RU2565549C2

RU2565549C2 - Biopreparation for bioremediation of oil-contaminated soils for climatic conditions of far north

Info

Publication number: RU2565549C2
Application number: RU2013155969/10A
Authority: RU
Inventors: Лариса Анатольевна Ерофеевская; Юлия Станиславовна Глязнецова
Original assignee: Общество с ограниченной ответственностью "Транснефть-Восток" (ООО "Транснефть-Восток"); Открытое акционерное общество "Акционерная компания по транспорту нефти "Транснефть" (ОАО "АК "Транснефть")
Priority date: 2013-12-17
Filing date: 2013-12-17
Publication date: 2015-10-20
Also published as: RU2013155969A

Abstract

FIELD: biotechnology.

SUBSTANCE: biopreparation is proposed for the bioremediation of oil-contaminated soils for the climatic conditions of the Far North. The biopreparation comprises a solid substrate-carrier and a consortium of hydrocarbon-oxidizing microorganisms immobilized on its surface, comprising strains of Bacillus vallismoris RNCIM B-11017, Exguobacterium mexicanum RNCIM B-11011, Serratia plymuthica VKM B-2819D, Rhodococcus sp. VKM Ac-2626D, and the mineral nutrient substrate for bacteria.

EFFECT: high degree of purification of soil and ground of oil and petroleum products under conditions of cold climate of the Far North in a short period of time.

4 cl, 9 tbl, 3 ex

Description

Изобретение относится к микробиологической очистке мерзлотных почв от нефтяных загрязнений.The invention relates to microbiological cleaning of permafrost soils from oil pollution.

Проблема очистки почв от загрязнений нефтью является важной задачей защиты окружающей среды, поскольку процесс самовосстановления нефтезагрязненных почв является очень длительным и может продолжаться более 25 лет, а в районах Крайнего Севера до 50 и более лет.The problem of cleaning soils from oil pollution is an important task of protecting the environment, since the process of self-healing of oil-contaminated soils is very long and can last more than 25 years, and in the Far North up to 50 years or more.

Трудности реабилитации нарушенных экосистем в условиях вечной мерзлоты связаны с крайне низкой способностью почв к самоочищению.Difficulties in the rehabilitation of disturbed ecosystems in permafrost are associated with the extremely low ability of soils to self-clean.

Низкие температуры, застойное увлажнение, присутствие близко залегающей многолетней мерзлоты, слабое преобразование органической и минеральной частей, недостаток питательных веществ, короткий вегетационный период, низкая активность микробных популяций - все это отражается на морфологии и свойствах северных почв и сдерживает процессы естественного восстановления окружающей среды, загрязненной нефтяными углеводородами (УВ).Low temperatures, stagnant humidification, the presence of closely occurring permafrost, poor conversion of organic and mineral parts, lack of nutrients, short growing season, low activity of microbial populations - all this affects the morphology and properties of northern soils and inhibits the processes of natural restoration of the environment polluted petroleum hydrocarbons (HC).

Интенсификация биодеградации углеводородов нефти в мерзлотных почвах может быть достигнута за счет внесения в загрязненную почву биопрепаратов, содержащих углеводородокисляющие микроорганизмы (УОМ).The intensification of biodegradation of oil hydrocarbons in permafrost soils can be achieved by introducing biological products containing hydrocarbon-oxidizing microorganisms (UOM) into contaminated soil.

Известен биопрепарат «Путидойл» (Дядечко, Толстокорова, Морозова. Патент SU 1076446, 1984), предназначенный для биологической очистке воды от нефти и нефтепродуктов. Его недостатком является сложная технология приготовления препарата, которая предусматривает распылительную сушку живой культуры бактерий, что вызывает травмирование бактерий и, как следствие, их гибель или потерю необходимой активности вследствие инактивации клеток под действием высоких температур (+60°C). Для восстановления жизнедеятельности бактерий авторы применяют сложный комплекс мер: подогрев большого количества воды (5 м³) от +18 до +28°C, перемешивание, аэрирование, и все это в течение длительного времени (16-24 ч), что в полевых условиях выполнить довольно сложно. Малоэффективность препарата «Путидойл» в естественных условиях подтверждена в публикациях (Новиков, Комзолова, 1992).Known biological product "Putidul" (Uncle, Tolstokorova, Morozov. Patent SU 1076446, 1984), intended for the biological treatment of water from oil and oil products. Its disadvantage is the complicated technology of preparation of the drug, which provides for spray drying of a live culture of bacteria, which causes injury to bacteria and, as a result, their death or loss of necessary activity due to inactivation of cells under the influence of high temperatures (+ 60 ° C). To restore bacterial activity, the authors apply a complex set of measures: heating a large amount of water (5 m ³ ) from +18 to + 28 ° C, mixing, aeration, and all this for a long time (16-24 hours), which is in the field It’s quite difficult to complete. The inefficiency of the drug "Putidul" in vivo has been confirmed in publications (Novikov, Komzolova, 1992).

Известен способ очистки почв от загрязнений нефтью и нефтепродуктами, в котором в качестве биопрепарата используют консорциум нефтеокисляющих микроорганизмов Pseudomonas putida ПИ Ко-1, Pseudomonas fluorescens ПИ-896, Micrococcus sp. ПИ Ку-1, Burkholderia caryophylli Jap-3, Serratia odorifera Jap-1 при весовом соотношении 3-12 мас.% каждого микроорганизма, при этом совместно с суспензией биопрепарата в загрязненную среду вводят ризоторфин в количестве 30-120 г/м² (RU 2191643, В09С 1/10, 2001.07.09), где ризоторфин - землеудобрительный препарат азотфиксирующих микроорганизмов.A known method of cleaning soils from oil and oil products contaminants, in which a consortium of oil-oxidizing microorganisms Pseudomonas putida PI Ko-1, Pseudomonas fluorescens PI-896, Micrococcus sp. PI Ku-1, Burkholderia caryophylli Jap-3, Serratia odorifera Jap-1 at a weight ratio of 3-12 wt.% Each microorganism, while together with a suspension of a biological product, risotorfin is introduced in an amount of 30-120 g / m ² (RU 2191643, B09C 1/10, 2001.07.09), where risotorfin is a fertilizer of nitrogen-fixing microorganisms.

Недостатком является то, что при приготовлении рабочей суспензии микроорганизмов температура поддерживается на уровне +18…+22°C, т.е. микроорганизмы, входящие в состав консорциума, не способны к деградации нефтепродуктов при пониженных положительных температурах (+4…+8°C).The disadvantage is that when preparing a working suspension of microorganisms, the temperature is maintained at + 18 ... + 22 ° C, i.e. microorganisms that make up the consortium are not capable of degradation of oil products at low positive temperatures (+ 4 ... + 8 ° C).

Известен способ очистки почвы с использованием биопрепарата "Деворойл", содержащего консорциум углеводородокисляющих микроорганизмов Rhodococcus maris, Rhodococcus erythropolis, Pseudomonas stutzeri, Yarrowia lipolytica. Этот способ предусматривает при хранении суспензии микроорганизмов использование NaCl, биологически активных веществ (витамины) и осмопротекторов (бетаин) (RU 2114071, C02F 3/34, 1997.05.22). Недостатком является то, что несмотря на добавление к бактериальной суспензии защитных веществ численность микроорганизмов снижается независимо от температуры хранения.A known method of cleaning the soil using a biological product "Devoroil" containing a consortium of hydrocarbon-oxidizing microorganisms Rhodococcus maris, Rhodococcus erythropolis, Pseudomonas stutzeri, Yarrowia lipolytica. This method involves the storage of a suspension of microorganisms using NaCl, biologically active substances (vitamins) and osmoprotectors (betaine) (RU 2114071, C02F 3/34, 1997.05.22). The disadvantage is that despite the addition of protective substances to the bacterial suspension, the number of microorganisms decreases regardless of the storage temperature.

Известен бактериальный препарат, состоящий из высокоактивных живых аэробных нефтеокисляющих бактерий (Mycobacterium, Pseudomonas и др.), выращенных на твердых субстратах-носителях с титрами 2,5-7,0-109 кл./г. В качестве субстрата-носителя для иммобилизации микроорганизмов используют гамма-стерильный торф с pH 6,8-7,0 в количестве 40-45 мас.% и воду в количестве 58,95-53,25 мас.%. С целью поддержания нефтеокисляющей активности в процессе хранения в препарат дополнительно вводят питательные субстраты: аммоний щавелевокислый (0,05-1,0 мас.%) и нормальные парафины (1,0-1,5 мас.%). Срок годности биопрепарата - 6 месяцев при температуре +10…+15°C с момента его изготовления (RU 2053205, МПК C02F 3/34). Биопрепарат содержит нефтеокисляющие бактерии, для поддержания жизнедеятельности которых требуется pH среды 6.8-7.0 и большое количество воды (около 60% воды), что снижает его эффективность во времени.Known bacterial preparation consisting of highly active live aerobic oil-oxidizing bacteria (Mycobacterium, Pseudomonas, etc.) grown on solid carrier substrates with titers of 2.5-7.0-109 cells / g. As a carrier substrate for the immobilization of microorganisms, gamma-sterile peat with a pH of 6.8-7.0 in the amount of 40-45 wt.% And water in the amount of 58.95-53.25 wt.% Are used. In order to maintain oil-oxidizing activity during storage, nutrient substrates are additionally introduced into the preparation: ammonium oxalate (0.05-1.0 wt.%) And normal paraffins (1.0-1.5 wt.%). The shelf life of a biological product is 6 months at a temperature of + 10 ... + 15 ° C from the moment of its manufacture (RU 2053205, IPC C02F 3/34). The biological product contains oil-oxidizing bacteria, which require a pH of 6.8-7.0 and a large amount of water (about 60% water) to maintain their vital functions, which reduces its effectiveness over time.

