RU2557951C1 - Способ получения мультиплексного риккетсиального диагностикума - Google Patents
Способ получения мультиплексного риккетсиального диагностикума Download PDFInfo
- Publication number
- RU2557951C1 RU2557951C1 RU2014121164/15A RU2014121164A RU2557951C1 RU 2557951 C1 RU2557951 C1 RU 2557951C1 RU 2014121164/15 A RU2014121164/15 A RU 2014121164/15A RU 2014121164 A RU2014121164 A RU 2014121164A RU 2557951 C1 RU2557951 C1 RU 2557951C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- coxiella
- rickettsia
- nanoparticles
- multiplex
- diagnostic preparation
- Prior art date
Links
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
Изобретение относится к медицине, а именно к диагностике риккетсиозов, и может быть использовано для выявления антител к риккетсиям Провачека и коксиеллам Бернета в сыворотке крови людей, а также при изучении иммунологической структуры населения и проверке эффективности вакцинации. Способ получения мультиплексного риккетсиального диагностикума включает в себя метку корпускулярных антигенов риккетсий и коксиелл полупроводниковыми коллоидными наночастицами разного цвета флуоресценции. Корпускулярные антигены риккетсий Провачека конъюгируют с наночастицами с длиной волны флуоресценции в красном диапазоне спектра (610-670 нм), а корпускулярный антиген коксиелл Бернета - с наночастицами с длиной волны флуоресценции в зеленом диапазоне спектра (520-540 нм). Конъюгацию проводят в течение 1 часа при постоянном перемешивании. Удаление непрореагировавших наночастиц проводят методом гель-фильтрации на сефадексе G-25. Затем меченые риккетсии и коксиеллы соединяют в мультиплексный диагностикум и используют его в иммунофлуоресцентной реакции наноагглютинации (ИФРНА). Мультиплексный диагностикум позволяет выявлять антитела одновременно к риккетсиям Провачека и коксиеллам Бернета в одной постановке ИФРНА. Способ упрощает выявление специфических антител в сыворотке крови людей, сокращает время проведения реакции в 2 раза и повышает специфичность детекции иммунофлуоресцентного анализа. 3 табл., 3 пр.
Description
Изобретение относится к медицине, а именно к диагностике риккетсиозов, и может быть использовано для выявления антител к риккетсиям Провачека и коксиеллам Бернета в сыворотке крови людей, а также при изучении иммунологической структуры населения и проверке эффективности вакцинации.
Известен способ получения флуоресцирующих риккетсиальных диагностикумов для иммунофлуоресцентной реакции микроагглютинации (П.С. Барбан, В.Я. Мирский. Лаб. дело, 1973, №1. с 28-30; П.С. Барбан, В.Я. Мирский. - Лаб. дело, 1975, №5, с. 315).
Однако при этом способе каждый вид риккетсий и коксиелл был конъюгирован с органическим красителем (изотиоцианатом флуоресцеина - ФИТЦ) и использован в раздельных постановках в иммунофлуоресцентной реакции микроагглютинации (ИФРМА). Меченые риккетсии и коксиеллы окрашиваются ФИТЦем в зеленый цвет и не могут быть индицированы в едином диагностикуме. Кроме того, технология приготовления таких диагностикумов длительна и энергоемка (18 часов конъюгация и 3-5-кратное высокоскоростное центрифугирование).
Целью изобретения является упрощение способа выявления антител к риккетсиям и коксиеллам в сыворотке крови людей, сокращение постановки реакции в 2 раза и повышение детекции (фотостабильность и высокая яркость) иммунофлуоресцентного анализа.
Сущность способа заключается в получении мультиплексного диагностикума путем соединения риккетсий Провачека и коксиелл Бернета, меченных наночастицами, разными по цвету флуоресценции, и использовании их для одновременного выявления антител к риккетсиям Провачека и коксиеллам Бернета в одной постановке иммунофлуоресцентной реакции наноагглютинации (ИФРНА).
