RU2651774C2 - Способ определения генотипа человека по полиморфизму в гене цитохрома p450 cyp2d6*4 (1846g>a), rs3892097 - Google Patents
Способ определения генотипа человека по полиморфизму в гене цитохрома p450 cyp2d6*4 (1846g>a), rs3892097 Download PDFInfo
- Publication number
- RU2651774C2 RU2651774C2 RU2016135956A RU2016135956A RU2651774C2 RU 2651774 C2 RU2651774 C2 RU 2651774C2 RU 2016135956 A RU2016135956 A RU 2016135956A RU 2016135956 A RU2016135956 A RU 2016135956A RU 2651774 C2 RU2651774 C2 RU 2651774C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- allele
- fluorescence
- cytochrome
- labeled
- polymorphism
- Prior art date
Links
- 108010001237 Cytochrome P-450 CYP2D6 Proteins 0.000 title claims abstract description 7
- 108010015742 Cytochrome P-450 Enzyme System Proteins 0.000 title claims abstract description 4
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 10
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 claims abstract description 25
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 16
- 238000002844 melting Methods 0.000 claims abstract description 11
- 230000008018 melting Effects 0.000 claims abstract description 11
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 9
- 102100021704 Cytochrome P450 2D6 Human genes 0.000 claims abstract description 6
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 claims abstract description 4
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 claims abstract description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 5
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 5
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 claims 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- NKANXQFJJICGDU-QPLCGJKRSA-N Tamoxifen Chemical compound C=1C=CC=CC=1C(/CC)=C(C=1C=CC(OCCN(C)C)=CC=1)/C1=CC=CC=C1 NKANXQFJJICGDU-QPLCGJKRSA-N 0.000 description 20
- 229960001603 tamoxifen Drugs 0.000 description 10
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 5
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 4
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 4
- 101150010738 CYP2D6 gene Proteins 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 description 3
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 3
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 102000003849 Cytochrome P450 Human genes 0.000 description 1
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 206010071602 Genetic polymorphism Diseases 0.000 description 1
- 102100026450 POU domain, class 3, transcription factor 4 Human genes 0.000 description 1
- 101710133389 POU domain, class 3, transcription factor 4 Proteins 0.000 description 1
- 229960002932 anastrozole Drugs 0.000 description 1
- YBBLVLTVTVSKRW-UHFFFAOYSA-N anastrozole Chemical compound N#CC(C)(C)C1=CC(C(C)(C#N)C)=CC(CN2N=CN=C2)=C1 YBBLVLTVTVSKRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000003886 aromatase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229940046844 aromatase inhibitors Drugs 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000002651 drug therapy Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229940011871 estrogen Drugs 0.000 description 1
- 239000000262 estrogen Substances 0.000 description 1
- 108010038795 estrogen receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000015694 estrogen receptors Human genes 0.000 description 1
- 238000002189 fluorescence spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 229960003881 letrozole Drugs 0.000 description 1
- HPJKCIUCZWXJDR-UHFFFAOYSA-N letrozole Chemical compound C1=CC(C#N)=CC=C1C(N1N=CN=C1)C1=CC=C(C#N)C=C1 HPJKCIUCZWXJDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000037323 metabolic rate Effects 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 230000002974 pharmacogenomic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 1
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
- G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6804—Nucleic acid analysis using immunogens
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6858—Allele-specific amplification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6881—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for tissue or cell typing, e.g. human leukocyte antigen [HLA] probes
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области медицины, биологии и биотехнологии и предназначено для определения генотипа человека по полиморфизму в гене цитохрома Р450 CYP2D6*4 (1846G>A) rs3892097. Используют пару праймеров, флуоресцентно-меченые аллель-специфичные олигонуклеотидные пробы и универсальный олигонуклеотид, меченный гасителем флуоресценции. Отнесение образца к гомозиготе или гетерозиготе по данному аллелю оценивается по форме кривых плавления ДНК, а именно по максимуму первой производной графиков флуоресценции. Изобретение обеспечивает возможность проводить исследование в одной пробирке, что снижает затраты на исследование. 1 ил., 2 табл.
