RU2646448C1 - Method for prediction of risk of preeclampsia development based on matrix metal proteinase genes combinations - Google Patents
Method for prediction of risk of preeclampsia development based on matrix metal proteinase genes combinations Download PDFInfo
- Publication number
- RU2646448C1 RU2646448C1 RU2017115326A RU2017115326A RU2646448C1 RU 2646448 C1 RU2646448 C1 RU 2646448C1 RU 2017115326 A RU2017115326 A RU 2017115326A RU 2017115326 A RU2017115326 A RU 2017115326A RU 2646448 C1 RU2646448 C1 RU 2646448C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- mmp
- risk
- preeclampsia
- matrix metal
- combinations
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6804—Nucleic acid analysis using immunogens
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6858—Allele-specific amplification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2531/00—Reactions of nucleic acids characterised by
- C12Q2531/10—Reactions of nucleic acids characterised by the purpose being amplify/increase the copy number of target nucleic acid
- C12Q2531/113—PCR
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2561/00—Nucleic acid detection characterised by assay method
- C12Q2561/113—Real time assay
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/118—Prognosis of disease development
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/36—Gynecology or obstetrics
- G01N2800/368—Pregnancy complicated by disease or abnormalities of pregnancy, e.g. preeclampsia, preterm labour
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/50—Determining the risk of developing a disease
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к области медицинской диагностики, может быть использовано в акушерстве и гинекологии для прогнозирования риска развития преэклампсии на основе генов матриксных металлопротеиназ.The invention relates to the field of medical diagnostics, can be used in obstetrics and gynecology to predict the risk of preeclampsia based on matrix metalloproteinase genes.
Преэклампсия (далее ПЭ) – осложнение беременности, характеризующееся развитием эндотелиальной дисфункции, полиорганной недостаточностью, нарушением свертывающей и противосвертывающей систем, микроциркуляции, обменных процессов, иммунного ответа [Серов, В.Н. Клинические рекомендации. Акушерство и гинекология. - 4-е изд. / В.Н. Серов, Г.Т. Сухих. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2014. - 1024 с.; Eiland, E. Preeclampsia / E. Eiland, C. Nzerue, M. Faulkner // J. Pregnancy, 2012. – P. 586—578].Preeclampsia (hereinafter referred to as PE) is a pregnancy complication characterized by the development of endothelial dysfunction, multiple organ failure, impaired coagulation and anticoagulation systems, microcirculation, metabolic processes, and the immune response [Serov, V.N. Clinical recommendations. Obstetrics and gynecology. - 4th ed. / V.N. Serov, G.T. Dry. - M.: GEOTAR-Media, 2014 .-- 1024 p .; Eiland, E. Preeclampsia / E. Eiland, C. Nzerue, M. Faulkner // J. Pregnancy, 2012. - P. 586-578].
ПЭ характеризуется следующими типичными клиническими симптомами: артериальной гипертензией, протеинурией, отеками, а также глубокими расстройствами функции сосудистой системы, гемостаза, иммунитета, гемодинамики и микроциркуляции, фетоплацентарной недостаточностью, нарушением функции почек, печени, легких. PE is characterized by the following typical clinical symptoms: arterial hypertension, proteinuria, edema, as well as deep disorders of the vascular system, hemostasis, immunity, hemodynamics and microcirculation, fetoplacental insufficiency, impaired renal function, liver, lungs.
По данным статистических исследований, частота ПЭ практически не снижается на протяжении последних двадцати лет и в Российской Федерации варьируется по разным территориям от 17,8% до 22,2% [Радзинский, В.Е. Проблемы гестоза и подходы к ее решению [Текст]. / В.Е. Радзинский, Т.В. Галина // Казанский медицинский журнал. – 2007. – Т. 88, № 2. – С. 114-117].According to statistical studies, the frequency of PE has not decreased over the past twenty years and in the Russian Federation varies in different territories from 17.8% to 22.2% [Radzinsky, V.E. Problems of gestosis and approaches to its solution [Text]. / V.E. Radzinsky, T.V. Galina // Kazan Medical Journal. - 2007. - T. 88, No. 2. - S. 114-117].
Согласно литературным данным к факторам риска развития данной патологии беременности относятся: ПЭ при предыдущей беременности, возраст, первая беременность, многоплодие, генетические факторы, социальные аспекты, профессиональные вредности, вредные привычки, неудовлетворительная экологическая обстановка, недостаточное и несбалансированное питание, осложненный акушерско-гинекологический анамнез, воспалительные заболевания гениталий, которые, как правило, сочетаются с поражением мочевыводящих путей, патология сосудистой системы [Risk factors for a prolonged length of stay in women hospitalized for preeclampsia in Texas / Z.D. Mulla, B.S. Nuwayhid, K.M. Garcia [et al.] [Text]. // Hypertens Pregnancy. 2010. Vol. 29, № 1. P. 54–68].According to literature data, the risk factors for the development of this pathology of pregnancy include: PE during a previous pregnancy, age, first pregnancy, multiple pregnancy, genetic factors, social aspects, occupational hazards, bad habits, poor environmental conditions, insufficient and unbalanced nutrition, complicated obstetric and gynecological history inflammatory diseases of the genitals, which are usually combined with lesions of the urinary tract, pathology of the vascular system [Ris k factors for a prolonged length of stay in women hospitalized for preeclampsia in Texas / Z.D. Mulla, B.S. Nuwayhid, K.M. Garcia [et al.] [Text]. // Hypertens Pregnancy. 2010. Vol. 29, No. 1. P. 54–68].