Для метки риккетсиальных и коксиеллезного антигенов используют полупроводниковые коллоидные наночастицы, обладающие флуоресценцией в разных диапазонах видимого спектра (Воробьев И.А., Рафаловская-Орловская Е.П., Гладких А.А., Поташникова Д.М., Бартенева Н.С. Цитология. 2011, т. 53, №5, с. 392-403; Патент RU 2381304 РФ). Корпускулярный антиген риккетсий Провачека конъюгируют с наночастицами с длиной волны флуоресценции в красном диапазоне спектра (610-670 нм), а корпускулярный антиген коксиелл Бернета - с наночастицами с длиной волны флуоресценции в зеленом диапазоне спектра (520-540 нм). Конъюгацию проводят в течение 1 часа при постоянном перемешивании. Удаление непрореагировавших наночастиц осуществляют методом гель-фильтрации на сефадексе G-25. Затем меченые риккетсии и коксиеллы соединяют в мультиплексный диагностикум и используют его в иммунофлуоресцентной реакции наноагглютинации (ИФРНА) для выявления антител одновременно к риккетсиям Провачека и коксиеллам Бернета.
Пример 1. Получение меченого антигена риккетсий Провачека.
В качестве исходного материала используют корпускулярный антиген риккетсий Провачека (патент №2062110 РФ). Содержимое ампулы с антигеном ресуспендируют в 0,05 М боратном буфере pH 7,2 до концентрации риккетсий 1×109 степени. К взвеси риккетсий добавляют 10 мкл коллоидного раствора наночастиц с длиной волны флуоресценции в красном диапазоне спектра (610-670 нм) и содержанием частиц 3,0×10-5 мол/л. Конъюгацию риккетсий и наночастиц проводят при постоянном перемешивании при температуре 6-10°C в течение 1 часа. Непрореагировавшие наночастицы удаляют методом гель-фильтрации на сефадексе G-25. Элюат стандартизуют до 1×109 в 1 мл и контролируют на иммунофлуоресцентную активность и отсутствие спонтанной агглютинации в ИФРНА.
| Таблица №1 | ||||
| Исследование иммунных сывороток к риккетсиям и коксиеллам с меченым антигеном риккетсий Провачека в иммунофлуоресцентной реакции наноагглютинации | ||||
| № пп | Наименование исследуемой сыворотки | Количество сывороток | Иммунофлуоресцентная активность (средний геометрический титр) | Индикация положительного результата |
| 1 | Сыворотки к риккетсиям Провачека | 10 | 1:208 | 4+ агглютинаты красного цвета |
| 2 | Сыворотки к коксиеллам Бернета | 10 | отсутствует | Изолированные риккетсии красного цвета |
| 3 | Контроль | отсутствует | Изолированные риккетсии красного цвета | |
Результаты исследований приведены в табл. 1, из которой видно, что предложенный меченый антиген Провачека агглютинируется (4+) антителами к риккетсиям Провачека, находящимися в гомологичных сыворотках, не взаимодействует с гетерологичными сыворотками (к коксиеллам Бернета) и располагается изолированно, как и в контроле.
Пример 2. Получение меченого антигена коксиелл Бернета
В качестве исходного материала используют корпускулярный антиген коксиелл Бернета (патент №2167674 РФ). Содержимое ампулы с антигеном ресуспендируют в 0,05 М боратном буфере pH 7,2 до концентрации коксиелл 1×109 степени. К взвеси коксиелл добавляют 10 мкл коллоидного раствора наночастиц с длиной волны флуоресценции в зеленом диапазоне спектра (520-540 нм) и содержанием частиц 3,0×10-5 мол/л. Конъюгацию коксиелл и наночастиц проводят при постоянном перемешивании при температуре 6-10°C в течение 1 часа. Удаление непрореагировавших наночастиц проводят методом гель-фильтрации на сефадексе G-25. Элюат стандартизуют до 1×109 коксиелл в 1 мл и контролируют на иммунофлуоресцентную активность и отсутствие спонтанной агглютинации в ИФРНА.
| Таблица №2 | ||||
| Исследование иммунных сывороток к риккетсиям и коксиеллам с меченым антигеном коксиелл Бернета в ИФРНА | ||||
| № пп | Наименование исследуемой сыворотки | Количество сывороток | Иммунофлуоресцентная активность (средний геометрический титр) | Индикация положительного результата |
| 1 | Сыворотки к коксиеллам Бернета | 10 | 1:120 | 3+ агглютинаты коксиелл зеленого цвета |
| 2 | Сыворотки к риккетсиям Провачека | 10 | отсутствует | Изолированные коксиеллы зеленого цвета |
| 3 | Контроль | отсутствует | Изолированные коксиеллы зеленого цвета | |
Результаты исследований приведены в табл. 2, из которой видно, что антитела к коксиеллам Бернета, находящиеся в гомологичных сыворотках, вызывают агглютинацию (3+) коксиелл, в то время как в реакции с гетерологичными сыворотками и в контроле коксиеллы располагаются изолированно.
