RU2542523C1 - Способ микробиологической обработки целлюлозосодержащего сырья - Google Patents
Способ микробиологической обработки целлюлозосодержащего сырья Download PDFInfo
- Publication number
- RU2542523C1 RU2542523C1 RU2013147322/13A RU2013147322A RU2542523C1 RU 2542523 C1 RU2542523 C1 RU 2542523C1 RU 2013147322/13 A RU2013147322/13 A RU 2013147322/13A RU 2013147322 A RU2013147322 A RU 2013147322A RU 2542523 C1 RU2542523 C1 RU 2542523C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cellulose
- containing raw
- substrate
- microbiological
- per
- Prior art date
Links
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии и кормопроизводства и может быть использовано при переработке целлюлозосодержащего сырья. Предварительно подготовленное увлажненное до содержания влаги 65% целлюлозосодержащее сырье засевают посевным материалом. Для подготовки посевного материала используют субстрат, состоящий из 1 части воды и 1 части размола, с добавлением микробиологического препарата «Байкал ЭМ-1» в концентрации 0,08 г на 1 кг субстрата с внесением 0,5% раствора лактозы из расчета 100 г на 1 кг субстрата. Предварительная обработка целлюлозосодержащего сырья заключается в термогидролизе при температуре 24-26°C. Процесс микробиологической обработки проводят в течение трех суток в анаэробных условиях при температуре 24-26°C с начальным pH 5,4-5,5, при этом через 36 часов от начала процесса микробиологической обработки вносят 0,5% раствор лактозы из расчета 100 г на 1 кг предварительно обработанного целлюлозосодержащего сырья. Осуществление изобретения позволяет сократить время разложения целлюлозосодержащего материала и повысить качество готового кормового продукта с повышением содержания в нем сырого протеина. 1 з.п. ф-лы, 6 табл., 4 пр.
Description
Изобретение относится к области биотехнологии, микробиологической и перерабатывающей промышленности и может быть использовано при переработке целлюлозосодержащего сырья (отходов сельскохозяйственного производства) с целью получения кормовых продуктов для сельскохозяйственных животных и птицы на фермах, животноводческих и птицеводческих комплексах.
Ежегодный естественный прирост целлюлозы в мире составляет около 100 млрд тонн. Сельскохозяйственное производство зерновых приводит к накоплению огромных запасов отходов: соломы, шелухи, мучки и др., практически не востребованных в настоящее время из-за сложности и высокой себестоимости переработки. Сложность переработки целлюлозосодержащего сырья обусловлена длительностью деструкции целлюлозного комплекса отходов. Известно, что в состав соломы злаковых культур входит 50-60% целлюлозы и 10-20% лигнина, которые должны быть предварительно разрушены почвенными целлюлозолитическими микроорганизмами до простых сбраживаемых сахаров. Полученные моносахара могут быть использованы впоследствии в качестве источника энергии для почвенных микроорганизмов, например для азотфиксирующих, присутствующих в почве и способных связывать атмосферный азот в доступные для растений формы.
Процесс расщепления целлюлозного комплекса соломы в природе за счет почвенных микроорганизмов очень длителен и протекает в течение нескольких месяцев даже при благоприятных внешних условиях. Кроме того, известно, что в естественных условиях на целлюлозосодержащих отходах природная почвенная ассоциация целлюлозолитических микроорганизмов образуется только через 120 дней [Antunes L.A., Agr. Siol. Technol., 1986, V.29, N.3. pp.533-543] - (1).
Известен способ ферментативной переработки целлюлозосодержащего сырья с использованием культуры гриба Rleurotus ostreatus на корм животным. Процесс длится до 10 суток [патент RU 2080078, A23K 1/00, 27.05.1997] - (2).
Известен способ получения биологически активного корма из целлюлозосодержащего сырья с использованием культуры гриба Agricus bisporus. Процесс длится до 7 суток [патент RU 2097979, A23K 1/00, 10.12.1997] - (3).
