RU2653429C1 - Генетическая конструкция для обеспечения экспрессии комплекса ферментов эндоглюканаз и ксиланаз в клетках гриба penicillium verruculosum и способ получения комплексных ферментных препаратов на его основе, предназначенных для кормопроизводства - Google Patents
Генетическая конструкция для обеспечения экспрессии комплекса ферментов эндоглюканаз и ксиланаз в клетках гриба penicillium verruculosum и способ получения комплексных ферментных препаратов на его основе, предназначенных для кормопроизводства Download PDFInfo
- Publication number
- RU2653429C1 RU2653429C1 RU2017116156A RU2017116156A RU2653429C1 RU 2653429 C1 RU2653429 C1 RU 2653429C1 RU 2017116156 A RU2017116156 A RU 2017116156A RU 2017116156 A RU2017116156 A RU 2017116156A RU 2653429 C1 RU2653429 C1 RU 2653429C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- penicillium
- endo
- verruculosum
- xylanase
- glucanase
- Prior art date
Links
- 241001516650 Talaromyces verruculosus Species 0.000 title claims abstract description 49
- 108010059892 Cellulase Proteins 0.000 title claims abstract description 21
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 13
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 title claims abstract 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 title claims description 20
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 title claims description 20
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 11
- 101710121765 Endo-1,4-beta-xylanase Proteins 0.000 title description 24
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 title description 17
- 229940079919 digestives enzyme preparation Drugs 0.000 title description 8
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 21
- 241000228172 Penicillium canescens Species 0.000 claims abstract description 14
- 108010001817 Endo-1,4-beta Xylanases Proteins 0.000 claims abstract description 11
- YERABYSOHUZTPQ-UHFFFAOYSA-P endo-1,4-beta-Xylanase Chemical compound C=1C=CC=CC=1C[N+](CC)(CC)CCCNC(C(C=1)=O)=CC(=O)C=1NCCC[N+](CC)(CC)CC1=CC=CC=C1 YERABYSOHUZTPQ-UHFFFAOYSA-P 0.000 claims abstract description 10
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 9
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims abstract 2
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 claims description 10
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 claims description 8
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims description 8
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims description 8
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims description 8
- 239000003531 protein hydrolysate Substances 0.000 claims description 8
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 claims description 8
- 108010008885 Cellulose 1,4-beta-Cellobiosidase Proteins 0.000 claims description 7
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 6
- 229920000168 Microcrystalline cellulose Polymers 0.000 claims description 5
- 235000019813 microcrystalline cellulose Nutrition 0.000 claims description 5
- 239000008108 microcrystalline cellulose Substances 0.000 claims description 5
- 229940016286 microcrystalline cellulose Drugs 0.000 claims description 5
- 230000009471 action Effects 0.000 claims description 4
- 235000015099 wheat brans Nutrition 0.000 claims description 4
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 3
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 claims description 3
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 claims description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 3
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 241000228143 Penicillium Species 0.000 claims 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 claims 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 claims 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 claims 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims 1
- 108010079846 endometriosis protein II Proteins 0.000 claims 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 claims 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 claims 1
- PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;potassium Chemical compound [K].OP(O)(O)=O PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 15
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 19
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 14
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 11
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 11
- 241000209056 Secale Species 0.000 description 10
- 235000007238 Secale cereale Nutrition 0.000 description 10
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 10
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 9
- 108010091384 endoglucanase 2 Proteins 0.000 description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 9
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 8
- 229920001221 xylan Polymers 0.000 description 8
- 150000004823 xylans Chemical class 0.000 description 8
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 7
- 241000209219 Hordeum Species 0.000 description 7
- 235000007340 Hordeum vulgare Nutrition 0.000 description 7
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 7
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 7
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 7
- 101100382641 Aspergillus aculeatus cbhB gene Proteins 0.000 description 6
- 108010089934 carbohydrase Proteins 0.000 description 6
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 6
- 229940121649 protein inhibitor Drugs 0.000 description 6
- 239000012268 protein inhibitor Substances 0.000 description 6
- 229920002498 Beta-glucan Polymers 0.000 description 5
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 5
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 5
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 5
- 244000144977 poultry Species 0.000 description 5
- FYGDTMLNYKFZSV-URKRLVJHSA-N (2s,3r,4s,5s,6r)-2-[(2r,4r,5r,6s)-4,5-dihydroxy-2-(hydroxymethyl)-6-[(2r,4r,5r,6s)-4,5,6-trihydroxy-2-(hydroxymethyl)oxan-3-yl]oxyoxan-3-yl]oxy-6-(hydroxymethyl)oxane-3,4,5-triol Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1[C@@H](CO)O[C@@H](OC2[C@H](O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]2O)CO)[C@H](O)[C@H]1O FYGDTMLNYKFZSV-URKRLVJHSA-N 0.000 description 4
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 4
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 description 4
- 102000004157 Hydrolases Human genes 0.000 description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 4
- 125000003147 glycosyl group Chemical group 0.000 description 4
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 4
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 4
- 150000004804 polysaccharides Chemical class 0.000 description 4
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 4
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 4
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 4
- 229920002134 Carboxymethyl cellulose Polymers 0.000 description 3
- 108010084185 Cellulases Proteins 0.000 description 3
- 102000005575 Cellulases Human genes 0.000 description 3
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 3
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 230000000433 anti-nutritional effect Effects 0.000 description 3
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010047754 beta-Glucosidase Proteins 0.000 description 3
- 102000006995 beta-Glucosidase Human genes 0.000 description 3
- 244000309464 bull Species 0.000 description 3
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 3
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 3
- 235000010980 cellulose Nutrition 0.000 description 3
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 3
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 3
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 3
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 3
- 101150074257 xylE gene Proteins 0.000 description 3
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000018185 Betula X alpestris Nutrition 0.000 description 2
- 235000018212 Betula X uliginosa Nutrition 0.000 description 2
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 2
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 2
- SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N D-mannomethylose Natural products CC1OC(O)C(O)C(O)C1O SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N D-xylopyranose Chemical compound O[C@@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- 101710126559 Endoglucanase EG-II Proteins 0.000 description 2
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 2
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 2
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- GZCGUPFRVQAUEE-SLPGGIOYSA-N aldehydo-D-glucose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O GZCGUPFRVQAUEE-SLPGGIOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003674 animal food additive Substances 0.000 description 2
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920000617 arabinoxylan Polymers 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 2
- 108010085318 carboxymethylcellulase Proteins 0.000 description 2
- 229940106157 cellulase Drugs 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 210000000416 exudates and transudate Anatomy 0.000 description 2
