RU2534558C2 - Способ получения антител на основе фракций поли-1-винилимидазола - Google Patents
Способ получения антител на основе фракций поли-1-винилимидазола Download PDFInfo
- Publication number
- RU2534558C2 RU2534558C2 RU2012145704/10A RU2012145704A RU2534558C2 RU 2534558 C2 RU2534558 C2 RU 2534558C2 RU 2012145704/10 A RU2012145704/10 A RU 2012145704/10A RU 2012145704 A RU2012145704 A RU 2012145704A RU 2534558 C2 RU2534558 C2 RU 2534558C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- poly
- vinylimidazole
- fractions
- adjuvant
- antigen
- Prior art date
Links
Landscapes
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области медицины. Предложен способ получения антител с использованием иммуноадъюванта. В качестве иммуноадъюванта используют узкие фракции поли-1-винилимидазола молекулярной массы 8800-32000, полученные дробным осаждением из раствора нефракционированного образца поли-1-винилимидазола. Фракционирование поли-1-винилимидазола проводят используя в качестве осадителей ацетон и гексан. В качестве антигена используют вакцинный препарат «Кодивак». Отсутствие в адъюванте малоактивных высоко- и низкомолекулярных полимерных фракций позволяет значительно снизить риск побочных эффектов при использовании адъюванта и понизить его действующую концентрацию в 10 раз (до 0,001 мг/мл). Изобретение может быть использовано для получения защитных антител к бактериям C. Diphteriae при вакцинопрофилактике и в производстве гипериммунных сывороток, необходимых для диагностических и лечебных целей. 3 з.п. ф-лы, 1 табл.
Description
Изобретение относится к области медицины и может быть использовано для получения защитных антител к бактериям C.Diphteriae при вакцинопрофилактике и в производстве гипериммунных сывороток, необходимых для диагностических и лечебных целей.
Известные методы получения антител основаны на введении в организм животных или человека антигенов, являющихся, как правило, белками или полисахаридами, входящими в структуру бактериальных клеток, вирусов и других микроорганизмов. Использование чистых антигенов не всегда приводит к должному ответу иммунной системы организма из-за различных факторов: низкая активность иммунокомпетентных клеток, быстрое выведение антигена из организма или их нейтрализация имеющимися антителами при наличии пассивного иммунитета, например, у новорожденных. В этой связи добиться необходимой концентрации антител удается увеличением дозы антигена и повторными вакцинациями, что экономически нецелесообразно из-за высокой стоимости антигенов и может приводить к осложнениям из-за использования больших доз чужеродного белка. Альтернативным подходом к усилению иммунной реакции в ответ на антиген является использование адъювантов - веществ, замедляющих выведение антигена из организма, стимулирующих иммунную систему и облегчающих распознавание ею антигена. Известные адъюванты относятся к нескольким основным классам: неорганические наночастицы гидроксида или фосфата алюминия [1], масляные композиции [2], водорастворимые синтетические [3-6] или биополимеры [5]. Необходимость работ по совершенствованию существующих адъювантов и разработке новых отмечается в публикациях [7], в частности, в связи с проблемой ликвидации полиомиелита [8].
Известен способ получения защитных антител к бактериям С. Diphtehriae с использование поли-1-винилимидазола в форме растворов концентрацией 0.01-0.6 мг/мл в качестве адъюванта [Патент №2205408 РФ, МПК7 G01N 33/569, А61K 31/787. Иммуноадъювантная активность поли-1-винилимидазола и способ получения антител к коринебактериям дифтерии на его основе / С.И.Лещук и др.; Иркутский институт химии им. А.Е.Фаворского СО РАН. - №2001128413/14; заявл. 18.10.2001; опубл. 27.05.2003] [9]. Преимуществами данного препарата являются низкая токсичность (LD50>1000 мг/мл); возможность формирования иммунноактивного комплекса при смешении растворов адъюванта и антигена без их ковалентного связывания; низкая вязкость раствора адъюванта, исключающая проблемы при работе с тонкими иглами в случае мелких животных.
Недостатком известного адъюванта является использование полидисперсных образцов полимера, содержащих фракции различной молекулярной массы. Как известно, физиологическая активность полимеров существенно зависит от их молекулярной массы [10]. По этой причине полидисперсные образцы могут содержать существенную долю неактивных фракций, понижающих общую активность препарата, увеличивающих токсичность вводимой дозы и возможность побочных эффектов.
Техническим результатом заявляемого изобретения является повышение активности полимерного адъюванта для снижения его действующей концентрации и уменьшения количества чужеродных веществ, вводимых в организм при иммунизации.
Технический результат достигают тем, что используют узкие фракции поли-1-винилимидазола молекулярной массы 8800-32000, полученные дробным осаждением из раствора нефракционированного образца поли-1-винилимидазола.