Кроме того, разрушение микроорганизмами клетчатки в природе происходит под действием не одной какой-либо группы, а комплексом, включающим и бактерии, и грибы, и дрожжи. Одна группа способствует подготовке субстрата для других [Стейнифорт А.Р. Солома злаковых культур. Пер. с англ. - М.: Колос, 1983. - с.77-178] - (4).
Наиболее близким способом по технической сущности и достигаемому эффекту является способ ферментативной переработки целлюлозосодержащих материалов в кормовые продукты с использованием ассоциации штаммов микроорганизмов, содержащей культуры Syncephalastrum racemosum (Mucoralus) и Allescherie terrestris. Процесс ферментации целлюлозосодержащего сырья без учета предварительной подготовки посевного материала по вышеприведенному способу составляет 4 суток. В процессе ферментации разрушается 54% полисахаридов и 70% лигнина [патент RU 2169760, A23K 1/00, 27.06.2001] - (5).
Недостатком известного способа является необходимость предварительной подготовки посевного материала в течение 10-15 суток и обеспечение стерильных условий на этой стадии.
Задачей предлагаемого способа является обеспечение возможности ускоренной микробиологической переработки целлюлозосодержащего сырья.
Техническим результатом, получаемым в результате реализации изобретения, является сокращение времени предварительного выращивания посевного материала.
Поставленная задача решается благодаря тому, что в известном способе микробиологической обработки целлюлозосодержащего сырья, заключающемся в том, что предварительно подготовленное увлажненное до содержания влаги 65% целлюлозосодержащее сырье засевают посевным материалом, согласно изобретению для подготовки посевного материала используют субстрат, состоящий из 1 части воды и 1 части размола, с добавлением микробиологического препарата «Байкал ЭМ-1» в концентрации 0,08 г на 1 кг субстрата с внесением 0,5% раствора лактозы из расчета 100 г на 1 кг субстрата, при этом предварительная обработка целлюлозосодержащего сырья заключается в термогидролизе при температуре 24-26°C, а процесс микробиологической обработки проводят в течение трех суток в анаэробных условиях при температуре 24-26°C с начальным pH 5,4-5,5, при этом через 36 часов от начала процесса микробиологической обработки вносят 0,5% раствор лактозы из расчета 100 г на 1 кг предварительно обработанного целлюлозосодержащего сырья. Для предварительной подготовки целлюлозосодержащего сырья можно также использовать процесс термической обработки при температуре 100°C.
Используемая ассоциация микроорганизмов микробиологического препарата «Байкал ЭМ-1» представлена следующими видами: фотосинтезирующими и молочнокислыми бактериями, дрожжами, актиномицетами, ферментирующими грибами родов Aspergillus и Penicillium. Штаммы способны синтезировать целлюлозолитические ферменты и одноклеточный белок. Микроорганизмы биопрепарата не являются спорообразующими, согласно СанПин 23.2.1078-01 они входят в перечень веществ, не оказывающих вредного воздействия на кормовые продукты.
Целлюлозосодержащее сырье - солома злаковых культур - обладает невысокой питательной ценностью и состоит, главным образом, из полисахаридов (таблица 1).
| Таблица 1 | ||
| Химический состав соломы злаковых культур | ||
| показатели | содержание, % а.с.в. | |
| солома пшеницы | солома гречихи | |
| Целлюлоза | 41,52±0,4 | 38,2±0,78 |
| Гемицеллюлоза | 23,23±0,13 | 20,89±0,17 |
| Лигнин | 21,37±0,81 | 20,51±1,01 |
| сырая клетчатка | 34,02±0,84 | 44,95±1,28 |
| сырой протеин | 4,52±0,09 | 2,95±0,08 |
| сырой жир | 1,46±0,17 | 1,18±0,01 |
| сырая зола | 4,14±0,04 | 2,19±0,12 |
Наибольшее значение в разложении клетчатки имеют почвенные микроорганизмы, которые способствуют эффективному разложению этого компонента в природе в кислых почвах (лесные подстилки, кислые торфяники, подзолы).