Пример 3. Отстандартизованные антигены, меченые разными цветами, объединяют в соотношении 1:1 и проверяют на иммунофлуоресцентную активность, отсутствие спонтанной агглютинации и специфичность детекции. При получении положительного результата с гомологичными сыворотками (образование 3+ - 4+ агглютинатов), отсутствии спонтанной агглютинации, отсутствии агглютинации с гетерологичными сыворотками, мультиплексный диагностикум используют для диагностики сыпного тифа и коксиллеза.
| Таблица №3 | ||||
| Исследование иммунных сывороток к риккетсиям Провачека и коксиеллам Бернета с мультиплексным диагностикумом в ИФРНА | ||||
| № пп | Наименование исследуемой сыворотки | Количество сывороток | Иммунофлуоресцентная активность (средний геометрический титр) | Индикация положительного результата флуоресценции |
| 1 | Сыворотки к риккетсиям Провачека | 10 | 1:160 | 4+ агглютинаты риккетсий Провачека красного цвета, изолированные коксиеллы Бернета зеленого цвета |
| 2 | Сыворотки к коксиеллам Бернета | 10 | 1:69 | 3+ агглютинаты коксиелл Бернета зеленого цвета, изолированные риккетсии Провачека красного цвета, |
| 3 | Контроль | отсутствует | Изолированные риккетсии Провачека красного цвета, изолированные коксиеллы Бернета - зеленого цвета | |
Таким образом, приготовленный мультиплексный диагностикум (табл. 3) обладает достаточной иммунофлуоресцентной активностью с гомологичными сыворотками и не взаимодействует с гетерологичными сыворотками, не дает спонтанной агглютинации в контроле и позволяет четко индифицировать по цвету флуоресценции риккетсии Провачека и коксиеллы Бернета в одной постановке ИФРНА. Возможность использования мультиплексного риккетсиального диагностикума для одновременного определения антител к риккетсиям Провачека и коксиеллам Бернета сокращает время проведения реакции в 2 раза и улучшает детекцию иммунофлуоресцентного анализа за счет фотостабильности и яркости наночастиц.
Claims (1)
- Способ получения мультиплексного риккетсиального диагностикума, включающий метку корпускулярных антигенов риккетсий Провачека в концентрации 1×109 наночастицами с длиной волны флуоресценции в красном диапазоне спектра (610-670 нм), коксиелл Бернета в концентрации 1×109 - наночастицами с длиной волны флуоресценции в зеленом диапазоне спектра (520-540 нм), конъюгацию в течение 1 часа, удаление непрореагировавших реагентов методом гель-фильтрации на сефадексе G-25, соединение активных меченых антигенов в мультиплексный диагностикум в соотношении 1:1.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2014121164/15A RU2557951C1 (ru) | 2014-05-27 | 2014-05-27 | Способ получения мультиплексного риккетсиального диагностикума |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2014121164/15A RU2557951C1 (ru) | 2014-05-27 | 2014-05-27 | Способ получения мультиплексного риккетсиального диагностикума |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2557951C1 true RU2557951C1 (ru) | 2015-07-27 |
Family
ID=53762599
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2014121164/15A RU2557951C1 (ru) | 2014-05-27 | 2014-05-27 | Способ получения мультиплексного риккетсиального диагностикума |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2557951C1 (ru) |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2062110C1 (ru) * | 1993-08-03 | 1996-06-20 | Научно-производственное объединение "Биомед" | Способ получения диагностикума риккетсиозного провачека, корпускулярного |
| EP2245186A2 (en) * | 2008-01-14 | 2010-11-03 | Ultrapid Nanodiagnostics, Inc. | Rapid test including genetic sequence probe |