Известен способ очистки почв и грунтов, загрязненных нефтью и нефтепродуктами, с использованием олеофильного биопрепарата на основе ассоциации нефтеокисляющих микроорганизмов - Rhodococcus erythropolis ИЭГМ 708 и Rhodococcus ruber ИЭГМ 327 и биосурфактанта-Rhodococcus, отличающийся тем, что производят первоначальную обработку сильнозагрязненной почвы/грунта до достижения уровня остаточных нефтепродуктов 5-10 вес.% и последующее добавление органического разрыхлителя, олеофильный биопрепарат вносят в количестве не менее 10 л на 0,5-1,0 м³ почвы/грунта по меньшей мере один раз в неделю в течение первого месяца и в дальнейшем по меньшей мере один раз в месяц до окончания цикла биоремедиации в сочетании с периодическим рыхлением и увлажнением и дополнительно производят фиторемедиацию - засев многолетними травами (RU 2193464, В09С 1/10, 2001.11.14). Однако вышеописанный способ предполагает использование твердожидкофазного биореактора и/или аэрируемых почвенных площадок в качестве первоначальной обработки сильнозагрязненной почвы. Такой метод снижения уровня загрязнения трудоемок и предполагает нарушение плодородного слоя почвы (гумусированной части почвенного профиля), что не применимо при авариях и разливах нефти и нефтепродуктов в условиях Крайнего Севера (в том числе в зоне тундры). Поскольку обязательным условием очистки и восстановления нефтезагрязненных мерзлотных почв является сохранение плодородного слоя почвы. Это объясняется тем, что на месте снятия почвенного покрова в мерзлотных условиях возможно образование термокарстовой оттайки с образованием воронок, провалов или аласов, что в свою очередь приводит к развитию термоэрозии и наносит большой ущерб ранимой и трудно восстанавливаемой почвенной экосистеме Крайнего Севера.A known method of cleaning soils and soils contaminated with oil and oil products using an oleophilic biological product based on the association of oil-oxidizing microorganisms - Rhodococcus erythropolis IEGM 708 and Rhodococcus ruber IEGM 327 and biosurfactant-Rhodococcus, characterized in that the soil is thoroughly cultivated to reach the initial level residual oil 5-10 wt.% and then adding an organic disintegrant oleophilic biological product is introduced into an amount of not less than 10 liters of 0.5-1.0 m ³ of soil / ground at least about once a week during the first month and thereafter at least once a month until the end of the bioremediation cycle in combination with periodic loosening and moistening and additionally produce phytoremediation - sowing with perennial herbs (RU 2193464, B09C 1/10, 2001.11.14) . However, the above method involves the use of solid-liquid bioreactor and / or aerated soil sites as the initial treatment of highly contaminated soil. This method of reducing the level of pollution is time-consuming and involves disruption of the fertile soil layer (humus part of the soil profile), which is not applicable for accidents and oil spills in the Far North (including in the tundra zone). Since a prerequisite for cleaning and restoring oil-contaminated permafrost soils is the preservation of the fertile soil layer. This is explained by the fact that at the place of removing the soil cover under permafrost conditions, the formation of thermokarst defrost with the formation of funnels, dips or alas is possible, which in turn leads to the development of thermoerosion and causes great damage to the vulnerable and difficult to restore soil ecosystem of the Far North.

Наиболее близким к предлагаемому техническому решению является «Способ очистки мерзлотных почв от нефти спорообразующими бактериями Bacillus subtilis» (RU 2446900, В09С 1/10 дата публикации 10.04.2012), согласно которому для очистки почвы от нефтяных загрязнений вносят микробный препарат на основе суспензии штамма бактерий Bacillus subtilis «Колыма-7/2к». Применение такого микробного препарата позволяет за 3 месяца летнего периода снизить концентрацию нефти до 0,48%.Closest to the proposed technical solution is the "Method of cleaning permafrost soils from oil with spore-forming bacteria Bacillus subtilis" (RU 2446900, B09C 1/10 publication date 04/10/2012), according to which a microbial preparation based on a suspension of a strain of bacteria is added to clean the soil from oil pollution Bacillus subtilis "Kolyma-7 / 2k." The use of such a microbial preparation allows reducing the oil concentration to 0.48% over 3 months of the summer period.

Одним из недостатков этого способа является неспособность входящего в микробный препарат штамма деградировать нефть при температурах наружного воздуха от +4 до +30°C.One of the disadvantages of this method is the inability of the strain included in the microbial preparation to degrade oil at outdoor temperatures from +4 to + 30 ° C.

Другим недостатком данного способа является получение только жидкой формы препарата, что сокращает сроки хранения биопрепарата и не всегда удобно при транспортировке препарата для устранения аварийных разливов нефтепродуктов в труднодоступных местах (поросших растительностью, скалистых, овражистых и т.д.). Кроме того, в состав микробного препарата входит только один штамм бактерий Bacillus subtilis «Колыма-7/2к», выращенный на мясопептонном агаре при pH 7,0-7,2, в течение 5 суток при температуре +37°C. Как известно биопрепараты, состоящие из двух и более штаммов микроорганизмов, более эффективно утилизируют нефтезагрязнения. Следует также подчеркнуть, что в процессе окисления нефти штаммам, хотя и принадлежит ведущая роль, однако практическое использование микробной деградации нефти определяется составом биопрепарата, что определяет жизнеспособность бактерий, их количеством и технологией использования препаратов в практических целях.Another disadvantage of this method is to obtain only a liquid form of the drug, which reduces the shelf life of the biological product and is not always convenient when transporting the drug to eliminate emergency oil spills in hard-to-reach places (overgrown with vegetation, rocky, ravine, etc.). In addition, the composition of the microbial preparation includes only one strain of bacteria Bacillus subtilis "Kolyma-7 / 2k", grown on meat and peptone agar at pH 7.0-7.2, for 5 days at a temperature of + 37 ° C. As you know, biological products consisting of two or more strains of microorganisms more effectively utilize oil pollution. It should also be emphasized that, in the process of oil oxidation, strains, although they play a leading role, however, the practical use of microbial degradation of oil is determined by the composition of the biological product, which determines the viability of bacteria, their number and the technology for using drugs for practical purposes.

Задачей изобретения является повышение эффективности биоремедиации в условиях короткого северного лета, ускорение процессов деструкции нефтепродуктов и сокращение сроков подготовки почв к самовосстановлению.The objective of the invention is to increase the effectiveness of bioremediation in the conditions of a short northern summer, accelerate the processes of degradation of oil products and reduce the time for preparing soil for self-healing.

Технический результат заключается в снижении уровня нефтезагрязнения в различных типах мерзлотных почв на 87-88% за 60 суток.The technical result consists in reducing the level of oil pollution in various types of permafrost soils by 87-88% in 60 days.

Задача выполняется, а технический результат достигается созданием биопрепарата для биоремедиации нефтезагрязненных почв для климатических условий Крайнего Севера.The task is carried out, and the technical result is achieved by creating a biological product for bioremediation of oil-contaminated soils for climatic conditions of the Far North.

Совокупность существенных признаков, обеспечивающих получение технического результата, приведена ниже.The set of essential features that provide a technical result is shown below.

Биопрепарат для биоремедиации нефтезагрязненных почв для климатических условий Крайнего Севера содержит твердый субстрат-носитель, иммобилизованный на его поверхность консорциум углеводородокисляющих микроорганизмов, выступающих в качестве биодеструкторов, и минеральный питательный субстрат для микроорганизмов.The biological product for bioremediation of oil-contaminated soils for the climatic conditions of the Far North contains a solid carrier substrate immobilized on its surface by a consortium of hydrocarbon-oxidizing microorganisms acting as biodestructors, and a mineral nutrient substrate for microorganisms.

Биопрепарат в качестве нефтедеструкторов содержит в равных соотношениях (1:1:1:1) консорциум углеводородокисляющих микроорганизмов в концентрации не менее 1×10⁹ кл./см³, выделенных из мерзлотных почв и грунтов, загрязненных нефтью и нефтепродуктами, и включает:The biological product as oil destructors contains in equal proportions (1: 1: 1: 1) a consortium of hydrocarbon-oxidizing microorganisms in a concentration of at least 1 × 10 ⁹ cells / cm ³ isolated from permafrost soils and soils contaminated with oil and oil products, and includes:

- Bacillus vallismortis ELA-4 ВКГТМ B-11017- Bacillus vallismortis ELA-4 VKGTM B-11017

- Exiguobacterium mexicanum ELA-5 ВКПМ B-11011- Exiguobacterium mexicanum ELA-5 VKPM B-11011

- Serratia plymuthica ELA-9 VKM B-2819D- Serratia plymuthica ELA-9 VKM B-2819D

- Rhodococcus sp. LER-12 BKM Ac-2626D.- Rhodococcus sp. LER-12 BKM Ac-2626D.

Биопрепарат в качестве твердого субстрата-носителя содержит измельченный мелкозернистый минерал клиноптилолит-гейландитового ряда (цеолитизированный туф) фракцией 1-3 мм с содержанием цеолита 60…95% и с химическим составом SiO₂ 65,01-70,45%; TiO₂ 0,16-0,18%; Al₂O₃ 10,99-12,00%; Fe₂O₃ 0,70-0,99%; MnO 0-0,02%; MgO 0,77-3,76%; СаО 0,52-3,73%; SrO 0,14-0,24%; Na₂O 0,44-3,87%; K₂O 0,9-11,63%; H₂O 12,96-11,34%; P₂O₅ 0,01-0,21%.The biological product as a solid carrier substrate contains crushed fine-grained mineral of clinoptilolite-heilandite series (zeolitized tuff) with a fraction of 1-3 mm with a zeolite content of 60 ... 95% and with a chemical composition of SiO ₂ 65.01-70.45%; TiO ₂ 0.16-0.18%; Al ₂ O ₃ 10.99-12.00%; Fe ₂ O ₃ 0.70-0.99%; MnO 0-0.02%; MgO 0.77-3.76%; CaO 0.52-3.73%; SrO 0.14-0.24%; Na ₂ O 0.44-3.87%; K ₂ O 0.9-11.63%; H ₂ O 12.96-11.34%; P ₂ O ₅ 0.01-0.21%.