Пример 1.
Для эффективной деструкции углеводного комплекса целлюлозосодержащего сырья необходимы условия, в которых будет превалирующим действие целлюлозолитических микроорганизмов биологического препарата. Исходя из этого, приготовление посевного материала проводили при pH 5,4-5,5 с внесением 0,5% раствора лактозы. К субстрату, состоящему из 1 части размола (0,3 части проросших зерен ячменя и 0,7 части пшеничных отрубей) и 1 части воды, нагретой до температуры 80-100°C, добавляли микробиологический препарат «Байкал ЭМ-1» из расчета 0,08 г на 1 кг субстрата и 0,5% раствор лактозы из расчета 100 г на 1 кг субстрата. Полученную таким образом закваску оставляли для созревания на 5-6 часов, а без лактозы на 10-12 часов при комнатной температуре. Полученный подобным образом посевной материал использовали при засеве целлюлозосодержащего сырья. Для этого в камеру объемом 3000 мл поместили измельченную пропаренную при температуре 100°C солому пшеницы, увлажнили ее до содержания влаги 65% и добавили посевной материал. Ферментацию проводили в течение 3 суток (72 часа) в анаэробных условиях при температуре 24-26°C с начальным pH 5,4-5,5. Спустя 36 часов в конце экспоненциальной фазы роста микроорганизмов для активации биосинтеза целлюлозолитических ферментов в субстрат вносили 0,5% раствор лактозы дискретно (из расчета 100 г на 1 кг сырья). Эффективность деструкции целлюлозного комплекса соломы пшеницы оценивали по накоплению редуцирующих веществ в ферментолизате (таблица 2).
| Таблица 2 | ||||||
| Эффективность процесса биодеструкции нативной соломы пшеницы по накоплению редуцирующих веществ | ||||||
| Условия микробиологической обработки | Содержание редуцирующих веществ, % | |||||
| Время микробиологической обработки, ч | ||||||
| 12 | 24 | 36 | 48 | 60 | 72 | |
| Без внесения лактозы | 2,18±0,11 | 3,19±0,05 | 4,23±0,06 | 5,56±0,16 | 7,16±0,13 | 8,3±0,13 |
| С внесением лактозы через 36 часов ферментации | 2,18±0,11 | 3,19±0,05 | 5,08±0,03 | 6,13±0,09 | 9,0±0,08 | 9,65±0,06 |
Через 70-72 часов ферментации разрушилось 47,86% полисахаридов и 72,67% лигнина. Содержание сырого протеина составило 5,93%, что на 1,41% больше, чем в нативной соломе пшеницы. Содержание редуцирующих веществ с внесением лактозы на 16,27% больше, чем без внесения этого компонента (таблица 3). Результаты микробиологической обработки нативной соломы пшеницы представлены в таблице 3.
| Таблица 3 | ||
| Состав полученных продуктов после микробиологической обработки нативной соломы пшеницы | ||
| Показатели | Содержание, % а.с.в. | |
| без внесения раствора лактозы | с внесением раствора лактозы | |
| Целлюлоза и гемицеллюлоза | 35,72±0,005 | 33,76±0,22 |
| Лигнин | 5,63±0,02 | 5,84±0,02 |
| Сырой протеин | 5,11±0,02 | 5,93±0,02 |
| PB | 8,3±0,13 | 9,65±0,06 |
| pH | 6,4±0,03 | 6,47±0,06 |
Пример 2.