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 2
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 2
- 108091006086 inhibitor proteins Proteins 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 2
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 2
- 239000007974 sodium acetate buffer Substances 0.000 description 2
- 238000001694 spray drying Methods 0.000 description 2
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IJJLRUSZMLMXCN-SLPGGIOYSA-N (2r,3r,4s,5r)-2,3,4,6-tetrahydroxy-5-sulfanylhexanal Chemical compound OC[C@@H](S)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O IJJLRUSZMLMXCN-SLPGGIOYSA-N 0.000 description 1
- DBTMGCOVALSLOR-DEVYUCJPSA-N (2s,3r,4s,5r,6r)-4-[(2s,3r,4s,5r,6r)-3,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)-4-[(2s,3r,4s,5s,6r)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxyoxan-2-yl]oxy-6-(hydroxymethyl)oxane-2,3,5-triol Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](CO)O[C@H](O)[C@@H]2O)O)O[C@H](CO)[C@H]1O DBTMGCOVALSLOR-DEVYUCJPSA-N 0.000 description 1
- VRYALKFFQXWPIH-PBXRRBTRSA-N (3r,4s,5r)-3,4,5,6-tetrahydroxyhexanal Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CC=O VRYALKFFQXWPIH-PBXRRBTRSA-N 0.000 description 1
- PMMURAAUARKVCB-DUVQVXGLSA-N 2-deoxy-D-galactopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)C[C@@H](O)[C@H]1O PMMURAAUARKVCB-DUVQVXGLSA-N 0.000 description 1
- ASJSAQIRZKANQN-CRCLSJGQSA-N 2-deoxy-D-ribose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)CC=O ASJSAQIRZKANQN-CRCLSJGQSA-N 0.000 description 1
- 235000007319 Avena orientalis Nutrition 0.000 description 1
- 244000075850 Avena orientalis Species 0.000 description 1
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 1
- 101710130006 Beta-glucanase Proteins 0.000 description 1
- 241000273930 Brevoortia tyrannus Species 0.000 description 1
- 206010006474 Bronchopulmonary aspergillosis allergic Diseases 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N D-ribofuranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H]1O HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-IOVATXLUSA-N D-xylofuranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@H]1O HMFHBZSHGGEWLO-IOVATXLUSA-N 0.000 description 1
- QRLVDLBMBULFAL-UHFFFAOYSA-N Digitonin Natural products CC1CCC2(OC1)OC3C(O)C4C5CCC6CC(OC7OC(CO)C(OC8OC(CO)C(O)C(OC9OCC(O)C(O)C9OC%10OC(CO)C(O)C(OC%11OC(CO)C(O)C(O)C%11O)C%10O)C8O)C(O)C7O)C(O)CC6(C)C5CCC4(C)C3C2C QRLVDLBMBULFAL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 1
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- 108010073032 Grain Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101150017040 I gene Proteins 0.000 description 1
- LKDRXBCSQODPBY-AMVSKUEXSA-N L-(-)-Sorbose Chemical compound OCC1(O)OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O LKDRXBCSQODPBY-AMVSKUEXSA-N 0.000 description 1
- PNNNRSAQSRJVSB-UHFFFAOYSA-N L-rhamnose Natural products CC(O)C(O)C(O)C(O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-OWMBCFKOSA-N L-ribopyranose Chemical compound O[C@H]1COC(O)[C@@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-OWMBCFKOSA-N 0.000 description 1
- 229920001543 Laminarin Polymers 0.000 description 1
- 239000005717 Laminarin Substances 0.000 description 1
- 229910002651 NO3 Inorganic materials 0.000 description 1
- NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N Nitrate Chemical compound [O-][N+]([O-])=O NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000913 Nitrate Reductases Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 108010064851 Plant Proteins Proteins 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N Ribose Natural products OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UGXQOOQUZRUVSS-ZZXKWVIFSA-N [5-[3,5-dihydroxy-2-(1,3,4-trihydroxy-5-oxopentan-2-yl)oxyoxan-4-yl]oxy-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methyl (e)-3-(4-hydroxyphenyl)prop-2-enoate Chemical compound OC1C(OC(CO)C(O)C(O)C=O)OCC(O)C1OC1C(O)C(O)C(COC(=O)\C=C\C=2C=CC(O)=CC=2)O1 UGXQOOQUZRUVSS-ZZXKWVIFSA-N 0.000 description 1
- DPXJVFZANSGRMM-UHFFFAOYSA-N acetic acid;2,3,4,5,6-pentahydroxyhexanal;sodium Chemical compound [Na].CC(O)=O.OCC(O)C(O)C(O)C(O)C=O DPXJVFZANSGRMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PNNNRSAQSRJVSB-BXKVDMCESA-N aldehydo-L-rhamnose Chemical compound C[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-BXKVDMCESA-N 0.000 description 1
- 208000006778 allergic bronchopulmonary aspergillosis Diseases 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N alpha-D-Furanose-Ribose Natural products OCC1OC(O)C(O)C1O HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PMMURAAUARKVCB-UHFFFAOYSA-N alpha-D-ara-dHexp Natural products OCC1OC(O)CC(O)C1O PMMURAAUARKVCB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O ammonium group Chemical group [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000006286 aqueous extract Substances 0.000 description 1
- 150000004783 arabinoxylans Chemical class 0.000 description 1
- SESFRYSPDFLNCH-UHFFFAOYSA-N benzyl benzoate Chemical compound C=1C=CC=CC=1C(=O)OCC1=CC=CC=C1 SESFRYSPDFLNCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N beta-D-galactosamine Natural products NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MSWZFWKMSRAUBD-QZABAPFNSA-N beta-D-glucosamine Chemical compound N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O MSWZFWKMSRAUBD-QZABAPFNSA-N 0.000 description 1
- 238000006065 biodegradation reaction Methods 0.000 description 1
- 235000010948 carboxy methyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 235000019621 digestibility Nutrition 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- UVYVLBIGDKGWPX-KUAJCENISA-N digitonin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H]([C@]2(CC[C@@H]3[C@@]4(C)C[C@@H](O)[C@H](O[C@H]5[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O[C@H]6[C@@H]([C@@H](O[C@H]7[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)CO7)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O6)O[C@H]6[C@@H]([C@@H](O[C@H]7[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O7)O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O6)O)[C@@H](CO)O5)O)C[C@@H]4CC[C@H]3[C@@H]2[C@@H]1O)C)[C@@H]1C)[C@]11CC[C@@H](C)CO1 UVYVLBIGDKGWPX-KUAJCENISA-N 0.000 description 1
- UVYVLBIGDKGWPX-UHFFFAOYSA-N digitonine Natural products CC1C(C2(CCC3C4(C)CC(O)C(OC5C(C(O)C(OC6C(C(OC7C(C(O)C(O)CO7)O)C(O)C(CO)O6)OC6C(C(OC7C(C(O)C(O)C(CO)O7)O)C(O)C(CO)O6)O)C(CO)O5)O)CC4CCC3C2C2O)C)C2OC11CCC(C)CO1 UVYVLBIGDKGWPX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000012978 lignocellulosic material Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960000988 nystatin Drugs 0.000 description 1
- VQOXZBDYSJBXMA-NQTDYLQESA-N nystatin A1 Chemical compound O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1/C=C/C=C/C=C/C=C/CC/C=C/C=C/[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 VQOXZBDYSJBXMA-NQTDYLQESA-N 0.000 description 1
- 238000011022 operating instruction Methods 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 125000001477 organic nitrogen group Chemical group 0.000 description 1
- 238000009304 pastoral farming Methods 0.000 description 1
- 238000005453 pelletization Methods 0.000 description 1
- 235000021118 plant-derived protein Nutrition 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 238000009374 poultry farming Methods 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 238000007480 sanger sequencing Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- ZZORFUFYDOWNEF-UHFFFAOYSA-N sulfadimethoxine Chemical compound COC1=NC(OC)=CC(NS(=O)(=O)C=2C=CC(N)=CC=2)=N1 ZZORFUFYDOWNEF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 239000002023 wood Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
- C12N1/145—Fungal isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2405—Glucanases
- C12N9/2434—Glucanases acting on beta-1,4-glucosidic bonds
- C12N9/244—Endo-1,3(4)-beta-glucanase (3.2.1.6)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2477—Hemicellulases not provided in a preceding group
- C12N9/248—Xylanases
- C12N9/2482—Endo-1,4-beta-xylanase (3.2.1.8)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
- C12R2001/80—Penicillium
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Mycology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Virology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Botany (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биохимии, генной инженерии и биотехнологии, в частности к генетической конструкции для обеспечения экспрессии целевых гомологичного и гетерологичного генов в клетках реципиентного гриба Penicillium verruculosum. Настоящая конструкция содержит целевую кодирующую последовательность, включающую последовательно соединенные ген eglII, кодирующий высокоактивную эндо-1,4-β-глюканазу II, и ген xyIE Penicillium canescens, кодирующий неингибируемую эндо-1,4-β-ксиланазу Е. Изобретение также относится к рекомбинантным штаммам Penicillium verruculosum ЕХ13, ВКМ F-4765D, и Penicillium verruculosum EX35, ВКМ F-4766D. Указанные штаммы предназначены для продукции гомологичной высокоактивной эндо-1,4-β-глюканазы II и неингибируемой эндо-1,4-β-ксиланазы Е Penicillium canescens. Настоящее изобретение позволяет получать неингибируемую эндо-1,4-β-ксиланазу Е Penicillium canescens и высокоактивную эндо-1,4-β-глюканазу II Penicillium verruculosum. 4 н.п. ф-лы, 2 ил., 2 табл., 3 пр.