Биопрепарат в качестве дополнительного минерального питательного субстрата для микроорганизмов содержит минеральные компоненты, в следующем соотношении (г), KNO₃ - 4,0; MgSO₄·7H₂O - 0,8; NaCl - 1,0; K₂ HPO₄ - 1,4; KH₂PO₄ - 0,6.The biological product as an additional mineral nutrient substrate for microorganisms contains mineral components, in the following ratio (g), KNO ₃ - 4.0; MgSO ₄ · 7H ₂ O — 0.8; NaCl - 1.0; K ₂ HPO ₄ - 1.4; KH ₂ PO ₄ - 0.6.

Природный цеолитизированный туф - каркасный аллюмосиликат, в структуре которого имеются сообщающиеся полости, занятые крупными ионами различных элементов и молекулами воды, имеющими значительную свободу движения, благодаря чему происходят ионный обмен и обратимая дегидратация. Кристаллическая решетка цеолитизированных туфов сформирована тетраидами с хорошо развитой внутренней поверхностью, что обеспечивает сорбционную способность минералу и хорошую адгезию микробным клеткам, позволяя закрепляться нефтедеструкторам не только на поверхности носителя, но и внутри. Одному грамму цеолита соответствует внутренняя поверхность, равная 800 м². Отсюда следует, что плотность цеолитов также мала и составляет 1,9-2,3 г/см³.Natural zeolitized tuff is a skeleton aluminosilicate, in the structure of which there are communicating cavities occupied by large ions of various elements and water molecules that have significant freedom of movement, due to which ion exchange and reversible dehydration occur. The crystal lattice of zeolitized tuffs is formed by tetraids with a well-developed inner surface, which ensures the sorption ability of the mineral and good adhesion to microbial cells, allowing oil destructors to be fixed not only on the surface of the carrier, but also inside. One gram of zeolite corresponds to an inner surface of 800 m ² . It follows that the density of zeolites is also low and amounts to 1.9-2.3 g / cm ³ .

Благодаря своему кристаллохимическому строению цеолиты биологически активны. Закрепление микроорганизмов внутри кристаллов цеолита позволяет им благополучно переносить воздействие прямых солнечных лучей и резких перепадов температур окружающей среды, а сорбционные и ионообменные свойства минерала обеспечивают микроорганизмы дополнительными источниками питания (углеводородами нефти и элементами минерального питания, сорбируемыми из почвы), необходимыми для метаболизма микробных клеток. Это обеспечивает высокоэффективность и пролонгированность реакций деструкции нефтепродуктов. Кроме того, сам цеолит выступает источником макро- и микроэлементов, необходимых для активации и питания нефтеокисляющих микроорганизмов почвы (таблица 1).Due to its crystal-chemical structure, zeolites are biologically active. The fixation of microorganisms inside zeolite crystals allows them to safely tolerate exposure to direct sunlight and sudden changes in ambient temperatures, and the sorption and ion-exchange properties of the mineral provide microorganisms with additional nutrition sources (oil hydrocarbons and mineral nutrition elements sorbed from the soil) necessary for the metabolism of microbial cells. This ensures high efficiency and prolonged degradation of petroleum products. In addition, the zeolite itself acts as a source of macro- and microelements necessary for the activation and nutrition of oil-oxidizing microorganisms of the soil (table 1).

Являясь катализатором реакций деструкции нефтяных углеводородов, цеолит при внесении его в нефтезагрязненные почвы способствует и формированию в загрязненном грунте центров активной деструкции нефтяных углеводородов благодаря сорбции на его поверхности нефтеусваивающих культур микроорганизмов. При этом дополнительными характеристиками цеолита является: экологическая безопасность, широкая сырьевая база и сравнительно невысокая стоимость. На земном шаре открыто около 1000 крупных месторождений. Из них более 50 обнаружено в СНГ и более 20 в Сибири. Среди которых: Хонгуринское - в Якутии; Холинское и Шивыртуйское - в Читинской области; Пегасское - в Кемеровской области; Назаровское - в Красноярском крае; Раденское - в Еврейской автономной области; Чугуевское - на Дальнем Востоке и др. Только на месторождении Хонгуруу утверждены запасы 11462 тыс. тонн. По стоимости природные цеолиты в 20-200 раз дешевле субститутов.As a catalyst for the destruction of petroleum hydrocarbons, zeolite, when introduced into oil-contaminated soils, also contributes to the formation of centers of active destruction of petroleum hydrocarbons in contaminated soil due to the sorption of oil-absorbing microorganisms on its surface. Moreover, the additional characteristics of the zeolite are: environmental safety, a wide raw material base and relatively low cost. About 1000 large deposits have been discovered on the globe. Of these, more than 50 were found in the CIS and more than 20 in Siberia. Among which: Khongurinsky - in Yakutia; Kholinskoye and Shivyrtuiskoye - in the Chita region; Pegasus - in the Kemerovo region; Nazarovskoye - in the Krasnoyarsk Territory; Radenskoe - in the Jewish Autonomous Region; Chuguevskoye - in the Far East and others. Only reserves of 11462 thousand tons were approved at the Honguruu field alone. At the cost of natural zeolites are 20-200 times cheaper than substitutes.

Предложенное техническое решение выгодно, так как для своего осуществления не требует сложного технологического оборудования. А цеолит, служащий в данном способе носителем для микроорганизмов, является одновременно и доступным и дешевым сырьем, поскольку цеолиты имеют поверхностное залегание и разрабатываются открытым способом.The proposed technical solution is beneficial, since it does not require sophisticated technological equipment for its implementation. And the zeolite, which serves in this method as a carrier for microorganisms, is both an affordable and cheap raw material, since zeolites have a surface occurrence and are developed in an open way.

Очистка почвы от нефтезагрязнений предлагаемым биопрепаратом на основе нефтедеструкторов, иммобилизованных на цеолит, позволяет предотвратить распространение веществ-загрязнителей на сопряженные ландшафты, добиться устранения пятен загрязненного грунта, снизить токсичность почв и стимулировать появление естественного растительного покрова на загрязненных участках, что значительно улучшает санитарно-экологическое состояние нарушенной территории.Purification of soil from oil pollution by the proposed biological product based on oil destructors immobilized on a zeolite helps to prevent the spread of pollutants to conjugated landscapes, eliminate stains of contaminated soil, reduce soil toxicity and stimulate the appearance of natural vegetation in contaminated areas, which significantly improves the sanitary and environmental condition disturbed territory.

Предлагаемый биопрепарат для очистки почвы от нефтяных загрязнений является экологически безопасным, поскольку основой для его приготовления являются природные образования - природный цеолитизированный туф и непатогенный микроорганизмы, утилизирующие разлитую нефть. Отбор штаммов, входящих в состав биопрепарата, проводили на основании их способности к утилизации углеводородов при культивировании в контакте с нефтью в широком диапазоне температур.The proposed biological product for cleaning the soil from oil pollution is environmentally friendly, since the basis for its preparation are natural formations - natural zeolitized tuff and non-pathogenic microorganisms that utilize spilled oil. The strains included in the biological product were selected on the basis of their ability to utilize hydrocarbons during cultivation in contact with oil in a wide temperature range.

Харктеристика штаммов:The characteristics of the strains:

1. Bacillus vallismortis ELA-4 ВКПМ B-110171. Bacillus vallismortis ELA-4 VKPM B-11017

Штамм характеризуется следующими признаками:грамположительные споровые палочки, в мазках расположены одиночно и короткими цепочками.The strain is characterized by the following features: gram-positive spore bacilli, located in smears singly and in short chains.

На мясопептонном агаре (масс.%: ферментативный пептон - 1,0; натрий хлористый - 0,5; агар - 1,0; вода мясная - остальное, pH 7,0-7,2) с добавлением 1% глюкозы растет в виде сморщенных суховатых бежевых колоний, через 1-3 суток колонии окрашиваются в коричневый цвет, субстрат не пигментирует.On meat and peptone agar (wt.%: Enzymatic peptone - 1.0; sodium chloride - 0.5; agar - 1.0; meat water - the rest, pH 7.0-7.2) with the addition of 1% glucose grows in the form wrinkled, dry, beige colonies, after 1-3 days, the colonies turn brown, the substrate does not pigment.

Штамм каталазоположителен, оксидазоотрицателен. Метаболизм окислительного типа. Биохимическая активность выражена слабо. Не усваивает лизин и орнитин. Не потребляет цитрат и малонат натрия. Желатин не гидролизует. Крахмал не разлагает. Индолоотрицателен. Не образует сероводород. Реакция Фогес-Проскауэра отрицательная. Фенилаланиндезоксаминаза отрицательная. Ферментирует бета- галактозидазу.The strain is catalase-positive, oxidase-negative. Oxidative metabolism. Biochemical activity is poorly expressed. Does not absorb lysine and ornithine. Does not consume sodium citrate and malonate. Gelatin does not hydrolyze. Starch does not decompose. Indolene negative. Does not form hydrogen sulfide. The Voges-Proskauer reaction is negative. Phenylalanine deoxaminase is negative. It ferments beta-galactosidase.

Штамм хорошо растет при температуре от +8 до +37°C, в аэробных условиях. При температуре ниже +8°C и в анаэробных условиях штамм сразу не погибает, но развивается медленнее. Растет при pH 6,0-8,0. Растет в солевом бульоне с добавлением 0,1-2,0% NaCl.The strain grows well at temperatures from +8 to + 37 ° C, under aerobic conditions. At temperatures below + 8 ° C and under anaerobic conditions, the strain does not die immediately, but develops more slowly. Grows at pH 6.0-8.0. It grows in salt broth with the addition of 0.1-2.0% NaCl.

