RU2640927C1

RU2640927C1 - Method for soil sampling for lamblia cysts and cryptosporidia oocysts determination

Info

Publication number: RU2640927C1
Application number: RU2016148897A
Authority: RU
Inventors: Юрий Анатольевич Рахманин; Мария Михайловна Асланова; Камаля Юнис кызы Кузнецова; Оксана Олеговна Синицына; Анжелика Владимировна Загайнова
Priority date: 2016-12-13
Filing date: 2016-12-13
Publication date: 2018-01-12

Abstract

FIELD: medicine.

SUBSTANCE: sampling and step-by-step research are performed. During research, distilled water is added to the selected volume of the soil sample. The slurry is stirred and settled for an experimentally set time of 20 minutes or centrifuged for 3 minutes at 1500 rpm. The supernatant is poured into centrifuge tubes and centrifuged for 3 minutes at 1500 rpm. The supernatant is removed from the tubes. The resulting precipitate is examined by an adapted method of immunomagnetic separation followed by immunofluorescence labelling. At that, the number of studies is calculated by the amount of precipitation obtained. The 25 ml of supernatant is placed in 3 tubes, after centrifugation of which 3 sediment samples are formed, calculated as 1 precipitate per 1 study. If the total volume of precipitation in test tubes is not more than 1.0 ml, they are combined into one study, after which the lamblia cysts and the cryptosporidia oocysts are determined by an adapted method of immunomagnetic separation followed by immunofluorescence labelling. The result is taken into account on the basis that lamblia cysts are sparkling and fluorescent apple-green objects, from rounded to oval, 8 to 14 microns in length, 7 to 10 microns in width, with brightly highlighted edges. Cryptosporidia oocysts are sparkling and fluorescent apple-green objects from oval to spherical, 3 to 5 microns in diameter, with brightly highlighted edges.

EFFECT: increased effectiveness lamblia and cryptosporidia oocysts determination in the soil for timely prevention, detection of parasitic contamination.

2 tbl, 1 dwg, 2 ex

Description

Предлагаемое изобретение относится к области медицины, более конкретно к работам по санитарной паразитологии по определению паразитологических агентов в почве с разработанной пробоподготовкой проб к проведению исследований адаптированным методом иммуномагнитной сепарации с последующим иммунофлуоресцентным мечением.The present invention relates to medicine, more specifically to work on sanitary parasitology for the determination of parasitological agents in the soil with developed sample preparation of samples for research using the adapted method of immunomagnetic separation followed by immunofluorescence labeling.

До настоящего времени в санитарной паразитологии определение паразитологических агентов в почве проводят с 1992 года классическим методом Падченко, включающим отбор проб и многоэтапные исследования проб почвы (Методические указания МУК 4.2.2661-10).To date, in parasitology in sanitation, the determination of parasitological agents in the soil has been carried out since 1992 using the classic Padchenko method, including sampling and multi-stage studies of soil samples (Methodological guidelines MUK 4.2.2661-10).

Этот метод является многоэтапным и трудновоспроизводимым методом исследования, в котором не определены количества исследований образовавшихся в ходе пробоподготовки больших остатков осадков. Пересчет результата исследования 1 мл осадка на весь объем надосадочной жидкости или объединенной пробы почвы, по методу не уточнен, что заведомо снижает значимость гигиенического заключения на образец. Не проведена стандартизация количества исследований промывных вод и надосадочной жидкости из одной пробы, а отстаивание конечной взвеси свыше 24 часов для проведения паразитологического исследования не позволяет интенсифицировать этап пробоподготовки.This method is a multi-stage and difficult to reproduce research method, in which the number of studies formed during the sample preparation of large sediment residues is not determined. Recalculation of the test result of 1 ml of sediment for the entire volume of the supernatant or the combined soil sample was not specified by the method, which obviously reduces the significance of the hygienic conclusion on the sample. The standardization of the number of studies of washing water and supernatant from one sample has not been carried out, and defending the final suspension for more than 24 hours to conduct a parasitological study does not allow to intensify the sample preparation stage.

