RU2566672C1

RU2566672C1 - Method of preparation of feed from microalgae for far eastern sea cucumber larvae

Info

Publication number: RU2566672C1
Application number: RU2014119107/13A
Authority: RU
Inventors: Георгий Николаевич Ким; Елена Константиновна Журба; Галина Георгиевна Калинина; Анна Сергеевна Советкина; Татьяна Михайловна Азьмука
Priority date: 2014-05-12
Filing date: 2014-05-12
Publication date: 2015-10-27

Abstract

FIELD: agriculture.

SUBSTANCE: method comprises year-round cultivation of unialgal monocultures of microalgae Dunaliella salina and Chaetoceros muelleri on a nutrient medium prepared based on natural sea water with the salinity of 31%, which is carried out in two stages. At the first stage, the biomass of algae is increased, and the most viable monocultures are selected, which are inoculated separately into the translucent culture containers on a modified nutrient medium of Waln. At the second stage, the biomass of monocultures obtained are conditioned every 4 days in portions by growing in a nutrient medium of Goldberg.

EFFECT: obtaining of stable density of microalgae.

2 ex, 8 dwg

Description

Изобретение относится к одному из направлений рыбной отрасли, а именно аквакультуре, в частности к культивированию микроводорослей - одноклеточных видов водорослей Dunaliella salina и Chaetoceros muelleri для использования в качестве живого корма при выращивании дальневосточного трепанга. Изобретение может быть использовано при выращивании дальневосточного трепанга в искусственных условиях.The invention relates to one of the areas of the fishing industry, namely, aquaculture, in particular to the cultivation of microalgae - unicellular species of algae Dunaliella salina and Chaetoceros muelleri for use as live food for growing Far Eastern trepang. The invention can be used in the cultivation of Far Eastern trepang in artificial conditions.

Важным условием в процессе выращивания личинок трепанга является их кормление живыми кормами. Состав и качество этих кормов существенно влияют на скорость роста личинок и их выживаемость. Поэтому подбор оптимального состава кормов и рациона является первоочередной задачей для воспроизводства дальневосточного трепанга.An important condition in the process of growing trepang larvae is their feeding with live food. The composition and quality of these feeds significantly affect the growth rate of larvae and their survival. Therefore, the selection of the optimal composition of feed and diet is a priority for the reproduction of the Far Eastern trepang.

Особенную ценность представляют такие одноклеточные организмы как зеленые водоросли Dunaliella salina Teod. (Chlorophyta) и диатомовые водоросли Chaetoceros muelleri Lemm. (Bacillariophyta), клетки которых имеют подходящие для питания личинок трепанга размеры (8-20 мкм) [1]. В них содержатся практически все незаменимые аминокислоты, жиры, углеводы, много различных витаминов [1-4]. Существенно облегчает усвоение биомассы данных водорослей то, что клетки D. salina лишены целлюлозной оболочки и окружены лишь плазмолеммой, а стенки панциря С.muelleri очень тонкие, с нежной структурой, благодаря чему применяются в качестве кормовой базы для личинок трепанга.Of particular value are such unicellular organisms as the green algae Dunaliella salina Teod. (Chlorophyta) and Chaetoceros muelleri Lemm diatoms. (Bacillariophyta), the cells of which are suitable for feeding the larvae of trepang sizes (8-20 microns) [1]. They contain almost all the essential amino acids, fats, carbohydrates, many different vitamins [1-4]. The assimilation of the biomass of these algae greatly facilitates the fact that D. salina cells lack a cellulose membrane and are surrounded only by a plasmolemma, and the walls of the carapace of C. muelleri are very thin, with a delicate structure, due to which they are used as a food base for trepang larvae.

Для выращивания дальневосточного трепанга необходимым условием является одновременное созревание корма для его личинок, которым являются микроводоросли D. salina и С.muelleri. А для этого микроводоросли необходимо выращивать одновременно. Поэтому для создания оптимальных условий их роста в условиях аквакультуры необходимо искусственно изменять условия содержания (температуру, освещенность, солевой состав).For the cultivation of Far Eastern sea cucumber, a necessary condition is the simultaneous maturation of food for its larvae, which are microalgae D. salina and C. muelleri. And for this, microalgae must be grown at the same time. Therefore, to create optimal conditions for their growth under aquaculture conditions, it is necessary to artificially change the conditions of detention (temperature, illumination, salt composition).

Известны работы, в которых даны рекомендации по массовому культивированию микроводорослей. Наиболее значимыми факторами, оказывающими влияние на ростовые и биохимические характеристики культур, являются световое и минеральное обеспечение [5].Known works in which recommendations are given on the mass cultivation of microalgae. The most significant factors influencing the growth and biochemical characteristics of crops are light and mineral supply [5].

Существуют множество отработанных технологий выращивания одноклеточных водорослей. Для их выращивания используют установки открытого и закрытого типов. Водоросли в установках открытого типа выращиваются либо под открытым небом, либо под защитной пленкой, пропускающей ультрафиолетовые лучи. Выращивание без защитной пленки осложняется возможностью заражения водорослей посторонними культурами.There are many proven technologies for growing unicellular algae. For their cultivation, plants of open and closed types are used. Algae in open-type plants are grown either in the open air or under a protective film that transmits ultraviolet rays. Growing without a protective film is complicated by the possibility of contamination of algae with foreign crops.

Известен способ культивирования штамма микроводорослей Chlorella vulgaris ИФР С-111, предусматривающий розлив питательной среды в емкости, инокуляцию суспензии штаммом, освещение культуральной жидкости в процессе роста микроводорослей и поддержание необходимой температуры суспензии, притом, что емкости представляют собой сосуды из прозрачного материала и для освещения используют источник искусственного света, при этом сосуды размещены на расстоянии один от другого на поддоне каркаса вокруг источника света, ккоторый установлен на каркасе с возможностью вертикального перемещения к поддону (патент РФ №2176667, МПК C12N 001/12, С12М 003/00, С12М 003/04). Изобретение обеспечивает интенсификацию процесса выращивания микроводорослей с использованием упомянутого выше штамма и получение стабильной плотности клеток за определенный период времени. Согласно информации представленной в описании изобретения, температура суспензии хлореллы в бутылях равняется 30°С (нагрев от лампы) при температуре окружающего воздуха 20°С.A known method of cultivating a strain of microalgae Chlorella vulgaris IGF S-111, providing for the filling of the nutrient medium in a container, inoculating the suspension with a strain, illuminating the culture fluid during the growth of microalgae and maintaining the required temperature of the suspension, despite the fact that the containers are vessels of transparent material and use lighting an artificial light source, while the vessels are placed at a distance from one another on a pallet of the frame around the light source, which is mounted on the frame with the possibility of vertical movement to the pallet (RF patent No. 2176667, IPC C12N 001/12, C12M 003/00, C12M 003/04). The invention provides an intensification of the process of growing microalgae using the strain mentioned above and obtaining a stable cell density over a certain period of time. According to the information presented in the description of the invention, the temperature of the suspension of chlorella in bottles is 30 ° C (heating from a lamp) at an ambient temperature of 20 ° C.

Однако, эти условия являются непригодными для Dunaliella salina и Chaetoceros muelleri, потому что для последних необходимо регулярное перемешивание, более низкая температура.However, these conditions are unsuitable for Dunaliella salina and Chaetoceros muelleri, because the latter require regular mixing, lower temperature.

Известен также способ культивирования микроводорослей с использованием питательных сред, приготовленных на основе сточных вод животноводческих и рыбных ферм (Patentscope, method of cultivating microalgae, SU 01621823, 23.01.1991 (з. №4392268, 15.03.1988).There is also known a method of cultivating microalgae using nutrient media prepared on the basis of wastewater from livestock and fish farms (Patentscope, method of cultivating microalgae, SU 01621823, 01/23/1991 (z. No. 4392268, 03/15/1988).

Способ заключается в том, что при культивировании микроводорослей, после инокулирования среды осуществляют выращивание в суспензионной культуре в накопительном режиме в условиях перемешивания и освещения до максимального прироста биомассы. Процесс культивирования проводят в две стадии. На первой стадии культивирование осуществляют до достижения рН в суспензионной культуре 9,4-9,6 и последующего культивирования при данном значении рН, после чего отстаивают суспензию для формирования коллоидно-бактериального осадка, после удаляют образовавшийся осадок и проводят вторую стадию культивирования до максимального прироста биомассыThe method consists in the fact that during the cultivation of microalgae, after inoculating the medium, they are grown in suspension culture in a cumulative mode under conditions of mixing and lighting to the maximum increase in biomass. The cultivation process is carried out in two stages. At the first stage, cultivation is carried out until the pH in suspension culture reaches 9.4–9.6 and subsequent cultivation at a given pH value, after which the suspension is defended for the formation of a colloidal bacterial precipitate, then the precipitate formed is removed and the second cultivation stage is carried out to the maximum biomass increase

Недостатком данного способа является большая бактериальная зараженность культуры и невозможность длительного культивирования в связи с последующими процессами гниения за счет нереализованных белковых соединений. Данная технология может использоваться лишь при выращивании сине-зеленых водорослей. Она неприменима для одновременного культивирования Dunaliella salina и Chaetoceros muelleri из-за высокого уровня рН и присутствия бактерий.The disadvantage of this method is the large bacterial contamination of the culture and the impossibility of long-term cultivation in connection with the subsequent processes of decay due to unrealized protein compounds. This technology can only be used when growing blue-green algae. It is not suitable for the simultaneous cultivation of Dunaliella salina and Chaetoceros muelleri due to the high pH level and the presence of bacteria.

