RU2612023C1 - Method for quantitative determination of species composition of microbiota of parodontal recesses - Google Patents
Method for quantitative determination of species composition of microbiota of parodontal recesses Download PDFInfo
- Publication number
- RU2612023C1 RU2612023C1 RU2015155929A RU2015155929A RU2612023C1 RU 2612023 C1 RU2612023 C1 RU 2612023C1 RU 2015155929 A RU2015155929 A RU 2015155929A RU 2015155929 A RU2015155929 A RU 2015155929A RU 2612023 C1 RU2612023 C1 RU 2612023C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- dna
- concentration
- microorganisms
- parodontal
- streptococcus
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
Abstract
Description
Изобретение относится к области медицины, в частности к стоматологии, и предназначено для получения количественных данных о видовом составе микроорганизмов при исследовании содержимого пародонтального кармана.The invention relates to medicine, in particular to dentistry, and is intended to obtain quantitative data on the species composition of microorganisms in the study of the contents of the periodontal pocket.
Информация о количественных изменениях состава биологических жидкостей имеет большое значение для медицины и стоматологии.Information on quantitative changes in the composition of biological fluids is of great importance for medicine and dentistry.
Известен способ диагностики патологических изменений микрофлоры полости рта, характеризующийся тем, что исследуют ДНК, выделенную из ротовой жидкости или зубного налета больного, методом ПЦР с применением олигонуклеотидов, специфичных для пародонтопатогенов Actinobacter actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis, Bacteroides forsythi. При этом проводят одновременную идентификацию трех указанных видов микроорганизмов и при наличии положительной реакции на два и более из указанных видов диагностируют патологические изменения микрофлоры полости рта. Это позволяет прогнозировать высокий риск заболевания, проводить своевременные профилактические и лечебные мероприятия, контролировать эффективность лечения заболеваний пародонта [патент RU 2324182, 2008 г.].A known method for diagnosing pathological changes in the microflora of the oral cavity, characterized in that they examine the DNA extracted from the patient’s oral fluid or plaque by PCR using oligonucleotides specific for periodontopathogens Actinobacter actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis, Bacteroides forsythi. At the same time, the three indicated types of microorganisms are simultaneously identified and, if there is a positive reaction to two or more of these types, pathological changes in the microflora of the oral cavity are diagnosed. This allows us to predict a high risk of the disease, conduct timely preventive and therapeutic measures, monitor the effectiveness of treatment of periodontal diseases [patent RU 2324182, 2008].
Показано, что для диагностики и лечения заболеваний, сопровождающихся нарушениями микрофлоры полости рта, может определяться количественный и качественный состав короткоцепочечных жирных кислот. По их суммарному уровню, в норме 0,8-1,9 мг/г, судят об отклонениях от нормального состояния микрофлоры полости рта. Исходя из выявленных изменений подбирается фармакологический препарат и оценивается эффективность проводимого лечения [патент RU 2229130, 2004 г.].It is shown that for the diagnosis and treatment of diseases accompanied by violations of the microflora of the oral cavity, the quantitative and qualitative composition of short-chain fatty acids can be determined. According to their total level, normally 0.8-1.9 mg / g, deviations from the normal state of the microflora of the oral cavity are judged. Based on the identified changes, a pharmacological preparation is selected and the effectiveness of the treatment is evaluated [patent RU 2229130, 2004].
Основными условиями такого рода диагностических исследований является возможность получения биологических образцов из конкретных областей и точное измерение объема взятого образца.The main conditions for this kind of diagnostic research is the ability to obtain biological samples from specific areas and accurate measurement of the volume of the sample taken.
Прототипом изобретения является способ определения маркеров пародонтопатогенов Porphyromonas gingivalis, Actinibacillus actinomycetemcommitans, Treponema denticola, Bacteroides forsythus, Prevotella intermedia для диагностики степени тяжести пародонтита, включающий взятие материала из пародонтальных карманов бумажным штифтом, который вводят пинцетом в пародонтальный карман до дна на 10 секунд и затем помещают в пробирку с лизирующим раствором, после чего с помощью мультиплексной ПРЦ-системы «Дентал», разработанной ЗАО «Гентех» (Москва), спектр микроорганизмов оценивают количественно и качественно [патент RU 2386394, 2010 г.]. Недостатком данного способа является недостаточная точность определения количественного состава патогенной микрофлоры, так как предполагается использование классической ПЦР, позволяющей оценивать результаты реакции лишь по конечной точке и отвечать на вопрос о наличии или отсутствии пародонтопатогенных микроорганизмов.The prototype of the invention is a method for determining the markers of periodontal pathogens Porphyromonas gingivalis, Actinibacillus actinomycetemcommitans, Treponema denticola, Bacteroides forsythus, Prevotella intermedia for the diagnosis of severity of periodontitis, including taking material from periodontal pockets with a paper pin that is inserted into the pocket for 10 seconds into a test tube with a lysing solution, and then using the Dental multiplex PRC system developed by Gentech CJSC (Moscow), the spectrum of microorganisms is quantified and evaluated indirectly [patent RU 2386394, 2010]. The disadvantage of this method is the lack of accuracy in determining the quantitative composition of pathogenic microflora, since it is assumed to use classical PCR, which allows to evaluate the reaction results only at the end point and answer the question about the presence or absence of periodontopathogenic microorganisms.