В настоящее время известно свыше 100 генов-кандидатов преэклампсии. Локальные генные сети преэклампсии включают гены метаболизма, гены эндотелиальной дисфункции, гены сосудистой системы, гены ростовых факторов и цитокинов, гены эндокринной системы, гены главного комплекса гистосовместимости [Генетический паспорт – основа индивидуальной и предиктивной медицины [Текст]: Коллектив. моногр. / В. С. Баранов, А. С. Глотов, Т. Э. Иващенко и др.; под ред. В. С. Баранова. – Санкт-Петербург: Изд-во Н-Л, 2009. – 527 с.: ил.]. Currently, over 100 candidate genes for preeclampsia are known. Local gene networks of preeclampsia include genes for metabolism, genes for endothelial dysfunction, genes for the vascular system, genes for growth factors and cytokines, genes for the endocrine system, genes for the main histocompatibility complex [Genetic passport - the basis of individual and predictive medicine [Text]: Team. monograph / V. S. Baranov, A. S. Glotov, T. E. Ivashchenko and others; under the editorship of V.S. Baranova. - St. Petersburg: Publishing House NL, 2009. - 527 pp., Ill.].
Согласно данным литературы матриксная металлопротеиназа-7 (MMP-7) является сильной протеиназой, которая гидролизует ряд белков матрикса, таких как фибронектин, ламинин, эластин, аггрекан, коллаген V типа, и экспрессируется в эпителиальных клетках. Ген ММР-7 расположен на 11 хромосоме в положении 11q22.2. Наиболее изучены два функциональных полиморфизма гена ММР-7: (rs11568819) и (rs11568818), модулирующие транскрипцию путем взаимодействия с ядерными связывающими белками [Аllеlе-sресifiс rеgulаtiоn оf mаtriх mеtаllорrоtеinаsе-7 рrоmоtеr асtivity is аssосiаtеd with соrоnаry аrtеry luminаl dimеnsiоns аmоng hyреrсhоlеstеrоlеmiс раtiеnts [Tехt]. / S. Jоrmsjö, С. Whаtling, D.H. Wаltеr [еt аl.] // Аrtеriоsсlеr. Thrоmb. Vаsс. Biоl. – 2001. – Vоl. 21, № 11. – Р. 1834-1839].According to the literature, matrix metalloproteinase-7 (MMP-7) is a strong proteinase that hydrolyzes a number of matrix proteins, such as fibronectin, laminin, elastin, aggrecan, type V collagen, and is expressed in epithelial cells. The MMP-7 gene is located on chromosome 11 at position 11q22.2. The most studied two functional polymorphism of MMP-7: (rs11568819) and (rs11568818), modulating transcription by interaction with the nuclear binding proteins [Allele-sresifis regulation ° F matrih metallorroteinase-7 rromoter astivity is assosiated with soronary artery luminal dimensions among hyrersholesterolemis ratients [Teht ]. / S. Jörmsjö, S. Whatling, D.H. Wälter [et al.] // Arteriossl. Thromb. Vасс. Biol. - 2001. - Vol. 21, No. 11. - R. 1834-1839].
Матриксная металлопротеиназа-8 (ММР-8) или нейтрофильная коллагеназа содержится в специфических гранулах полиморфноядерных лейкоцитов в виде неактивного профермента. Ген ММР-8 находится на 11 хромосоме в области 11q22.2–q22.3. В гене наиболее изучены два полиморфных локуса с однонуклеотидными заменами в кодирующей области ММР-8 (rs11225395) и ММР-8 (rs1320632). Данные полиморфизмы связаны с преждевременным разрывом плодных оболочек, хроническим и острым периодонтитом, развитием рака молочной железы, рака легких и атеросклерозом сонных артерий [Mаtriх mеtаllорrоtеinаsе 8 (MMР8) gеnе роlymоrрhisms in сhrоniс реriоdоntitis [Tехt]. / L. Izаkоviсоvа Hоllа, B. Hrdliсkоvа, J. Vоkurkа [еt аl.] // Аrсh. Оrаl Biоl. – 2012. – Vоl. 57, № 2. – Р. 188-196].Matrix metalloproteinase-8 (MMP-8) or neutrophilic collagenase is contained in specific granules of polymorphonuclear leukocytes in the form of an inactive proenzyme. The MMP-8 gene is located on chromosome 11 in the region 11q22.2 – q22.3. Two polymorphic loci with single nucleotide substitutions in the coding region of MMP-8 (rs11225395) and MMP-8 (rs1320632) were most studied in the gene. These polymorphisms are associated with premature rupture of the membranes, chronic and acute periodontitis, the development of breast cancer, lung cancer and carotid atherosclerosis [Мatrix metalorroteinase 8 (MMP8) gene polarithriton. / L. Izakovisova Holla, B. Hrdlicova, J. Vokurka [et al.] // Arkh. ORAL Biol. - 2012. - Vol. 57, No. 2. - R. 188-196].