Достигаемым при использовании предлагаемого изобретения техническим результатом является повышение эффективности определения цист лямблий и ооцист криптоспоридий в почве, сокращении времени пробоподготовки от 40 до 45 минут и сокращении потери патогенов на этапах исследования за счет сокращения множественных ее промываний.Achievable when using the present invention, the technical result is to increase the efficiency of determination of lamblia cysts and cryptosporidium oocysts in the soil, reducing sample preparation time from 40 to 45 minutes and reducing the loss of pathogens at the research stages by reducing its multiple leaching.

Технический результат достигается тем, что в способе пробоподготовки почвы для проведения определения цист лямблий и ооцист криптоспоридий, включающий отбор проб и поэтапные исследования, при исследовании в отобранный объем пробы почвы добавляют дистиллированную воду, после чего взвесь перемешивают и отстаивают в течение экспериментально установленного времени 20 мин или центрифугируют 3 мин при 1500 об/мин, надосадочную жидкость переливают в центрифужные пробирки и центрифугируют 3 мин при 1500 об/мин, надосадочную жидкость из пробирок удаляют, полученный осадок исследуют адаптированным методом иммуномагнитной сепарации с последующим иммунофлуоресцентным мечением, при этом количество исследований рассчитывают по количеству полученных осадков таким образом, что в 25 мл надосадочной жидкости размещаются в 3 пробирки, после центрифугирования которых образуются 3 пробы осадка, по расчету 1 осадок на 1 исследование, после объединения которых проводят определение цист лямблий и ооцист криптоспоридий адаптированным методом иммуномагнитной сепарации с последующим иммунофлуоресцентным мечением, результат учитывают исходя из того, что цисты лямблий представляют собой сверкающие и флюоресцирующие яблочно-зеленым светом объекты, от округлых до овальных, от 8 до 14 мкм в длину, от 7 до 10 мкм в ширину, с ярко подсвеченными краями, ооцисты криптоспоридий представляют собой сверкающие и флюоресцирующие яблочно-зеленым светом объекты от овальных до сферических от 3 до 5 мкм в диаметре, с ярко подсвеченными краями.The technical result is achieved by the fact that in the method of soil preparation for determining the cystosporidium lamblia cysts and oocysts, including sampling and phased studies, in the study, distilled water is added to the selected soil sample volume, after which the suspension is mixed and settled for an experimentally established time of 20 minutes or centrifuged for 3 min at 1500 rpm, the supernatant was poured into centrifuge tubes and centrifuged for 3 min at 1500 rpm, the supernatant from the test tubes They add, the precipitate obtained is examined by the adapted method of immunomagnetic separation followed by immunofluorescence labeling, while the number of studies is calculated by the amount of precipitation obtained in such a way that 25 tubes are placed in 25 ml of the supernatant, after centrifugation of which 3 sediment samples are formed, 1 precipitate per 1 study, after combining which they determine the lamblia cysts and cryptosporidium oocysts by the adapted method of immunomagnetic separation followed by immunoflu by luminescent labeling, the result is taken into account on the basis that lamblia cysts are objects that sparkle and fluoresce with apple-green light, from round to oval, from 8 to 14 μm in length, from 7 to 10 μm in width, with brightly lit edges, oocysts cryptosporidia are oval to spherical objects from 3 to 5 microns in diameter with sparkling and fluorescent apple-green light, with brightly lit edges.

Разработанный способ пробоподготовки проб почвы для исследования адаптированным методом иммуномагнитной сепарации с последующим иммунофлуоресцентным мечением основан на принципе замачивания проб почвы в воде и последующим исследованием осадка надосадочной жидкости после 20 мин отстаивания взвеси без промывки.The developed method of sample preparation of soil samples for research by the adapted method of immunomagnetic separation followed by immunofluorescence labeling is based on the principle of soaking soil samples in water and subsequent investigation of the precipitate of the supernatant after 20 minutes of sediment suspension without washing.

Предлагаемый способ реализуется следующим образом.The proposed method is implemented as follows.