Для получения количественных данных о видовом составе микробиоты биологических образцов (вагинальный секрет, соскобы из цервикального канала, слюна и др.) наиболее широко из амплификационных методов применяется ПЦР в режиме реального времени (РТ-ПЦР). Количественную оценку видового состава микробиоты при этом предлагается осуществлять в абсолютных и относительных показателях. Значения указанных показателей рассчитываются исходя из номера «порогового» цикла, на котором регистрируются первые положительные сигналы о начале амплификации специфических фрагментов ДНК [Шипицина Е.В., Мартикайнен З.М., Воробьева Н.Е., Ермошкина М.С., Степанова О.С., Донников А.Е., Скоркина Ю.А., Тумбинская Л.В. Применение теста ФЕМОФЛОР для оценки микробиоценоза влагалища. Журнал акушерства и женских болезней. 2009; LVIII(3): 44-50.]. Считается, что чем раньше начинается специфическая амплификация (раньше наступает «пороговый» цикл), тем выше исходная концентрация искомых микроорганизмов в образце. Количество ДНК искомого микроорганизма в образце принято выражать в геном-эквивалентах (ГЭ), которое прямо пропорционально количеству микроорганизмов. ГЭ соответствует количеству копий ДНК искомого микроорганизма в образце, представленного в виде десятичного логарифма - lg (ГЭ/образец). Однако значения абсолютного показателя исключительно широко варьируют в зависимости от техники взятия биоматериала, способа выделения ДНК и т.п. В частности, разная техника взятия образца часто приводит к забору исходно различных количеств биоматериала, что исключает возможность точного определения концентрации. Разные способы выделения ДНК при изначально неизвестном общем количестве взятого биоматериала также существенно искажают значения абсолютных показателей. Ошибка при этом может составлять несколько порядков, что сводит на нет возможность получения точных количественных данных о результатах амплификации.To obtain quantitative data on the species composition of the microbiota of biological samples (vaginal secretions, scrapings from the cervical canal, saliva, etc.), the most widely used amplification methods are real-time PCR (RT-PCR). It is proposed to carry out a quantitative assessment of the species composition of microbiota in absolute and relative terms. The values of these indicators are calculated based on the number of the “threshold” cycle, on which the first positive signals are recorded about the beginning of amplification of specific DNA fragments [Shipitsina E.V., Martikainen Z.M., Vorobyeva N.E., Ermoshkina M.S., Stepanova O.S., Donnikov A.E., Skorkina Yu.A., Tumbinskaya L.V. Application of the FEMOFLOR test to assess vaginal microbiocenosis. Journal of Obstetrics and Women's Diseases. 2009; LVIII (3): 44-50.]. It is believed that the earlier specific amplification begins (the earlier the “threshold” cycle begins), the higher the initial concentration of the desired microorganisms in the sample. The amount of DNA of the desired microorganism in the sample is usually expressed in genome equivalents (GE), which is directly proportional to the number of microorganisms. GE corresponds to the number of DNA copies of the desired microorganism in the sample, presented in the form of a decimal logarithm - log (GE / sample). However, the values of the absolute indicator vary extremely widely depending on the technique of taking the biomaterial, the method of DNA isolation, etc. In particular, different sampling techniques often lead to the collection of initially different amounts of biomaterial, which precludes the possibility of accurately determining the concentration. Different methods of DNA isolation with an initially unknown total amount of biomaterial taken also significantly distort the values of the absolute indices. The error can be several orders of magnitude, which negates the possibility of obtaining accurate quantitative data on the amplification results.