Штамм Bacillus vallismortis ВКПМ В-11017 утилизирует нефть в качестве источника углерода. Процесс идет в широком диапазоне температур (+8…+37°C) (таблица 2).The strain Bacillus vallismortis VKPM B-11017 utilizes oil as a carbon source. The process runs in a wide temperature range (+ 8 ... + 37 ° C) (table 2).

1.1 Исследование нефтеокисляющей активности штамма бактерий Bacillus vallismortis ELA-4 ВКПМ В-110171.1 the Study of the oil-oxidizing activity of the bacterial strain Bacillus vallismortis ELA-4 VKPM B-11017

Клетки штамма Bacillus vallismortis ELA-4 ВКПМ В-11017 со скошенного МПА смывают 0,9% раствором NaCl, готовят исходную микробную суспензию бактериального изолята, объемом 25 см³, с концентрацией 1×10⁹ кл./см³ по оптическому стандарту ГИСК им. A.M. Тарасевича.Cells of the strain Bacillus vallismortis ELA-4 VKPM B-11017 are washed off with the beveled MPA with a 0.9% NaCl solution, the initial microbial suspension of the bacterial isolate is prepared, with a volume of 25 cm ³ , with a concentration of 1 × 10 ⁹ cells / cm ³ according to the optical standard GISK them . AM Tarasevich.

Полученный бактериальный изолят штамма Bacillus vallismortis ELA-4 ВКПМ В-11017 культивируют в жидкой минеральной среде Мюнца следующего состава (масс.%): KNO₃ - 0,4; MgSO₄·7Н₂О - 0,08; NaCl - 0,1; K₂ НРО₄ - 0,14; KH₂ РО₄ - 0,06; агар - 2,0; вода дистиллированная - остальное; pH среды - 7,2.The obtained bacterial isolate of the strain Bacillus vallismortis ELA-4 VKPM B-11017 is cultured in the liquid mineral Münz medium of the following composition (wt.%): KNO ₃ - 0.4; MgSO ₄ · 7H ₂ O - 0.08; NaCl - 0.1; K ₂ NRA ₄ - 0.14; KH ₂ PO ₄ - 0.06; agar - 2.0; distilled water - the rest; the pH of the medium is 7.2.

В колбочки объемом 200,0 см³ вносят по 100,0 см³ готовой минеральной среды и 1000 мг нефти. Колбы засевают клетками штамма до концентрации 1·10⁹ кл./см³. В качестве контроля ставят такую же колбу со средой, нефтью и без бактерий для определения общих (естественных) потерь. Опыт проводят в трех повторностях. Колбы культивируют в качалочных условиях на установке «УВМТ-12-250» при 200 об/мин, при температурах +8°C; +20°C; +30°C и +37°C в течение 7 суток.100.0 cm ^{3 of the} finished mineral medium and 1000 mg of oil are introduced into cones with a volume of 200.0 cm ³ . Flasks are seeded with cells of the strain to a concentration of 1 · 10 ⁹ cells / cm ³ . As a control, put the same flask with medium, oil and without bacteria to determine the total (natural) losses. The experiment is carried out in triplicate. The flasks are cultured in rocking conditions on the installation "UVMT-12-250" at 200 rpm, at temperatures + 8 ° C; + 20 ° C; + 30 ° C and + 37 ° C for 7 days.

Биодеградацию нефти и нефтепродуктов определяют спектрометрическим методом, с использованием концентратомера «ИКН-025» (ФР. 1.31.2007.03234).Biodegradation of oil and oil products is determined by spectrometric method, using a concentrator "IKN-025" (FR. 1.31.2007.03234).

Объективные данные, полученные в результате проведения эксперимента, показывают, что предлагаемый штамм уже на 7-е сутки при температуре +8°C утилизирует 18,5% - нефти; при температуре +20°C - 57,5%, при температуре +30°C - 60,7%, при температуре +37°C 52,8% (таблица 2).Objective data obtained as a result of the experiment show that the proposed strain already utilizes 18.5% of oil on the 7th day at a temperature of + 8 ° C; at a temperature of + 20 ° C - 57.5%, at a temperature of + 30 ° C - 60.7%, at a temperature of + 37 ° C 52.8% (table 2).

Таблица 2table 2 Степень утилизации нефти штаммом Bacillus vallismortis ELA-4 ВКПМ B-11017 через 7 суток культивированияThe degree of utilization of oil by a strain of Bacillus vallismortis ELA-4 VKPM B-11017 after 7 days of cultivation ВариантOption Среднеарифметическое содержание нефти, мг/дм³ The arithmetic average oil content, mg / DM ³ t°Ct ° C +8+8 +20+20 +30+30 +37+37 до опытаto experience 1000,01000,0 1000,01000,0 1000,01000,0 1000,01000,0 после опытаafter experience 814,1814.1 425,0425.0 393,0393.0 471,8471.8 % деструкции% destruction 18,518.5 57,557.5 60,760.7 52,852.8

Таким образом, преимуществом штамма Bacillus vallismortis ELA-4 ВКПМ B-11017 является то, что он обладает высокой утилизирующей способностью по отношению к нефти, действует в широком диапазоне температур от +8 до +37°C и может быть использован для очистки субстратов от нефтяных загрязнений.Thus, the advantage of the strain Bacillus vallismortis ELA-4 VKPM B-11017 is that it has a high utilizing ability with respect to oil, acts in a wide temperature range from +8 to + 37 ° C and can be used to clean oil substrates pollution.

Штамм не вирулентный, не токсичный, не токсигенный, не фитотоксичен (проверка проведена на белых мышах и семенах высших растений (овес сорт «Скакун» и пшеница сорт «Приленская-19»).The strain is not virulent, not toxic, not toxigenic, not phytotoxic (the test was carried out on white mice and seeds of higher plants (oats cultivar Skakun and wheat cultivar Prilenskaya-19)).

Условия хранения:Storage conditions:

1. В лиофилизированном виде в ампулах при +4°C.1. In lyophilized form in ampoules at + 4 ° C.

2. Штамм может поддерживаться регулярными пересевами (1 раз в 2 недели) на скошенном МПА.2. The strain can be maintained by regular reseeding (1 time in 2 weeks) on the slanted MPA.

Штамм депонирован Всероссийской коллекцией промышленных микроорганизмов в ФГУП ГосНИИГенетика - ВКПМ, 117545, г. Москва, 1-й Дорожный проезд, 1. Коллекционный номер ВКПМ В-11017.The strain was deposited by the All-Russian collection of industrial microorganisms at the Federal State Unitary Enterprise State Research Institute of Genetics - VKPM, 117545, Moscow, 1st Dorozhniy proezd, 1. Collection number VKPM V-11017.

2. Exiguobacterium mexicanum ELA-5 ВКПМ В-110112. Exiguobacterium mexicanum ELA-5 VKPM B-11011

Штамм характеризуется следующими признаками:грамположительные палочки, размером 0,8-1,0 мкм. Подвижные, с перитрихиально расположенными жгутиками. В мазках располагаются скоплениями и попарно. Способны развиваться в анаэробных условиях. Спор и капсул не образуют.The strain is characterized by the following features: gram-positive bacilli, size 0.8-1.0 microns. Movable, with peritrichous flagella. In smears are clusters and in pairs. Able to develop under anaerobic conditions. Spore and capsules do not form.

На мясопептонном агаре (масс.%: ферментативный пептон - 1,0; натрий хлористый - 0,5; агар - 1,0; вода мясная - остальное, pH 7,0-7,2) формируют влажные, грязно-желтого цвета колонии округлой формы. Через 1-2 суток рельеф колоний изменяется. Колонии становятся суховатыми, края неровные.On meat and peptone agar (wt.%: Enzymatic peptone - 1.0; sodium chloride - 0.5; agar - 1.0; meat water - the rest, pH 7.0-7.2) form wet, dirty yellow colonies round shape. After 1-2 days, the relief of the colonies changes. The colonies become dry, the edges are uneven.

Штамм каталаза положителен, оксидаза отрицателен. Метаболизм окислительного типа. Биохимическая активность выражена слабо. Не усваивает многоатомные спирты. Слабо ферментирует глюкозу и сахарозу, другие углеводы не ферментирует. Не усваивает лизин и орнитин. Не потребляет цитрат и малонат натрия. Желатин не гидролизует. Крахмал не разлагает. Индол отрицателен. Реакция Фогес-Проскауэра отрицательная. Фенилаланиндезоксаминаза отрицательная. Ферментирует бета- галактозидазу.The strain of catalase is positive, oxidase is negative. Oxidative metabolism. Biochemical activity is poorly expressed. Does not absorb polyhydric alcohols. It weakly ferments glucose and sucrose; other carbohydrates do not ferment. Does not absorb lysine and ornithine. Does not consume sodium citrate and malonate. Gelatin does not hydrolyze. Starch does not decompose. Indole is negative. The Voges-Proskauer reaction is negative. Phenylalanine deoxaminase is negative. It ferments beta-galactosidase.

Штамм растет при температуре от +4 до +37°C, лучше в аэробных условиях. В анаэробных условиях штамм сразу не погибает, но развивается медленнее. Растет при pH 6,0-8,0. Растет в солевом бульоне с добавлением 0,1-2,0% NaCl.The strain grows at temperatures from +4 to + 37 ° C, better under aerobic conditions. Under anaerobic conditions, the strain does not die immediately, but develops more slowly. Grows at pH 6.0-8.0. It grows in salt broth with the addition of 0.1-2.0% NaCl.

Штамм Exiguobacterium mexicanum ВКПМ В-11011 утилизирует нефть в качестве источника углерода. Процесс идет в широком диапазоне температур (+4…+37°C) (таблица 3).The strain Exiguobacterium mexicanum VKPM B-11011 utilizes oil as a carbon source. The process runs in a wide temperature range (+ 4 ... + 37 ° C) (table 3).