Отобранную пробу почвы, отбираемую установленным нормируемым объемом 25 г, помещают в фаянсовую ступку и добавляют небольшое количество дистиллированной воды, затем растирают до образования гомогенной кашицы. Образовавшуюся смесь переносят в чистый стакан, заливают дистиллированной водой в соотношении 1 к 2. Взвесь перемешивают и отстаивают в течение стандартизованного времени 20 мин или центрифугируют при стандартных параметрах в течение 3 мин при 1500 об/мин. Надосадочную жидкость переливают в центрифужные пробирки и центрифугируют при стандартных параметрах 3 мин при 1500 об/мин. Надосадочную жидкость из пробирок удаляют. Полученный осадок 1.0 мл исследуют адаптированным методом иммуномагнитной сепарации с последующим иммунофлуоресцентным мечением.A selected soil sample, taken in a standardized volume of 25 g, is placed in an earthenware mortar and a small amount of distilled water is added, then rubbed until a homogeneous slurry is formed. The resulting mixture is transferred to a clean glass, filled with distilled water in a ratio of 1 to 2. The suspension is stirred and settled for a standardized time of 20 minutes or centrifuged at standard parameters for 3 minutes at 1500 rpm. The supernatant is poured into centrifuge tubes and centrifuged at standard parameters for 3 minutes at 1500 rpm. The supernatant is removed from the tubes. The resulting 1.0 ml precipitate was examined by the adapted method of immunomagnetic separation followed by immunofluorescence labeling.

Количество исследований рассчитывают по количеству полученных осадков, таким образом, что в 25 мл надосадочной жидкости размещаются в 3 пробирки, после центрифугирования которых образуются 3 пробы осадка. По расчету 1 осадок -1 исследование. Если суммарный объем осадков в пробирках составляет не более 1.0 мл, их можно объединить в одно исследование. Результат учитывают исходя из того, что цисты лямблий представляют собой сверкающие и флюоресцирующие яблочно-зеленым светом объекты, от округлых до овальных, от 8 до 14 мкм в длину, от 7 до 10 мкм в ширину, с ярко подсвеченными краями, ооцисты криптоспоридий представляют собой сверкающие и флюоресцирующие яблочно-зеленым светом объекты от овальных до сферических от 3 до 5 мкм в диаметре, с ярко подсвеченными краями.The number of studies is calculated according to the amount of precipitation obtained, so that in 25 ml of the supernatant liquid are placed in 3 tubes, after centrifugation of which 3 sediment samples are formed. According to the calculation of 1 precipitate -1 study. If the total volume of precipitation in test tubes is not more than 1.0 ml, they can be combined into one study. The result is taken into account on the basis that lamblia cysts are objects that sparkle and fluoresce with apple-green light, from round to oval, from 8 to 14 μm in length, from 7 to 10 μm in width, with brightly lit edges, cryptosporidium oocysts are objects glistening and fluorescent with apple-green light from oval to spherical from 3 to 5 microns in diameter, with brightly lit edges.

Предлагаемый способ поясняется примерами.The proposed method is illustrated by examples.