В связи с вышеуказанным для количественной оценки данных РТ-ПЦР предлагалось использовать «относительный» количественный показатель микроорганизма, который рассчитывается как отношение количества (ГЭ/мл) искомого микроорганизма к количеству общей бактериальной массы (ОБМ), также оцениваемых в ГЭ/мл. Относительные показатели имели несколько большее клиническое значение, но также не являлись точными и объективными, так как при этом опять же неизвестным оставалось количество взятого исходно биоматериала. Результаты представлялись в двух вариантах: разница десятичных логарифмов количества соответствующей группы микроорганизмов и ОБМ и в процентах по отношению к ОБМ.In connection with the above, for the quantitative assessment of RT-PCR data, it was proposed to use a “relative” quantitative indicator of the microorganism, which is calculated as the ratio of the number (GE / ml) of the desired microorganism to the total bacterial mass (MBP), also estimated in GE / ml. Relative indices had a slightly greater clinical value, but were also not accurate and objective, since the amount of biomaterial taken initially was also unknown. The results were presented in two versions: the difference in decimal logarithms of the number of the corresponding group of microorganisms and MBP and in percent relative to MBP.
Таким образом, все вышеприведенное представляло собой попытку выразить абсолютные данные в относительных единицах (коэффициенты и прочее), что для количественных данных не является корректным.Thus, all of the above was an attempt to express absolute data in relative units (coefficients, etc.), which is not correct for quantitative data.
Задачей изобретения является разработка способа количественного определения видового состава микробиоты пародонтальных карманов амплификационными методами.The objective of the invention is to develop a method for the quantitative determination of the species composition of the microbiota of periodontal pockets by amplification methods.
Технический результат при использовании изобретения - повышение точности за счет определения концентрации пародонтопатогенных бактерий в абсолютных значениях - количество копий ДНК/мл.The technical result when using the invention is to increase accuracy by determining the concentration of periodontopathogenic bacteria in absolute values - the number of copies of DNA / ml
Предлагаемый способ количественного определения видового состава микробиоты пародонтальных карманов осуществляется следующим образом. Проводят взятие содержимого пародонтального кармана стерильными бумажными эндодонтическими штифтами размером №25, который вводят в наиболее глубокие участки пародонтального кармана экспозицией не менее 10 секунд, последующее помещение штифта с биоматериалом в стерильную пластиковую пробирку типа Eppendorf (1,5 мл), содержащую 1 мл физиологического раствора, необходимого для продления «жизни» микроорганизмов, поскольку раствор подпитывает микробную биомассу и препятствует процессам отмирания и разложения. Затем осуществляют тщательное ресуспендирование на приборе типа Vortex. Штифт с биоматериалом находится в пробирке до момента выделения ДНК (до 2 часов при комнатной температуре, до 6 часов - при +4°С и до 6 мес - при -20°С). После этого 50 мкл биоматериала переносят в пробирку с 200 мкл реагента с ионообменной смолой (Chelex100) для выделения тотальной ДНК. Для дальнейшей амплификации используют 3 мкл супернатанта. В дальнейшем по стандартной методике осуществляют амплификацию искомых фрагментов ДНК методом ПЦР в режиме реального времени. Определяют концентрацию искомых микроорганизмов в биоматериале по формулеThe proposed method for the quantitative determination of the species composition of the microbiota of periodontal pockets is as follows. The contents of the periodontal pocket are taken using sterile paper endodontic pins No. 25 in size, which are inserted into the deepest parts of the periodontal pocket with an exposure of at least 10 seconds, then the pin with biomaterial is placed in a sterile plastic Eppendorf tube (1.5 ml) containing 1 ml of physiological saline necessary to prolong the "life" of microorganisms, since the solution feeds the microbial biomass and prevents the processes of dying and decomposition. Then carry out a thorough resuspension on a device such as Vortex. The biomaterial pin is in the test tube until DNA is isolated (up to 2 hours at room temperature, up to 6 hours at + 4 ° C and up to 6 months at -20 ° C). After that, 50 μl of biomaterial is transferred into a test tube with 200 μl of ion exchange resin reagent (Chelex100) to isolate total DNA. For further amplification using 3 μl of the supernatant. Further, according to the standard method, the desired DNA fragments are amplified by real-time PCR. The concentration of the desired microorganisms in the biomaterial is determined by the formula
где В - концентрация микроорганизмов, копий ДНК/мл;where B is the concentration of microorganisms, copies of DNA / ml;
Nst - стандартная начальная концентрация ДНК;Nst is the standard initial concentration of DNA;
Е - эффективность РТ-ПЦР - число, показывающее, во сколько раз за один цикл изменится количество фрагментов ДНК;E - the effectiveness of RT-PCR - a number showing how many times in one cycle the number of DNA fragments will change;
Cst - значение порогового цикла стандартного образца;Cst is the value of the threshold cycle of the standard sample;
Ct - значение порогового цикла опытного образца;Ct is the value of the threshold cycle of the prototype;
V - объем исследуемой пробы, мл;V is the volume of the test sample, ml;
1,7 - коэффициент перерасчета.1.7 - conversion factor.