Из области техники известен «Способ прогнозирования гестоза» по патенту РФ № 2191384 по заявке №2000115821/14, 16.06.2000. Заявляемый способ позволяет прогнозировать развитие гестоза за 2-4 недели до его клинических проявлений (артериальная гипертензия, протеинурия, отеки). Определяемое у беременных время устойчивости эритроцитов к перекисному гемолизу характеризует суммарный показатель состояния клеточных мембран.From the field of technology known "Method for predicting gestosis" according to the patent of the Russian Federation No. 2191384 according to the application No. 2001 15821/14, 06.16.2000. The claimed method allows to predict the development of gestosis 2-4 weeks before its clinical manifestations (arterial hypertension, proteinuria, edema). The time of erythrocyte resistance to peroxide hemolysis, determined in pregnant women, characterizes the total indicator of the state of cell membranes.
Недостаток указанного способа заключается в том, что не рассматриваются генетические полиморфизмы и их сочетания с риском развития ПЭ. The disadvantage of this method is that it does not consider genetic polymorphisms and their combination with the risk of developing PE.
За прототип выбран «Способ прогнозирования риска развития преэклампсии на основе комбинаций генов цитокинов» по патенту РФ №2568891, номер заявки 2014135181/15, 28.08.2014, включающий прогнозирование минимального риска развития преэклампсии при сочетании трех генетических вариантов четырех генетических полиморфизмов: G I-ТАС (rs4512021) и +36 GG TNFR1; +250 A Ltα, G I-TAC (rs4512021) и +36 GG TNFR1; +250 G Ltα (rs909253), +36 A TNFR1 (rs767455), -403 G/A RANTES (rs2107538). Использование изобретения позволяет повысить эффективность выявления риска развития преэклампсии.For the prototype, “Method for predicting the risk of developing preeclampsia based on combinations of cytokine genes” was selected according to RF patent No. 2568891, application number 2014135181/15, 08/28/2014, which includes predicting the minimum risk of preeclampsia with the combination of three genetic variants of four genetic polymorphisms: G I-TAC (rs4512021) and +36 GG TNFR1; +250 A Ltα, G I-TAC (rs4512021) and +36 GG TNFR1; +250 G Ltα (rs909253), +36 A TNFR1 (rs767455), -403 G / A RANTES (rs2107538). The use of the invention improves the effectiveness of identifying the risk of preeclampsia.
Задачей настоящего исследования является расширение арсенала способов диагностики, а именно создание способа прогнозирования риска развития преэклампсии на основе комбинаций генов матриксных металлопротеиназ. The objective of this study is to expand the arsenal of diagnostic methods, namely the creation of a method for predicting the risk of preeclampsia based on combinations of matrix metalloproteinase genes.
Технический результат использования изобретения – получение критериев оценки риска развития преэклампсии на основе генов матриксных металлопротеиназ.The technical result of using the invention is to obtain criteria for assessing the risk of preeclampsia based on matrix metalloproteinase genes.
В соответствии с поставленной задачей был разработан способ прогнозирования риска развития преэклампсии на основе комбинаций генов матриксных металлопротеиназ у женщин русской национальности, являющихся уроженками Центрального Черноземья России, включающий:In accordance with the task, a method was developed for predicting the risk of preeclampsia based on combinations of matrix metalloproteinase genes in women of Russian nationality who are natives of the Central Black Earth Region of Russia, including:
- выделение ДНК из периферической венозной крови;- DNA isolation from peripheral venous blood;
- анализ полиморфизмов генов матриксных металлопротеиназ ММР-7 (rs11568818) и ММР-8 (rs11225395);- analysis of polymorphisms of the genes of matrix metalloproteinases MMP-7 (rs11568818) and MMP-8 (rs11225395);
- прогнозирование риска развития преэклампсии при выявлении сочетания аллелей А MMР-7 (rs11568818) и T MMР-8 (rs11225395);- prediction of the risk of preeclampsia in detecting a combination of alleles A MMP-7 (rs11568818) and T MMP-8 (rs11225395);
- сочетание аллеля С MMР-8 (rs11225395) и генотипа GG MMР-7(rs11568818) является протективным фактором развития ПЭ. - the combination of the C allele MMP-8 (rs11225395) and the genotype GG MMP-7 (rs11568818) is a protective factor in the development of PE.