Известен способ непрерывного культивирования микроорганизмов в больших открытых резервуарах в солнечном свете (US 6673592 В1). Открытая система для культивирования микроводорослей включает в себя большой открытый контейнер и неограниченный солнечный свет как источник ультрафиолетового излучения. Контейнер, желательно из стекловолокна, имеет открытый верх, диаметром около 18 дюймов и высотой около 5 метров. Используется питательная среда с рН 8.2. 90% культивируемых микроводорослей каждый день изымается, заменяется новой культурой. Этот способ является малотрудоемким и экономически эффективным.A known method of continuous cultivation of microorganisms in large open tanks in sunlight (US 6673592 B1). An open microalgae cultivation system includes a large open container and unlimited sunlight as a source of ultraviolet radiation. The container, preferably fiberglass, has an open top with a diameter of about 18 inches and a height of about 5 meters. Used nutrient medium with a pH of 8.2. 90% of cultivated microalgae are seized every day, replaced by a new culture. This method is low labor intensive and cost effective.

Однако при его использовании появляется возможность возникновения инфекций, которые могут стать причиной гибели всего объема культуры. Также большим минусом является зависимость от погодных условий.However, when using it, there is the possibility of infections that can cause the death of the entire culture. Also a big minus is the dependence on weather conditions.

Наиболее близким для культивирования микроводорослей в условиях выращивания дальневосточного трепанга из существующих ныне является способ подготовки кормов для выращивания другого представителя морских беспозвоночных в искусственных условиях, а именно: гигантской устрицы Crassostrea gigas в Черном море в условиях питомника (Патент UA 80385, А01К 61/00, А23К 1/18). Способ включает культивирование микроводорослей в накопительном и проточном режимах с применением модифицированной среды Конвея, приготовленной на воде с соленостью выше 40%о, причем на стадии велигера используют микроводоросли, которые культивируют в течение 17-ти дней в накопительном режиме, для стадии великонхи применяют 10-дневные микроводоросли, которые культивируют в проточном режиме и для стадии педивелигера микроводоросли проходят 24-дневное культивирование.The closest to the cultivation of microalgae in the conditions of growing Far Eastern trepang from the existing ones is the method of preparing feed for growing another representative of marine invertebrates in artificial conditions, namely: giant oyster Crassostrea gigas in the Black Sea in a nursery (Patent UA 80385, А01К 61/00, A23K 1/18). The method involves the cultivation of microalgae in storage and flow modes using a modified Conway medium prepared in water with a salinity higher than 40%, moreover, microalgae are used in the veliger stage, which are cultivated for 17 days in a storage mode, 10- daily microalgae, which are cultivated in a flow mode and for the pediveliger stage, microalgae undergo 24-day cultivation.

Недостатком данного способа является не только сложность, но и использование для приготовления питательной среды вод гипергалинных озер, соленость которых выше 40%. Для подготовки кормов из микроводорослей для личинок дальневосточного трепанга при выращивании трепанга в экологических условиях бухты Северная в Славянском заливе Японского моря на мини-заводе этот способ не пригоден, в том числе в связи с тем, что для Dunaliella salina (в требуемой для кормления трепанга «зеленой фазе») и Chaetoceros muelleri оптимальна соленость для культивирования 31%.The disadvantage of this method is not only complexity, but also the use of hyperhaline lakes, the salinity of which is higher than 40%, for preparing the nutrient medium. For the preparation of feed from microalgae for larvae of the Far Eastern trepang when growing trepang in the ecological conditions of Severnaya Bay in the Slavic Bay of the Sea of Japan in a mini-plant this method is not suitable, including due to the fact that for Dunaliella salina (in the required for feeding trepang " green phase ”) and Chaetoceros muelleri optimal salinity for cultivation of 31%.

Задача состоит в создании способа подготовки кормов из микроводорослей для личинок дальневосточного трепанга, позволяющего выращивать одновременно микроводоросли Dunaliella salina и Chaetoceros muelleri и получать монокультуры со стабильной плотностью к началу периода кормления личинок, таким образом обеспечивая одновременное созревание корма.The objective is to create a method of preparing feed from microalgae for larvae of the Far Eastern trepang, which allows the simultaneous cultivation of microalgae Dunaliella salina and Chaetoceros muelleri and obtain monocultures with a stable density at the beginning of the larval feeding period, thus ensuring simultaneous maturation of the feed.

Для решения поставленной задачи в способе подготовки кормов из микроводорослей для личинок дальневосточного трепанга, включающем культивирование альгологически чистых монокультур микроводорослей на питательной среде, приготовленной на основе природной соленой воды, согласно изобретению, в качестве микроводорослей используют одноклеточные водоросли Dunaliella salina и Chaetoceros muelleri, которые культивирую круглый год в два этапа: на первом подготовительном этапе наращивают биомассу водорослей и проводят отбор наиболее жизнеспособных монокультур, которые инокулируют раздельно в светопроницаемые культуральные емкости на приготовленную на основе природной морской воды соленостью 31% модифицированную питательную среду Уолна, следующего состава, мг/л:To solve the problem in the method of preparation of feed from microalgae for larvae of the Far Eastern trepang, including the cultivation of algologically pure monocultures of microalgae on a nutrient medium prepared from natural salt water according to the invention, unicellular algae Dunaliella salina and Chaetoceros muelüleri are used as microalgae, which year in two stages: at the first preparatory stage, the algae biomass is increased and the most viable monocultes are selected ur, which are inoculated separately in translucent culture containers prepared on the basis of natural sea water with a salinity of 31% modified nutrient medium of Walne, of the following composition, mg / l:

ZnCl₂ ZnCl ₂ 0,210.21 CoCl₂·6H₂OCoCl ₂ · 6H ₂ O 0,30.3 (NН₄)₆Мо₇O₂₄·4H₂O(NH ₄ ) ₆ Mo ₇ O ₂₄ · 4H ₂ O 0,140.14 CuSO₄·5H₂OCuSO ₄ · 5H ₂ O 0,20.2 FeCl₃·6H₂OFeCl ₃ · 6H ₂ O 1,31.3 MnCl₂·4H₂OMnCl ₂ · 4H ₂ O 0,360.36 H₃BO₃ H ₃ BO ₃ 33,633.6 EDTA (C₁₀H₁₄N₂O₈Na₂·2H₂O)EDTA (C ₁₀ H ₁₄ N ₂ O ₈ Na ₂ · 2H ₂ O) 45,045.0 NaH₂PO₄·2H₂ONaH ₂ PO ₄ · 2H ₂ O 30,030,0 NaNO₃ NaNO ₃ 100,0100.0 Na₂SiO₃ Na ₂ SiO ₃ 5,05,0

и культивируют при температуре 22°С, рН среды 7,2 при фотопериодичности 18 часов света с освещенностью 30000 люкс и 6 часов темноты, при периодическом перемешивании до плотности 2-2,5 млн кл./мл с последующими пересадками на свежую среду этого же состава, при этом пересадку Dunaliella salina проводят каждые 15-20 дней в течение всего подготовительного этапа, а Chaetoceros muelleri - каждые 10-15 дней, и только в зимний период этого этапа пересадку проводят каждые 20-25 дней; на втором - кормовом этапе, за 7 дней до нереста трепанга и в течение всего кормового периода личинок трепанга каждые 4 дня полученные биомассы монокультур порционно кондиционируют путем выращивания на приготовленной на основе природной морской воды соленостью 31%о питательной среде Гольдберга при температуре 22°С, рН среды 7,2 и фотопериодичности 18 часов света с освещенностью 30000 люкс и 6 часов темноты, в светопроницаемых культуральных емкостях при периодическом перемешивании в течение 4-6 суток до плотности 1,0-1,5 млн кл./мл.and cultivated at a temperature of 22 ° C, a pH of 7.2 at a photoperiod of 18 hours of light with an illuminance of 30,000 lux and 6 hours of darkness, with periodic stirring to a density of 2-2.5 million cells / ml, followed by transfers to fresh medium of the same the composition, while the transplantation of Dunaliella salina is carried out every 15-20 days during the entire preparatory stage, and Chaetoceros muelleri - every 10-15 days, and only in the winter period of this stage, the transplant is carried out every 20-25 days; at the second - feed stage, 7 days before the trepang spawning and throughout the entire feeding period of the trepang larvae, every 4 days the obtained biomass of monocultures is portionwise conditioned by growing 31% of Goldberg's nutrient medium at the temperature of Goldberg prepared on the basis of natural sea water, The pH of the medium is 7.2 and the photoperiods of 18 hours of light with illumination of 30,000 lux and 6 hours of darkness, in translucent culture containers with periodic stirring for 4-6 days to a density of 1.0-1.5 million cells / ml.