Для количественной оценки впитывающей способности стерильного бумажного эндодонтического штифта размером №25 измерялась сорбция дистиллированной Н2О при трех различных экспозициях (табл. 1): 5 сек, 10 сек и 15 сек. Для этого при использовании стеклянного градуированного капилляра (до 100 мкл) и секундомера измеряли объем воды, поглощаемой штифтом, погруженным в воду на 5, 10 или 15 сек. Бумажный штифт помещался на сухое плоское основание испытуемой стороной к капилляру, содержащему 100 мкл дистиллированной воды, который затем устанавливали нижним концом на испытуемый конец штифта, плотно прижав, для исключения просачивания жидкости. Эксперимент повторяли в трех сериях и в 20 повторах - для каждой экспозиции в отдельности. По истечении времени экспозиции определяли объем поглощенной жидкости по уменьшению объема воды в капилляре.To quantify the absorbency of a sterile paper endodontic pin of size 25, sorption of distilled H 2 O was measured at three different exposures (Table 1): 5 sec, 10 sec and 15 sec. For this, using a graduated glass capillary (up to 100 μl) and a stopwatch, the volume of water absorbed by a pin immersed in water for 5, 10, or 15 seconds was measured. The paper pin was placed on a dry flat base with the test side facing the capillary containing 100 μl of distilled water, which was then placed with the lower end on the test end of the pin, pressing tightly to prevent fluid leakage. The experiment was repeated in three series and in 20 repetitions - for each exposure separately. After the exposure time, the volume of absorbed liquid was determined by reducing the volume of water in the capillary.
Затем для количественной оценки впитывающей способности стерильного бумажного эндодонтического штифта размером №25 была определена сорбция 0,9% водного раствора хлорида натрия (NaCl) при трех различных экспозициях (табл. 2): 5 сек, 10 сек и 15 сек. Для этого при использовании стеклянного градуированного капилляра (до 100 мкл) и секундомера измеряли объем 0,9% водного NaCl, поглощаемого штифтом, погруженным в указанный раствор на 5, 10 или 15 сек. Бумажный штифт помещался на сухое плоское основание испытуемой стороной к капилляру, содержащему 100 мкл 0,9% водного NaCl, который затем устанавливали нижним концом на испытуемый конец штифта, плотно прижав, для исключения просачивания жидкости. Эксперимент повторяли в трех сериях и в 20 повторах - для каждой экспозиции в отдельности. По истечении времени экспозиции определяли объем поглощенной жидкости по уменьшению объема соответствующего раствора в капилляре.Then, to quantify the absorbency of a sterile paper endodontic pin of size 25, the sorption of a 0.9% aqueous solution of sodium chloride (NaCl) was determined at three different exposures (Table 2): 5 sec, 10 sec and 15 sec. For this, using a graduated glass capillary (up to 100 μl) and a stopwatch, the volume of 0.9% aqueous NaCl absorbed by a pin immersed in the indicated solution for 5, 10, or 15 seconds was measured. The paper pin was placed on a dry flat base with the test side facing the capillary containing 100 μl of 0.9% aqueous NaCl, which was then placed with the lower end on the test end of the pin, pressing tightly to prevent fluid from seeping. The experiment was repeated in three series and in 20 repetitions - for each exposure separately. After the exposure time, the volume of absorbed liquid was determined by reducing the volume of the corresponding solution in the capillary.