Фракционирование поли-1-винилимидазола проводят из этанольного раствора используя в качестве осадителей ацетон и гексан.
Для получения антител в качестве антигена используют клеточные стенки коринебактерий дифтерии (вакцинный препарат «Кодивак»).
Фракции поли-1-винилимидазола используют в виде растворов концентрации 0,001 мг/мл.
Адъювантную активность фракций определяют для растворов поли-1-винилимидазола с указанной минимально активной концентрацией, равной 0.001 мг/мл. Это в 10 раз ниже минимально активной концентрации для нефракционированного полимера [9]. В качестве антигена применяют препарат «Кодивак», представляющий собой клеточные стенки коринебактерий дифтерии [11] и использованный ранее в экспериментах с поли-1-винилимидазолом [9].
Возможность осуществления способа иллюстрируют приведенные ниже примеры его проведения в лабораторных условиях. В примере 1 описано получение фракций поли-1-винилимидазола, в примере 2 сопоставлена адъювантная активность нефракционированного поли-1-винилимидазола и его фракций с молекулярными массами 8800, 14500 и 32000. Полученные данные указывают на выраженную активность полимерных фракций, которая проявляется при их концентрации 0,001 мг/мл. Нефракционированный образец при этой концентрации неактивен, что связано с малым содержанием в нем активных фракций, суммарная доля которых составляет 12%.
Пример 1.
Для получения фракций поли-1-винилимидазола используют полимер, полученный радикальной полимеризацией 1-винилимидазола в соответствии с изложенным в источнике [12] методом. При этом поли-1-винилимидазол растворяют в этаноле в количестве 17 г на 400 мл. К полученному раствору при 20°C и интенсивном перемешивании добавляют вначале 1500 мл ацетона, далее порциями по 35 мл. После добавления каждой порции смесь выдерживают 20-22 ч, выпавший осадок отделяют декантацией и центрифугированием (10 мин, 3000 g) и добавляют новую порцию осадителя. После добавления 1700 мл ацетона осаждение продолжают гексаном. Собирают фракции, осаждаемые при добавлении 1550, 1800, 2100, 2200 и 2400 мл осадителя. Фракции сушат в вакууме до постоянной массы. Молекулярную массу определяют вискозиметрически используя константы в уравнении Марка-Куна-Хаувинка из [13].
Выход и молекулярные массы фракций составляют:
0,70 г (65000), 0.68 г (32000), 0,624 г (14500), 0,72 г (8800) и 0,16 г (6000).
Пример 2.
Исследование адъювантной активности фракций поли-1-винилимидазола проводят на линейных мышах (BALB) весом 18-20 г. Формируют 14 групп, по 10 мышей в каждой группе, из которых 12 групп опытные, 2 группы - контрольные. Иммунизацию проводят один раз в неделю, в течение 4-х недель смесью раствора вакцины «Кодивак» с равным объемом водного раствора поли-1-винилимидазола и его фракций. Вакцинацию проводят внутрибрюшинно по 0,4 мл и в подушечки лап по 0,1 мл, всего на одну мышь 0,5 мл смеси. Смесь для иммунизации готовят из 0.25 мл раствора вакцины «Кодивак» с концентрацией антигена 0.0002 мг/мл и по 0.25 мл растворов поли-1-винилимидазола с концентрацией 0,001 мг/мл и с концентрацией 0,01 мг/мл. В контрольных опытах раствор поли-1-винилимидазола заменяют на физиологический раствор или полный адъювант Фрейнда.
Через семь дней после последней иммунизации проводят забор крови. Кровь от каждой группы собирают в одну пробирку. Сыворотку для исследования готовят общепринятым методом: образцы крови центрифугируют в течение 10 мин при 1500 g, затем определяют титры специфических антител в пуле сывороток методом реакции пассивной гемагглютинации (РИГА) с эритроцитарным диагностикумом.
Для выявления специфических антител в РПГА используют антигенный эритроцитарный диагностикум, содержащий антиген (белок 64 кД) вакцины «Кодивак», приготовленный в соответствии с описанием к патенту [14]. Сыворотку титруют в иммунологических планшетах на 8 лунок кратно двум в физиологическом растворе. Затем добавляют в каждую лунку по 25 мкл диагностикума, планшет встряхивают и оставляют при комнатной температуре. Предварительный учет результатов проводят через 1,5-2 часа, а окончательный - через 20 часов. При положительном результате реакции эритроциты оседают на дне лунки в виде зонтика, оседание эритроцитов в виде точки свидетельствует об отрицательном результате. Результаты определения титров антител после иммунизации представлены в Таблице. В Таблице приведены показатели адъювантной активности поли-1-винилимидазола и его фракций при иммунизации мышей вакциной «Кодивак».