Новизна и изобретательский уровень заключается в том, что из уровня техники не известна возможность прогноза развития преэклампсии по наличию сочетания генетических вариантов полиморфных локусов на основе комбинаций генов матриксных металлопротеиназ ММР-7 (rs11568818) и ММР-8 (rs11225395).The novelty and inventive step is that the prior art does not know the possibility of predicting the development of preeclampsia by the presence of a combination of genetic variants of polymorphic loci based on combinations of the genes of matrix metalloproteinases MMP-7 (rs11568818) and MMP-8 (rs11225395).
Выделение геномной ДНК из периферической крови осуществляют методом фенольно-хлороформной экстракции (Mathew, 1984) в два этапа. На первом этапе к 4 мл крови добавляют 25 мл лизирующего буфера, содержащего 320 мМ сахарозы, 1% тритон Х-100, 5мМ MgCl2, 10 мМ трис-HCl (pH=7,6). Полученную смесь перемешивают и центрифугируют при 4ºС, 4000 об/мин в течение 20 минут. После центрифугирования надосадочную жидкость сливают, к осадку добавляют 4 мл раствора, содержащего 25 мМ ЭДТА (рН=8,0) и 75 мМ NaCl, ресуспензируют. Затем прибавляют 0,4 мл 10% SDS, 35 мкл протеиназы К (10 мг/мл) и инкубируют образец при 37ºС в течение 16 часов. Genomic DNA is isolated from peripheral blood by phenol-chloroform extraction (Mathew, 1984) in two stages. At the first stage, 25 ml of lysis buffer containing 320 mM sucrose, 1% Triton X-100, 5 mM MgCl 2 , 10 mM Tris-HCl (pH = 7.6) is added to 4 ml of blood. The resulting mixture was stirred and centrifuged at 4 ° C, 4000 rpm for 20 minutes. After centrifugation, the supernatant is decanted, 4 ml of a solution containing 25 mM EDTA (pH = 8.0) and 75 mM NaCl are added to the precipitate, and they are resuspended. Then add 0.4 ml of 10% SDS, 35 μl of proteinase K (10 mg / ml) and incubate the sample at 37 ° C for 16 hours.
На втором этапе из полученного лизата последовательно проводят экстракцию ДНК равными объемами фенола, фенол-хлороформа (1:1) и хлороформа с центрифугированием при 4000 об/мин в течение 10 минут. После каждого центрифугирования производят отбор водной фазы. ДНК осаждают из раствора двумя объемами охлажденного 96% этанола. Сформированную ДНК растворяют в бидистиллированной, деионизированной воде и хранят при -20ºС. Выделенную ДНК используют для проведения полимеразной цепной реакции синтеза ДНК.At the second stage, DNA is sequentially extracted from the obtained lysate in equal volumes of phenol, phenol-chloroform (1: 1) and chloroform with centrifugation at 4000 rpm for 10 minutes. After each centrifugation, the aqueous phase is selected. DNA is precipitated from solution in two volumes of chilled 96% ethanol. The formed DNA is dissolved in bidistilled, deionized water and stored at -20 ° C. Isolated DNA is used to carry out the polymerase chain reaction of DNA synthesis.
Для исследования полиморфизма MMР-7 (rs11568818) используют стандартные олигонуклеотидные праймеры и зонды [Аssосiаtiоn оf mаtriх mеtаllорrоtеinаsеs (MMР2, MMР7 аnd MMР9) gеnеtiс vаriаnts with lеft vеntriсulаr dysfunсtiоn in соrоnаry аrtеry disеаsе раtiеnts [Tехt]. / А. Mishrа, А. Srivаstаvа, T. Mittаl [еt аl.] // Сlin. Сhim. Асtа. – 2012. – Vоl. 413, № 19-20. – Р. 1668-1674] и наборы 2,5х реакционной смеси для проведения ПЦР-РВ в объеме 25 мкл на 1 образец, включавших 2,5х реакционную смесь (2,5х ПЦР буфер: (KСl, ТрисHСl (рH 8,8), 6,25 мМ MgСl2), SynTаq ДНК-полимеразу, дезоксинуклеозидтрифосфаты, глицерол, Twееn 20) в объеме 10 мкл, 25 мМ MgСl2 в объеме 1,5 мкл, ddH2О (деионизированная вода), по 10 пкмоль каждого праймера и по 5 пкмоль каждого зонда. При проведении ПЦР в амплификаторе с флюоресцентной детекцией (на амплификаторе CFX96) генотипирование осуществляют методом TaqMan зондов по данным величин ОЕФ (оптические единицы флуоресценции). Для ММР-7 (rs11568818) зонд с флуоресцентным красителем ROX соответствует аллелю A, зонд с красителем FAM – аллелю G .To study the polymorphism MMP-7 (rs11568818), standard oligonucleotide primers and probes are used [Associative of matriot metinorecents (MMP2, Mp7 and optimized with incomparable). / A. Mishra, A. Srivastava, T. Mittal [et al.] // Сlin. Chim. Assa. - 2012. - Vol. 413, No. 19-20. - R. 1668-1674] and kits of 2.5x reaction mixture for PCR-RV in a volume of 25 μl per 1 sample, including 2.5x reaction mixture (2.5x PCR buffer: (KCl, TrisHCl (pH 8.8) , 6.25 mM MgCl 2 ), SynTaq DNA polymerase, deoxynucleoside triphosphates, glycerol, Tween 20) in a volume of 10 μl, 25 mm MgCl 2 in a volume of 1.5 μl, ddH 2 O (deionized water), 10 pcmol of each primer and 5 pmol of each probe. When performing PCR in a thermocycler with fluorescence detection (on a CFX96 thermocycler), genotyping is carried out using TaqMan probes according to OEF values (optical fluorescence units). For MMP-7 (rs11568818), a probe with a ROX fluorescent dye corresponds to allele A, a probe with a FAM dye corresponds to allele G.