Description
Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к созданию и производству комплексных ферментных препаратов (ФП), эффективно деградирующих некрахмальные полисахариды зерна. Изобретение может быть использовано в кормовой отрасли в качестве кормовой добавки в корм сельскохозяйственных животных и птиц.
Зерно, являющееся основой любых комбикормов, содержит набор некрахмальных полисахаридов (НПС), которые являются антипитательным фактором и затрудняют процесс переваривания комбикорма. Важнейшими НПС злаков являются β-глюкан и ксилан. Именно вязкие растворы β-глюканов и арабиноксиланов, не гидролизуемых в желудочно-кишечном тракте моногастричных животных, являются основным источником проблем при скармливании ячменя и ржи, и, отчасти, пшеницы (в зависимости от ее вязкости). НПС, в первую очередь ксиланы, сорбируют на себя значительную часть питательных веществ и жидкости, которые в неизменном виде выводятся из организма животных. Это приводит к перерасходу кормов и снижению показателей продуктивности у с/х животных и птицы. Следует учесть, что затраты на корма составляют до 70% от себестоимости конечной продукции животноводства.
Ячмень и рожь содержат значительный процент (до 15%) НПС [Бутейкис Г., Блажинскас Д. Ферменты – гарантия ощутимой выгоды сегодня и в будущем. Комбикорма. №6. 2012. С. 105-106]. Тем не менее, в России, особенно в Центральном и Северо-Западном районе, цена на рожь, овес и ячмень значительно ниже, чем на пшеницу, что определяет экономическую целесообразность использования этих злаков в рационе с/х животных. Влияние антипитательных факторов в виде арабиноксилана и β-глюкана корректируют введением соответствующих ФП, а именно ксиланаз и эндоглюканаз, в рацион животных. Поэтому одной из основных составляющих производства современных комбикормов, обеспечивающих высокие показатели продуктивности животноводства и птицеводства, является использование в рецептурах ФП разного целлюлазно/эндоглюканазного/ксиланазного состава для коррекции антипитательных факторов и улучшения усвояемости компонентов кормов.
Не менее важным фактором, определяющим эффективность применения ферментов (ксиланаз, эндоглюканаз, целлюлаз) для гидролиза природных НПС, является низкая степень или отсутствие ингибирования этих ферментов под действием белков-ингибиторов, входящих в состав большинства злаков. Наличие у зерновых белков-ингибиторов является эволюционным фактором, призванным защитить зерно от поражения микроорганизмами, расщепляющими полисахариды. Водорастворимые зерновые ингибиторы карбогидраз (семейства TAXI, XYP и др.) оказывают значительное действие на эндо-1,4-β-ксиланазы, относящиеся к 11 семье гликозилгидролаз, в то время как ксиланазы, относящиеся к 10 семье, менее подвержены ингибирующему воздействию [Гусаков А.В. // Биохимия. 2010. Т. 75. № 10. С. 1331].
Мицелиальный гриб Penicillium canescens относится к почвенным грибам, основным питательным субстратом которого является ксилано-богатая растительная биомасса, поэтому комплекс секретируемых ферментов гриба представлен, в основном, ксиланазами (КсилА, КсилЕ, КсилF и др.) и арабинофуранозидазами (АБФА, АБФБ и др). Ксиланазы А и Е относятся к 10 семейству гликозилгидролаз, при этом КсилЕ практически не ингибируется белками ржи. Разница в уменьшении приведенной вязкости для нативного и термоинактивированного экстрактов составляет лишь 5%. В случае КсилА эта разница выражена намного более заметно (~30%) [Денисенко Ю.А. с соавт // Сравнительная характеристика ксиланаз XylA и XylE из гриба Penicillium canescens. Вестник московского университета. Серия 2. Химия. 2015, т. 56, №6, с. 348-353].
Мицелиальный гриб Penicillium verruculosum PV2007 (ВКМ F-3972D) обладает собственным гидролитическим комплексом ферментов для биодеградации целлюлозосодержащих растительных материалов. В этот комплекс входят целлобиогидролазы различной специфичности, набор эндоглюканаз и β-глюкозидаза. Для реципиентного штамма P. verruculosum 537 (ΔniaD) разработана трансформационная и экспрессионная системы [патент RU 2378372 С2, опубл. 10.01.2010, бюл. №1], что позволяет использовать данный гриб как основу для получения рекомбинантных штаммов различного промышленного применения [Мерзлов Д.А. с соавт // Свойства ферментных препаратов и гомогенных ферментов эндоглюканазы EG2 Penicillium verruculosum и эндоглюканазы LAM Myceliophtora thermophile. Биохимия, 2015, том 20, вып.4, с.556-567; Синицын А.П. с соавт // Оптимизация состава целлюлазного ферментного комплекса Penicillium verruculosum: увеличение гидролитической способности с помощью методов генетической инженерии. Кат в пром. 2015, Т. 15, №6, с.78-83; заявка на патент №2015151483 от 02.12.2015; патент RU 2550044 C2, опубл. 10.05.2015, бюл. №13; патент RU 2532840 C2, опубл. 19.11.2014, бюл. №31].
Таким образом, разработка новых высокоэффективных и стабильных ФП для кормопроизводства, которые не будут подвержены ингибирующему действию растительных белков-ингибиторов карбогидраз, а также будут эффективны при кормлении сельскохозяйственных животных и птицы, является важной и актуальной задачей современного агропромышленного комплекса.