Технический результат заключается в создании нового способа подготовки кормов из микроводорослей для личинок дальневосточного трепанга, обеспечивающего одновременное созревание D. salina и С.muelleri ко времени нереста и получение стабильной плотности клеток к периоду кормления личинок трепанга дальневосточного, путем регулирования частоты пересадки, фотопериодичности, освещения, температуры и солености в культуральных емкостях.The technical result consists in creating a new method of preparation of feed from microalgae for Far Eastern trepang larvae, providing simultaneous maturation of D. salina and C. muelleri at the time of spawning and obtaining a stable cell density for the feeding period of Far Eastern trepang larvae by controlling the frequency of transplantation, photoperiodicity, lighting, temperature and salinity in cultural containers.

Количество пересадок определяется потребностями завода - производителя.The number of transplants is determined by the needs of the manufacturer.

Процесс культивирования микроводорослей для кормления личинок дальневосточного трепанга осуществляется круглогодично.The process of cultivating microalgae for feeding the larvae of the Far Eastern trepang is carried out year-round.

На фиг. 1 - графически представлена динамика плотности клеток в культуре D. salina в период исследования минерального обеспечения.In FIG. 1 - graphically presents the dynamics of cell density in the culture of D. salina during the study of mineral supply.

На фиг. 2 - графически представлена динамика плотности клеток в культуре С.muelleri исследования минерального обеспечения.In FIG. 2 - graphically presents the dynamics of cell density in the culture of C. muelleri mineral support studies.

На фиг. 3 и фото к фиг. 3 - представлены клетки в культуре D. salina (среда Уол-на модифицированная).In FIG. 3 and the photo to FIG. 3 - presents cells in the culture of D. salina (Wal-on medium modified).

На фиг. 4 и фото к фиг. 4 - представлена цепочка клеток С.muelleri (среда Уолна модифицированная).In FIG. 4 and the photo of FIG. 4 - a chain of C. muelleri cells (modified Walne medium) is presented.

На фиг. 5 и фото к фиг. 5 - представлена клетка в культуре D. salina (среда Гольдберга).In FIG. 5 and the photo to FIG. 5 - presents a cell in the culture of D. salina (Goldberg medium).

На фиг. 6 и фото к фиг. 6 - представлена клетка в культуре С.muelleri (среда Гольдберга).In FIG. 6 and the photo of FIG. 6 - presents a cell in the culture of C. muelleri (Goldberg medium).

На фиг. 7 - графически представлена динамика плотности культуры D. salina на среде Уолна (стандартной и модифицированной),In FIG. 7 - graphically presents the dynamics of the density of the culture of D. salina in the medium of Walne (standard and modified),

где 1 - стандартная среда Уолна; 2 - модифицированная среда Уолна; 3 - модифицированная среда Уолна с добавлением витаминов.where 1 is the standard Walne medium; 2 - modified Walne medium; 3 - modified Walne medium with the addition of vitamins.

На фиг. 8 - графически представлено влияние светового периода на плотность клеток в культуре D. salina.In FIG. 8 - graphically presents the effect of light period on cell density in the culture of D. salina.

Способ осуществляют следующим образом.The method is as follows.

Заявляемый способ включает два этапа, связанных с циклом выращиванием дальневосточного трепанга. Первый этап начинается в период оседания трепанга и длится до его преднерестовой стадии.The inventive method includes two stages associated with a cycle of growing Far Eastern trepang. The first stage begins in the period of sedimentation of trepang and lasts until its pre-spawning stage.

На первом этапе осуществляется посев жизнеспособных клеток водорослей Dunaliella salina и Chaetoceros muelleri в разные емкости на одинаковую для обеих культур модифицированную заявителем, приготовленную на основе природной морской воды соленостью 31% питательную среду Уолна, следующего состава, мг/л: ZnCl₂ - 0.21, CoCl₂·6H₂O - 0.3, (NН₄)₆Мо₇O₂₄·4H₂O - 0.14, CuSO₄·5H₂O - 0.2, FeCl₃·6H₂O - 1.3, MnCl₂·4H₂O - 0.36, Н₃ВО₃ - 33.6, EDTA (C₁₀H₁₄N₂O₈Na₂·2H₂O) - 45.0, NaH₂PO₄·2H₂O - 30.0, NaNO₃ - 100.0, Na₂SiO₃ - 5.0 для наращивания биомассы монокультур и длится до начала подготовки биомассы к кондиционированию корма.At the first stage, viable cells of the algae Dunaliella salina and Chaetoceros muelleri are sown in different containers for the same as the applicant’s modified for both cultures, prepared on the basis of natural sea water with a salinity of 31% nutrient medium Walna, the following composition, mg / l: ZnCl ₂ - 0.21, CoCl ₂ · 6H ₂ O - 0.3, (NH ₄ ) ₆ Mo ₇ O ₂₄ · 4H ₂ O - 0.14, CuSO ₄ · 5H ₂ O - 0.2, FeCl ₃ · 6H ₂ O - 1.3, MnCl ₂ · 4H ₂ O - 0.36 , H ₃ BO ₃ - 33.6, EDTA (C ₁₀ H ₁₄ N ₂ O ₈ Na ₂ · 2H ₂ O) - 45.0, NaH ₂ PO ₄ · 2H ₂ O - 30.0, NaNO ₃ - 100.0, Na ₂ SiO ₃ - 5.0 to increase the biomass of monocultures and lasts until the preparation of biomass for conditioning the feed.

На втором этапе полученные в биомассе Dunaliella salina и Chaetoceros muelleri, которые предназначены быть кормом для личинок трепанга, кондиционируют путем замены питательной среды. Для этого биомассы пересаживают на среду, в составе которой полностью отсутствуют вредные для развития личинок дальневосточного трепанга вещества. Продолжительность второго этапа связана с периодом нереста и личиночного развития дальневосточного трепангаAt the second stage, Dunaliella salina and Chaetoceros muelleri obtained in biomass, which are intended to be feed for trepang larvae, are conditioned by replacing the nutrient medium. For this, biomass is transplanted onto an environment in which there are completely no substances harmful to the development of larvae of the Far Eastern trepang. The duration of the second stage is associated with the period of spawning and larval development of the Far Eastern trepang

Обоснование выбора питательных сред на этапахThe rationale for the selection of culture media at the stages

Эксперимент по подбору питательной среды, оптимальной для роста и развития микроводорослей из разных отделов в течение длительного периода с наращиванием биомассы, проводили в течение 14 дней.An experiment on the selection of a nutrient medium optimal for the growth and development of microalgae from different departments over a long period with an increase in biomass was carried out for 14 days.

При исследовании были использованы две питательные среды (Гольдберга и модифицированная среда Уолна).In the study, two nutrient media were used (Goldberg and modified Walne medium).

В начальный период эксперимента водоросли в течение 20 суток адаптировали к задаваемым питательным средам. Перед началом опытов плотность клеточных суспензий во всех колбах была одинаковой. Каждый вариант опыта выполнялся одновременно в трех повторностях, и все приведенные количественные данные являются средними из значений, полученных в каждой параллели.In the initial period of the experiment, algae were adapted to specified nutrient media for 20 days. Before starting the experiments, the density of cell suspensions in all flasks was the same. Each experiment was carried out simultaneously in three replicates, and all the quantitative data presented are the average of the values obtained in each parallel.

Рост культур D. salina и С .muelleri на среде Уолна характеризовался S-образной кривой с небольшими изломами (фиг. 1, 2).The growth of D. salina and C. muelleri cultures on the Walne medium was characterized by an S-curve with small kinks (Figs. 1, 2).

Максимальный среднесуточный прирост культуры D. salina на среде Уолна зарегистрирован на 6-е сутки. Клетки на протяжении всего эксперимента имели правильную овальную форму (Фиг. 3), активно передвигались. Отрицательный скачок роста наблюдался на стадии экспоненциального роста на 7-е сутки.The maximum daily average growth of D. salina culture on Walne's medium was recorded on the 6th day. Cells throughout the experiment had the correct oval shape (Fig. 3), actively moved. A negative growth spurt was observed at the stage of exponential growth on the 7th day.