Анализ полиморфизма гена ММР-8 (rs11225395) проводят методом ПЦР-синтеза ДНК на амплификаторе СFX96 (Bio-Rad) с использованием стандартных олигонуклеотидных праймеров и зондов [Еlеvаtеd MMР-8 аnd dесrеаsеd myеlореrохidаsе соnсеntrаtiоns аssосiаtе signifiсаntly with thе risk fоr реriрhеrаl аthеrоsсlеrоsis disеаsе аnd аbdоminаl аоrtiс аnеurysm [Tехt]. / Р. Рrаdhаn-Раlikhе, Р. Vikаtmаа, T. Lаjunеn [еt аl.] // Sсаnd. J. Immunоl. – 2010. – Vоl. 72, № 2. – Р. 150-157] с последующим анализом полиморфизма методом дискриминации аллелей. Реакционная смесь объемом 25 мкл включает: 67 мМ трис-HCl (pH=8,8), 2,5 мМ MgCl2, 0,1 мкг геномной ДНК, по 10 пМ каждого праймера, по 5 пкмоль каждого зонда, по 200 мкМ dATP, dGTP, dCTP, dTTP и 1 единицу активной Taq-полимеразы. После денатурации (5 мин при 95°С) выполняют 40 циклов амплификации по схеме: отжиг праймеров – 1 мин при t+54.0°С; денатурация – 15 с при t+95°С. При проведении ПЦР в амплификаторе с флюоресцентной детекцией (на амплификаторе CFX96) генотипирование осуществляют методом TaqMan зондов по данным величин ОЕФ (оптические единицы флуоресценции) каждого зонда. Для ММР-8 (rs11225395) зонд с флуоресцентным красителем ROX соответствует аллелю Т, зонд с красителем FAM – аллелю С.Analysis of gene polymorphism of MMP-8 (rs11225395) is carried out by PCR-synthesis of DNA on a thermocycler SFX96 (Bio-Rad) using standard oligonucleotide primers and probes [Elevated MMR-8 and desreased myelorerohidase sonsentrations assosiate signifisantly with the risk for rerirheral atherosslerosis disease and abdominal aortic aneurysm [Tex]. / R. Pradhan-Ralike, R. Vikatmaa, T. Lajunen [et al.] // Snd. J. Immunol. - 2010. - Vol. 72, No. 2. - R. 150-157] followed by analysis of polymorphism by the method of discrimination of alleles. A 25 μl reaction mixture includes: 67 mM Tris-HCl (pH = 8.8), 2.5 mM MgCl 2 , 0.1 μg of genomic DNA, 10 pM of each primer, 5 pcm of each probe, 200 μM of dATP , dGTP, dCTP, dTTP and 1 unit of active Taq polymerase. After denaturation (5 min at 95 ° C), 40 amplification cycles are performed according to the scheme: primer annealing - 1 min at t + 54.0 ° C; denaturation - 15 s at t + 95 ° С. When performing PCR in a thermocycler with fluorescence detection (on a CFX96 thermocycler), genotyping is carried out using TaqMan probes according to the OEF values (optical fluorescence units) of each probe. For MMP-8 (rs11225395), the probe with the fluorescent dye ROX corresponds to the T allele, the probe with the FAM dye corresponds to the C allele.
Выделенную ДНК подвергают полимеразной цепной реакции с использованием стандартных олигонуклеотидных праймеров (фиг. 3).Isolated DNA is subjected to polymerase chain reaction using standard oligonucleotide primers (Fig. 3).
Изобретение характеризуется чертежами.The invention is characterized by drawings.
Фиг 1. Дискриминации аллелей методом детекции TaqMan зондов по данным величин ОЕФ (оптические единицы флуоресценции) каждого зонда на амплификаторе CFX96 c детектирующей системой в режиме реального времени полиморфизма MMР-7 (rs11568818), где ● - гомозигота GG MMР-7 (rs11568818), ■ - гомозигота АА MMР-7 (rs11568818), ▲ - гетерозигота GА MMР-7 (rs11568818), × - отрицательный контроль.Fig 1. Allele discrimination by the TaqMan detection method according to the OEF values (optical fluorescence units) of each probe on a CFX96 amplifier with a real-time polymorphism detection system MMP-7 (rs11568818), where ● homozygote GG MMP-7 (rs11568818) ■ - homozygote AA MMP-7 (rs11568818), ▲ - heterozygote GA MMP-7 (rs11568818), × - negative control.