Микробиологическую обработку нативной соломы пшеницы проводили аналогично примеру 1, только вместо пропаривания при температуре 100°C солому подвергали термогидролизу при pH 3,0, температура 112°C, давление 0,5 атм, время экспозиции 25 минут. Затем pH ферментационного субстрата доводили до 5,4-5,5. Через 70-72 часов ферментации разрушилось 56,14% полисахаридов и 78,38% лигнина. Содержание сырого протеина составило 8,55%, что на 4,02% больше, чем в нативной соломе пшеницы. Содержание редуцирующих веществ с внесением лактозы на 23,54% больше, чем без внесения этого компонента (таблица 4).
| Таблица 4 | ||
| Состав полученных продуктов после микробиологической обработки прогидролизованной соломы пшеницы | ||
| Показатели | Содержание, % а.с.в. | |
| без внесения раствора лактозы | с внесением раствора лактозы | |
| Целлюлоза и гемицеллюлоза | 28,98±0,02 | 28,4±0,02 |
| Лигнин | 4,54±0,04 | 4,58±0,15 |
| Сырой протеин | 7,34±0,03 | 8,55±0,05 |
| PB | 11,64±0,03 | 14,38±0,02 |
| pH | 6,45± | 6,53±0,004 |
Пример 3.
Микробиологическую обработку проводили аналогично примеру 1, только в качестве целлюлозосодержащего сырья использовали нативную солому гречихи. Через 70-72 часов ферментации разрушилось 35,76% полисахаридов и 61,04% лигнина. Содержание сырого протеина составило 5,52%, что на 2,58% больше, чем в нативной соломе гречихи. Содержание редуцирующих веществ с внесением 0,5% раствора лактозы на 36,18% больше, чем без внесения этого компонента (таблица 5).
| Таблица 5 | ||
| Состав полученных продуктов после микробиологической обработки нативной соломы гречихи | ||
| Показатели | Содержание, % а.с.в. | |
| без внесения раствора лактозы | с внесением раствора лактозы | |
| Целлюлоза и гемицеллюлоза | 37,99±0,02 | 37,96±0,02 |
| Лигнин | 7,97±0,01 | 7,99±0,06 |
| Сырой протеин | 4,97±0,02 | 5,52±0,03 |
| PB | 5,86±0,05 | 7,98±0,01 |
| pH | 6,28±0,03 | 6,45±0,04 |
Пример 4.
Микробиологическую обработку соломы гречихи проводили аналогично примеру 3, только вместо термической обработки сырья (при 100°C), субстрат подвергали термогидролизу при pH 3,0, температуре 112°C, время экспозиции 25 минут. Затем pH ферментационного субстрата доводили до pH 5,4-5,5. Через 70-72 часов ферментации разрушилось 50,13% полисахаридов и 71,62% лигнина. Содержание сырого протеина составило 8,14%, что на 5,19% больше, чем в нативной соломе гречихи. Содержание редуцирующих веществ с внесением 0,5% раствора лактозы на 40,88% больше, чем без внесения этого компонента (таблица 6).
| Таблица 6 | ||
| Состав полученных продуктов после микробиологической обработки прогидролизованной соломы гречихи | ||
| Показатели | Содержание, % а.с.в. | |
| без внесения раствора лактозы | с внесением раствора лактозы | |
| Целлюлоза и гемицеллюлоза | 30,99±0,02 | 29,47±0,01 |
| Лигнин | 5,75±0,05 | 5,82±0,02 |
| Сырой протеин | 7,21±0,02 | 8,14±0,02 |
| PB | 10,03±0,05 | 14,13±0,01 |
| pH | 6,26±0,02 | 6,3±0,03 |
Таким образом, микробиологическая обработка целлюлозосодержащего сырья биопрепаратом «Байкал ЭМ-1» снижает содержание полисахаридов в среднем на 50,13-56,14%, лигнина на 71,62-78,38%, увеличивает сырой протеин на 4,02-5,19%. Биодеструкция целлюлозосодержащего сырья эффективна при использовании прогидролизованной соломы с внесением 0,5% раствора лактозы. Содержание редуцирующих веществ в таких продуктах выше на 16,27-40,88%.
Техническим результатом исследования является получение кормовых продуктов, богатых биологически активными пребиотическими, пробиотическими компонентами.