Техническая задача, на решение которой направлено данное изобретение, состоит в получении комплексных ФП на основе новых рекомбинантных штаммов Penicillium verruculosum, являющихся продуцентами гомологичной высокоэффективной эндоглюканазы II, принадлежащей 5 семейству гликозил-гидролаз, и гетерологичной неингибируемой ксиланазы Е из Penicillium canescens, относящейся к 10 семейству гликозил-гидролаз для применения в кормопроизводстве при обработке рационов, содержащих зерновые, в частности рожь и ячмень.
Технический результат от предлагаемого изобретения состоит в снижении вязкости корма, содержащего НПС ячменя или ржи, и повышении кормовой ценности рационов для сельскохозяйственных моногастричных животных и птицы при обработке корма новыми комплексными ФП, содержащими высокоактивную эндоглюканазу, неингибируемую ксиланазу и комплекс сопутствующих карбогидраз.
Сущность изобретения заключается в получении новых штаммов-продуцентов:
- Penicillium verruculosum EX13 (ВКМ F-4765D), который при выращивании на ферментационных средах на основе микрокристаллической целлюлозы и гидролизата куриного белка обеспечивает получение ФП комплексного действия, включающего неингибируемую эндо-1,4-β-ксиланазу (ксиланазу Е), высокоактивную эндо-1,4-β-глюканазу (эндоглюканазу II) с активностями в КЖ 550 ед./мл (по ксилану, рН 5,0, 50°С) и 500 ед./мл (Na-КМЦ, рН 5,0, 50°С) соответственно, и комплекс сопутствующих карбогидраз: целлобиогидролаза I, целлобиогидролаза II, β-глюкозидаза;
- Penicillium verruculosum EX35 (ВКМ F-4766D), который при выращивании на ферментационных средах на основе микрокристаллической целлюлозы и гидролизата куриного белка обеспечивает получение ФП комплексного действия, включающего неингибируемую эндо-1,4-β-ксиланазу (ксиланазу Е), высокоактивную эндо-1,4-β-глюканазу (эндоглюканазу II) с активностями в КЖ 800 ед./мл (по ксилану, рН 5,0, 50°С) и 300 ед./мл (Na-КМЦ, рН 5,0, 50°С) соответственно, и комплекс сопутствующих карбогидраз: целлобиогидролаза I, целлобиогидролаза II, β-глюкозидаза.
Способ получения ФП предусматривает глубинное культивирование штаммов–продуцентов P. verruculosum EX13 (BKM F-4765D) и P. verruculosum EX35 (ВКМ F-4766D) на удешевленной среде с заменой дрожжевого экстракта на гидролизат куриного белка с последующей распылительной сушкой культуральной жидкости. Изобретение позволяет получать ФП с высокой активностью целевых эндоглюканазы II и неингибируемой ксиланазы Е. Полученный ФП характеризуется высокой стабильностью, эффективностью при обработке кормовых смесей, содержащих ячмень и/или рожь, по сравнению с коммерческими ФП. Применение нового комплексного ФП позволит повысить кормовую ценность рационов на основе зерновых культур.
Изобретение реализуется следующим образом.
Штаммы P. verruculosum EX13 (BKM F-4765D) и P. verruculosum EX35 (ВКМ F-4766D) получены из исходного штамма Penicillium verruculosum PV2007 (ВКМ F-3972D) путем трансформации плазмидой pEGII-XylE с последующей селекцией на агаризованной среде с 10 мМ NaNO3.
Культурально-морфологические и микроскопические особенности штаммов (общие для P. verruculosum EX13 и P. verruculosum EX35):
Растут на агаризованных средах (среда Чапека с дрожжевым автолизатом, Мальц-агар, глюкозокартофельный агар, сусло-агар) при t 26-30°С в течение 7-10 суток, рН 4.5-5.0.
На среде Чапека с дрожжевым экстрактом при культивировании гриба при 25°С на 7 сутки колонии достигают 24-30 мм в диаметре, складчатые, поверхность сильно радиально плотная, тонкая, ростовая зона врастает в агар, имеет ширину 1.5-2.0 мм. Мицелий светло-желтоватый, шерстистый, центр колонии выпуклый, конидиогенез слабый, серо-зеленоватого оттенка. Экссудата и растворимого пигмента нет. Обратная сторона светлая, в центре колонии – палево-оранжевая. При температуре 37°С колонии диаметром 5 мм, мицелий светлый, конидиообразования нет. При температуре 5°С роста нет.
При росте на Мальц-агаре диаметр колонии 23-24 мм, поверхность сильно радиально складчатая, плотная, тонкая, ростовая зона врастает в агар, шириной 1,5-2,0 мм. Мицелий белый, шерстистый, прижатый, конидиогенез очень слабый, практически отсутствует. Эксудата и растворимого пигмента нет. Обратная сторона светлая.
При микроскопировании штаммы имеют конидиеносцы двухъярусные, терминальные, бивертициллятные, гладкие длиной около 150 мкм, шириной 2-3 мкм. Метулы расходящиеся размером 10-13х2.5-3.0 мкм, фиалиды ампуллиформные размером 7-8х2.8-3.0 мкм. Конидии округлые, шероховатые размером 3.0-3.5 мкм.
При культивировании в глубинных условиях с использованием растворимых субстратов (глюкоза, фруктоза, лактоза) штаммы образуют рыхлый разветвленный мицелий со слабой пеллетизацией, удельная культивирования 0,1 ч-1.
Физиолого-биохимические признаки штамма:
Мезофилен. Оптимальная температура роста мицелия 32°С (29-34°С), оптимум для образования целлюлаз 28°С (26-29°С). Оптимальные значения рН роста и секреции целлюлаз 3,5-5,0. Рост мицелия наблюдается и при рН 2,5, но при этом не наблюдается очень слабое образование целлюлаз и других карбогидраз.
Резистентность к нистатину хорошая. При поверхностном культивировании устойчив к концентрации до 0,5 мкг/мл, при концентрации 2,5 мкг/мл рост подавляется. При добавлении в среду дигитонина (3,5-4,0 мкг/мл) или бенгальского розового (30-50 мкг/мл) размер колоний уменьшается.
Является прототрофом. Способен быстро ассимилировать глюкозу, лактозу, глицерин, галактозу, ксилозу, D-маннозу, D-маннит, трегалозу, сорбозу и сорбит, медленнее - D-ксилозу, L- и D-арабинозу, L-рамнозу и рибозу. Слабо ассимилирует: D-глюкозамин, дезоксирибозу, дезоксигалактозу, 2-дезокси-D-глюкозу и 5-тио-D-глюкозу.
Использует неорганический и органический азот, хорошо ассимилирует нитратную и аммонийную форму азота.
Образует ферментные системы, позволяющие расти на соответствующих комплексных субстратах: целлюлозе, крахмале, ксилане, ламинарине, β-глюкане.
Штамм P. verruculosum EX13 (BKM F-4765D) отличается от исходного повышенной продукцией неингибируемой ксиланазы Е и высокоактивной эндоглюканазы II.
Штамм P. verruculosum EX35 (BKM F-4766D) отличается от исходного преимущественной продукцией неингибируемой ксиланазы Е и повышенной продукцией высокоактивной эндоглюканазы II.
