru) * | 2007-08-24 | 2009-09-27 | Федеральное государственное учреждение "Научный Центр акушерства, гинекологии и перинатологии Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи" | Биотрансплантат, способ лечения хронических заболеваний печени и способ лечения цирроза печени и портальной гипертензии |
RU2639404C1 (ru) * | 2016-08-24 | 2017-12-21 | Государственное автономное учреждение здравоохранения Свердловской области "Центр специализированных видов медицинской помощи "Институт медицинских клеточных технологий" | Способ восстановления лимфоидной ткани селезенки лабораторных животных |
Non-Patent Citations (5)
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2765912C1 (ru) * | 2021-07-29 | 2022-02-04 | Государственное автономное учреждение здравоохранения Свердловской области "Центр специализированных видов медицинской помощи "Институт медицинских клеточных технологий" | Способ выделения звездчатых клеток печени |
RU2802673C1 (ru) * | 2022-11-07 | 2023-08-30 | Государственное автономное учреждение здравоохранения Свердловской области "Центр специализированных видов медицинской помощи "Институт медицинских клеточных технологий" (ГАУЗ СО "ИМКТ") | Способ лечения фиброза печени аллогенной трансплантацией мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК) лабораторных животных |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Wang et al. | A toxicity study of multiple-administration human umbilical cord mesenchymal stem cells in cynomolgus monkeys | |
Cesselli et al. | Multipotent progenitor cells are present in human peripheral blood | |
Pierini et al. | Foxp3+ regulatory T cells maintain the bone marrow microenvironment for B cell lymphopoiesis | |
Frenette et al. | Mesenchymal stem cell: keystone of the hematopoietic stem cell niche and a stepping-stone for regenerative medicine | |
US20080038231A1 (en) | Processing procedure for peripheral blood stem cells | |
CA2649874C (en) | Immune privileged and modulatory progenitor cells | |
Zhang et al. | Cotransplantation of HLA‐identical mesenchymal stem cells and hematopoietic stem cells in Chinese patients with hematologic diseases | |
Li et al. | Effects of bone marrow mesenchymal stem cells on hematopoietic recovery and acute graft-versus-host disease in murine allogeneic umbilical cord blood transplantation model | |
Lo Iacono et al. | Wharton’s jelly mesenchymal stromal cells as a feeder layer for the ex vivo expansion of hematopoietic stem and progenitor cells: a review | |
Ueda et al. | Hematopoietic capability of CD34+ cord blood cells: a comparison with CD34+ adult bone marrow cells | |
Jobin et al. | Heterogeneity of in vitro–cultured CD34+ cells isolated from peripheral blood | |
Ribitsch et al. | Sheep placenta cotyledons: a noninvasive source of ovine mesenchymal stem cells | |
RU2729931C1 (ru) | Способ восстановления биохимических показателей периферической крови лабораторных животных с циррозом печени | |
Pörtner et al. | Landscape of manufacturing process of ATMP cell therapy products for unmet clinical needs | |
RU2639404C1 (ru) | Способ восстановления лимфоидной ткани селезенки лабораторных животных | |
US9650604B2 (en) | Equine amniotic membrane-derived mesenchymal stem cells | |
Bačenková et al. | Analysis of same selected immunomodulatory properties of chorionic mesenchymal stem cells | |
Madlambayan et al. | Umbilical cord-derived stem cells for tissue therapy: current and future uses | |
RU2628092C1 (ru) | Способ получения МСК-ассоциированных недифференцированных гемопоэтических клеток-предшественников с фенотипов CD34+/CD133+ | |
RU2739855C1 (ru) | Способ восстановления биохимических показателей периферической крови лабораторных животных с токсическим гепатитом | |
Rao et al. | Structural and functional characterization of deceased donor stem cells: a viable alternative to living donor stem cells | |
Ookura et al. | Adipocyte differentiation of human marrow mesenchymal stem cells reduces the supporting capacity for hematopoietic progenitors but not for severe combined immunodeficiency repopulating cells | |
CN101506353A (zh) | 外周造血干细胞的处理方法 | |
Pavlović et al. | Animal and plant stem cells | |
RU2654228C1 (ru) | Способ активации эритропоэза лабораторных животных после лучевой нагрузки |