Пример 1. Классическим методом исследования проб почвы является метод Падченко, основанный на разности удельного веса воды и цист патогенных простейших при отстаивании взвеси в больших объемах воды с последующим исследованием надосадочной жидкости. По методу Падченко анализ проводят в течение первых 2-3 суток после получения пробы и экспозиции водной взвеси, полученной 3-кратной промывкой пробы, в течение 24 ч, при этом эффективность метода выявляемости цист лямблий составляет не более 15-19%, ооцист криптоспоридий не выявляется. Этот метод является единственным унифицированным методом определения загрязненности почвы патогенными кишечными возбудителями и был принят в настоящей работе для сравнительной оценки эффективности способ пробоподготовки почвы с адаптированным методом иммуномагнитной сепарации с последующим иммунофлуоресцентным мечением. Для проведения исследований почвы адаптированным метод иммуномагнитной сепарации с последующим иммунофлуоресцентным мечением разработана методика пробоподготовки (Таблица 1), которая позволяет проводить исследования в день доставки проб в лабораторию; не проводится экспозиция смеси проб почвы в течение 24 ч; не проводится дополнительная промывка смеси, что сокращает время пробоподготовки и сохраняет возможные потери патогенов, при этом эффективность адаптированного метода иммуномагнитной сепарации с последующим иммунофлуоресцентным мечением с пробоподготовкой почвы составляет 85-90% по определению цист лямблий и ооцист криптоспоридий (потери патогена за счет их адгезии с почвенными частицами).Example 1. The classic method of studying soil samples is the Padchenko method, based on the difference in the specific gravity of water and cysts of pathogenic protozoa when sediment is suspended in large volumes of water, followed by a study of the supernatant. According to the Padchenko method, the analysis is carried out during the first 2-3 days after receiving the sample and exposing the aqueous suspension obtained by washing the sample 3 times for 24 hours, while the lamblia cyst detection method is no more than 15-19%, cryptosporidium oocysts do not comes to light. This method is the only unified method for determining soil contamination by pathogenic intestinal pathogens and was adopted in this work for a comparative evaluation of the effectiveness of the method of soil preparation with the adapted method of immunomagnetic separation followed by immunofluorescence labeling. To conduct soil studies with an adapted method of immunomagnetic separation followed by immunofluorescence labeling, a sample preparation technique was developed (Table 1), which allows studies on the day samples are delivered to the laboratory; soil samples are not exposed for 24 hours; no additional washing of the mixture is carried out, which reduces the time of sample preparation and preserves possible pathogen losses, while the efficiency of the adapted method of immunomagnetic separation with subsequent immunofluorescence labeling with soil sample preparation is 85-90% by the definition of lamblia cryptosporidium cysts (pathogen loss due to their adhesion with soil particles).

Пример 2. Для определения специфичности адаптированным методом иммуномагнитной сепарации с последующим иммунофлуоресцентным мечением со способом пробоподготовки почвы использовали экспериментальные модели с искусственным заражением натурного материала почвы. Эффективность исследований способа пробоподготовки почвы адаптированным методом иммуномагнитной сепарации с последующим иммунофлуоресцентным мечением в экспериментальной серии составила 100.0% по определению цист лямблий и 100.0% по определению ооцист криптоспоридий, в отличие от метода Падченко, эффективность которого составила 55.0% для цист лямблий, 0% - для ооцист криптоспоридий (Таблица 2).Example 2. To determine the specificity of the adapted method of immunomagnetic separation followed by immunofluorescence labeling with the method of sample preparation of the soil, experimental models with artificial infection of natural soil material were used. The effectiveness of studies of the method of soil preparation by the adapted method of immunomagnetic separation followed by immunofluorescence labeling in the experimental series was 100.0% according to the definition of lamblia cysts and 100.0% according to the definition of cryptosporidium oocysts, unlike the Padchenko method, whose efficiency was 55.0% for lamblia cysts, 0% for cryptosporidium oocysts (table 2).

Claims

A method of soil preparation for determining lamblia cysts and cryptosporidium oocysts using the adaptive method of immunomagnetic separation followed by immunofluorescence labeling, including sampling and phased studies, characterized in that distilled water is added to the selected soil sample volume during the study, after which the suspension is mixed and settled in the sediment during the experimentally established time of 20 min or centrifuged for 3 min at 1500 rpm, the supernatant is poured into a centrifuge tube and centrifuged for 3 min at 1500 rpm, the supernatant was removed from the tubes, the resulting precipitate was examined by the adapted method of immunomagnetic separation followed by immunofluorescence labeling, and the number of studies was calculated by the amount of precipitation obtained so that 25 ml of supernatant were placed in 3 tubes after centrifugation of which 3 sediment samples are formed, according to the calculation, 1 precipitate per 1 study, and if the total volume of precipitation in test tubes is not more than 1.0 ml, combining them They are used in one study, after which the lamblia cysts and cryptosporidium oocysts are determined by the adapted method of immunomagnetic separation, followed by immunofluorescence labeling, the result is taken into account on the basis that lamblia cysts are sparkling and fluorescent apple-green objects, from round to oval, from 8 up to 14 microns in length, from 7 to 10 microns in width, with brightly highlighted edges, cryptosporidium oocysts are objects that sparkle and fluoresce with apple-green light from oval to spheres riches from 3 to 5 microns in diameter, with brightly lit edges.