В предлагаемом изобретении метод определения ксиланазной, β-глюканазной и КМЦ-азной активностей основан на измерении скорости образования восстанавливающих сахаров (ВС) методом Шомоди-Нельсона при гидролизе полисахаридных субстратов (ксилана из древесины березы, βглюкана ячменя и карбоксиметилцеллюлозы, натриевой соли соответственно). За единицу активности принимается такое количество фермента, которое приводит к образованию 1 мкмоль ВС в минуту при рН 5.0 и 50°C [Синицын А.П., Гусаков А.В., Черноглазов В.А. Биоконверсия лигноцеллюлозных материалов. – М.: МГУ, 1995. – 144 с.].
Новые комплексные ФП обладают улучшенными эксплуатационными характеристиками, включая устойчивость к ингибированию со стороны зерновых белковых ингибиторов и увеличенную операционную стабильность, что является преимуществом данных ферментных препаратов в сравнении с имеющимися на рынке коммерческими аналогами.
Применение новых комплексных ФП высокоактивной эндоглюканазы II и неингибируемой ксиланазы Е существенно повысит рентабельность применения комплексных препаратов в кормопроизводстве за счет обеспечения оптимального сочетания основных ферментативных активностей, необходимых для гидролиза НПС зерновой составляющей рациона корма с/х животных и птиц.
Возможность использования изобретения иллюстрируется примерами, которые не ограничивают объем и сущность притязаний, связанных с ними.
Пример 1. Конструирование экспрессионной плазмиды pEGII-XylE состояло из амплификации генов eglII P. verruculosum [патент РФ № 2378372], xylE P. canescens [AN: FJ860894], промоторной и терминаторной области гена cbhI P.verruculosum [патент РФ № 2378372], и финальной амплификации линейного продукта, состоящего из состыкованных генов, соответствующих промоторной области гена cbhI, гена eglII и гена xylE, соединенных через синтетический линкер, и терминаторной области гена cbhI P. verruculosum.
Для индивидуальной амплификации каждой из частей плазмиды использовались следующие олигонуклеотиды:
| (1) | tacttccaatccatgaagcttggaaacgacgccgaca |
| (2) | ctggcaacagctggtgctgcaaactcaaaagaagtcaag |
| (3) | cttgacttcttttgagtttgcagcaccagctgttgccag |
| (4) | cttccgcagccggcagcggttctgatgcgtccatccctagtgatcgcggccttg |
| (5) | cagaaccgctgccggctgcggaagtcaaaaataagtctccaaaatcga |
| (6) | gaaagccttgcagtgtgtgctagactttcacttttttcgacagttg |
| (7) | caactgtcgaaaaaagtgaaagtctagcacacactgcaaggctttc |
| (8) | tatccacctttactgcggccgcatccttattcaatctcgtatg |
Далее с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) и праймеров (1 и 3) синтезируют отдельно промоторную область гена cbhI размером 1303 п.н. В качестве матрицы для ПЦР используют геномную ДНК штамма P. verruculosum, выделенную из мицелия. Нуклеотидную последовательность полученного фрагмента определяют методом Сэнгера по обеим цепям.
Далее с помощью ПЦР и праймеров (2 и 5) синтезируют отдельно ген eglI I размером 1367 п.н., из которых 1343 п.н. составляет ген eglII, 24 п.н. относятся к синтетическому линкерному участку, соединяющему ген eglII c 3`-конца гена и ген xylE с 5`-конца гена. В качестве матрицы для ПЦР используют геномную ДНК штамма P. verruculosum, выделенную из мицелия. Нуклеотидную последовательность полученного фрагмента определяют методом Сэнгера по обеим цепям.
Далее с помощью ПЦР и праймеров (4 и 7) синтезируют отдельно ген xylE размером 1148 п.н. В качестве матрицы для ПЦР используют геномную ДНК штамма P. canescens, выделенную из мицелия. Нуклеотидную последовательность полученного фрагмента также определяют методом Сэнгера по обеим цепям.
Далее с помощью ПЦР и праймеров (6 и 8) синтезируют ген cbhI и его терминаторную область размером 570 п.н. В качестве матрицы для ПЦР используют геномную ДНК штамма P. verruculosum, выделенную из мицелия. Нуклеотидную последовательность полученного фрагмента определяют методом Сэнгера по обеим цепям.
Полученные ПЦР-фрагменты смешивают в эквимолярном соотношении и используют в качестве матрицы для финальной ПЦР-реакции при помощи праймеров (1) и (8). Синтезированный линейный фьюжн-фрагмент имеет размер 4388 п.н. Нуклеотидную последовательность полученного фрагмента определяют методом секвенирования по Сэнгеру по обеим цепям. Далее, полученный фрагмент клонируют в лабораторный вектор pUC-LIC с образованием плазмиды pEGII-XylE. Структура плазмиды pEGII-XylE представлена на фиг.1. На фиг. 1 темно-серым обозначены промоторная и терминаторная области гена cbhI, светло-серым гены eglII и xylE, между генами eglII и xylE обозначен линкер.
Плазмида pEGII-XylE была трансформирована в реципиентный штамм P.verruculosum 537 (ΔniaD) совместно с трансформирующей плазмидой pSTA10 по стандартной методике [Sambrook, J., and Russell, D.W. (2001) Molecular cloning:a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y., A.Y. Aleksenko, N.A. Makarova, I.V. Nikolaev, A.J. Clutterbuck, Integrative and replicative transformation of Penicillium canescens with a heterologous nitrate-reductase gene, Curr. Genet. 28 (1995) 474-478]. В результате трансформации было получено более 200 рекомбинантных штаммов серии P. verruculosum EX, из которых в результате первичного скрининга на стандартной среде культивирования были отобраны 10 клонов (Таблица 1). Стандартная среда культивирования имела следующий состав (г/л): KH2PO4 - 15, (NH4)2SO4 - 5, MgSO4×7H2O - 0,3, CaCl2×2H2O - 0,3, дрожжевой экстракт - 10, целлюлоза – 20, пшеничные отруби - 10.
Анализ удельных активностей в культуральной жидкости 10 рекомбинантных штаммов (Таблица 1) показал наличие клонов с различными комбинациями ксиланазной и КМЦ-азной активностей, что позволило отобрать два штамма для дальнейших прикладных испытаний - Penicillium verruculosum EX13 с приблизительно равными целевыми ферментативными активностями ксиланазы и эндоглюканазы и Penicillium verruculosum EX35 с превалирующей ксиланазной активностью.
Пример 2. Культивирование штаммов Penicillium verruculosum EX13 (ВКМ F-4765D) и Penicillium verruculosum EX35 (ВКМ F-4766D) проводили в ферментерах объемом 3 л, оснащенных барботерами для подачи воздуха в аппарат и турбинной мешалкой на средах 1 и 2 следующего состава:
Среда 1. Стандартная среда (г/л):
| Глюкоза | 40 |
| Микрокристаллическая целлюлоза | 20 |
| Дрожжевой экстракт | 10 |
| Пшеничные отруби | 10 |
| KH2PO4 | 15 |
| (NH4)2SO4 | 5 |
| CaCl2 | 0,3 |
| MgSO4⋅7H2O | 0,3 |
Среда 2. Экспериментальная среда (г/л):
| Глюкоза | 40 |
| Микрокристаллическая целлюлоза | 20 |
| Гидролизат куриного белка | 10 |
| Пшеничные отруби | 10 |
| KH2PO4 | 15 |
| (NH4)2SO4 | 5 |
| CaCl2 | 0,3 |
| MgSO4⋅7H2O | 0,3 |
В экспериментальной среде вместо французского дрожжевого экстракта («Lessafre», Франция) использовался отечественный гидролизат куриного белка (ООО «Симбио», Россия) в том же процентном соотношении, что и дрожжевой экстракт в стандартной среде.