| RU2413533C2 (ru) * | 2009-05-26 | 2011-03-10 | Федеральное государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Омский государственный аграрный университет" | Способ получения сыворотки для диагностики коксиеллеза крупного рогатого скота в реакции непрямой иммунофлуоресценции |
| US20140094383A1 (en) * | 2012-10-02 | 2014-04-03 | Ohio State Innovation Foundation | Tethered Lipoplex nanoparticle Biochips And Methods Of Use |
-
2014
- 2014-05-27 RU RU2014121164/15A patent/RU2557951C1/ru active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2062110C1 (ru) * | 1993-08-03 | 1996-06-20 | Научно-производственное объединение "Биомед" | Способ получения диагностикума риккетсиозного провачека, корпускулярного |
| EP2245186A2 (en) * | 2008-01-14 | 2010-11-03 | Ultrapid Nanodiagnostics, Inc. | Rapid test including genetic sequence probe |
| RU2413533C2 (ru) * | 2009-05-26 | 2011-03-10 | Федеральное государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Омский государственный аграрный университет" | Способ получения сыворотки для диагностики коксиеллеза крупного рогатого скота в реакции непрямой иммунофлуоресценции |
| US20140094383A1 (en) * | 2012-10-02 | 2014-04-03 | Ohio State Innovation Foundation | Tethered Lipoplex nanoparticle Biochips And Methods Of Use |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN105308458B (zh) | 用于进行过敏症和自身免疫性疾病的诊断测定的自动化免疫分析系统 | |
| CN101587043B (zh) | 从生物体液样本中富集与检测稀有细胞的整合方法 | |
| Gardner et al. | Application of immunofluorescent antibody technique in rapid diagnosis of respiratory syncytial virus infection | |
| Fletcher | Indirect fluorescent antibody technique in the serology of Toxoplasma gondii | |
| CN109187981A (zh) | 一种快速检测β-淀粉样蛋白的量子点免疫层析试纸条与应用 | |
| CN101413955A (zh) | 一种检测玉米赤霉烯酮的elisa测试盒及制备及检测方法 | |
| Wieser et al. | Efficient quantification and characterization of bacterial outer membrane derived nano-particles with flow cytometric analysis | |
| CN109254148A (zh) | 人体外周血t细胞免疫功能精简评估试剂盒及评估方法 | |
| Seo et al. | Engineered nanoconstructs for the multiplexed and sensitive detection of high-risk pathogens | |
| EP2433964A1 (en) | Peptide inducing xage-1b-specific immune reaction and utilization of same | |
| Zhai et al. | Rapid detection of Vibrio parahaemolyticus using magnetic nanobead-based immunoseparation and quantum dot-based immunofluorescence | |
| RU2557951C1 (ru) | Способ получения мультиплексного риккетсиального диагностикума | |
| CN101065669A (zh) | 细胞毒性测定法 | |
| Gordon | Rapid serological differentiation of Candida albicans from Candida stellatoidea | |
| CN102313813B (zh) | 从生物体液样本中富集与检测稀有细胞的整合方法 | |
| Chowdhury et al. | Prevalence of agglutinating anti-Leishmania antibodies in two multi-thousand Bengoli communities | |
| CN101381410A (zh) | 罗丹明123人工抗原合成、抗体制备方法及应用 | |
| US20110070599A1 (en) | Method for Screening of Active Tuberculosis | |
| Zarei et al. | Peptide-based polyclonal antibody production against P110 protein of Mycoplasma genitalium | |
| CN109439624A (zh) | 一种用于识别或富集有核红细胞的方法 | |
| CN105911292B (zh) | 用于组合分析CD11c+CD11b+ DC亚群以及其分化程度和功能的试剂盒及方法 | |
| Honigberg et al. | Trypanosoma brucei: antigenic analysis of bloodstream, vector, and culture stages by the quantitative fluorescent antibody methods | |
| Boulanger et al. | IV. Demonstration of the Viral Antigen by Means of Immunofluorescence | |
| Cakir-Koc et al. | Conjugation and Characterization of Latex Particles with Toxoplasma gondii–specific Immunoglobulin Y Antibodies for Diagnostic Aim and Evaluation Efficiency in In Vitro Culture | |
| EP2909630A1 (fr) | Antigenes gra recombinants et leur application pour le diagnostic precoce de la toxoplasmose |