Фиг. 2. Дискриминации аллелей методом детекции TaqMan зондов по данным величин ОЕФ (оптические единицы флуоресценции) каждого зонда на амплификаторе CFX96 c детектирующей системой в режиме реального времени полиморфизма ММР-8 (rs11225395), где ● - гомозигота СС ММР-8 (rs11225395), ■ - гомозигота TT ММР-8 (rs11225395), ▲ - гетерозигота СT ММР-8 (rs11225395), × - отрицательный контроль).FIG. 2. Allele discrimination by the TaqMan detection method according to the OEF values (optical fluorescence units) of each probe on a CFX96 amplifier with a real-time MMP-8 polymorphism detection system (rs11225395), where ● homozygous SS MMP-8 (rs11225395) - homozygote TT MMP-8 (rs11225395), ▲ - heterozygous CT MMP-8 (rs11225395), × - negative control).
Фиг. 3. Распространенность сочетаний некоторых аллелей/генотипов матриксных металлопротеиназ у женщин с ПЭ и в контрольной группе.FIG. 3. The prevalence of combinations of certain alleles / genotypes of matrix metalloproteinases in women with PE and in the control group.
Анализ ассоциаций сочетаний генетических вариантов с преэклампсией проведен с помощью программного обеспечения APSampler (http://sources.redhat.com/cygwin/), использующего метод Монте-Карло марковских цепей и байесовскую непараметрическую статистику.An analysis of the associations of combinations of genetic variants with preeclampsia was performed using the APSampler software (http://sources.redhat.com/cygwin/), using the Monte Carlo method of Markov chains and Bayesian nonparametric statistics.
Статистическая обработка данных проводилась на персональном компьютере с использованием программных пакетов «STATISTICA for Windows 6.0» и «Microsoft Exсel 2002».Statistical data processing was carried out on a personal computer using the software packages "STATISTICA for Windows 6.0" and "Microsoft Excel 2002".
Возможность использования предложенного способа для оценки риска возникновения и развития преэклампсии подтверждает анализ результатов наблюдений 468 пациенток с ПЭ и 577 женщин контрольной группы. Общий объем исследуемой выборки составил 1045 человек. Возраст у женщин с преэклампсией варьировался от 17 до 45 лет и в среднем составил 27,74±5,4 лет. Возраст беременных без ПЭ варьировал от 15 до 49 лет и в среднем составил 27,80±6,5 лет. В исследуемые выборки включались индивидуумы русской национальности, являющиеся уроженцами Центрального Черноземья России и не имеющие родства между собой. Таким образом, контрольная группа не отличалась от группы женщин с ПЭ по полу, возрасту, месту рождения и национальности.The possibility of using the proposed method to assess the risk of the occurrence and development of preeclampsia is confirmed by an analysis of the observation results of 468 patients with PE and 577 women in the control group. The total sample size was 1045 people. The age of women with preeclampsia ranged from 17 to 45 years and averaged 27.74 ± 5.4 years. The age of pregnant women without PE varied from 15 to 49 years and averaged 27.80 ± 6.5 years. The studied samples included individuals of Russian nationality who are natives of the Central Black Earth Region of Russia and have no kinship between themselves. Thus, the control group did not differ from the group of women with PE by gender, age, place of birth, and nationality.
Все клинические и клинико-лабораторные исследования проводились на базе Перинатального центра Белгородской областной клинической больницы с информированного согласия пациенток на использование материалов лечебно-диагностических мероприятий, проводимых за период госпитализации и после, связанной с ПЭ, для научно-исследовательских целей и протоколировались по стандартам этического комитета Российской Федерации. Анализ ассоциаций сочетаний генетических вариантов с ПЭ проведен с помощью программного обеспечения APSampler (http://sources.redhat.com/cygwin/), использующего метод Монте-Карло марковских цепей и байесовскую непараметрическую статистику [A Gibbs sampler for identification of symmetrically structured, spaced DNA motifs with improved estimation of the signal length [Text]. / A. V. Favorov, M. S. Gelfand, A. V. Gerasimova [et al.] // Bioinformatics. – 2005. – Vol. 21, № 10. – P. 2240-2245].All clinical and clinical laboratory studies were carried out on the basis of the Perinatal Center of the Belgorod Regional Clinical Hospital with the informed consent of the patients to use the materials of the treatment and diagnostic measures carried out during the hospitalization period and after associated with PE for research purposes and were recorded according to the standards of the ethics committee Russian Federation. An analysis of the associations of combinations of genetic variants with PE was performed using the APSampler software (http://sources.redhat.com/cygwin/), using the Monte Carlo method of Markov chains and Bayesian nonparametric statistics [A Gibbs sampler for identi fi cation of symmetrically structured, spaced DNA motifs with improved estimation of the signal length [Text]. / A. V. Favorov, M. S. Gelfand, A. V. Gerasimova [et al.] // Bioinformatics. - 2005. - Vol. 21, No. 10. - P. 2240-2245].