Далее количественная оценка впитывающей способности стерильного бумажного эндодонтического штифта размером №25 определялась сорбцией ротовой жидкости при трех различных экспозициях (табл. 3): 5 сек, 10 сек и 15 сек. Для этого при использовании стеклянного градуированного капилляра (до 100 мкл) и секундомера измеряли объем ротовой жидкости, поглощаемой штифтом, погруженным в указанный раствор на 5, 10 или 15 сек. Бумажный штифт помещался на сухое плоское основание испытуемой стороной к капилляру, содержащему 100 мкл ротовой жидкости, который затем устанавливали нижним концом на испытуемый конец штифта, плотно прижав, для исключения просачивания жидкости. Эксперимент повторяли в трех сериях и в 20 повторах - для каждой экспозиции в отдельности. По истечении времени экспозиции определяли объем поглощенной жидкости по уменьшению объема соответствующего раствора в капилляре.Next, a quantitative assessment of the absorbency of a sterile paper endodontic pin of size 25 was determined by the sorption of oral fluid at three different exposures (Table 3): 5 sec, 10 sec and 15 sec. For this, using a graduated glass capillary (up to 100 μl) and a stopwatch, the volume of oral fluid absorbed by a pin immersed in the indicated solution for 5, 10, or 15 seconds was measured. The paper pin was placed on a dry flat base with the test side facing the capillary containing 100 μl of oral fluid, which was then placed with the lower end on the test end of the pin, pressing tightly to prevent fluid from seeping. The experiment was repeated in three series and in 20 repetitions - for each exposure separately. After the exposure time, the volume of absorbed liquid was determined by reducing the volume of the corresponding solution in the capillary.
Изобретение иллюстрируется следующими клиническими примерами.The invention is illustrated by the following clinical examples.
Пример №1. Пациентка Р., 42 года. Диагноз: хронический генерализованный пародонтит средней степени в стадии обострения. Жалобы на подвижность зубов, запах изо рта, кровоточивость десен при чистке зубов. Пациентка курит и имеет сердечно-сосудистую патологию.Example No. 1. Patient R., 42 years old. Diagnosis: chronic generalized periodontitis of moderate degree in the acute stage. Complaints of tooth mobility, bad breath, bleeding gums when brushing your teeth. The patient smokes and has a cardiovascular pathology.
Содержимое пародонтального кармана и ротовую жидкость отбирали из наиболее глубоких участков с помощью стерильных бумажных эндодонтических штифтов размером №25, которые были введены в пародонтальный карман экспозицией не менее 10 сек. В дальнейшем штифты с биоматериалом были помещены в стерильные пластиковые пробирки типа Eppendorf (1,5 мл), содержащие по 1 мл физиологического раствора. Образцы были тщательно ресуспендированы на приборе типа Vortex. Штифты с биоматериалом находились в пробирке до момента выделения ДНК 1 час при комнатной температуре. После чего по 50 мкл каждого из исследуемых образцов было перенесено в отдельные пробирки, содержащие по 200 мкл раствора с ионообменной смолой (Chelex100) для выделения тотальной ДНК. Для дальнейшей амплификации использовалось по 3 мкл супернатанта каждого из образцов.The contents of the periodontal pocket and oral fluid were taken from the deepest areas using sterile paper endodontic pins No. 25 in size, which were inserted into the periodontal pocket with an exposure of at least 10 seconds. Subsequently, the biomaterial pins were placed in sterile plastic Eppendorf tubes (1.5 ml) containing 1 ml of physiological saline. Samples were carefully resuspended on a Vortex type instrument. The biomaterial pins were in a test tube until DNA was isolated for 1 hour at room temperature. Then, 50 μl of each of the test samples was transferred into separate tubes containing 200 μl of a solution with ion-exchange resin (Chelex100) to isolate total DNA. For further amplification, 3 μl of the supernatant of each sample was used.
Для выделения тотальной ДНК из образцов ДНК использовали ионообменную смолу Chelex100. Для постановки ПЦР в реальном времени использовали подобранные нами пары видоспецифичных праймеров к фрагментам ДНК Porphyromonas gingivalis, Streptococcus oralis, Streptococcus sanguis, Streptococcus sobrinus, Treponema denticola и реакционную смесь в присутствии SYBR Green I (ООО «СИНТОЛ», согласно инструкции производителя). ПЦР проводили с помощью детектирующего амплификатора CFX96 Touch "REAL TIME" (Bio-Rad, США). Учет результатов проводили с помощью программного обеспечения Bio-Rad CFX Manager.Chelex100 ion exchange resin was used to isolate total DNA from DNA samples. For real-time PCR, we used pairs of species-specific primers for DNA fragments of Porphyromonas gingivalis, Streptococcus oralis, Streptococcus sanguis, Streptococcus sobrinus, Treponema denticola and the reaction mixture in the presence of SYBR Green I (according to the manufacturer's instructions). PCR was performed using a CFX96 Touch “REAL TIME” detection amplifier (Bio-Rad, USA). Analysis was performed using the Bio-Rad CFX Manager software.