Максимальный среднесуточный прирост культуры С. muelleri на среде Уолна зарегистрирован на 11-е сутки - 1798 тыс кл./мл. Форма клеток оставалась неизменной (прямоугольная). До 10 суток эксперимента преобладали одиночные клетки, далее - сцепленные по 2 и 3 (Фиг. 4). Значительный отрицательный скачок роста наблюдался на 9-е сутки.The maximum daily average growth of C. muelleri culture on Walne's medium was recorded on the 11th day - 1798 thousand cells / ml. The shape of the cells remained unchanged (rectangular). Up to 10 days of the experiment, single cells prevailed, then - linked by 2 and 3 (Fig. 4). A significant negative growth spike was observed on the 9th day.

Кривая роста культуры D. salina на среде Гольдберга имеет множество точек излома (Фиг. 1). Микроводоросли развивались неоднозначно в течение всего эксперимента. Снижение темпа роста и значительная смертность клеток в культуре наблюдается на 5-е и 10-е сутки. Максимальный среднесуточный прирост культуры зарегистрирован на 5-е сутки - 542 тыс кл./мл. Некоторые клетки округлились (Фиг. 5), их движение замедлилось, но на 12-е сутки вытянулись и ускорились.The growth curve of D. salina culture on Goldberg's medium has many break points (Fig. 1). Microalgae developed ambiguously throughout the experiment. A decrease in the growth rate and a significant mortality of cells in the culture are observed on the 5th and 10th days. The maximum average daily increase in culture was recorded on the 5th day - 542 thousand cells / ml. Some cells were rounded (Fig. 5), their movement slowed down, but on the 12th day they extended and accelerated.

Кривую роста культуры С. muelleri на среде Гольдберга можно охарактеризовать линейной прямой с небольшими отклонениями (Фиг. 2). Максимальный среднесуточный прирост культуры зарегистрирован на 5-е сутки. Форма клеток не изменилась, преобладали одиночные (фиг. 6).The growth curve of C. muelleri culture on Goldberg's medium can be characterized by a linear line with slight deviations (Fig. 2). The maximum average daily increase in culture was recorded on the 5th day. The shape of the cells did not change; single cells prevailed (Fig. 6).

За время эксперимента среднесуточный прирост на среде Уолна составил: 446±0,19 млн клеток/сут для D. salina, 389±0,13 млн клеток/сут для С. muelleri; на среде Гольдберга соответственно: 24±0,15 млн клеток/сут, 30±0,24 млн клеток/сут.During the experiment, the average daily increase in the Walne medium was: 446 ± 0.19 million cells / day for D. salina, 389 ± 0.13 million cells / day for C. muelleri; on Goldberg's medium, respectively: 24 ± 0.15 million cells / day, 30 ± 0.24 million cells / day.

Представленные фотографии сделаны автором во время проведения эксперимента цифровым фотоаппаратом Olympus FE 5010 при увеличении ×1600. При выращивании микроводорослей основной целью является сохранение последних в конце экспоненциальной фазы роста, чего мы добились как при использовании питательной среды Уолна, так и Гольдберга.The photographs presented were taken by the author during the experiment with an Olympus FE 5010 digital camera at a magnification of × 1600. When growing microalgae, the main goal is to preserve the latter at the end of the exponential growth phase, which we achieved both by using Waln’s and Goldberg’s culture media.

Однако в результате эксперимента выяснилось, что микроводоросли растут быстрее на среде Уолна и медленнее - на среде Гольдберга, причем разница в приросте к концу эксперимента достигла для D. salina 11 раз, для С. muelleri - 8,8 (табл. 1).However, as a result of the experiment, it was found that microalgae grow faster on the Waln medium and slower on the Goldberg medium, and the difference in growth by the end of the experiment reached 11 times for D. salina and 8.8 for C. muelleri (Table 1).

Таблица 1
Рост микроводорослей на двух питательны средах (результат показан на 14-е сутки)Table 1
The growth of microalgae on two nutrient media (the result is shown on the 14th day) № п/пNo. p / p СредаWednesday Концентрация водорослей (млн кл./мл)The concentration of algae (million cells / ml) D. salinaD. salina С.muelleriC. muelleri 1one УолнаWalna 6,4806,480 5,6805,680 22 ГольдбергаGoldberg 0,5730.573 0,6480.648

Как и ожидалось, среда с самой низкой концентрацией питательных веществ (Гольдберга) показала самую низкую плотность клеток. Вероятно это связано с недостатком в данных средах такого микроэлемента как молибден.As expected, the medium with the lowest concentration of nutrients (Goldberg) showed the lowest cell density. This is probably due to the lack of such a trace element as molybdenum in these media.

Обоснование выбора модификации питательной среды УолнаThe rationale for the selection of a modification of the nutrient medium of Walne

Именно использование среды Уолна при выращивании микроводорослей D. salina и С.muelleri позволяет в течение длительного времени поддерживать культуру в фазе активного роста и оптимальной концентрации.It is the use of the Walne medium for the cultivation of microalgae D. salina and C. muelleri that allows for a long time to maintain the culture in the phase of active growth and optimal concentration.

Однако, соотношение азота к фосфору питательной среде - это самостоятельно регулируемый фактор. В стандартную среду Уолна были внесены изменения: концентрация NaH₂PO₄ и увеличены до 30 мг/л. Концентрации СоСl₂·6Н₂O и (NH₄)₆Mo₇O₂₄·4Н₂O увеличены до 0,3 и 5 мг/л соответственно. В среду был добавлен Na₂SiO₃ в количестве 5 мг/л. Раствор витаминов был исключен полностью.However, the ratio of nitrogen to phosphorus in a nutrient medium is an independently regulated factor. Changes were made to the standard Walne medium: NaH ₂ PO ₄ concentration and increased to 30 mg / L. The concentrations of CoCl ₂ · 6H ₂ O and (NH ₄ ) ₆ Mo ₇ O ₂₄ · 4H ₂ O were increased to 0.3 and 5 mg / L, respectively. 5 mg / L Na ₂ SiO ₃ was added to the medium. A solution of vitamins was completely excluded.

Для исследования модифицированной питательной среды Уолна D. salina и С.muelleri культивировали в течение 8 суток при выбранных концентрациях элементов. Контролем служила стандартная среда Уолна. Также водоросли культивировали на выбранной модификации с добавлением витаминов по стандартной схеме для среды Уолна. Динамика изменений плотности культуры D. salina в зависимости от состава среды отображена на фиг. 7.To study the modified nutrient medium, Walnne D. salina and C. muelleri were cultured for 8 days at selected element concentrations. The control was a standard Walne medium. Algae were also cultivated on the selected modification with the addition of vitamins according to the standard scheme for Waln medium. The dynamics of the density variation of D. salina culture depending on the composition of the medium is shown in FIG. 7.

В первой фазе эксперимента обе модификации показали себя положительно (скачки роста отсутствовали, клетки оставались овальными, подвижными, цисты отсутствовали). На 5 сутки эксперимента инокулят, культивируемый на модифицированной питательной среде Уолна с добавлением витаминов, перешел на фазу отмирания: более 25% клеток погибло и осело на дно колбы.In the first phase of the experiment, both modifications showed themselves positively (growth jumps were absent, cells remained oval, mobile, cysts were absent). On the 5th day of the experiment, the inoculum, cultured on a modified Waln’s nutrient medium supplemented with vitamins, went into the dying phase: more than 25% of the cells died and settled on the bottom of the flask.

Модифицированная питательная среда Уолна (без витаминов), напротив, дала прирост на 540 тыс кл./мл выше, чем стандартная среда Уолна.The modified Waln's nutrient medium (without vitamins), on the contrary, gave an increase of 540 thousand cells / ml higher than the standard Waln medium.

Эксперимент с С.muelleri показал аналогичные результаты. Культивирование D. salina и С.muelleri в на модифицированной среде Уолна дает большие приросты, чем стандартная.The experiment with C. muelleri showed similar results. Cultivation of D. salina and C. muelleri in the modified Walne medium gives greater growth than standard.

Обоснование выбора условий освещенности.Justification for the choice of lighting conditions.

Влияние светового периода на плотность клеток в культуре отражено на фиг. 8The effect of the light period on the density of cells in the culture is reflected in FIG. 8

D. salina Культуру D. salina выращивали в течение 10 дней при различном световом обеспечении: при круглосуточном освещении в 30000 люкс и при фотопериодическом освещении с продолжительностью светового периода 18 часов при освещенности 30000 люкс.D. salina D. salina culture was grown for 10 days under various lighting conditions: with round-the-clock illumination of 30,000 lux and with photoperiodic illumination with a light period of 18 hours under illumination of 30,000 lux.