2.1 Исследование нефтеокисляющей активности штамма Exiguobacterium mexicanum ELA-5 ВКПМ B-110112.1 Study of the oil-oxidizing activity of the strain Exiguobacterium mexicanum ELA-5 VKPM B-11011

Клетки штамма Exiguobacterium mexicanum ELA-5 ВКПМ B-11011 со скошенного МПА смывают 0,9% раствором NaCl, готовят исходную микробную суспензию бактериального изолята, объемом 25 см³, с концентрацией 1×10⁹ микробных кл./см³ по оптическому стандарту ГИСК им. A.M. Тарасевича.Cells of the strain Exiguobacterium mexicanum ELA-5 VKPM B-11011 are washed off with mowed MPA with a 0.9% NaCl solution, the initial microbial suspension of the bacterial isolate is prepared, with a volume of 25 cm ³ , with a concentration of 1 × 10 ⁹ microbial cells / cm ³ according to the optical GIS standard them. AM Tarasevich.

Бактериальный изолят штамма культивируют в жидкой минекральной среде Мюнца.The bacterial isolate of the strain is cultured in liquid mineral Münz medium.

В колбочки объемом 200,0 см³ вносят по 100,0 см³ готовой минеральной среды и 1000 мг нефти. Колбы засевают клетками штамма до концентрации 1·10⁹ клеток/ см³. В качестве контроля ставят такую же колбу со средой, нефтью и без бактерий для определения общих (естественных) потерь. Опыт проводят в трех повторностях. Колбы культивируют при температурах +4°C; +20°C; +30°C и +37°C в течение 7 суток.100.0 cm ^{3 of the} finished mineral medium and 1000 mg of oil are introduced into cones with a volume of 200.0 cm ³ . Flasks are seeded with cells of the strain to a concentration of 1 · 10 ⁹ cells / cm ³ . As a control, put the same flask with medium, oil and without bacteria to determine the total (natural) losses. The experiment is carried out in triplicate. Flasks are cultured at temperatures of + 4 ° C; + 20 ° C; + 30 ° C and + 37 ° C for 7 days.

Объективные данные, полученные в результате проведения эксперимента, показывают, что предлагаемый штамм уже на 7-е сутки при температуре +4°C утилизирует 6,3% - нефти; при температуре +20°C - 49,7%, при температуре +30°C - 51,9%, при температуре +37°C -5 7,7% нефти (таблица 3).Objective data obtained as a result of the experiment show that the proposed strain already utilizes 6.3% of oil on the 7th day at a temperature of + 4 ° C; at a temperature of + 20 ° C - 49.7%, at a temperature of + 30 ° C - 51.9%, at a temperature of + 37 ° C -5 7.7% of oil (table 3).

Таблица 3Table 3 Степень утилизации нефти штаммом Exiguobacterium mexicanum ELA-5 ВКПМ B-11011 через 7 суток культивированияThe degree of oil utilization by strain Exiguobacterium mexicanum ELA-5 VKPM B-11011 after 7 days of cultivation ВариантOption Среднеарифметическое содержание нефти, мг/дм³ The arithmetic average oil content, mg / DM ³ t°Ct ° C +4+4 +20+20 +30+30 +37+37 до опытаto experience 1000,01000,0 1000,01000,0 1000,01000,0 1000,01000,0 после опытаafter experience 936,2936.2 502,4502.4 481,0481.0 422,2422.2 % деструкции% destruction 6,36.3 49,749.7 51,951.9 57,757.7

Таким образом, преимуществом штамма Exiguobacterium mexicanum ELA-5 ВКПМ B-11011 является то, что он обладает высокой утилизирующей способностью по отношению к нефти, действует в широком диапазоне температур от +4 до +37°C и может быть использован для очистки субстратов от нефтяных загрязнений.Thus, the advantage of the strain Exiguobacterium mexicanum ELA-5 VKPM B-11011 is that it has a high utilizing ability with respect to oil, acts in a wide temperature range from +4 to + 37 ° C and can be used to clean oil substrates pollution.

Условия хранения:Storage conditions:

2. Штамм может поддерживаться регулярными пересевами (1 раз в месяц) на скошенном МГЛА.2. The strain can be maintained by regular reseeding (1 time per month) on the slanted MSLA.

Штамм депонирован во Всероссийской кКоллекции промышленных микроорганизмов ФГУП ГосНИИГенетика (ВКПМ) (Москва, 1-й Дорожный пр., д.1) под регистрационным номером ВКПМ В-11011.The strain was deposited in the All-Russian kollektsii industrial microorganisms FSUE GosNIIGenetika (VKPM) (Moscow, 1st Dorozhny pr., D.1) under registration number VKPM V-11011.

3. Характеристика штамма Rhodococcus sp. LER-12 ВКМ Ac-2626D3. Characterization of the strain Rhodococcus sp. LER-12 VKM Ac-2626D

Штамм Rhodococcus sp. LER-12 ВКМ Ac-2626D характеризуется следующими морфо-культуральными свойствами:грамположительные крупные палочки, в мазках расположены одиночно и небольшими скоплениями. Штамм растет при температуре +4…+30°C в аэробных условиях и слабо в анаэробных условиях. Оптимум роста +4…+20°C. Использует в качестве источника энергии углеводороды нефти и нефтепродуктов.Strain Rhodococcus sp. LER-12 VKM Ac-2626D is characterized by the following morpho-cultural properties: gram-positive large sticks, in smears are located singly and in small clusters. The strain grows at a temperature of + 4 ... + 30 ° C under aerobic conditions and weakly under anaerobic conditions. The optimum growth is + 4 ... + 20 ° C. Uses petroleum hydrocarbons and oil products as an energy source.

На МПА и ГРМ-агаре (на основе гидролизата рыбной муки) формирует крупные сметанообразные колонии, кремового цвета, диаметром до 5 мм и более. Консистенция мягкая, легко снимаются с поверхности агара, легко размазываются. На среде Сабуро формирует кремовые блестящие слизистые колонии. На агаризованной среде Мюнца с нефтью растет в виде кремовых выпуклых колоний диаметром 1-2 мм и более. В мясопептонном бульоне образуют муть с обильным слизистым осадком.On MPA and GRM agar (based on a fish meal hydrolyzate) it forms large creamy colonies, cream-colored, with a diameter of up to 5 mm or more. The consistency is soft, easily removed from the surface of the agar, easily smeared. On Wednesday, Saburo forms creamy shiny mucous colonies. On an agar medium, Muntz with oil grows in the form of creamy convex colonies with a diameter of 1-2 mm or more. In the meat and peptone broth form a turbidity with abundant mucous sediment.

Штамм оксидаза отрицателен. Биохимическая активность выражена слабо. Ферментирует сорбит. Не ферментирует глюкозу, лактозу, сахарозу и другие углеводы. Не усваивает лизин. Усваивает орнитин. Не потребляет цитрат и малонат натрия. Желатин не гидролизует. Крахмал не разлагает. Индол отрицателен. Реакция Фогес-Проскауэра отрицательная. Фенилаланиндезоксаминаза отрицательная. Не ферментирует бета--галактозидазу.The oxidase strain is negative. Biochemical activity is poorly expressed. Ferments sorbitol. Does not ferment glucose, lactose, sucrose and other carbohydrates. Does not absorb lysine. Absorbs ornithine. Does not consume sodium citrate and malonate. Gelatin does not hydrolyze. Starch does not decompose. Indole is negative. The Voges-Proskauer reaction is negative. Phenylalanine deoxaminase is negative. Does not ferment beta-galactosidase.

3.1 Исследование нефтеокисляющей активности штамма Rhodococcus sp. LER-12 ВКМ Ac-2626D3.1 Study of the oil-oxidizing activity of the strain Rhodococcus sp. LER-12 VKM Ac-2626D

Клетки штамма Rhodococcus sp. LER-12 ВКМ Ac-2626D со скошенного МПА смывают 0,9% раствором NaCl, готовят исходную микробную суспензию бактериального изолята, объемом 25 см³, с концентрацией 1×10⁹ микробных клеток/см³ по оптическому стандарту ГИСК им. A.M. Тарасевича.Cells of the strain Rhodococcus sp. LER-12 VKM Ac-2626D is washed off from the beveled MPA with a 0.9% NaCl solution, the initial microbial suspension of the bacterial isolate is prepared, with a volume of 25 cm ³ , with a concentration of 1 × 10 ⁹ microbial cells / cm ³ according to the optical standard GISK named after AM Tarasevich.

Бактериальный изолят штамма культивируют в жидкой минеральной среде Мюнца.The bacterial isolate of the strain is cultured in liquid mineral Münz.

В колбочки объемом 200,0 см³ вносят по 100,0 см³ готовой минеральной среды и 1000 мг нефти. Колбы засевают клетками штамма до концентрации 1·10⁹ кл./см³. В качестве контроля ставят такую же колбу со средой, нефтью и без бактерий для определения общих (естественных) потерь. Опыт проводят в трех повторностях. Колбы культивируют при температурах +4°C; +20°C; +30°C и +37°C в течение 7 суток.100.0 cm ^{3 of the} finished mineral medium and 1000 mg of oil are introduced into cones with a volume of 200.0 cm ³ . Flasks are seeded with cells of the strain to a concentration of 1 · 10 ⁹ cells / cm ³ . As a control, put the same flask with medium, oil and without bacteria to determine the total (natural) losses. The experiment is carried out in triplicate. Flasks are cultured at temperatures of + 4 ° C; + 20 ° C; + 30 ° C and + 37 ° C for 7 days.

Объективные данные, полученные в результате проведения эксперимента, показывают, что предлагаемый штамм уже на 7-е сутки при температуре +4°C утилизирует 14,8% - нефти; при температуре +20°C - 96,5%, при температуре +30°C - 71,9%, при температуре +37°C - 55,7% нефти (таблица 4).The objective data obtained as a result of the experiment show that the proposed strain already utilizes 14.8% of oil on the 7th day at a temperature of + 4 ° C; at a temperature of + 20 ° C - 96.5%, at a temperature of + 30 ° C - 71.9%, at a temperature of + 37 ° C - 55.7% of oil (table 4).