Результаты исследования микрофлоры зубодесневых карманов методом Real-Time PCR: обнаружены микроорганизмы Porphyromonas gingivalis, Treponema denticola, Streptococcus sobrinus.The results of the study of microflora of gingival pockets using the Real-Time PCR method: microorganisms Porphyromonas gingivalis, Treponema denticola, Streptococcus sobrinus were found.
В дальнейшем в соответствии с предлагаемым нами способом были рассчитаны концентрации искомых микроорганизмов в исследованных образцах по формуле В=1,7×(Nst×Ε×(Cst-Ct))/V, которые составили 8,4×107 копий ДНК/мл Porphyromonas gingivalis: В=1,7×(3,5×104×2,0×(20,23-18,12))/0,003=8,4×107 копий ДНК/мл; 3,1×107 копий ДНК/мл Treponema denticola: В=1,7×(3,5×104×2,0×(20,23-19,44))/0,003=3,1×107 копий ДНК/мл; 2,24×108 копий ДНК/мл Streptococcus sobrinus: В=1,7×(3,5×104×2,0×(20,23-14,56))/0,003=2,24×108 копий ДНК/мл.Subsequently, in accordance with our method, the concentrations of the desired microorganisms in the studied samples were calculated using the formula B = 1.7 × (Nst × Ε × (Cst-Ct)) / V, which amounted to 8.4 × 10 7 copies of DNA / ml Porphyromonas gingivalis: B = 1.7 × (3.5 × 10 4 × 2.0 × (20.23-18.12)) / 0.003 = 8.4 × 10 7 copies of DNA / ml; 3.1 × 10 7 DNA copies / ml Treponema denticola: B = 1.7 × (3.5 × 10 4 × 2.0 × (20.23-19.44)) / 0.003 = 3.1 × 10 7 copies of DNA / ml; 2.24 × 10 8 DNA copies / ml Streptococcus sobrinus: B = 1.7 × (3.5 × 10 4 × 2.0 × (20.23-14.56)) / 0.003 = 2.24 × 10 8 copies of DNA / ml.
Пример №2. Пациент К., 45 лет. Диагноз: хронический генерализованный пародонтит средней степени в стадии обострения. Жалобы на подвижность зубов, запах изо рта, кровоточивость десен при чистке зубов. Сопутствующие заболевания: гастрит и гипотиреоз.Example No. 2. Patient K., 45 years old. Diagnosis: chronic generalized periodontitis of moderate degree in the acute stage. Complaints of tooth mobility, bad breath, bleeding gums when brushing your teeth. Concomitant diseases: gastritis and hypothyroidism.
Содержимое пародонтального кармана и ротовую жидкость отбирали из наиболее глубоких участков с помощью стерильных бумажных эндодонтических штифтов размером №25, которые были введены в пародонтальный карман экспозицией не менее 10 сек. В дальнейшем штифты с биоматериалом были помещены в стерильные пластиковые пробирки типа Eppendorf (1,5 мл), содержащие по 1 мл физиологического раствора. Образцы были тщательно ресуспендированы на приборе типа Vortex. Штифты с биоматериалом находились в пробирке до момента выделения ДНК 1 час при комнатной температуре. После чего по 50 мкл каждого из исследуемых образцов было перенесено в отдельные пробирки, содержащие по 200 мкл раствора с ионообменной смолой (Chelex100) для выделения тотальной ДНК. Для дальнейшей амплификации использовалось по 3 мкл супернатанта каждого из образцов.The contents of the periodontal pocket and oral fluid were taken from the deepest areas using sterile paper endodontic pins No. 25 in size, which were inserted into the periodontal pocket with an exposure of at least 10 seconds. Subsequently, the biomaterial pins were placed in sterile plastic Eppendorf tubes (1.5 ml) containing 1 ml of physiological saline. Samples were carefully resuspended on a Vortex type instrument. The biomaterial pins were in a test tube until DNA was isolated for 1 hour at room temperature. Then, 50 μl of each of the test samples was transferred into separate tubes containing 200 μl of a solution with ion-exchange resin (Chelex100) to isolate total DNA. For further amplification, 3 μl of the supernatant of each sample was used.