Начальная плотность культур во всех вариантах эксперимента была одинаковой и соответствовала 240 тыс кл./мл. Каждый вариант опыта выполнялся одновременно в двух повторностях, и все приведенные количественные данные являются средними из значений, полученных в каждой параллели.The initial density of cultures in all variants of the experiment was the same and corresponded to 240 thousand cells / ml. Each experiment was carried out simultaneously in two replicates, and all the quantitative data presented are the average of the values obtained in each parallel.

Кривая роста культуры D. salina при круглосуточном освещении имеет множество точек излома (Фиг. 8). Микроводоросли развивались неоднозначно в течение всего эксперимента. Снижение темпа роста и значительная смертность клеток в культуре наблюдается на 4, 7 и 8 сутки. Максимальный среднесуточный прирост культуры зарегистрирован на 3-е сутки - 820 тыс кл./мл. Многие клетки округлились, их движение замедлилось, на 10-е сутки появились цисты.The growth curve of D. salina culture with round-the-clock illumination has many break points (Fig. 8). Microalgae developed ambiguously throughout the experiment. A decrease in the growth rate and a significant mortality of cells in the culture are observed on days 4, 7, and 8. The maximum average daily increase in culture was recorded on the 3rd day - 820 thousand cells / ml. Many cells rounded, their movement slowed down, cysts appeared on the 10th day.

Рост культуры D. salina при фотопериодическом освещении характеризовался S-образной кривой с небольшими изломами.The growth of D. salina culture under photoperiodic illumination was characterized by an S-curve with small kinks.

Максимальный среднесуточный прирост культуры D. salina при фотопериодическом освещении зарегистрирован на 10-е сутки - 2450 тыс кл./мл. Клетки на протяжении всего эксперимента имели правильную овальную форму, активно передвигались. Отрицательный скачок роста наблюдался на стадии экспоненциального роста на 8-е сутки.The maximum daily average growth of D. salina culture under photoperiodic illumination was recorded on the 10th day - 2450 thousand cells / ml. Cells throughout the experiment had the correct oval shape, actively moved. A negative jump in growth was observed at the stage of exponential growth on the 8th day.

За время эксперимента среднесуточный прирост D. salina в контрольном образце составил 446 млн кл./сут для, в опытном - 38 млн кл./сут.During the experiment, the average daily increase in D. salina in the control sample was 446 million cells / day for, in the experimental - 38 million cells / day.

Обеспечение световой энергией является основным фактором, влияющим на синтез биомассы клетками микроводорослей. На примере различных видов морских и пресноводных микроводорослей было показано, что длительность фотопериода оказывает влияние на интенсивность фотосинтеза, продуктивность, скорость деления клеток, потребление углекислого газа. Практически всегда перечисленные показатели при различных светотемновых режимах были выше, чем при непрерывном режиме освещения [6].The provision of light energy is the main factor affecting the synthesis of biomass by microalgae cells. Using the example of various types of marine and freshwater microalgae, it was shown that the duration of the photoperiod affects the intensity of photosynthesis, productivity, cell division rate, and carbon dioxide consumption. Almost always, the listed indicators for various light and dark modes were higher than for continuous lighting [6].

В результате эксперимента выяснилось, что культура микроводоросли D. salina растет быстрее при фотопериодическом режиме освещения и медленнее - при постоянном освещении, причем разница в приросте к концу эксперимента достигла 4,5 раза (табл.2). Предположительно, это обусловлено возрастанием концентрации углерода в опытном образце в течение темнового периода за счет темнового дыхания клеток.As a result of the experiment, it was found that the culture of D. salina microalgae grows faster under photoperiodic lighting conditions and slower under constant illumination, and the difference in growth by the end of the experiment reached 4.5 times (Table 2). Presumably, this is due to an increase in the concentration of carbon in the test sample during the dark period due to the dark respiration of the cells.

Таблица 2
Рост микроводорослей D. salina при различном освещении. (результат показан на 10-е сутки)table 2
The growth of D. salina microalgae under different lighting conditions. (the result is shown on the 10th day) № п/пNo. p / p ОбразецSample Концентрация клеток D. salina в конце эксперимента (млн кл./мл)The concentration of D. salina cells at the end of the experiment (million cells / ml) 1one КонтрольныйControl 0,63±0,0210.63 ± 0.021 22 ОпытныйExperienced 2,840±0,142.840 ± 0.14

Культивирование D. salina в фотопериодическом режиме позволяет в течение длительного времени поддерживать культуру в фазе активного роста и оптимальной концентрации.Cultivation of D. salina in photoperiodic mode allows for a long time to maintain the culture in the phase of active growth and optimal concentration.

Динамика прироста в эксперименте с культурой С.muelleri, выращенной в течение 10 дней при различном световом обеспечении: при круглосуточном освещении в 30000 люкс и при фотопериодическом освещении с продолжительностью светового периода 18 часов при освещенности 30000 люкс, показала результаты, аналогичные с полученными при культивировании D. salina, отраженными на фиг. 8.The growth dynamics in an experiment with a C. muelleri culture grown for 10 days under different lighting conditions: with round-the-clock illumination of 30,000 lux and photoperiodic illumination with a light period of 18 hours under illumination of 30,000 lux, showed results similar to those obtained with cultivation D salina reflected in FIG. 8.

Экспериментальные исследования выполнены заявителем на мини-заводе Научно-производственного департамента марикультуры ФГБОУ ВПО «Дальрыбвтуз» в условиях бухты Северной Славянского залива Японского моря, где первый этап длится от 9 до 10 месяцев в зависимости от климатических условий (август/сентябрь-май), а второй этап длится 2-3 месяца (июнь-июль/август), включает начало преднерестового периода трепанга, период кормления и до окончания кормления личинок трепанга, т.е. до оседания.Experimental studies were carried out by the applicant at the mini-factory of the Scientific and Production Department of Mariculture of FSBEI HPE Dalrybvtuz in the conditions of the bay of the Northern Slavic Bay of the Sea of Japan, where the first stage lasts from 9 to 10 months depending on climatic conditions (August / September-May), and the second stage lasts 2-3 months (June-July / August), includes the beginning of the pre-spawning period of trepang, the feeding period and until the end of feeding of trepang larvae, i.e. before settling.

Культивирование на ПЕРВОМ ЭТАПЕ.Cultivation on the FIRST STAGE.

Для культивирования микроводорослей на первом этапе используют модифицированную заявителем приготовленную на основе природной морской воды соленостью 31% питательную среду Уолна следующего состава, согласно таблице 3. В таблице для информации указан состав стандартной среды Уолна.For the cultivation of microalgae at the first stage, the applicant’s modified medium based on natural sea water with a salinity of 31% salinity of the following composition is used, prepared according to table 3. The table for information indicates the composition of the standard Waln medium.

Как видно из таблицы в модификации исключены витамины, поскольку в результате исследований установлено, что их влияние на рост и развитие культур настолько незначительное, что их наличием можно пренебречь, в связи с трудоемкостью создания рабочей питательной среды.As can be seen from the table, vitamins are excluded from the modification, since studies have shown that their influence on the growth and development of crops is so insignificant that their presence can be neglected, due to the complexity of creating a working nutrient medium.

Пересев микроводорослей осуществляют только на свежеприготовленную среду. Поскольку пересадку проводят часто, то для упрощения процесса приготовления модифицированной среды Уолна готовят концентрированные растворы макро- и микроэлементов на основе дистиллированной воды с рН 7,2.Reseeding of microalgae is carried out only on freshly prepared medium. Since transplants are often performed, concentrated solutions of macro- and microelements based on distilled water with a pH of 7.2 are prepared to simplify the process of preparing the modified Walnn medium.

Срок хранения этих растворов ограничен шестью месяцами. Затем готовят свежие.The shelf life of these solutions is limited to six months. Then cook fresh.

Для получения свежей среды готовые концентрированные растворы макро- и микроэлементов с рН 7,2 растворы добавляют по 1 мл на 1 л фильтрованной стерилизованной морской воды.To obtain a fresh medium, ready-made concentrated solutions of macro- and microelements with a pH of 7.2 solutions are added 1 ml per 1 liter of filtered sterilized sea water.

В качестве исходного материала для культивирования используются лабораторные альгологически чистые культуры D. salina и С.muelleri из коллекции Научно-производственного департамента марикультуры Дальрыбвтуза.Laboratory algologically pure cultures of D. salina and C. muelleri from the collection of the Scientific and Production Department of Mariculture of Dalrybvtuz are used as starting material for cultivation.

Этот этап (первый) включает осенний, зимний и весенний климатические периоды.This stage (first) includes autumn, winter and spring climatic periods.