Таблица 4Table 4 Степень утилизации нефти штаммом Rhodococcus sp. LER-12 ВКМ Ac-2626D через 7 суток культивированияThe degree of oil utilization by strain Rhodococcus sp. LER-12 VKM Ac-2626D after 7 days of cultivation ВариантOption Среднеарифметическое содержание нефти, мг/дм³ The arithmetic average oil content, mg / DM ³ t°Ct ° C +4+4 +20+20 +30+30 +37+37 до опытаto experience 1000,01000,0 1000,01000,0 1000,01000,0 1000,01000,0 после опытаafter experience 852,0852.0 35,035.0 281,0281.0 443,0443.0 % деструкции% destruction 14,814.8 96,596.5 71,971.9 55,755.7

Таким образом, преимуществом штамма Rhodococcus sp. LER-12 ВКМ Ac-2626D является то, что он является психрофильным штаммом, способен к росту и развитию при оптимальных температурах +4…+20°C, обладает утилизирующей способностью по отношению к нефти и может быть использован для очистки почв от нефтяных загрязнений в почвенно-климатических условиях Крайнего Севера.Thus, the advantage of the strain Rhodococcus sp. LER-12 VKM Ac-2626D is that it is a psychrophilic strain, capable of growth and development at optimal temperatures of + 4 ... + 20 ° C, has a utilizing ability with respect to oil and can be used to clean soils from oil pollution in soil and climatic conditions of the Far North.

Условия хранения: Storage conditions:

2. Штамм может поддерживаться регулярными пересевами (1 раз в месяц) на скошенном МПА.2. The strain can be maintained by regular reseeding (1 time per month) on the slanted MPA.

Штамм депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов ИБФМ РАН (ВКМ) (г. Пущино, Московская обл., пр. Науки, дом 5) под регистрационным номером ВКМ Ac-2626D.The strain was deposited in the All-Russian Collection of Industrial Microorganisms, IBPM RAS (VKM) (Pushchino, Moscow Region, Nauky Ave., Building 5) under registration number VKM Ac-2626D.

4. Характеристика штамма Serratia plymuthica ELA-9 VKM B-2819D4. Characterization of the strain of Serratia plymuthica ELA-9 VKM B-2819D

Штамм Serratia plymuthica ELA-9 VKM B-2819D характеризуется следующими морфолого-культуральными признаками: грамотрицательные палочки, в мазках расположены одиночно, беспорядочно или короткими цепочками. Штамм растет при температуре +4…+30°C с оптимумом +4…+15°C в аэробных условиях. На мясопептонном агаре формирует влажные красно-оранжевые колонии средних размеров. На поверхности скошенного МПА растет в виде маслянистого налета красно-оранжевого цвета. В мясопептонном бульоне образует равномерную муть с диффунгированием пигмента в бульон. На минеральной среде Мюнца с нефтью растет в виде пастообразных колоний малиново-красного цвета.The strain of Serratia plymuthica ELA-9 VKM B-2819D is characterized by the following morphological and cultural characteristics: gram-negative bacilli, in smears are located singly, randomly or in short chains. The strain grows at a temperature of + 4 ... + 30 ° C with optimum + 4 ... + 15 ° C in aerobic conditions. On meat and peptone agar forms moist red-orange colonies of medium size. On the surface of the beveled MPA grows in the form of an oily plaque of red-orange color. In the meat and peptone broth forms a uniform turbidity with the diffusion of pigment into the broth. On the mineral environment, Muntz with oil grows in the form of pasty colonies of crimson-red color.

Штамм оксидаза положительный. Уреаза положительный. Биохимическая активность выражена слабо. Ферментирует сорбит и инозит. Не ферментирует глюкозу, лактозу, сахарозу и другие углеводы. Не усваивает лизин и орнитин. Не потребляет цитрат и малонат натрия. Желатин не гидролизует. Крахмал не разлагает. Индол отрицателен. Реакция Фогес - Проскауэра отрицательная. Фенилаланиндезоксаминаза отрицательная. Ферментирует бета-- галактозидазу.The oxidase strain is positive. Urease is positive. Biochemical activity is poorly expressed. Ferments sorbitol and inositol. Does not ferment glucose, lactose, sucrose and other carbohydrates. Does not absorb lysine and ornithine. Does not consume sodium citrate and malonate. Gelatin does not hydrolyze. Starch does not decompose. Indole is negative. The Voges - Proskauer reaction is negative. Phenylalanine deoxaminase is negative. Ferments beta-galactosidase.

4.1 Исследование нефтеокисляющей активности штамма Serratia plymuthica ELA-9 VKM B-2819D4.1 Study of the oil-oxidizing activity of a strain of Serratia plymuthica ELA-9 VKM B-2819D

Клетки штамма Serratia plymuthica ELA-9 VKM B-2819D со скошенного МПА смывают 0,9% раствором NaCl, готовят исходную микробную суспензию бактериального изолята, объемом 25 см³, с концентрацией 1×10⁹ микробных кл./см³ по оптическому стандарту ГИСК им. A.M. Тарасевича.Cells of the strain Serratia plymuthica ELA-9 VKM B-2819D from the beveled MPA are washed off with a 0.9% NaCl solution, the initial microbial suspension of the bacterial isolate is prepared, with a volume of 25 cm ³ , with a concentration of 1 × 10 ⁹ microbial cells / cm ³ according to the optical standard GISK them. AM Tarasevich.

Объективные данные, полученные в результате проведения эксперимента, показывают, что предлагаемый штамм уже на 7-е сутки при температуре +4°C утилизирует 18,2% - нефти; при температуре +20°C - 76,3%, при температуре +30°C - 28,9%, при температуре +37°C - 6,2% нефти (таблица 5).The objective data obtained as a result of the experiment show that the proposed strain already utilizes 18.2% of oil on the 7th day at a temperature of + 4 ° C; at a temperature of + 20 ° C - 76.3%, at a temperature of + 30 ° C - 28.9%, at a temperature of + 37 ° C - 6.2% of oil (table 5).

Таблица 5Table 5 Степень утилизации нефти штаммом Serratia plymuthica ELA-9 VKM B-2819D через 7 суток культивированияThe degree of utilization of oil by a strain of Serratia plymuthica ELA-9 VKM B-2819D after 7 days of cultivation ВариантOption Среднеарифметическое содержание нефти, мг/дм³ The arithmetic average oil content, mg / DM ³ t°Ct ° C +4+4 +20+20 +30+30 +37+37 до опытаto experience 1000,01000,0 1000,01000,0 1000,01000,0 1000,01000,0 после опытаafter experience 818,0818.0 237,0237.0 711,0711.0 938,0938.0 % деструкции% destruction 18,218.2 76,376.3 28,928.9 6,26.2

Таким образом, преимуществом штамма Serratia plymuthica ELA-9 VKM B-2819D является то, что он является психрофильным штаммом, способен к росту и развитию при оптимальных температурах +4…+15°C, обладает утилизирующей способностью по отношению к нефти и может быть использован для очистки почв от нефтяных загрязнений в почвенно-климатических условиях Крайнего Севера.Thus, the advantage of the strain of Serratia plymuthica ELA-9 VKM B-2819D is that it is a psychrophilic strain, capable of growth and development at optimal temperatures + 4 ... + 15 ° C, has a utilizing ability with respect to oil and can be used for cleaning soils from oil pollution in soil and climatic conditions of the Far North.

Условия хранения:Storage conditions:

Штамм депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов ИБФМ РАН (ВКМ) (г. Пущино, Московская обл., пр. Науки, дом 5) под регистрационным номером VKM B-2819D.The strain was deposited in the All-Russian Collection of Industrial Microorganisms, IBPM RAS (VKM) (Pushchino, Moscow Region, Nauky Ave., Building 5) under registration number VKM B-2819D.

Технология приготовления «Биопрепарата для биоремедиации нефтезагрязненных почв для климатических условий Крайнего Севера»Preparation technology "Biological product for bioremediation of oil-contaminated soils for climatic conditions of the Far North"

- Получение маточной культуры- Obtaining uterine culture

Для получения маточных культур используют агаровые культуры рабочей коллекции УОМ. Эти культуры являются посевным материалом, используемым для засева в ферментеры.To obtain uterine cultures, agar cultures of the working collection of UOM are used. These crops are seeds used for sowing in fermenters.

Для каждого бактериального изолята, являющегося на данном этапе производственным штаммом, готовят отдельный посевной материал и проводят культивирование в отдельном ферментере. При этом учитываются индивидуальные видовые и штаммовые особенности бактериального деструктора. Для получения маточной культуры используют минеральную среду следующего состава (масс.%): KNO₃ - 0,4; MgSO₄·7Н₂О - 0,08; NaCl - 0,1; K₂ НРО₄ - 0,14; KH₂ РО₄ - 0,06; агар - 2,0; вода дистиллированная - остальное; pH среды - 7,2. Объем посевного материала должен составлять 5-10% от объема питательной среды.For each bacterial isolate, which is at this stage a production strain, a separate seed is prepared and cultivation is carried out in a separate fermenter. In this case, individual species and strain features of the bacterial destructor are taken into account. To obtain a uterine culture, the following mineral composition is used (mass%): KNO ₃ - 0.4; MgSO ₄ · 7H ₂ O - 0.08; NaCl - 0.1; K ₂ NRA ₄ - 0.14; KH ₂ PO ₄ - 0.06; agar - 2.0; distilled water - the rest; the pH of the medium is 7.2. The amount of seed should be 5-10% of the volume of the nutrient medium.