Description
1. Область техники
Предложенный способ относится к области медицины, биологии и биотехнологии и может быть использован при составлении индивидуального «генетического паспорта», реализации концепции индивидуальной медицины, для формирования персональных рекомендаций при назначении и корректировке химиотерапии с применением тамоксифена с учетом индивидуальных генетических особенностей пациента. Тамоксифен - селективный модулятор эстрогеновых рецепторов, является «золотым стандартом» в лечении эстроген-позитивного рака молочной железы начальных стадий. Продолжительные исследования показали, что его применение снижает риск рецидива и смерти на 30-50%. Ингибиторы ароматазы (анастрозол и летрозол) результативнее тамоксифена, но из-за значительного числа побочных эффектов подходят гораздо меньшему числу пациентов (Lash T.L. et al., 2009; Goetz M.P. et al., 2007; Ingelman-Sundberg M. et al., 2005). Метаболическая активность тамоксифена в организме определяется активностью одного из ферментов семейства цитохрома Р450, кодируемого геном CYP2D6: под действием фермента тамоксифен переходит в метаболически активную форму - эндоксифен. Было обнаружено, что различные аллельные варианты гена CYP2D6 по-разному влияют на активность фермента и, в конечном счете, на метаболическую активность тамоксифена. Ген CYP2D6 крайне полиморфичен - для него описано более 100 аллелей. Аллели CYP2D6*3, CYP2D6*4, CYP2D6*6 являются неактивными (нефункциональными) аллелями, ассоциированными с низким уровень метаболизма тамоксифена (poor metabolizer group). Для пациентов с двумя неактивными (нефункциональными) аллелями CYP2D6 характерен низкий уровень метаболизма тамоксифена (poor metabolizer group), для пациентов с одним или двумя малоактивными аллелями или с одним неактивным/малоактивным и одним активным аллелями - сниженный уровень метаболизма (intermediate metabolizer group), для пациентов с двумя активными аллелями - нормальный уровень метаболизма (ultrarapid metabolizer group). Для первых двух групп пациентов терапевтический эффект от применения тамоксифена снижен или даже отсутствует. (Goetz M.P. et al., 2005; Schroth W. et al., 2007; Bradford L.D. et al., 2002; Ingelman-Sundberg M. et al., 2007)
2. Уровень техники
Широко распространен способ определения типа нуклеотида, находящегося в определенном месте ДНК, основанный на использовании аллель-специфичных праймеров с регистрацией результатов ПЦР по окончании реакции с помощью электрофореза. При использовании ПЦР с регистрацией результатов в ходе реакции известны различные способы определения генотипа исследуемого образца. Существуют различные способы, позволяющие определить тип нуклеотида, находящегося в определенном месте ДНК, основанные на использовании аллель-специфичных праймеров с регистрацией результатов ПЦР непосредственно в ходе реакции с помощью использования флуоресцентно-меченных проб (олигонуклеотидов) (Andreas R. Tobler at all, "THE SNPlex Genotiping System: A Flexible and Scalable Platform for SNP Genotyping", Journal of Biomolecular Techniques, V. 16, issue 4, Desember 2005). Например, в наборах производства Applied Biosystems используют одну пару праймеров для каждого аллеля и два зонда с различными флуорецентными метками, в зависимости от генотипа аллеля фиксируют разгорание различных меток ("TaqMan SNP Genotyping Assays", Applied Biosistems, Prodakt Bulletin, USA, 06/2006). Недостатком способа, используемого в данных наборах, является сравнительно невысокая достоверность результатов исследования из-за небольшой разницы между получаемыми кривыми флуоресценции для разных аллелей. Предлагаемым подходом к детекции генетического полиморфизма является использование двух аллель-специфичных и меченных разными флуоресцентными метками олигонуклеотидов, а также олигонуклеотида, несущего гаситель флуоресценции и гибридизирующегося на матрицу рядом с аллель-специфичным олигонуклеотидом. Гибридизация аллель-специфичного олигонуклеотида на матрицу ведет к переносу энергии с находящегося на нем флуорофора-донора на гаситель флуоресценции расположенного рядом «гасящего» олигонуклеотида. Регистрацию результатов амплификации ведут по окончании ПЦР путем снятия спектра флуоресценции при изменении температуры реакционной смеси в диапазоне от 25 до 80 градусов по Цельсию (так называемые «кривые плавления»). При получении графиков флуоресценции возможен как нагрев, так и охлаждение реакционной смеси в указанном интервале температур. Предлагаемое изобретение делает определение вариабельных позиций в ДНК более надежными удешевляет подобные исследования благодаря использованию стандартного оборудования.