В начале первого этапа из маточной коллекции микроводорослей НПДМ ФГБОУ ВПО «Дальрыбвтуз» обычно отбираются по 2 л каждой культуры микроводорослей и пересеиваются на свежеприготовленную питательную среду в заранее простерилизованные 5-литровые колбы. Далее регулярно через каждые 15-20 дней производят отбор культур в стадии активного роста (определяется при подсчете клеток) и их пересев.At the beginning of the first stage, from the masterbatch of microalgae NPDM FSBEI HPE Dalrybvtuz, usually 2 l of each microalgae culture are selected and transferred to freshly prepared nutrient medium in pre-sterilized 5-liter flasks. Then, regularly every 15-20 days, cultures are selected in the stage of active growth (determined by cell counting) and reseeding.

Культивирование D. salina и С.muelleri происходит в монокультуре на приготовленной на основе природной морской воды модифицированной питательной среде Уолна следующего состава, мг/л: ZnCl₂ - 0.21, CoCl₂·6H₂O - 0.3, (NН₄)₆Мо₇O₂₄·4H₂O - 0.14, CuSO₄·5H₂O - 0.2, FeCl₃·6H₂O - 1.3, MnCl₂·4H₂O - 0.36, Н₃ВО₃ - 33.6, EDTA (C₁₀H₁₄N₂O₈Na₂·2H₂O) - 45.0, NaH₂PO₄·2H₂O - 30.0, NaNO₃ - 100.0, Na₂SiO₃ - 5.0. Не допускается смешивание между собой D. salina и С.muelleri, а также их бактериальное заражение. Если подобное произошло, следует уничтожить испорченную культуру во избежание последующего заражения. Для дополнительных гарантий от заражения всех имеющихся микроводорослей D. salina и С.muelleri на данном этапе культивирование производится в стеклянных плоскодонных термостойких колбах объемом 5 л. Колбы с D. salina и С.muelleri размещаются на удалении от друг друга, в пределах одного помещения на специальных стеллажах со стеклянными полками. На все колбы равномерно попадает естественный солнечный свет, однако от прямых солнечный лучей, губительных для микроводорослей, культуры защищены шторами из плотного белого материала. В течение периода с 9 до 17 часов ежедневно осуществляется дополнительно освещение микроводорослей искусственными источниками света. Для этого используются люминесцентные лампы. Культуру микроводорослей регулярно перемешивают, взбалтывая, в течение всего светового дня (каждые 4 часа). Температуру поддерживают на уровне 22°С, соленость - 31%.The cultivation of D. salina and C. muelleri takes place in a monoculture on the modified nutrient medium of Walne prepared on the basis of natural sea water, with the following composition, mg / L: ZnCl ₂ - 0.21, CoCl ₂ · 6H ₂ O - 0.3, (NH ₄ ) ₆ Mo ₇ O ₂₄ · 4H ₂ O - 0.14, CuSO ₄ · 5H ₂ O - 0.2, FeCl ₃ · 6H ₂ O - 1.3, MnCl ₂ · 4H ₂ O - 0.36, H ₃ BO ₃ - 33.6, EDTA (C ₁₀ H ₁₄ N ₂ O ₈ Na ₂ · 2H ₂ O) - 45.0, NaH ₂ PO ₄ · 2H ₂ O - 30.0, NaNO ₃ - 100.0, Na ₂ SiO ₃ - 5.0. Mixing between themselves D. salina and C. muelleri, as well as their bacterial infection, is not allowed. If this happens, you should destroy the damaged culture in order to avoid subsequent infection. For additional guarantees against infection of all available microalgae D. salina and C. muelleri at this stage, the cultivation is carried out in glass flat-bottomed heat-resistant flasks with a volume of 5 l. Flasks with D. salina and C. muelleri are placed at a distance from each other, within the same room on special shelving with glass shelves. All flasks evenly receive natural sunlight, however, from direct sunlight, harmful to microalgae, cultures are protected by curtains made of dense white material. During the period from 9 to 17 hours, additional illumination of microalgae by artificial light sources is carried out daily. For this, fluorescent lamps are used. The microalgae culture is regularly mixed, shaking, throughout the daylight hours (every 4 hours). The temperature is maintained at 22 ° C, salinity - 31%.

Культуру D. salina и С.muelleri периодически пересеивают на свежеприготовленную модифицированную питательную среду Уолна. Пересев для D. salina желательно проводить раз в 15-20 дней, для С.muelleri - раз в 10-15 дней. Прирост биомассы водорослей определяют по увеличению числа клеток, которое определяют ежедневно, просчитывая клетки в каждой колбе в 2 камерах Горяева под световым микроскопом. Образцы для подсчета клеток отбирают после тщательного перемешивания в одно и то же время суток через 3-4 ч после окончания темнового периода и фиксируют этиловым спиртом.The culture of D. salina and C. muelleri is periodically plated on freshly prepared modified Waln medium. Reseeding for D. salina is preferably carried out once every 15-20 days, for C. muelleri - once every 10-15 days. The growth of algae biomass is determined by the increase in the number of cells, which is determined daily, counting the cells in each flask in 2 Goryaev's cameras under a light microscope. Samples for cell counting are taken after thorough mixing at the same time of the day 3-4 hours after the end of the dark period and fixed with ethyl alcohol.

Также непосредственно перед пересевом определяют количество и качество водорослей при помощи микроскопа. При пересеве в стерилизованную колбу помещают свежеприготовленную питательную среду в объеме 3 л культуру D. salina или С.muelleri в требуемом объеме (в зависимости от концентрации клеток в исходной культуре) (обычно 1 л). После пересева колбы закрываются стерилизованной фильтровальной бумагой.Also, immediately before reseeding, the quantity and quality of algae are determined using a microscope. When reseeding, a freshly prepared culture medium in a volume of 3 l of D. salina or C. muelleri culture in the required volume (depending on the concentration of cells in the initial culture) is placed in a sterilized flask (usually 1 l). After reseeding, the flasks are closed with sterilized filter paper.

В течение зимнего периода этапа для С.muelleri пересев требуется выполнять каждые 20-25 дней, поскольку темп роста этих микроводорослей замедляется.During the winter period of the stage for C. muelleri, reseeding is required to be performed every 20-25 days, since the growth rate of these microalgae slows down.

К концу первого этапа в результате работы по отбору культур и наращивания их объема получается запланированное ранее количество D. salina и С. muelleri, необходимое для получения достаточного количества корма в зависимости от мощности завода по культивированию дальневосточного трепанга.By the end of the first stage, as a result of the selection of crops and increasing their volume, the previously planned amount of D. salina and C. muelleri is obtained, which is necessary to obtain a sufficient amount of feed, depending on the capacity of the plant for cultivating Far Eastern trepang.

Культивирование на ВТОРОМ ЭТАПЕ.Cultivation on the SECOND STAGE.

На данном этапе микроводоросли используют непосредственно для кормления личинок дальневосточного трепанга: их необходимо обеспечить кормом ежедневно в объеме 3 л каждого вида водорослей на 1000 л морской воды, содержащей личинки трепанга с плотностью посадки 1 экз./мл. Для культивирования микроводорослей на втором этапе используют приготовленную на основе природной морской воды соленостью 31% среду Гольдберга следующего состава, мг/л: NaNO₃ - 50.0, КН₂РO₄ - 5.0, (FeC₆H₅O₇·NH₄OH) - 0.5, CON₂H₄ - 9.0 [1], поскольку модифицированную среда Уолна не подходит для кормления личинок, поскольку она вызывает гибель личинок (на 3 день кормления 70% погибли, 10% - с уродствами). На данной среде микроводоросли выращиваются в течение 4-6 дней. Далее выращивать микроводоросли не следует, поскольку они переходят в фазу замедленного роста и становятся непригодны как для кормления трепанга, так и для дальнейшего культивирования. Также возникает возможность массового развития простейшими, в том числе бактериями, по причине замедленного роста и частичной гибели культуры.At this stage, microalgae are used directly for feeding the larvae of Far Eastern sea cucumber: they must be provided with feed daily in the amount of 3 l of each species of algae per 1000 l of sea water containing larvae of trepang with a planting density of 1 ind./ml For the cultivation of microalgae in the second stage, Goldberg medium of the following composition, prepared on the basis of natural seawater with a salinity of 31%, is used, mg / L: NaNO ₃ - 50.0, KH ₂ PO ₄ - 5.0, (FeC ₆ H ₅ O ₇ · NH ₄ OH) - 0.5, CON ₂ H ₄ - 9.0 [1], since the modified Walne medium is not suitable for feeding larvae, since it causes the death of larvae (on the 3rd day of feeding, 70% died, 10% with deformities). In this medium, microalgae are grown for 4-6 days. Further, microalgae should not be grown, since they pass into the phase of slow growth and become unsuitable for feeding trepang, as well as for further cultivation. There is also the possibility of mass development of protozoa, including bacteria, due to slow growth and partial death of the culture.