Для выделения тотальной ДНК из образцов ДНК использовали ионообменную смолу Chelex100. Для постановки ПЦР в реальном времени использовали подобранные нами пары видоспецифичных праймеров к фрагментам ДНК Porphyromonas gingivalis, Streptococcus oralis, Streptococcus sanguis, Streptococcus sobrinus, Treponema denticola и реакционную смесь в присутствии SYBR Green I (ООО «СИНТОЛ», согласно инструкции производителя). ПЦР проводили с помощью детектирующего амплификатора CFX96 Touch "REAL TIME" (Bio-Rad, США). Учет результатов проводили с помощью программного обеспечения Bio-Rad CFX Manager.Chelex100 ion exchange resin was used to isolate total DNA from DNA samples. For real-time PCR, we used pairs of species-specific primers for DNA fragments of Porphyromonas gingivalis, Streptococcus oralis, Streptococcus sanguis, Streptococcus sobrinus, Treponema denticola and the reaction mixture in the presence of SYBR Green I (according to the manufacturer's instructions). PCR was performed using a CFX96 Touch “REAL TIME” detection amplifier (Bio-Rad, USA). Analysis was performed using the Bio-Rad CFX Manager software.
Результаты исследования микрофлоры зубодесневых карманов методом Real-Time PCR: обнаружены микроорганизмы Porphyromonas gingivalis, Treponema denticola, Streptococcus sobrinus, Streptococcus oralis, Streptococcus sanguis.The results of the study of microflora of gingival pockets using the Real-Time PCR method: Porphyromonas gingivalis, Treponema denticola, Streptococcus sobrinus, Streptococcus oralis, Streptococcus sanguis microorganisms were found.
В дальнейшем в соответствии с предлагаемым нами способом были рассчитаны концентрации искомых микроорганизмов в исследованных образцах по формуле В=1,7×(Nst×Ε×(Cst-Ct))/V, которые составили 2,01×108 копий ДНК/мл Porphyromonas gingivalis: В=1,7×(3,5×104×2,0×(20,23-15,17))/0,003=2,01×108 копий ДНК/мл; 8,77×107 копий ДНК/мл Treponema denticola: В=1,7×(3,5×104×2,0×(20,23-18,02))/0,003=8,77×107 копий ДНК/мл; 7,93×106 копий ДНК/мл Streptococcus sobrinus: В=1,7×(3,5×104×2,0×(20,23-20,03))/0,003=7,93×106 копий ДНК/мл; 2,58×107 копий ДНК/мл Streptococcus oralis: В=1,7×(3,5×104×2,0×(20,23-19,58))/0,003=2,58×107 копий ДНК/мл; и 1,32×108 копий ДНК/мл Streptococcus sanguis: В=1,7×(3,5×104×2,0×(20,23-16,9))/0,003=1,32×108 копий ДНК/мл.Subsequently, in accordance with our proposed method, the concentrations of the desired microorganisms in the studied samples were calculated using the formula B = 1.7 × (Nst × Ε × (Cst-Ct)) / V, which amounted to 2.01 × 10 8 copies of DNA / ml Porphyromonas gingivalis: B = 1.7 × (3.5 × 10 4 × 2.0 × (20.23-15.17)) / 0.003 = 2.01 × 10 8 copies of DNA / ml; 8.77 × 10 7 DNA copies / ml Treponema denticola: B = 1.7 × (3.5 × 10 4 × 2.0 × (20.23-18.02)) / 0.003 = 8.77 × 10 7 copies of DNA / ml; 7.93 × 10 6 copies of DNA / ml Streptococcus sobrinus: B = 1.7 × (3.5 × 10 4 × 2.0 × (20.23-20.03)) / 0.003 = 7.93 × 10 6 copies of DNA / ml; 2.58 × 10 7 DNA copies / ml Streptococcus oralis: B = 1.7 × (3.5 × 10 4 × 2.0 × (20.23-19.58)) / 0.003 = 2.58 × 10 7 copies of DNA / ml; and 1.32 × 10 8 copies of DNA / ml Streptococcus sanguis: B = 1.7 × (3.5 × 10 4 × 2.0 × (20.23-16.9)) / 0.003 = 1.32 × 10 8 copies of DNA / ml.