3. Раскрытие изобретения
Техническим результатом, на достижение которого направлено предлагаемое изобретение, является повышение доступности подобных исследований, поскольку способ может быть осуществлен на стандартном известном оборудовании. Также он обеспечивает возможность проводить исследование в одной пробирке, что снижает затраты на исследование. Использованный авторами способ генотипирования является вариантом классического метода «примыкающих проб». При определении замен одиночных нуклеотидов вначале проводили ПЦР с праймерами, общими для обоих вариантов последовательности, затем температуру реакционной смеси снижали для гибридизации полученной матрицы с олигонуклеотидными пробами. Для определения варианта последовательности использовали два типа олигонуклеотидов, гибридизирующихся на матрицу рядом. Один из олигонуклеотидов метили флуорофором, другой - гасителем флуоресценции. В реакции использовали один общий олигонуклеотид с гасителем флуоресценции и пару аллель-специфичных (сиквенс-специфичных) олигонуклеотидов, несущих флуорофор. Олигонуклеотидные пробы, соответствующие тому или иному варианту последовательности, метили различными флуорофорами, что позволило определять оба варианта в одной пробирке. Определение генотипа проводили после ПЦР и гибридизации путем измерения уровня флуоресценции в ходе температурной денатурации дуплексов олигонуклеотидов и полученных матриц (или наоборот - гибридизации). Данное измерение проводили в режиме реального времени, его результатом являлись кривые плавления. Условия реакции подбирали так, чтобы максимизировать разницу в температурах плавления совершенного и несовершенного дуплексов. Таким образом, если анализируемый образец содержал только один вариант последовательности, т.е. был гомозиготен по данному полиморфизму, температура плавления для пробы образующей совершенный дуплекс была существенно выше, нежели для пробы образующей несовершенный дуплекс.Если же анализировали гетерозиготный образец, температуры плавления были практически одинаковы. Указанный результат достигается путем использования при постановке ПЦР флуоресцентно-меченых аллель-специфичных олигонуклеотидных проб и праймеров:
4. Осуществление изобретения
В качестве материала для исследования рекомендуется использовать периферическую кровь. Выделение ДНК из биоматериала производится с использованием комплекта реагентов для выделения ДНК (не является предметом данного патента). Полимеразную цепную реакцию и определение температуры плавления олигонуклеотидных проб проводили с помощью детектирующего амплификатора «ДТпрайм» (ООО «НПО ДНК-Технология», Россия). Использовали следующий температурный режим амплификации: 94°С - 10 с, 64°С - 30 с в течение 50 циклов. По завершении реакции амплификации реакционную смесь остужали до 25°С со скоростью 2°С/с. Кривые плавления получали следующим образом: температуру реакционной смеси повышали с 25°С до 75°С с шагом 1°С, измеряя уровень флуоресценции на каждом шаге. Результаты, т.е. отнесение образца к гомозиготе или гетерозиготе по данному аллелю, оцениваются по форме кривых плавления ДНК (рис 1).
Список литературы
1. Lash TL, Lien EA, Sorensen HT, Hamilton-Dutoit S Genotype-guided tamoxifen therapy: time to pause for reflection? // Lancet Oncol. 2009 Aug; 10 (8): 825-33.
2. Goetz MP, Rae JM, Suman VJ, Safgren SL, Ames MM, Visscher DW, Reynolds C, Couch FJ, Lingle WL, Flockhart DA, Desta Z, Perez EA, Ingle JN. Pharmacogenetics of tamoxifen biotransformation is associated with clinical outcomes of efficacy and hot flashes. // J Clin Oncol. 2005 Dec 20; 23 (36): 9312-8.
3. Goetz MP, Ingle J. Early discontinuation of tamoxifen: a lesson for oncologists. // Cancer. 2007 Dec 1; 110 (11): 2595-6.
4. Schroth W, Antoniadou L, Fritz P, Schwab M, Muerdter T, Zanger UM, Simon W, Eichelbaum M, Brauch H. Breast cancer treatment outcome with adjuvant tamoxifen relative to patient CYP2D6 and CYP2C19 genotypes. // J Clin Oncol. 2007 Nov 20; 25 (33): 5187-93.
5. Bradford L.D. CYP2D6 allele frequency in European Caucasians, Asians, Africans and their descendants. // Pharmacogenomics. 2002 Mar; 3 (2): 229-43.