Культивирование проводили 144 ч, при рН не ниже 4,5 и 32°С. Образцы культуральной жидкости отбирали каждые сутки, начиная с 72 ч культивирования, центрифугировали и измеряли активности (Таблица 2).
Анализируя динамику накопления белка и биосинтез ксиланазы Е и эндоглюканазы II в культуральных жидкостях рекомбинантных штаммов P. verruculosum EX13 и P. verruculosum EX35 в процессе проведения ферментации, следует заключить, что замена дорогостоящего импортного дрожжевого экстракта на дешевый отечественный гидролизат куриного белка не влияет на биосинтез целевых ферментов в процессе культивирования рекомбинантных штаммов. Это означает что замена данного компонента целесообразна.
Культуральные жидкости рекомбинантных штаммов P. verruculosum EX13 и P. verruculosum EX35, полученные на Среде 2, были сепарированы с отделением биомассы гриба и высушены на распылительной сушке. Таким образом, были получены комплексные ферментные препараты (ФП) EX13 и EX35 c удельными ферментативными активностями по ксилану березы - 22500 и 30000 ед./г ФП, и по КМЦ - 19500 и 9000 ед./г ФП соответственно.
Сухие ферментные препараты были упакованы в двойные пластиковые мешки и хранились при температуре +6+3°С.
Пример 3. Водный экстракт из зерен ржи готовили следующим образом.
Зерно ржи очищали от посторонних включений и размалывали на лабораторной мельнице. На сите отбирали фракцию менее 0,5 мм.
Взвешивали 20,0 г размолотых зерен, прибавляли 100 мл натрий-ацетатного буфера (0,1 М, рН 5,0) и проводили экстракцию с использованием микробиологической качалки при температуре 40+1°С и 250 об/мин в течение 3 часов. Центрифугированием отделяли осадок от экстракта, после чего экстракт фильтровали через ткань типа ФП с размером пор около 10 мкм. Полученный нативный экстракт, содержащий водорастворимые белковые ингибиторы, укупоривали и хранили во льду в течение рабочего дня.
Экстракт, свободный от белковых ингибиторов, готовили путем нагревания части нативного экстракта в емкости на водяной бане при температуре 100°С в течение 10 минут с последующей фильтрацией через ткань типа ФП для отделения термоденатурированных белковых ингибиторов. Получали термоинактивированный экстракт, свободный от белковых ингибиторов, который укупоривали и хранили во льду в течение рабочего дня.
Капиллярный вискозиметр Оствальда подготавливали согласно инструкции по эксплуатации. Помещали вискозиметр в водяную баню при температуре 40+0,1°С, перед началом измерений все образцы инкубировали в течение 6-7 минут. Проводили определение времени истечения натрий-ацетатного буфера (0,1 М, рН 5,0), нативного и термоинактивированных экстрактов. Все измерения проводили с точностью до 0,1 с в трех повторностях.
К нативному и термоинактивированому экстракту прибавляли раствор ферментного препарата, содержащий 1 единицу ксиланазной активности, объемом, равным 1% от объема экстракта, и определяли динамику измерения времени истечения через равные промежутки времени на протяжении 25 минут. Время начала реакции отсчитывали от момента добавления к экстракту раствора ФП. Результаты представляли в виде зависимости отношения приведенной вязкости экстракта после добавления раствора ФП к приведенной вязкости исходного экстракта от времени ферментативной обработки.
Вязкость растворов ηi в каждой точке рассчитывали по формуле ηi = К⋅ρ⋅t К – константа вискозиметра, ρ – плотность раствора, t – время истечения раствора. η0, ηбуф – начальная вязкости экстракта и буфера, определенные вискозиметрическим методом. Относительную вязкость экстракта рассчитывали как ηотн = η/ηбуф; удельную вязкость рассчитывали, как ηуд = (η – ηбуф)/ηбуф = ηотн-1, приведенную вязкость рассчитывали как ηприв=ηуд/С, где С – весовая концентрация полимера. ηiуд/η0уд=ηiприв/η0прив, где η0уд и η0прив – удельная и приведенная вязкости экстракта до добавления раствора ферментного препарата; ηiуд и ηiприв после добавления раствора ферментного препарата в момент времени ферментативной обработки в точке i. Время ферментативной обработки i = время начала измерения времени истечения + ½⋅время истечения в точке i (за исключением начальной точки). Снижение удельной вязкости Δηiуд относительно вязкости экстракта в начальной точке рассчитывали, как (1-ηiуд/η0уд)⋅100% = (1-ηiприв/η0прив)⋅100%.
Среднее время эффективной работы внесенных с кормом ферментов в организме курицы составляет около 20-30 минут, после чего происходит их расщепление в желудочно-кишечном тракте. Результаты уменьшения вязкости нативного (светлые столбики на Фиг.2) и термоинактивированного (темные столбики на Фиг 2) экстракта после 25 минут ферментативной обработки представлены на Фиг. 2. В качестве контроля использовался ряд коммерческих ферментных препаратов, широко используемых в качестве кормовых добавок в составе современных рационов кормления с/х животных и птицы. К ним относятся: #2341 – Ronozyme WX (CT), #2343 – Natugrain TS, #2346 – Rovabio XL. Все препараты были дозированы по 1 Ед активности ксиланазы в реакционной смеси. Как видно из Фиг.2 максимальное значение снижения вязкости как термоинактивированного, так и нативного экстракта ржи наблюдалось в случае использования новых ферментных препаратов EX13 и EX35, что говорит о потенциальной эффективной применимости этих препаратов в рационах кормления с/х животных и птицы.