Культуры изолятов, выращенные на скошенном ГРМ-агаре, основой которого является гидролизат рыбной муки, либо мясопептонный агар (МПА) промышленного производства, смывают физиологическим раствором, готовят суспензию. Концентрация клеток в суспензии должна составлять не менее 1×10⁹ кл./см^-3 по оптическому стандарту ГИСК им. A.M. Тарасевича; объем - не менее 25-50 см³.Isolate cultures grown on chamfered timing agar, the basis of which is a fish meal hydrolyzate, or industrial meat-peptone agar (MPA), are washed off with physiological saline and a suspension is prepared. The concentration of cells in suspension should be at least 1 × 10 ⁹ cells / cm ^-3 according to the optical standard GISK them. AM Tarasevich; volume - not less than 25-50 cm ³ .

- Культивирование посевного материала в колбах- Cultivation of seed in flasks

Питательную минеральную среду того же состава разливают по 150 см³ в колбы вместимостью 500 см³, в среду засевают 15-25 см³ бактериальной суспензии, приготовленной методом смыва. Туда же вносят 1,5 см³ стерильной нефти. Посевы в колбах инкубируют в УВМТ в течение 72 часов при 200-220 об/мин, температуре выращивания 29±1°C.Nutrient mineral medium of the same composition is poured into 150 cm ³ into flasks with a capacity of 500 cm ³ , 15-25 cm ^{3 of} bacterial suspension prepared by flushing are inoculated into the medium. 1.5 cm ^{3 of} sterile oil is added there. Crops in flasks are incubated in UVMT for 72 hours at 200-220 rpm, growing temperature 29 ± 1 ° C.

- Получение посевного материала для иммобилизации- Obtaining seed for immobilization

Выращивание бактерий, составляющих основу препарата, проводят на той же среде; в качестве единственного источника углерода используют стерильную сырую нефть, концентрация углеводородсодержащих продуктов в ферментационной жидкости составляет не менее 1% (по объему). Процесс ферментации осуществляют при интенсивном перемешивании при температуре 29±1°C в течение 36-48 часов. The cultivation of the bacteria that make up the basis of the drug is carried out on the same medium; sterile crude oil is used as the sole carbon source; the concentration of hydrocarbon-containing products in the fermentation liquid is at least 1% (by volume). The fermentation process is carried out with vigorous stirring at a temperature of 29 ± 1 ° C for 36-48 hours.

По окончании процесса культивирования наработанную жидкость сливают в стерильные емкости и используют для иммобилизации сорбента-носителя.At the end of the cultivation process, the produced fluid is poured into sterile containers and used to immobilize the carrier sorbent.

- Иммобилизация штаммов на сорбент-носитель- Immobilization of strains on a sorbent carrier

Посевной материал для иммобилизации смешивают в аппарате с мешалкой с цеолитовой крошкой фракции 1-3 мм, в соотношении 1:10 (1 часть суспензии УОМ на 10 частей цеолитового сырья). После пропитки цеолита посевным материалом для иммобилизации его высушивают контактным способом при температуре 37°C до постоянной массы или при комнатной температуре в течение 2-х суток. Биопрепарат готов к использованию. Сухой биопрепарат помещают в кеги или полиэтиленовые мешки и запаивают.Seeds for immobilization are mixed in an apparatus with a stirrer with a zeolite crumb of a fraction of 1-3 mm, in a ratio of 1:10 (1 part of a suspension of UOM for 10 parts of zeolite raw materials). After impregnation of the zeolite with seed for immobilization, it is dried by contact at a temperature of 37 ° C to constant weight or at room temperature for 2 days. The biological product is ready for use. Dry biological product is placed in kegs or plastic bags and sealed.

Параметры и характеристики биопрепарата должны соответствовать значениям таблицы 6.The parameters and characteristics of the biological product must correspond to the values of table 6.

Таблица 6Table 6 Биологические и физико-химические свойства «Биопрепарата для биоремедиации нефтезагрязненных почв для климатических условий Крайнего Севера»Biological and physico-chemical properties of "Biological product for bioremediation of oil-contaminated soils for climatic conditions of the Far North" Наименование показателяName of indicator НормаNorm Метод испытанияTest method 1. Внешний вид, цвет1. Appearance, color мелкозернистая крошка светло-зеленого цветаfine-grained crumb of light green color визуальныйvisual 2. Насыпная плотность (по сорбенту-носителю), г/см³ $*$

2. Bulk density (according to the sorbent carrier), g / cm ³

*

from 2.0 to 2.43 GOST 16190 3. Fractional composition, particle content,% - less than 1 mm; no more than 5 GOST 16187 - more than 3 mm 0 4. pH of the aqueous extract of the drug (conventional units) 7.0 ... 8.0 GOST 17.5.4.01 5. Mass fraction of moisture (water),%, no more 5 GOST 10898.1 GOST 11305 6. Specific surface S _BET , m ² / g not less than 15 GOST 10898.5 7. Content, not less - carrier sorbent,%; 85 - live UOM, cells / cm ³ ; 10 · 10 ⁹ - bacteria of the Escherichia coli group (coliform), cells / cm ³ ; absence ** GOST R 52816 - coagulase-positive staphylococci, GOST R 52815 cells / cm ³ ; absence ** GOST R 52814 - pathogenic genus Salmonella, cells / cm ³ ; absence ** - extraneous microflora, cl. no more than 10 in the field of view of the microscope with an increase of 1350 times 11. The porosity of the carrier absorbent,%, not less 7.0 GOST R 52129 12. Oil-oxidizing effectiveness of the drug,%, not less fifty RD 39-0147098-015 RD 52.18.647 GOST 17.4.3.03 Notes: 1 * The indicator is not defective. 2 ** Investigated if necessary, confirm the bacterial purity of the drug.

Использование биопрепарата на основе консорциума штаммов углеводородокисляющих микроорганизмов: Bacillus vallismortis ELA-4 ВКПМ В-11017; Exiguobacterium mexicanum ELA-5 ВКПМ B-11011; Serratia plymuthica ELA-9 VKM B-2819D; Rhodococcus sp. LER-12 BKM Ac-2626D, взятых в равных пропорция (1:1:1:1) и иммобилизованных на сорбент-носитель (цеолит) в соотношении 1:10 (1 часть бактериальной суспензии консорциума микроорганизмов на 10 частей цеолита) для очистки почв от нефтезагрязнений подтвержается примерами.The use of a biological product based on a consortium of strains of hydrocarbon-oxidizing microorganisms: Bacillus vallismortis ELA-4 VKPM B-11017; Exiguobacterium mexicanum ELA-5 VKPM B-11011; Serratia plymuthica ELA-9 VKM B-2819D; Rhodococcus sp. LER-12 BKM Ac-2626D, taken in equal proportions (1: 1: 1: 1) and immobilized on a sorbent carrier (zeolite) in a ratio of 1:10 (1 part of a bacterial suspension of a consortium of microorganisms per 10 parts of zeolite) for soil cleaning from oil pollution is confirmed by examples.

Примеры реализации изобретенияExamples of the invention

Пример 1. Очистка биопрепаратом мерзлотной болотистой почвыExample 1. Cleaning biological product of permafrost swampy soil

Концентрация нефти в мерзлотной болотистой почве до внесения биопрепарата составила 108338 мг/кг. Препарат вносили в концентрации 200 г на 1 кв.м, при глубине загрязнения 20 см. На протяжении эксперимента (60 суток) определяли динамику численности микроорганизмов, максимум которых в нефтезагрязненной почве увеличился после внесения биопрепарата на 3 порядка с 5,2·10⁴ до 3,3·10⁷ кл./г. Динамика роста численности микроорганизмов согласуется с их деструктивной активностью.The concentration of oil in permafrost marshy soil before the introduction of the biological product was 108338 mg / kg The drug was applied at a concentration of 200 g per 1 sq. M, at a depth of contamination of 20 cm. During the experiment (60 days), the dynamics of the number of microorganisms was determined, the maximum of which in oil-contaminated soil increased after application of the biological product by 3 orders of magnitude from 5.2 · 10 ⁴ to 3.3 · 10 ⁷ cells / g The growth dynamics of the number of microorganisms is consistent with their destructive activity.

Эффективность биодеградации нефти биопрепаратом оценивали гравиметрическим методом (РД 39-0147098-90, 1990). Содержание нефти в почве после внесения биопрепарата составила 12304 мг/кг. Таким образом, биодеградация нефти в мерзлотной болотистой почве за 60 суток составила 88,64%. В контрольном участке, не обработанном биопрепаратом в процессе естественного окисления, деструкция нефтезагрязнения за тот же промежуток времени составила 7,32% (таблица 7).The effectiveness of biodegradation of oil by a biological product was evaluated by the gravimetric method (RD 39-0147098-90, 1990). The oil content in the soil after application of the biological product was 12304 mg / kg. Thus, the biodegradation of oil in permafrost marshy soil over 60 days amounted to 88.64%. In the control plot, not treated with a biological product during natural oxidation, the destruction of oil pollution over the same period of time was 7.32% (table 7).

Таблица 7Table 7 Динамика деструкции нефти в мерзлотной болотистой почвеThe dynamics of oil destruction in permafrost swampy soil Вариант опыта Experience option Содержание нефти, мг/кгThe oil content, mg / kg Деструкция нефти за 60 суток, %Oil destruction in 60 days,% до внесения биопрепа
рата before applying biofeedback
rata через 60 суток после внесения биопрепарата 60 days after the introduction of the biological product Почва+нефть+биопрепаратSoil + oil + biological product 108338108338 1230412304 88,6488.64 Контроль (почва+нефть)Control (soil + oil) 1377113771 1276212762 7,327.32

Пример 2. Очистка биопрепаратом мерзлотно-таежной почвыExample 2. Cleaning biological product of permafrost-taiga soil

Концентрация нефти в мерзлотно-таежной почве до внесения биопрепарата составила 16260 мг/кг. Препарат вносили в концентрации 200 г на 1 кв.м, при глубине загрязнения 20 см. На протяжении эксперимента (60 суток) определяли динамику численности микроорганизмов, максимум которых в нефтезагрязненной почве увеличился после внесения биопрепарата на 4 порядка с 4,5·10³ до 4,7·10⁷ кл./г. Динамика роста численности микроорганизмов согласуется с их деструктивной активностью.The concentration of oil in permafrost-taiga soil before the introduction of the biological product was 16260 mg / kg The drug was applied at a concentration of 200 g per 1 sq.m, with a pollution depth of 20 cm. During the experiment (60 days), the dynamics of the number of microorganisms was determined, the maximum of which in oil-contaminated soil increased after application of the biological product by 4 orders of magnitude from 4.5 · 10 ³ to 4.7 · 10 ⁷ cells / g. The growth dynamics of the number of microorganisms is consistent with their destructive activity.