6. Ingelman-Sundberg M, Sim SC, Gomez A, Rodriguez-Antona C. Influence of cytochrome P450 polymorphisms on drug therapies: pharmacogenetic, pharmacoepigenetic and clinical aspects. // Pharmacol Ther. 2007 Dec; 116 (3): 496-526. Epub 2007 Oct 9.
7. Ingelman-Sundberg M, Rodriguez-Antona C. Pharmacogenetics of drug-metabolizing enzymes: implications for a safer and more effective drug therapy. //. Philos Trans R Soc Lond В Biol Sci. 2005 Aug 29; 360 (1460): 1563-70.
Claims (4)
- Способ определения генотипа человека по полиморфизму в гене цитохрома Р450 CYP2D6*4 (1846G>A) rs3892097, основанный на снятии кривых плавления с флуоресцентно-мечеными аллель-специфичными олигонуклеотидными пробами, отличающийся тем, что используют общую для всех аллелей пару праймеров, отличающиеся для каждого аллеля флуоресцентно-меченые аллель-специфичные олигонуклеотидные пробы и универсальный олигонуклеотид, меченный гасителем флуоресценции, следующего нуклеотидного состава:
-
- FAM - означает флуоресцентный краситель FAM, VIC - означает флуоресцентный краситель VIC, BHQ1 - означает присоединенный к 5'-концевому нуклеотиду темновой гаситель флуоресценции;
- отнесение образца к гомозиготе или гетерозиготе по данному аллелю оценивается по форме кривых плавления ДНК, по максимуму первой производной графиков флуоресценции.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2016135956A RU2651774C2 (ru) | 2016-09-06 | 2016-09-06 | Способ определения генотипа человека по полиморфизму в гене цитохрома p450 cyp2d6*4 (1846g>a), rs3892097 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2016135956A RU2651774C2 (ru) | 2016-09-06 | 2016-09-06 | Способ определения генотипа человека по полиморфизму в гене цитохрома p450 cyp2d6*4 (1846g>a), rs3892097 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2016135956A RU2016135956A (ru) | 2018-03-15 |
| RU2016135956A3 RU2016135956A3 (ru) | 2018-03-20 |
| RU2651774C2 true RU2651774C2 (ru) | 2018-04-23 |
Family
ID=61627394
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2016135956A RU2651774C2 (ru) | 2016-09-06 | 2016-09-06 | Способ определения генотипа человека по полиморфизму в гене цитохрома p450 cyp2d6*4 (1846g>a), rs3892097 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2651774C2 (ru) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113549681A (zh) * | 2021-06-17 | 2021-10-26 | 湖南菲思特精准医疗科技有限公司 | 一种他莫昔芬代谢标志物的检测试剂盒及其检测方法和应用 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2470998C2 (ru) * | 2006-06-22 | 2012-12-27 | Ян Любински | Определение предрасположенности к раку путем идентификации генотипических комбинаций специфичных вариантов генов cyp1b1, brca2 и снек2 |
-
2016
- 2016-09-06 RU RU2016135956A patent/RU2651774C2/ru active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2470998C2 (ru) * | 2006-06-22 | 2012-12-27 | Ян Любински | Определение предрасположенности к раку путем идентификации генотипических комбинаций специфичных вариантов генов cyp1b1, brca2 и снек2 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| AZAD A.K. et al. Genetic sequence variants and the development of secondary primary cancers in patients with head and neck cancers. Cancer. 2012 Mar 15; 118(6): 1554-65. Epub 2011 Aug 25. * |
| BRADFORD L.D. CYP2D6 allele frequency in European Caucasians, Asians, Africans and their descendants. Pharmacogenomics. 2002 Mar; 3(2): 229-43. * |
| LIM J.S. et al. Impact of CYP2D6, CYP3A5, CYP2C9 and CYP2C19 polymorphisms on tamoxifen pharmacokinetics in Asian breast cancer patients. Br J Clin Pharmacol. 2011 May; 71(5): 737-50. * |