Claims (9)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2015155929A RU2612023C1 (en) | 2015-12-24 | 2015-12-24 | Method for quantitative determination of species composition of microbiota of parodontal recesses |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2015155929A RU2612023C1 (en) | 2015-12-24 | 2015-12-24 | Method for quantitative determination of species composition of microbiota of parodontal recesses |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2612023C1 true RU2612023C1 (en) | 2017-03-01 |
Family
ID=58459100
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2015155929A RU2612023C1 (en) | 2015-12-24 | 2015-12-24 | Method for quantitative determination of species composition of microbiota of parodontal recesses |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2612023C1 (en) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2386394C1 (en) * | 2008-11-17 | 2010-04-20 | Людмила Владимировна Уварова | Diagnostic technique for periodontitis severity |
-
2015
- 2015-12-24 RU RU2015155929A patent/RU2612023C1/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2386394C1 (en) * | 2008-11-17 | 2010-04-20 | Людмила Владимировна Уварова | Diagnostic technique for periodontitis severity |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| DECAT E. et al. Optimization of quantitative polymerase chain reactions for detection and quantification of eight periodontal bacterial pathogens. BMC research Notes. 2012, 5:664. * |
| ИВАНЮШКО Т.П. и др. Исследование условно-патогенных микроорганизмов методом ПЦР в реальном времени у больных пародонтитом. Стоматология, 2011, N. 5, с. 22-26. * |
| ТАМАРОВА Э.Р. и др. Молекулярно-генетическая характеристика микрофлоры полости рта при пародонтите. Вестник Челябинского государственного университета. 2013, N.7, 298, Биология. Вып. 2, с. 70-71. * |
| ТАМАРОВА Э.Р. и др. Молекулярно-генетическая характеристика микрофлоры полости рта при пародонтите. Вестник Челябинского государственного университета. 2013, N.7, 298, Биология. Вып. 2, с. 70-71. DECAT E. et al. Optimization of quantitative polymerase chain reactions for detection and quantification of eight periodontal bacterial pathogens. BMC research Notes. 2012, 5:664. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Tanner et al. | Clinical characteristics and microbiota of progressing slight chronic periodontitis in adults | |
| Lima et al. | Saliva: reflection of the body | |
| Chapple et al. | Prediction and diagnosis of attachment loss by enhanced chemiluminescent assay of crevicular fluid alkaline phosphatase levels | |
| Martínez-Martínez et al. | Association between periodontitis, periodontopathogens and preterm birth: is it real? | |
| Sales‐Peres et al. | Periodontal status and pathogenic bacteria after gastric bypass: a cohort study | |
| RU2367959C1 (en) | Laboratory saliva-composition diagnostic technique for oral diseases | |
| Scalioni et al. | Salivary density of Streptococcus mutans and Streptococcus sobrinus and dental caries in children and adolescents with Down syndrome | |
| Ito et al. | Clinical evaluation of salivary periodontal pathogen levels by real‐time polymerase chain reaction in patients before dental implant treatment | |
| Kamaraj et al. | An evaluation of microbial profile in halitosis with tongue coating using PCR (polymerase chain reaction)-a clinical and microbiological study | |
| Gülseren et al. | The relationship between recurrent aphthous stomatitis, and periodontal disease and Helicobacter Pylori infection | |
| Yasunaga et al. | Exploration of bacterial species associated with the salivary microbiome of individuals with a low susceptibility to dental caries | |
| RU2390775C1 (en) | Differential diagnostic technique of inflammatory parodentium diseases parodonta, based on condition of local factors of nonspecific oral protection | |
| Eick et al. | Persistence of Porphyromonas gingivalis is a negative predictor in patients with moderate to severe periodontitis after nonsurgical periodontal therapy | |
| Ursărescu et al. | Study regarding the IL1-Α and IL1-Β levels in gingival crevicular fluid in patients with chronic periodontitis and osteoporosis | |
| Sharipovna et al. | Etiopatogenetic factors in the development of parodontal diseases in post-menopasis women | |
| Georgiou et al. | Host–microbiome interactions in apical periodontitis: The endodontic microbiome in relation to circulatory immunologic markers | |
| RU2460076C1 (en) | Early diagnostic technique for oral diseases in adolescents by microelement composition and lactic acid bacilli concentration in non-stimulated oral fluid | |
| Masulili et al. | Gingival Crevicular Fluid Levels of Resistin and Adiponectin in Chronic Periodontitis with Type 2 Diabetes Mellitus. | |
| RU2612023C1 (en) | Method for quantitative determination of species composition of microbiota of parodontal recesses | |
| Okada et al. | Characterization of specimens obtained by different sampling methods for evaluation of periodontal bacteria | |
| Zhang et al. | Saliva diagnostics for oral diseases | |
| RU2622028C1 (en) | Method for laboratory verification of vaginitis in girls with vulvitis at age of up to 8 years | |
| Schmidt et al. | Stress-related hormones in association with periodontal condition in adolescents—results of the epidemiologic LIFE Child study | |
| JP4792585B2 (en) | Rapid detection method for oral bacteria | |
| Hirsch et al. | Pulpal pathosis and severe alveolar lesions: a clinical study |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20171225 |