Полученные экспериментальные данные определяют основные направления переработки соломы злаковых культур микробиологическим препаратом «Байкал ЭМ-1» для получения кормовых гидролизатов, а также осахаренного объемистого корма для дальнейшего применения в качестве кормового продукта в животноводстве. При этом длительность ферментации предварительно обработанного целлюлозосодержащего сырья (соломы пшеницы и гречихи) по вышеприведенным способам уменьшается до 72 часов (3 суток).
Claims (2)
1. Способ микробиологической обработки целлюлозосодержащего сырья, заключающийся в том, что предварительно подготовленное увлажненное до содержания влаги 65% целлюлозосодержащее сырье засевают посевным материалом, отличающийся тем, что для подготовки посевного материала используют субстрат, состоящий из 1 части воды и 1 части размола, с добавлением микробиологического препарата «Байкал ЭМ-1» в концентрации 0,08 г на 1 кг субстрата с внесением 0,5% раствора лактозы из расчета 100 г на 1 кг субстрата, при этом предварительная обработка целлюлозосодержащего сырья заключается в термогидролизе при температуре 24-26°C, а процесс микробиологической обработки проводят в течение трех суток в анаэробных условиях при температуре 24-26°C с начальным pH 5,4-5,5, при этом через 36 часов от начала процесса микробиологической обработки вносят 0,5% раствор лактозы из расчета 100 г на 1 кг предварительно обработанного целлюлозосодержащего сырья.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что предварительно целлюлозосодержащее сырье подвергают термической обработке при температуре 100°C.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2013147322/13A RU2542523C1 (ru) | 2013-10-23 | 2013-10-23 | Способ микробиологической обработки целлюлозосодержащего сырья |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2013147322/13A RU2542523C1 (ru) | 2013-10-23 | 2013-10-23 | Способ микробиологической обработки целлюлозосодержащего сырья |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2542523C1 true RU2542523C1 (ru) | 2015-02-20 |
Family
ID=53289051
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2013147322/13A RU2542523C1 (ru) | 2013-10-23 | 2013-10-23 | Способ микробиологической обработки целлюлозосодержащего сырья |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2542523C1 (ru) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2675311C1 (ru) * | 2018-03-05 | 2018-12-18 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Всероссийский научно-исследовательский институт сахарной свёклы и сахара имени А.Л. Мазлумова" (ФГБНУ "ВНИИСС им. А.Л. Мазлумова") | ШТАММ МИКРОМИЦЕТА Humicola fuscoatra ВНИИСС 016 - ДЕСТРУКТОР ЦЕЛЛЮЛОЗОСОДЕРЖАЩИХ СУБСТРАТОВ |
| US10357523B2 (en) * | 2012-05-14 | 2019-07-23 | Ssipfeed B.V. | Animal feed comprising grain and agaricus blazei extract and use of the feed material |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2163076C1 (ru) * | 1999-12-27 | 2001-02-20 | ОАО "Научно-исследовательский институт комплексных проблем машиностроения для животноводства и кормопроизводства" | Способ биоконверсии растительных отходов и установка для его осуществления |
| RU2169760C1 (ru) * | 1999-11-29 | 2001-06-27 | Винаров Александр Юрьевич | Способ микробиологической обработки целлюлозосодержащих материалов |
| RU2486736C1 (ru) * | 2011-11-24 | 2013-07-10 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение Высшего профессионального образования КАБАРДИНО-БАЛКАРСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ АКАДЕМИЯ ИМЕНИ В.М. КОКОВА | Способ повышения плодородия почв |