| LIM J.S. et al. Impact of CYP2D6, CYP3A5, CYP2C9 and CYP2C19 polymorphisms on tamoxifen pharmacokinetics in Asian breast cancer patients. Br J Clin Pharmacol. 2011 May; 71(5): 737-50. AZAD A.K. et al. Genetic sequence variants and the development of secondary primary cancers in patients with head and neck cancers. Cancer. 2012 Mar 15; 118(6): 1554-65. Epub 2011 Aug 25. BRADFORD L.D. CYP2D6 allele frequency in European Caucasians, Asians, Africans and their descendants. Pharmacogenomics. 2002 Mar; 3(2): 229-43. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2016135956A3 (ru) | 2018-03-20 |
| RU2016135956A (ru) | 2018-03-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Chen et al. | Global gene expression profiling reveals genes expressed differentially in cattle with high and low residual feed intake | |
| US10883142B2 (en) | Risk assessment for phenytoin-induced adverse drug reactions | |
| JP2014524736A (ja) | フェニトインによって誘発される薬の副作用のリスク評価 | |
| Barnaud et al. | Development of nuclear microsatellite markers for the fonio, Digitaria exilis (Poaceae), an understudied West African cereal | |
| Nakai et al. | Ethnic differences in CYP2C9* 2 (Arg144Cys) and CYP2C9* 3 (Ile359Leu) genotypes in Japanese and Israeli populations | |
| Jamroziak et al. | Polymorphisms and haplotypes in the multidrug resistance 1 gene (MDR1/ABCB1) and risk of multiple myeloma | |
| Voisey et al. | SNP technologies for drug discovery: a current review | |
| RU2651774C2 (ru) | Способ определения генотипа человека по полиморфизму в гене цитохрома p450 cyp2d6*4 (1846g>a), rs3892097 | |
| JP2017503493A5 (ru) | ||
| KR101359851B1 (ko) | 간세포암종의 예후 진단용 단일 염기 다형성 | |
| Ngow et al. | CYP2C9 polymorphism: prevalence in healthy and warfarin-treated Malay and Chinese in Malaysia | |
| KR101359782B1 (ko) | 간세포암종의 재발 진단용 단일 염기 다형성 | |
| Cui et al. | Development of a high resolution melting method for genotyping of risk HLA-DQA1 and PLA2R1 alleles and ethnic distribution of these risk alleles | |
| Ingelsson et al. | Genotyping of apolipoprotein E: comparative evaluation of different protocols | |
| Khadzhieva et al. | Verification of the chromosome region 9q21 association with pelvic organ prolapse using RegulomeDB annotations | |
| Lee et al. | Association Between a Polymorphism in the Lymphotoxin− a Promoter Region and Migraine | |
| RU2651773C2 (ru) | СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГЕНОТИПА ЧЕЛОВЕКА ПО ПОЛИМОРФИЗМУ В ГЕНЕ ЦИТОХРОМА P450 CYP2D6*9 (2615-2617delAAG) rs5030656 | |
| RU2653492C2 (ru) | СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГЕНОТИПА ЧЕЛОВЕКА ПО ПОЛИМОРФИЗМУ В ГЕНЕ ЦИТОХРОМА Р450 CYP2D6*6 (1707delT) rs5030655 | |
| RU2651770C2 (ru) | СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГЕНОТИПА ЧЕЛОВЕКА ПО ПОЛИМОРФИЗМУ В ГЕНЕ ЦИТОХРОМА P450 CYP2D6∗3 (2549delA), rs35742686 | |
| CN101575641B (zh) | 一种检测原发性肝细胞癌的易感基因的荧光定量pcr基因分型方法及其试剂盒 | |
| Krüger et al. | The additive effect of p53 Arg72Pro and RNASEL Arg462Gln genotypes on age of disease onset in Lynch syndrome patients with pathogenic germline mutations in MSH2 or MLH1 | |
| JP2010279264A (ja) | Ｅｇｆｒ遺伝子変異検出プライマーセット、それを含むｅｇｆｒ遺伝子変異検出キット、およびそれを用いてｅｇｆｒ遺伝子変異検出を行うための核酸増幅装置 | |
| Feng et al. | Study on the haplotypes of MICA and MICB microsatellite and HLA‐B locus in the Guangzhou Han population | |
| JP6470044B2 (ja) | がんに対する免疫療法の有効性の予測方法 | |
| RU2548811C2 (ru) | СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГЕНОТИПА ЧЕЛОВЕКА ПО ПОЛИМОРФИЗМУ В ГЕНЕ МАТРИКСНОЙ МЕТАЛЛОПРОТЕИНАЗЫ ММР9-1562 С>Т (rs3918242) |