Выявлены особенности «генетической конституции» женщин с преэклампсией на основе комбинаций генов матриксных металлопротеиназ (Фиг. 3).The features of the “genetic constitution” of women with preeclampsia based on combinations of matrix metalloproteinase genes were revealed (Fig. 3).
Установлено, что протективным фактором развития ПЭ является сочетание аллеля С MMР-8 (rs11225395) и генотипа GG MMР-7 (rs11568818), зарегистрированное у 13,57% беременных с ПЭ и у 19,96% женщин контрольной группы (рf=0,005, рреrm=0,02 ОR=0,62, 95% СI 0,45-0,89).It was found that the protective factor for the development of PE is the combination of the C allele MMP-8 (rs11225395) and the genotype GG MMP-7 (rs11568818), registered in 13.57% of pregnant women with PE and in 19.96% of women in the control group (рf = 0.005, ррrm = 0.02 OR = 0.62, 95% CI 0.45-0.89).
Примеры конкретного применения.Examples of specific applications.
1. У беременной З., русской национальности, уроженки Центрального Черноземья, была взята венозная кровь, при генотипировании ДНК–маркеров было выявлено сочетание двух генетических вариантов С MMР-8 (rs11225395) и GG MMР-7(rs11568818), что позволило отнести ее в группу женщин с пониженным риском развития преэклампсии. Это подтвердило дальнейшее наблюдение. В течение беременности у нее не было выявлено признаков ПЭ.1. Venous blood was taken from a pregnant woman Z., of Russian nationality, a native of the Central Chernozem Region, and genotyping of DNA markers revealed a combination of two genetic variants C MMP-8 (rs11225395) and GG MMP-7 (rs11568818), which allowed her to be attributed in a group of women with a reduced risk of preeclampsia. This confirmed further observation. During pregnancy, she showed no signs of PE.
2. У женщины В., русской национальности, уроженки Центрального Черноземья, при прегравидарной подготовке была взята венозная кровь, при генотипировании ДНК–маркеров было выявлено сочетание двух генетических вариантов С MMР-8 (rs11225395) и генотипа GG MMР-7(rs11568818), что позволило отнести ее в группу женщин с пониженным риском развития преэклампсии. Это подтвердило дальнейшее наблюдение. При возникновении беременности у нее не было выявлено признаков ПЭ.2. Venous blood was taken from a woman V., a Russian nationality, a native of the Central Black Earth Region, during pregravid preparation, genotyping of DNA markers revealed a combination of two genetic variants C MMP-8 (rs11225395) and genotype GG MMP-7 (rs11568818), which allowed her to be included in the group of women with a reduced risk of preeclampsia. This confirmed further observation. When pregnancy occurred, she showed no signs of PE.
3. У беременной С., русской национальности, уроженки Центрального Черноземья, была взята венозная кровь, при генотипировании ДНК–маркеров было выявлено сочетание аллелей А MMР-7 (rs11568818) и T MMР-8 (rs1320632). При дальнейшем наблюдении у нее была диагностирована преэклампсия.3. Venous blood was taken from pregnant S., a Russian nationality, a native of the Central Chernozem Region, and genotyping of DNA markers revealed a combination of the A MMP-7 alleles (rs11568818) and T MMP-8 (rs1320632). Upon further observation, she was diagnosed with preeclampsia.