Эффективность биодеградации нефти биопрепаратом оценивают гравиметрическим методом (РД 39-0147098-90, 1990). Содержание нефти в почве после внесения биопрепарата составила 2045 мг/кг. Таким образом, биодеградация нефти в мерзлотно-таежной почве за 60 суток составила 87,42%. В контрольном участке, не обработанном биопрепаратом в процессе естественного окисления, деструкция нефтезагрязнения за тот же промежуток времени составила 25,29% (таблица 8).The effectiveness of biodegradation of oil by a biological product is evaluated by the gravimetric method (RD 39-0147098-90, 1990). The oil content in the soil after application of the biological product was 2045 mg / kg. Thus, the biodegradation of oil in permafrost-taiga soil for 60 days amounted to 87.42%. In the control plot, not treated with a biological product during natural oxidation, the destruction of oil pollution for the same period of time was 25.29% (table 8).

Таблица 8Table 8 Динамика деструкции нефти в мерзлотно-таежной почвеDynamics of oil destruction in permafrost-taiga soil Вариант опыта Experience option Содержание нефти, мг/кгThe oil content, mg / kg Деструкция нефти за 60 суток, %Oil destruction in 60 days,% до внесения биопрепа
рата before applying biofeedback
rata через 60 суток после внесения биопрепарата 60 days after the introduction of the biological product Почва+нефть+биопрепаратSoil + oil + biological product 1626016260 20452045 87,4287.42 Контроль (почва+нефть)Control (soil + oil) 3439134391 2569225692 25,2925.29

Пример 3. Очистка биопрепаратом мерзлотно-торфяной почвыExample 3. Biological product treatment of permafrost-peat soil

Концентрация нефти в торфяной почве до внесения биопрепарата составила 13588 мг/кг.The concentration of oil in peat soil before the introduction of the biological product was 13588 mg / kg.

Препарат вносили в концентрации 200 г на 1 куб.м. Препарат вносили в концентрации 200 г на 1 кв.м при глубине загрязнения 20 см. На протяжении эксперимента (60 суток) определяли динамику численности микроорганизмов, максимум которых в нефтезагрязненной почве увеличился после внесения биопрепарата на 4 порядка с 2,18·10⁵ до 33,0·10⁹ кл/г. Динамика роста согласуется с деструктивной активностью микроорганизмов. Эффективность биодеградации нефти биопрепаратом оценивают гравиметрическим методом (РД 39-0147098-90, 1990). Содержание нефти в почве после внесения биопрепарата составила 7391 мг/кг. Таким образом, биодеградация нефти в мерзлотно-торфяной почве за 60 суток составила 88,64%. В контрольном участке, не обработанном биопрепаратом в процессе естественного окисления, деструкция нефтезагрязнения за тот же промежуток времени составила 2,15% (таблица 9).The drug was added at a concentration of 200 g per 1 cubic meter. The drug was applied at a concentration of 200 g per 1 sq.m with a depth of contamination of 20 cm. During the experiment (60 days), the dynamics of the number of microorganisms was determined, the maximum of which in oil-contaminated soil increased after application of the biological product by 4 orders of magnitude from 2.18 · 10 ⁵ to 33 0 · 10 ⁹ cells / g. Growth dynamics are consistent with the destructive activity of microorganisms. The effectiveness of biodegradation of oil by a biological product is evaluated by the gravimetric method (RD 39-0147098-90, 1990). The oil content in the soil after application of the biological product was 7391 mg / kg. Thus, the biodegradation of oil in permafrost-peat soil over 60 days amounted to 88.64%. In the control plot, not treated with a biological product in the course of natural oxidation, the destruction of oil pollution over the same period of time was 2.15% (table 9).

Таблица 9Table 9 Динамика деструкции нефти в мерзлотно-торфяной почвеDynamics of oil destruction in permafrost-peat soil Вариант опытаExperience option Содержание нефти, мг/кгThe oil content, mg / kg Деструкция нефти за 60 суток, %Oil destruction in 60 days,% до внесения биопрепа-
ратаbefore applying bioprepa-
rata через 60 суток после внесения биопрепарата60 days after the introduction of the biological product Почва+нефть+биопрепаратSoil + oil + biological product 1358813588 73917391 88,6488.64 Контроль (почва+нефть)Control (soil + oil) 9904999049 9691896918 2,152.15

Таким образом, результаты экспериментов показывают, что применение предлагаемого биопрепарата через 60 суток снижает уровень нефтезагрязнения в различных типах мерзлотных почв на 87-88%.Thus, the experimental results show that the use of the proposed biological product after 60 days reduces the level of oil pollution in various types of permafrost soils by 87-88%.

Преимуществом предлагаемого «Биопрепарата для биоремедиации нефтезагрязненных почв для климатических условий Крайнего Севера» является то, что он благодаря совокупности уникальных свойств субстрата-носителя (цеолитизированного туфа) и иммобилизованным на его поверхности штаммов-нефтедеструкторов в составе: Bacillus vallismortis ELA-4 ВКПМ В-11017, Exiguobacterium mexicanum ELA-5 ВКПМ B-11011, Serratia plymuthica ELA-9 VKM B-2819D, Rhodococcus sp. LER-12 BKM Ac-2626D обладает способностью в сравнительно короткий промежуток времени (60 суток) снижать уровень нефтезагрязнения в различных типах мерзлотных почв на 87-88%.The advantage of the proposed “Biological product for bioremediation of oil-contaminated soils for the climatic conditions of the Far North” is that it is due to the combination of unique properties of the carrier substrate (zeolitized tuff) and oil-degrading strains immobilized on its surface in the composition: Bacillus vallismortis ELA-11 VKPM В , Exiguobacterium mexicanum ELA-5 VKPM B-11011, Serratia plymuthica ELA-9 VKM B-2819D, Rhodococcus sp. LER-12 BKM Ac-2626D has the ability in a relatively short period of time (60 days) to reduce the level of oil pollution in various types of permafrost soils by 87-88%.

Кроме того, большая удельная поверхность, высокая твердость, свободная сыпучесть субстрата-носителя способствуют структурированию нефтезагрязненной почвы, повышают доступ кислорода для почвенной микрофлоры, способствуют формированию в загрязненной почве центров активной деструкции нефтяных углеводородов.In addition, a large specific surface, high hardness, and free flowability of the carrier substrate contribute to the structuring of oil-contaminated soil, increase oxygen access for soil microflora, and contribute to the formation of centers of active destruction of petroleum hydrocarbons in contaminated soil.

Минеральные компоненты субстрата-носителя и субстрата для микроорганизмов служат источниками макро- и микроэлементов, необходимых для активизации нефтеокисляющих и азотфиксирующих микроорганизмов мерзлотной почвы, что приводит к пролангированию активности полезной микрофлоры в условиях короткого вегетационного периода и к сокращению сроков самовосстановления нарушенной экосистемы, позволяет значительно сократить расход минеральных удобрений при проведении мероприятий по биоремедиации нефтезагрязненных почв в условиях Крайнего Севера.The mineral components of the substrate carrier and the substrate for microorganisms serve as sources of macro- and microelements necessary for activating oil-oxidizing and nitrogen-fixing microorganisms of frozen soil, which leads to a prolongation of the activity of beneficial microflora in the short growing season and to a reduction in the self-healing time of the disturbed ecosystem, which can significantly reduce consumption fertilizers during bioremediation of oil-contaminated soils in Kraineg conditions about the North.

Таким образом, применение предлагаемого биопрепарата позволяет за короткий срок (60 суток) добиться высокой степени очистки почв и грунтов от нефти и нефтепродуктов в условиях холодного климата Крайнего Севера без передвижения почвенного слоя на 87-88%.Thus, the use of the proposed biological product allows for a short period (60 days) to achieve a high degree of purification of soils and soil from oil and oil products in the cold climate of the Far North without moving the soil layer by 87-88%.

Claims

1. Biological product for bioremediation of oil-contaminated soils for the climatic conditions of the Far North, characterized in that it contains a solid substrate carrier and a consortium of hydrocarbon-oxidizing microorganisms immobilized on its surface, acting as biodestructors - strains of Bacillus vallismoris VKPM B-11011 Exum Banguericum bumantum 11011 Exgu , Serratia plymuthica VKM B-2819D, Rhodococcus sp. BKM Ac-2626D, and a mineral nutrient substrate for bacteria.

2. The biological product according to claim 1, characterized in that, as oil destructors, it contains equal proportions of a consortium of hydrocarbon-oxidizing microorganisms in a concentration of at least 1 × 10 ⁹ cells / cm ³ isolated from permafrost soils and soils contaminated with oil and oil products.

3. The biological product according to claim 1, characterized in that a natural zeolite is used as a carrier for hydrocarbon-oxidizing microorganisms, combining the properties of a carrier for microorganisms and a sorbent for oil, with the possibility of prolonging the destruction of petroleum hydrocarbons.

4. The biological product according to claim 1, characterized in that as an additional mineral nutrient substrate for bacteria contains mineral components in the following ratio (g), KNO ₃ - 4.0; MgSO ₄ · 7H ₂ O — 0.8; NaCl - 1.0; To ₂ HPO ₄ - 1.4; KH ₂ PO ₄ - 0.6.