Для упрощения процесса готовят концентрированный раствор макроэлементов на основе дистиллированной воды. Для среды Гольдберга он имеет следующий состав:To simplify the process, a concentrated solution of macronutrients based on distilled water is prepared. For Goldberg's medium, it has the following composition:

КомпонентComponent Количество г на 1 лThe amount of g per 1 liter NaNO₃ NaNO ₃ 50,050,0 КН₂РO₄ KN ₂ PO ₄ 5,05,0 (FeC₆H₅O₇·NH₄OH)(FeC ₆ H ₅ O ₇ · NH ₄ OH) 0,50.5 CON₂H₄ CON ₂ H ₄ 9,09.0

рН среды доводят до 7,2 и разливают по 1000 мл в колбы емкостью 2000 мл. Среду стерилизуют 20 мин при температуре 80°С.The pH of the medium is adjusted to 7.2 and poured into 1000 ml into 2000 ml flasks. The medium is sterilized for 20 minutes at a temperature of 80 ° C.

Полученный раствор хранится в течение 5 дней. Затем следует приготовить новый. Для получения среды Гольдберга добавляют по 1 мл раствора элементов на 1 л фильтрованной стерилизованной морской воды соленостью 31%.The resulting solution is stored for 5 days. Then you should prepare a new one. To obtain the Goldberg medium, 1 ml of a solution of elements is added per 1 liter of filtered sterilized sea water with a salinity of 31%.

Культивирование D. salina и С.muelleri также происходит в монокультуре. Емкости с D. salina и С.muelleri размещаются в разных помещениях на специальных стеллажах. На все емкости равномерно попадает естественный солнечный свет, однако от прямых солнечный лучей, губительных для микроводорослей, культуры защищены тканью из белого хлопчатобумажного полотна.Cultivation of D. salina and C. muelleri also occurs in monoculture. Tanks with D. salina and C. muelleri are placed in different rooms on special racks. Natural sunlight is evenly distributed across all containers, however, crops are protected from white direct sunlight, harmful to microalgae, with a white cotton cloth.

Световой день для культур установлен в 18 часов при помощи искусственных источников света (люминесцентных ламп).The daylight for crops is set at 18 hours using artificial light sources (fluorescent lamps).

Культуру микроводорослей также регулярно перемешивают, взбалтывая, в течение всего светового дня (каждые 3 часа).The microalgae culture is also regularly mixed, shaking, throughout the daylight hours (every 3 hours).

Температуру поддерживают на уровне 22°С, соленость - 31%.The temperature is maintained at 22 ° C, salinity - 31%.

Культуру D. salina и С.muelleri пересеивают со среды Уолна на свежую приготовленную на основе природной морской воды соленостью 31% питательную среду Гольдберга каждые 4 дня. На 5-7 день выращивания микроводоросли идут на корм личинок трепанга, при более длительном культивировании они утилизируются, поскольку непригодны для использования в виде корма.The culture of D. salina and C. muelleri is transplanted from Walne’s medium to fresh Goldberg culture medium prepared with natural saline with a salinity of 31% every 4 days. On the 5-7th day of cultivation, microalgae go to feed the larvae of trepang, with longer cultivation they are disposed of, since they are unsuitable for use in the form of feed.

Перед пересевом определяют количество и качество водорослей при помощи микроскопа. После пересева емкости закрываются стерилизованной фильтровальной бумагой. Через 4-6 дней микроводоросли из бутылей идут на корм личинок трепанга, а в колбах вновь подвергаются пересеву на свежие питательные среды в колбы и бутыли. Данный процесс завершается после оседания личинок.Before reseeding, determine the quantity and quality of algae using a microscope. After reseeding, the containers are closed with sterilized filter paper. After 4-6 days, microalgae from the bottles go to feed the larvae of trepang, and in the flasks they are again reseeded on fresh nutrient media in flasks and bottles. This process ends after settling of the larvae.

Пример 1. (подготовка живого корма для личинок трепанга из культивированной микроводоросли Dunaliella salina).Example 1. (preparation of live food for trepang larvae from cultured microalgae Dunaliella salina).

На первом, иначе подготовительном, этапе в сентябре (осенний период) для культивирования D. salina отобрали природную морскую воду с соленостью 31%, затем очистили ее и простерилизовали. Затем на основе этой воды приготовили модифицированную питательную среду Уолна следующего состава (мг/л): ZnCl₂ - 0.21, CoCl₂·6H₂O - 0.3, (NН₄)₆Мо₇O₂₄·4H₂O - 0.14, CuSO₄·5H₂O - 0.2, FeCl₃·6H₂O - 1.3, MnCl₂·4H₂O - 0.36, Н₃ВО₃ - 33.6, EDTA (C₁₀H₁₄N₂O₈Na₂·2H₂O) - 45.0, NaH₂PO₄·2H₂O - 30.0, NaNO₃ - 100.0, Na₂SiO₃ - 5.0, со значением рН, равным 7,2. После питательную среду разлили в 5-литровые заранее стерилизованные термостойкие колбы по 3 л в каждую. На следующее утро в эту питательную среду ввели инокулят D. salina из маточной коллекции микроводорослей НПДМ ФГБОУ ВПО «Дальрыбвтуз» в количестве по 1 л до достижения концентрации клеток 200-250 тыс кл./мл (погрешность в 50 тыс кл./мл допускается). После колбы тщательно перемешали, горлышко колбы накрыли стерилизованной фильтровальной бумагой и поставили на стеклянную полку стеллажа в помещении с культурой D. salina. Культура D. salina выращивалась при фотопериодичности 18 часов света с освещенностью 30000 люкс и 6 часов темноты, при периодическом перемешивании (каждые 3 часа в течение световой фазы фотопериода). По истечении 15 суток численность клеток D. salina в суспензии составила 2-2,5 млн кл./мл. Далее пересадку D. salina проводят каждые 15-20 дней в зависимости скорости роста культуры. Пересадка производится по достижении плотности культуры 2-2,5 млн кл./мл. В случае пересадки культуры при меньшей концентрации рост культуры замедляется, при этом в питательной среде освобождается ниша для развития других организмов - возможно заражение культуры. При более высокой плотности культура постепенно переходит на стадию отмирания - часть клеток погибает, возникают процессы гниения. В обоих случаях культура непригодна для дальнейшего выращивания.At the first, otherwise preparatory, stage in September (autumn period), natural seawater with a salinity of 31% was taken for D. salina cultivation, then it was purified and sterilized. Then, based on this water, a modified Walne nutrient medium was prepared with the following composition (mg / L): ZnCl ₂ - 0.21, CoCl ₂ · 6H ₂ O — 0.3, (NH ₄ ) ₆ Mo ₇ O ₂₄ · 4H ₂ O — 0.14, CuSO ₄ · 5H ₂ O - 0.2, FeCl ₃ · 6H ₂ O - 1.3, MnCl ₂ · 4H ₂ O - 0.36, H ₃ BO ₃ - 33.6, EDTA (C ₁₀ H ₁₄ N ₂ O ₈ Na ₂ · 2H ₂ O) - 45.0, NaH ₂ PO ₄ · 2H ₂ O - 30.0, NaNO ₃ - 100.0, Na ₂ SiO ₃ - 5.0, with a pH value of 7.2. After the nutrient medium was poured into 5-liter pre-sterilized heat-resistant flasks of 3 l each. The next morning, D. salina inoculum was introduced into this nutrient medium from the masterbatch of microalgae NPDM FSBEI HPE Dalrybvtuz in an amount of 1 liter each until a cell concentration of 200-250 thousand cells / ml was reached (an error of 50 thousand cells / ml is allowed) . After the flask was thoroughly mixed, the neck of the flask was covered with sterilized filter paper and put on the glass shelf of the rack in the D. salina culture room. The D. salina culture was grown at a photoperiod of 18 hours of light with an illumination of 30,000 lux and 6 hours of darkness, with periodic stirring (every 3 hours during the light phase of the photoperiod). After 15 days, the number of D. salina cells in suspension was 2-2.5 million cells / ml. Then D. salina transplantation is carried out every 15-20 days depending on the growth rate of the culture. Transplantation is performed upon reaching a culture density of 2-2.5 million cells / ml. In the case of a culture transplant at a lower concentration, the growth of the culture slows down, while a niche for the development of other organisms is freed up in the nutrient medium - infection of the culture is possible. At a higher density, the culture gradually proceeds to the stage of dying off - part of the cells die, rotting processes occur. In both cases, the culture is unsuitable for further cultivation.