Применение данного способа позволит выявлять при прегравидарной подготовке и на ранних сроках беременности женщин, не входящих в группы риска.The application of this method will allow to identify with pregravid preparation and in the early stages of pregnancy women who are not at risk.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017115326A RU2646448C1 (en) | 2017-05-02 | 2017-05-02 | Method for prediction of risk of preeclampsia development based on matrix metal proteinase genes combinations |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017115326A RU2646448C1 (en) | 2017-05-02 | 2017-05-02 | Method for prediction of risk of preeclampsia development based on matrix metal proteinase genes combinations |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2646448C1 true RU2646448C1 (en) | 2018-03-05 |
Family
ID=61568893
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2017115326A RU2646448C1 (en) | 2017-05-02 | 2017-05-02 | Method for prediction of risk of preeclampsia development based on matrix metal proteinase genes combinations |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2646448C1 (en) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2775433C1 (en) * | 2021-12-17 | 2022-06-30 | Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Белгородский государственный национальный исследовательский университет" (НИУ "БелГУ") | Method for predicting the risk of developing preeclampsia based on molecular genetic analysis |
| CN114822682A (en) * | 2022-04-12 | 2022-07-29 | 苏州市立医院 | Target gene combination related to early-onset severe preeclampsia and application thereof |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2568891C1 (en) * | 2014-08-28 | 2015-11-20 | Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Белгородский государственный национальный исследовательский университет" (НИУ "БелГУ") | Method for prediction of risk of preeclampsia by combination of cytokine genes |
| RU2568893C1 (en) * | 2014-09-04 | 2015-11-20 | Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Белгородский государственный национальный исследовательский университет" (НИУ "БелГУ") | Method of predicting development of pre-eclampsia in women with non-burdened heredity |
-
2017
- 2017-05-02 RU RU2017115326A patent/RU2646448C1/en active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2568891C1 (en) * | 2014-08-28 | 2015-11-20 | Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Белгородский государственный национальный исследовательский университет" (НИУ "БелГУ") | Method for prediction of risk of preeclampsia by combination of cytokine genes |
| RU2568893C1 (en) * | 2014-09-04 | 2015-11-20 | Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Белгородский государственный национальный исследовательский университет" (НИУ "БелГУ") | Method of predicting development of pre-eclampsia in women with non-burdened heredity |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| YI Y.C. et al. Matrix metalloproteinase-7 (MMP-7) polymorphism is a risk factor for endometrial cancer susceptibility. Clin Chem Lab Med. 2010 Mar; 48(3): 337-344. * |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2775433C1 (en) * | 2021-12-17 | 2022-06-30 | Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Белгородский государственный национальный исследовательский университет" (НИУ "БелГУ") | Method for predicting the risk of developing preeclampsia based on molecular genetic analysis |
| RU2775434C1 (en) * | 2021-12-17 | 2022-06-30 | Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Белгородский государственный национальный исследовательский университет" (НИУ "БелГУ") | Method for predicting the risk of developing preeclampsia based on genetic testing |
| CN114822682A (en) * | 2022-04-12 | 2022-07-29 | 苏州市立医院 | Target gene combination related to early-onset severe preeclampsia and application thereof |
| CN114822682B (en) * | 2022-04-12 | 2023-07-21 | 苏州市立医院 | Gene combination related to occurrence of early severe preeclampsia and application thereof |
| RU2795660C1 (en) * | 2022-08-16 | 2023-05-05 | Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Белгородский государственный национальный исследовательский университет" (НИУ "БелГУ") | Method for predicting the risk of developing preeclampsia in women based on genetic markers |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2578425C2 (en) | Method for prediction of risk of preeclampsia | |
| RU2568893C1 (en) | Method of predicting development of pre-eclampsia in women with non-burdened heredity | |
| RU2624480C1 (en) | Method for prediction of risk of essential hypertension development based on matrix metal proteinase genes combinations | |
| RU2646448C1 (en) | Method for prediction of risk of preeclampsia development based on matrix metal proteinase genes combinations | |
| RU2653765C1 (en) | Method for prediction of severe preeclampsia development risk considering genetic data | |
| RU2568891C1 (en) | Method for prediction of risk of preeclampsia by combination of cytokine genes | |
| US20240011091A1 (en) | Methods for preventing or reducing acute kidney injury | |
| RU2642939C1 (en) | Method for prediction of risk of preeclampsia | |
| RU2646455C1 (en) | Method for prediction of risk of preeclampsia development in women depending on hereditary burden | |
| RU2661604C1 (en) | Method for predicting the risk of developing essential hypertension | |
| RU2664430C1 (en) | Method for predicting the risk of stroke in men based on genetic testing | |
| RU2598745C2 (en) | Method for prediction of risk of stage iii hypertensive disease in patients with hypertension with metabolic syndrome | |
| RU2585382C1 (en) | Method for predicting risk of developing chronic true eczema in individuals depending on availability of family history | |
| RU2565407C1 (en) | Method for predicting risk of stage iii hypertensive disease | |
| RU2550933C1 (en) | Method for predicting risk of hysteromyoma | |
| RU2795897C1 (en) | Method for predicting the risk of developing breast cancer in women using molecular genetic data | |
| RU2498313C1 (en) | Method for prediction of overall survival in patients with chronic lymphatic leukaemia | |
| Rafiei et al. | The correlation of long non-coding RNAs IFNG-AS1 and ZEB2-AS1 with IFN-γ and ZEB-2 expression in PBMCs and clinical features of patients with coronary artery disease | |
| RU2653450C1 (en) | Method for predicting the risk of developing an ischemic stroke, taking into account genetic factors | |
| RU2616246C1 (en) | Method of predicting risk of development of myomatous nodes of large sizes in patients with myoma | |
| RU2798666C1 (en) | Method of predicting a low risk of developing breast cancer in women with highly penetrating mutations in the brca1 and chek2 genes | |
| RU2565405C1 (en) | METHOD FOR PREDICTION OF BLOOD PRESSURE IN DELIVERING FEMALES WITH USING 4a/4b eNOS GENETIC POLYMORPHISM | |
| RU2507519C1 (en) | Method for prediction of clinical course of acute pancreatitis | |
| RU2664428C1 (en) | Method for predicting risk of developing essential hypertension in women based on genetic factors | |
| RU2809911C1 (en) | Method of predicting risk of developing hypertension based on data on intergenic interactions |