Таблица 1. Удельные активности ферментов (ед./мг) и концентрация белка (мг/мл) в культуральных жидкостях полученных рекомбинантных штаммов по сравнению с контрольным образцом (нетрансформированный штамм, Контроль)
| № штамма | СБ, [мг/мл] | ЭГII, ед./мг, рН 5,0, 50°С | КсилЕ, ед./мг, рН 5,0, 50°С |
| 3 | 3.6 | 42.0 | 20.2 |
| 4 | 7.2 | 17.1 | 42.4 |
| 9 | 6.5 | 33.5 | 34.4 |
| 13 | 6.3 | 39.1 | 40.6 |
| 15 | 5.4 | 26.3 | 30,0 |
| 18 | 6.4 | 28.2 | 32.1 |
| 21 | 4.2 | 39.1 | 32.7 |
| 27 | 6.6 | 13.4 | 41.8 |
| 28 | 6.2 | 12.0 | 49.0 |
| 35 | 5.9 | 26.1 | 60.9 |
| Контроль | 6.3 | 12.4 | 17.8 |
Таблица 2. Динамика накопления белка (мг/мл) и биосинтез ксиланазы Е и эндоглюканазы II в культуральных жидкостях рекомбинантных штаммов P. verruculosum EX13 и P. verruculosum EX35 в процессе проведения ферментации в 1-л ферментерах на Средах 1 и 2.
| Время ферментации, ч | СБ, [мг/мл], EX13/EX35* |
ЭГII, ед./мг рН 5,0, 50°С EX13/EX35* |
КсилЕ, ед./мг рН 5,0, 50°С EX13/EX35* |
| Среда 1- Стандартная среда | |||
| 72 | 4,4/4,2 | 3,7/1,2 | 5,3/9,7 |
| 96 | 13,5/12,8 | 15,4/6,6 | 16,8/21,4 |
| 120 | 22,1/22,3 | 26,7/15,3 | 28,2/39,5 |
| 144 | 32,5/31,1 | 21,2/12,1 | 24,2/33,3 |
| Среда 2-Экспериментальная среда | |||
| 72 | 3,0/3,6 | 1,8/0,5 | 4,7/8,0 |
| 96 | 15,1/14,7 | 12,3/8,1 | 12,3/21,5 |
| 120 | 27,4/27,4 | 26,4/18,0 | 25,2/37,9 |
| 144 | 30,9/31,5 | 20,8/13,0 | 21,8/31,6 |
*- Первая цифра соответствует параметрам биосинтеза ферментов в штамме P. verruculosum EX13, вторая цифра соответствует параметрам биосинтеза ферментов в штамме P. verruculosum EX35.
Claims (4)
1. Генетическая конструкция для обеспечения экспрессии целевых гомологичного и гетерологичного генов в клетках реципиентного гриба Penicillium verruculosum 537 (ΔniaD), используемого в качестве хозяина, содержащая целевую кодирующую последовательность, включающую последовательно соединенные ген eglII, кодирующий высокоактивную эндо-1,4-β-глюканазу II (ЭГII), и ген xyIE Penicillium canescens, кодирующий неингибируемую эндо-1,4-β-ксиланазу Е (КсилЕ) посредством синтетического линкера, и функционально связанную с регуляторными элементами гена целлобиогидролазы I Penicillium verruculosum, которые представляют собой промотор, сигнальный пептид и терминатор гена целлобиогидролазы I.
2. Рекомбинантный штамм Penicillium verruculosum ЕХ13, депонированный во Всероссийской коллекции микроорганизмов под номером ВКМ F-4765D, полученный путем трансформации клеток гриба Penicillium verruculosum 537 (ΔniaD) генетической конструкцией по п. 1 и предназначенный для продукции гомологичной высокоактивной эндо-1,4-β-глюканазы II и неингибируемой эндо-1,4-β-ксиланазы Е Penicillium canescens.
3. Рекомбинантный штамм Penicillium verruculosum EX35, депонированный во Всероссийской коллекции микроорганизмов под номером ВКМ F-4766D, полученный путем трансформации клеток гриба Penicillium verruculosum 537 (ΔniaD) генетической конструкцией по п. 1 и предназначенный для продукции преимущественно неингибируемой эндо-1,4-β-ксиланазы Е Penicillium canescens и высокоактивной эндо-1,4-β-глюканазы II.
4. Способ получения ферментного препарата ЕХ13, полученного на основе рекомбинантного штамма Penicillium verruculosum ЕХ13 по п. 2, при выращивании на ферментационных средах, обеспечивающий получение ферментного препарата комплексного действия, включающего неингибируемую эндо-1,4-β-ксиланазу Е Penicillium canescens и высокоактивную эндо-1,4-β-глюканазу II, и ферментного препарата ЕХ35, полученного на основе рекомбинантного штамма Penicillium verruculosum ЕХ35 по п. 3, при выращивании на ферментационных средах, обеспечивающий получение ферментного препарата преимущественно неингибируемой эндо-1,4-β-ксиланазы Е Penicillium canescens и высокоактивной эндо-1,4-β-глюканазы II и состоящий в культивировании рекомбинантных штаммов по пп. 2 и 3, раздельно, на ферментационной среде, состоящей из (г/л): глюкоза - 40, микрокристаллическая целлюлоза - 20, гидролизат куриного белка - 10, пшеничные отруби - 10, дигидрофосфат калия - 15, сульфат аммония - 5, хлорид кальция - 0,3, семиводный сульфат магния - 0,3, отличающейся от стандартной среды наличием гидролизата куриного белка вместо дрожжевого экстракта.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017116156A RU2653429C1 (ru) | 2017-05-10 | 2017-05-10 | Генетическая конструкция для обеспечения экспрессии комплекса ферментов эндоглюканаз и ксиланаз в клетках гриба penicillium verruculosum и способ получения комплексных ферментных препаратов на его основе, предназначенных для кормопроизводства |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017116156A RU2653429C1 (ru) | 2017-05-10 | 2017-05-10 | Генетическая конструкция для обеспечения экспрессии комплекса ферментов эндоглюканаз и ксиланаз в клетках гриба penicillium verruculosum и способ получения комплексных ферментных препаратов на его основе, предназначенных для кормопроизводства |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2653429C1 true RU2653429C1 (ru) | 2018-05-08 |
Family
ID=62105630
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2017116156A RU2653429C1 (ru) | 2017-05-10 | 2017-05-10 | Генетическая конструкция для обеспечения экспрессии комплекса ферментов эндоглюканаз и ксиланаз в клетках гриба penicillium verruculosum и способ получения комплексных ферментных препаратов на его основе, предназначенных для кормопроизводства |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2653429C1 (ru) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2796447C1 (ru) * | 2022-09-12 | 2023-05-23 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение Федеральный исследовательский центр "Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук" (ИЦиГ СО РАН) | Штамм Komagataella phaffii T07/pPZL-4x-OA-xyl-AsOr, обладающий способностью продуцировать ксиланазу из грибов вида Aspergillus oryzae |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2275631C1 (ru) * | 2004-10-14 | 2006-04-27 | Институт биологии Уфимского научного центра Российской Академии Наук (ИБ УНЦ РАН) | Способ диагностики дерматомикозов и питательная среда для дерматофитов |
| RU2378372C2 (ru) * | 2008-03-03 | 2010-01-10 | ООО НПК "Фермтек" | Генетическая конструкция для обеспечения экспрессии целевых гомологичных и гетерологичных генов в клетках мицелиального гриба penicillium verruculosum, используемого в качестве хозяина, способ получения штамма гриба penicillium verruculosum и способ получения ферментного препарата |