За неделю до нереста (начало июня) трепанга начинается второй, иначе кормовой, этап культивирования D. salina. Выращенные на этом этапе микроводоросли являются непосредственным живым кормом для личинок трепанга.A week before spawning (early June), trepang begins the second, otherwise fodder, stage of D. salina cultivation. Microalgae grown at this stage are the direct live food for trepang larvae.

Подготавливаются емкости для выращивания кормовых микроводорослей - 20-литровые прозрачные полипропиленовые бутыли. Подготовка морской воды производится аналогично первому этапу. На основе обработанной воды готовят питательную среду Гольдберга следующего состава, мг/л: NaNO₃ - 50.0, КН₂РO₄ - 5.0, (FeC₆H₅O₇·NH₄OH) - 0.5, CON₂H₄ - 9.0.Preparing containers for growing fodder microalgae - 20-liter transparent polypropylene bottles. The preparation of sea water is carried out similarly to the first stage. Based on the treated water, Goldberg's nutrient medium of the following composition is prepared, mg / L: NaNO ₃ - 50.0, KH ₂ PO ₄ - 5.0, (FeC ₆ H ₅ O ₇ · NH ₄ OH) - 0.5, CON ₂ H ₄ - 9.0.

Питательную среду разливают в бутыли по 12 л в каждый. На следующее утро в эту питательную среду вводят суспензию D. salina, ранее выращенную на первом этапе до плотности 2-2,5 млн кл./мл, в количестве по 4 л на бутыль до достижения концентрации клеток 200-250 тыс. кл./мл. После бутыли тщательно перемешивают, горлышко колбы накрывают стерилизованной фильтровальной бумагой и помещают на деревянную полку стеллажа в помещении с кормовой культурой D. salina. Культуру D. salina выращивают при фотопериодичности 18 часов света с освещенностью 30000 люкс и 6 часов темноты, при периодическом перемешивании (каждые 3 часа в течение световой фазы фотопериода). По истечении 4-6 суток (в зависимости от скорости роста) численность клеток в суспензии составляет 1-1,5 млн кл./мл. Полученная культура D. salina пригодна для кормления личинок трепанга и на 6-7 сутки должна быть полностью использована для кормления личинок дальневосточного трепанга.The nutrient medium is poured into bottles of 12 liters each. The next morning, D. salina suspension, previously grown in the first stage to a density of 2-2.5 million cells / ml, in an amount of 4 liters per bottle until a cell concentration of 200-250 thousand cells / is introduced, is introduced into this nutrient medium ml After the bottle is thoroughly mixed, the neck of the flask is covered with sterilized filter paper and placed on a wooden shelf of the rack in the room with D. salina fodder culture. The D. salina culture is grown at a photoperiod of 18 hours of light with an illumination of 30,000 lux and 6 hours of darkness, with periodic stirring (every 3 hours during the light phase of the photoperiod). After 4-6 days (depending on the growth rate), the number of cells in suspension is 1-1.5 million cells / ml. The resulting culture of D. salina is suitable for feeding the larvae of sea cucumber and for 6-7 days should be fully used for feeding the larvae of the Far Eastern sea cucumber.

Пример 2. (подготовка живого корма для личинок трепанга из культивированной микроводоросли Chaetoceros muelleri)Example 2. (preparation of live food for trepang larvae from cultured microalgae Chaetoceros muelleri)

На первом этапе в сентябре (осенний период) С.muelleri культивируют аналогично D. salina на первом этапе, за исключением пересадки - она производится каждые 10-15 дней, а в зимний период (с декабря по февраль) - каждые 20-25 дней (в зависимости скорости роста культуры).At the first stage in September (autumn period) C. muelleri is cultivated similarly to D. salina at the first stage, with the exception of transplanting - it is performed every 10-15 days, and in the winter period (from December to February) - every 20-25 days ( depending on the growth rate of the culture).

На втором этапе (июнь-июль/начало августа) С.muelleri культивируют аналогично D. salina на втором этапе.In the second stage (June-July / beginning of August) C. muelleri is cultivated similarly to D. salina in the second stage.

Список цитированных литературных источниковList of references

1. Чжан Я Цин, Дин Цзюнь, Сун Цзянь, Ян Вэй Дэн. Трепанг и морской еж. Биология, исследование и разведение. - Далянь: Даляньский Рыбохозяйственный университет, 2001. - 202 с.1. Zhang I Qing, Ding Jun, Song Jian, Yang Wei Dan. Trepang and sea urchin. Biology, research and breeding. - Dalian: Dalian University of Fisheries, 2001. - 202 p.

2. Паньков С.Л., Панькова С.Л., Герадзе К.Н. Опыт массового культивирования микроводорослей в условиях марихозяйства // Живые корма для объектов марикультуры. - М., 1988. - С. 26-33.2. Pankov S.L., Pankova S.L., Geradze K.N. The experience of mass cultivation of microalgae in the conditions of mariculture // Live feed for objects of mariculture. - M., 1988 .-- S. 26-33.

3. Хребтова Е.В. Влияние микроводорослей на рост и развитие личинок черноморской устрицы // Живые корма для объектов марикультуры. - М., 1988. - С. 15-26.3. Khrebtova E.V. The influence of microalgae on the growth and development of larvae of the Black Sea oyster // Live feed for objects of mariculture. - M., 1988 .-- S. 15-26.

4. Методика получения и выращивания молоди дальневосточного трепанга в искусственных условиях. - Владивосток: Дальрыбвтуз, 2011. - 13 с.4. The method of obtaining and growing juvenile Far Eastern sea cucumber in artificial conditions. - Vladivostok: Dalrybvtuz, 2011 .-- 13 p.

5. Walne, P.R. 1970. Studies on the food value of nineteen genera of algae to juvenile bivalves of the genera Ostrea, Crassostrea, Mercenaria. and Mvtilus. Fishery Investigations, London Series 2 26(5):1-62.5. Walne, P.R. 1970. Studies on the food value of nineteen genera of algae to juvenile bivalves of the genera Ostrea, Crassostrea, Mercenaria. and Mvtilus. Fishery Investigations, London Series 2 26 (5): 1-62.

6. Авсиян А.Л., Лелеков A.C. Влияние светового режима на продуктивность культуры Spirulina platensis / Pontus Euxinus 2011: Тез. VII междунар. науч.-практ. конф. по проблемам водных экосистем, посвящ. 140-летию ИнБЮМ НАНУ. - Севастополь, 2011. - С. 16-17.6. Avsiyan A.L., Lelekov A.C. The influence of light regime on the productivity of the culture of Spirulina platensis / Pontus Euxinus 2011: Abstract. VII int. scientific-practical conf. on the problems of aquatic ecosystems, dedicated. 140th anniversary of InByU NASU. - Sevastopol, 2011 .-- S. 16-17.

Claims

A method of preparing feed from microalgae for larvae of the Far Eastern trepang, comprising cultivating algologically pure monocultures of microalgae on a nutrient medium prepared from natural salt water, characterized in that single-celled algae Dunaliella salina and Chaetoceros muelleri are used as microalgae, which are cultivated in two stages all year round : at the first preparatory stage, the algae biomass is increased and the most viable monocultures that are inoculated separately are selected translucent culture vessel based on the prepared natural seawater salinity of 31% modified Walney medium, mg / L with the following composition:
ZnCl ₂ 0.21 CoCl ₂ · 6H ₂ O 0.3 (NH ₄ ) ₆ Mo ₇ O ₂₄ · 4H ₂ O 0.14 CuSO ₄ · 5H ₂ O 0.2 FeCl ₃ · 6H ₂ O 1.3 MnCl ₂ · 4H ₂ O 0.36 H ₃ BO ₃ 33.6 EDTA (C ₁₀ H ₁₄ N ₂ O ₈ Na ₂ · 2H ₂ O) 45.0 NaH ₂ PO ₄ · 2H ₂ O 30,0 NaNO ₃ 100.0 Na ₂ SiO ₃ 5,0

and cultivated at a temperature of 22 ° C, a pH of 7.2 at a photoperiod of 18 hours of light with an illumination of 30,000 lux and 6 hours of darkness, in translucent containers with periodic stirring to a density of 2-2.5 million cells / ml, followed by transfers to fresh Wednesday of the same composition, with the transplantation of Dunaliella salina carried out every 15-20 days during the entire preparatory stage, and Chaetoceros muelleri - every 10-15 days, and only in the winter period of this stage the transplantation is carried out every 20-25 days; at the second feed stage, 7 days before the trepang spawning and throughout the entire feeding period of the trepang larvae, every 4 days the obtained biomass of monocultures is portionwise conditioned by growing 31% Goldberg nutrient medium prepared on the basis of natural sea water at a temperature of 22 ° C, pH 7.2 medium and photoperiods of 18 hours of light with illumination of 30,000 lux and 6 hours of darkness, in translucent culture containers with periodic stirring for 4-6 days to a density of 1.0-1.5 million cells / ml.