-
2013
- 2013-10-23 RU RU2013147322/13A patent/RU2542523C1/ru not_active IP Right Cessation
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2169760C1 (ru) * | 1999-11-29 | 2001-06-27 | Винаров Александр Юрьевич | Способ микробиологической обработки целлюлозосодержащих материалов |
| RU2163076C1 (ru) * | 1999-12-27 | 2001-02-20 | ОАО "Научно-исследовательский институт комплексных проблем машиностроения для животноводства и кормопроизводства" | Способ биоконверсии растительных отходов и установка для его осуществления |
| RU2486736C1 (ru) * | 2011-11-24 | 2013-07-10 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение Высшего профессионального образования КАБАРДИНО-БАЛКАРСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ АКАДЕМИЯ ИМЕНИ В.М. КОКОВА | Способ повышения плодородия почв |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| СУХАМЕРА С.А. ЭМ-ТЕХНОЛОГИЯ БИОТЕХНОЛОГИЯ ХХI ВЕКА. Сборник материалов по практическому применению препарата "Байкал ЭМ-1". Алматы: ГУП "ИПК "Чувашия", 2006 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US10357523B2 (en) * | 2012-05-14 | 2019-07-23 | Ssipfeed B.V. | Animal feed comprising grain and agaricus blazei extract and use of the feed material |
| RU2675311C1 (ru) * | 2018-03-05 | 2018-12-18 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Всероссийский научно-исследовательский институт сахарной свёклы и сахара имени А.Л. Мазлумова" (ФГБНУ "ВНИИСС им. А.Л. Мазлумова") | ШТАММ МИКРОМИЦЕТА Humicola fuscoatra ВНИИСС 016 - ДЕСТРУКТОР ЦЕЛЛЮЛОЗОСОДЕРЖАЩИХ СУБСТРАТОВ |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| van Kuijk et al. | Fungal treatment of lignocellulosic biomass: Importance of fungal species, colonization and time on chemical composition and in vitro rumen degradability | |
| Li et al. | Pretreatment of Pennisetum sinese silages with ferulic acid esterase-producing lactic acid bacteria and cellulase at two dry matter contents: fermentation characteristics, carbohydrates composition and enzymatic saccharification | |
| Darwish et al. | Nutritional value upgrading of maize stalk by using Pleurotus ostreatus and Saccharomyces cerevisiae in solid state fermentation | |
| CN103892033B (zh) | 一种饲料的制备方法 | |
| CN106396807A (zh) | 一种提高食用菌生物转化率的培养基及其制备方法和食用菌的栽培方法 | |
| CN102599344A (zh) | 一种木薯渣发酵饲料及其制备方法 | |
| KR20180011312A (ko) | 곡물 분말 내의 단백질을 농축하는 방법 | |
| CN102934737A (zh) | 一种蛋白饲料的制备方法 | |
| CN101756012A (zh) | 两步法发酵醋糟生产高赖氨酸发酵饲料的方法 | |
| CN103993043B (zh) | 同步糖化发酵生产乳链菌肽和乳酸的方法及在饲料中应用 | |
| US20140248395A1 (en) | Cellulose to protein bio-conversion method for production of edible protein | |
| CN103352016B (zh) | 利用Alteromonas colwelliana A321发酵浒苔制备生物肥 | |
| RU2542523C1 (ru) | Способ микробиологической обработки целлюлозосодержащего сырья | |
| CN1868310A (zh) | 一种桑枝生产饲料的方法 | |
| KABIRIFARD et al. | Comparing the growth rate of four Pleurotus fungi on wheat stubble and date palm leaf | |
| CN105124170A (zh) | 一种利用食用菌菌糠生产饲料的方法 | |
| CN106244491A (zh) | 一种抑制枯萎病的香蕉茎叶残体腐熟菌剂及其制备方法 | |
| CN106718042A (zh) | 一种利用竹鼠粪便栽培杏鲍菇的方法 | |
| CN106063520A (zh) | 一种高营养价值湖羊饲料的制备方法 | |
| CN103098983A (zh) | 一种制备秸秆生物饲料的方法 | |
| Zuo et al. | Effect of white-rot fungal treatments on the in vitro rumen degradability of two kinds of corn stover | |
| CN106635843B (zh) | 发酵培养基、菌糠发酵菌剂及发酵方法 | |
| CN109232049A (zh) | 一种杏鲍菇培养基及其制备方法 | |
| CN105016870A (zh) | 一种采用板栗蒲制作的蜜环菌用蓬松透气保湿型培养基以及制备方法 | |
| CN114015579A (zh) | 一种高产β-葡聚糖的出芽短梗霉及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20151024 |