| RU2550044C2 (ru) * | 2013-09-10 | 2015-05-10 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии им. А.Н. Баха Российской академии наук (ИНБИ РАН) | ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ФЬЮЖН-КОНСТРУКЦИЯ ДЛЯ ОБЕСПЕЧЕНИЯ ЭКСПРЕССИИ МУЛЬТИФЕРМЕНТНОГО КОМПЛЕКСА КАРБОГИДРАЗ В КЛЕТКАХ МИЦЕЛИАЛЬНОГО ГРИБА Penicillium verruculosum, ИСПОЛЬЗУЕМОГО В КАЧЕСТВЕ ХОЗЯИНА, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО ШТАММА ГРИБА Penicillium verruculosum И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФЕРМЕНТНОГО ПРЕПАРАТА НА ЕГО ОСНОВЕ |
-
2017
- 2017-05-10 RU RU2017116156A patent/RU2653429C1/ru active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2275631C1 (ru) * | 2004-10-14 | 2006-04-27 | Институт биологии Уфимского научного центра Российской Академии Наук (ИБ УНЦ РАН) | Способ диагностики дерматомикозов и питательная среда для дерматофитов |
| RU2378372C2 (ru) * | 2008-03-03 | 2010-01-10 | ООО НПК "Фермтек" | Генетическая конструкция для обеспечения экспрессии целевых гомологичных и гетерологичных генов в клетках мицелиального гриба penicillium verruculosum, используемого в качестве хозяина, способ получения штамма гриба penicillium verruculosum и способ получения ферментного препарата |
| RU2550044C2 (ru) * | 2013-09-10 | 2015-05-10 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии им. А.Н. Баха Российской академии наук (ИНБИ РАН) | ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ФЬЮЖН-КОНСТРУКЦИЯ ДЛЯ ОБЕСПЕЧЕНИЯ ЭКСПРЕССИИ МУЛЬТИФЕРМЕНТНОГО КОМПЛЕКСА КАРБОГИДРАЗ В КЛЕТКАХ МИЦЕЛИАЛЬНОГО ГРИБА Penicillium verruculosum, ИСПОЛЬЗУЕМОГО В КАЧЕСТВЕ ХОЗЯИНА, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО ШТАММА ГРИБА Penicillium verruculosum И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФЕРМЕНТНОГО ПРЕПАРАТА НА ЕГО ОСНОВЕ |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| MERZLOV DA., et al., New enzyme preparation for animal feed production based on Penicillium recombinant strains, Микробные биотехнологии: фундаментальные и прикладные аспекты, тезисы докладов IX Международной научной конференции, 2015. MERZLOV DA., et al., Properties of enzyme preparations and homogeneous enzymes -Endoglucanases EG2 Penicillium verruculosum and LAM Myceliophthora thermophila, Biochemistry, 2015. MOROZOVA VV., et al., Cellulases of Penicillium verruculosum, Biotechnology journal, 2010. КОВАЛЕНКО ЕА., и др., Изучение возможности переработки вторичного сырья убоя птицы в гидролизаты микробиологических сред, / Хранение и переработка сельхозсырья, 2015. * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2810538C2 (ru) * | 2022-06-13 | 2023-12-27 | Федеральное государственное учреждение "Федеральный исследовательский центр "Фундаментальные основы биотехнологии" Российской академии наук" (ФИЦ Биотехнологии РАН) | ШТАММ ГРИБА PENICILLIUM VERRUCULOSUM ПРОДУЦЕНТ КОМПЛЕКСА ФИТАЗЫ А И ЭНДО-1,4-β-ГЛЮКАНАЗЫ II И ФЕРМЕНТНЫЙ ПРЕПАРАТ НА ЕГО ОСНОВЕ ДЛЯ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ В КАЧЕСТВЕ ДОБАВКИ В КОРМАХ |
| RU2796447C1 (ru) * | 2022-09-12 | 2023-05-23 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение Федеральный исследовательский центр "Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук" (ИЦиГ СО РАН) | Штамм Komagataella phaffii T07/pPZL-4x-OA-xyl-AsOr, обладающий способностью продуцировать ксиланазу из грибов вида Aspergillus oryzae |
| RU2819918C1 (ru) * | 2023-03-24 | 2024-05-28 | Федеральное государственное учреждение "Федеральный исследовательский центр "Фундаментальные основы биотехнологии" Российской академии наук" (ФИЦ Биотехнологии РАН) | ШТАММ ГРИБА PENICILLIUM VERRUCULOSUM ПРОДУЦЕНТ КОМПЛЕКСА ФИТАЗЫ А И ЭНДО-1,4-β-КСИЛАНАЗЫ Е И ФЕРМЕНТНЫЙ ПРЕПАРАТ НА ЕГО ОСНОВЕ ДЛЯ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ В КАЧЕСТВЕ ДОБАВКИ В КОРМАХ |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Motta et al. | A review of xylanase production by the fermentation of xylan: classification, characterization and applications | |
| Harris et al. | Xylanases and its application in food industry: a review | |
| EP2197893B1 (en) | Novel fungal enzymes | |
| CN102762727B (zh) | 能产生用于降解木质纤维素材料的酶的宿主细胞 | |
| Paloheimo et al. | Xylanases and cellulases as feed additives. | |
| CN102712893A (zh) | Talaromyces菌株和酶组合物 | |
| CN103348005B (zh) | 突变体纤维二糖水解酶 | |
| CN102597213A (zh) | 篮状菌转化体 | |
| CN103547659B (zh) | 表达细胞壁降解酶的植物生物质的联合预处理和水解 | |
| CN102834511A (zh) | 具有纤维二糖水解酶活性的多肽及其用途 | |
| CN102292438A (zh) | 用于生产纤维素酶的宿主和发酵方法 | |
| RU2361918C1 (ru) | Штамм мицелиального гриба penicillium verruculosum - продуцент комплекса целлюлаз, ксиланазы и ксилоглюканазы и способ получения ферментного препарата комплекса целлюлаз, ксиланазы и ксилоглюканазы для гидролиза целлюлозы и гемицеллюлозы | |
| CN103987838A (zh) | 真菌细胞和发酵方法 | |
| Ghori et al. | Corn stover-enhanced cellulase production by Aspergillus niger NRRL 567 | |
| CN106687586A (zh) | 具有木聚糖酶活性并具有对含木糖多糖的高转化率的多肽 | |
| Otero et al. | Screening of yeasts capable of producing cellulase-free xylanase | |
| Simões et al. | Screening of culture condition for xylanase production by filamentous fungi | |
| ES2727390T3 (es) | Expresión de enzimas beta-xilosidasas recombinantes | |
| Keshavarz et al. | Trichoderma reesei, a superior cellulase source for industrial applications | |
| Polizeli et al. | Enzyme system from Aspergillus in current industrial uses and future applications in the production of second-generation ethanol | |
| CN102421888A (zh) | 通过发酵条件改变酶平衡 | |
| RU2654564C1 (ru) | Штамм мицелиального гриба TRICHODERMA LONGIBRACHIATUM TW-14-220 - продуцент целлюлаз, бета - глюканаз и ксиланаз для кормопроизводства и способ получения кормового комплексного ферментного препарата | |
| WO2018113431A1 (zh) | 一种能降解纤维素生产益生纤维寡糖并分泌抗菌肽的多功能酿酒酵母 | |
| Fadel et al. | Cellulases and animal feed production by solid-state fermentation by Aspergillus fumigatus NRCF-122 mutant | |
| RU2653429C1 (ru) | Генетическая конструкция для обеспечения экспрессии комплекса ферментов эндоглюканаз и ксиланаз в клетках гриба penicillium verruculosum и способ получения комплексных ферментных препаратов на его основе, предназначенных для кормопроизводства |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| QB4A | Licence on use of patent |
Free format text: LICENCE FORMERLY AGREED ON 20190220 Effective date: 20190220 |