Можно отметить, что адъювантная активность наблюдается только для фракций с молекулярными массами в диапазоне 8800-32000. Понижение концентрации поли-1-винилимидазола с 0.01 мг/мл до 0.001 мг/мл приводит к повышению активности фракций в отличие от нефракционированного полимера.
Этот эффект согласуется с отмеченным ранее [6, 9, 15, 16] понижением адъювантной активности водорастворимых полимерных адъювантов при превышении концентрации над неким оптимальным значением. По-видимому, адъювантное действие поли-1-винилимидазола и родственных полимеров обусловлено образованием комплекса полимер-антиген за счет множественных водородных и/или ионных связей. Данное комплексообразование не является специфическим и при значительном количестве полимера может приводить к блокированию гаптенных участков антигена понижая иммунный ответ.
В результате осуществления способа оказалось возможным понизить концентрацию органического полимера (поли-1-винилимидазол) в адъюванте в 10 раз по сравнению с известным способом [9] при сохранении его высокой активности, особенно в случае образца с молекулярной массой 14500. Преимуществом способа является отсутствие в адъюванте малоактивных высоко- и низкомолекулярных полимерных фракций, потенциально способных увеличивать риск побочных эффектов при использовании адъюванта.
Источники информации
0. А. Ройт, Дж. Брюсстофф, Д. Мейл. Иммунология. Пер. с англ. - М.: Мир, 2000, 592 с.
1. Stephanie М. Noe, Mark A. Green, Harm HogenEsch, Stanley L. Hem Mechanism of immunopotentiation by aluminum-containing adjuvants elucidated by the relationship between antigen retention at the inoculation site and the immune response // Vaccine 28 (2010) 3588-3594.
2. Aldo Tagliabue, and Rino Rappuoli Vaccine adjuvants // Human Vaccines 2008, 4:5, 347-349.
3. Влияние иммуномодулятора полиоксидония на биологические свойства микроорганизмов / Д.А. Кириллов, И.В. Чайникова, Н.Б. Перунова, О.Е. Челпаченко, А.С. Панков, А.И. Смолягин, А.В. Валышев // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 2003. - N 4. - С.74-78.
4. А.с. 1578143 (СССР). Сополимер 5-изопропенилтетразола и N-винилпирролидона, обладающий свойствами иммуноадъюванта поверхностного антигена вирусного гепатита В / В.В. Анненков, С.И. Лещук, В.А. Круглова, Ананьев В.А., Ветрова М.М., Аксаментов И.В. // Заявл. 18.07.88, опубл. 15.07.90, бюл. №26.
5. Патент РФ №2111013. Способ получения антител к арбовирусам комплекса Калифорнийского энцефалита и Батаи / Анненков В.В., Круглова В.А., Феоктистов А.З., Чапоргина Е.А. // Заявл. 22.12.92, опубл. 20.05.98, бюл. №14.
6. Патент РФ №2129014. Способ получения антител к коринебактериям дифтерии / В.В. Анненков, С.И. Лещук, В.А. Круглова, Е.А. Шмелева, С.М. Попкова // Заявл. 31.03.95, опубл. 20.04.99, бюл. №11.
7. Alexander К. Andrianov, Daniel P. DeCollibus, Helice A. Gillis, Henry H. Kha, Alexander Marin, Mark R. Prausnitz, Lome A. Babiuk, Hugh Townsend, and George Mutwiri Poly[di(carboxylatophenoxy)phosphazene] is a potent adjuvant for intradermal immunization // PNAS 2009 vol. 106 no.45 18936-18941.
8. Hsin-Ming Liu, Sally E. Newbrough, Sudershan K. Bhatia, Christopher E. Dahle, Arthur M. Krieg, and George J. Weiner Immunostimulatory CpG Oligodeoxynucleotides Enhance the Immune Response to Vaccine Strategies Involving Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor // Blood, Vol. 92, No 10, 1998: pp. 3730-3736.
9. Патент №2205408 РФ, МПК7 G01N 33/569, А61K 31/787. Иммуноадъювантная активность поли-1-винилимидазола и способ получения антител к коринебактериям дифтерии на его основе / С.И. Лещук и др.; Иркутский институт химии им. А.Е. Фаворского СО РАН. - №2001128413/14; заявл. 18.10.2001; опубл. 27.05.2003.
10. Платэ Н.А., Васильев А.Е. Физиологически активные полимеры М.: Химия, 1986, 296 с.
11. Патент №2150958 РФ, МПК А61K 39/05. Способ лечения детей с затяжным и длительным бактерионосительством токсигенных коринебактерий дифтерии (ткд) / В.В. Иванова, Е.А. Шмелева и др.; НИИ детских инфекций. - №96113873/14; заявл. 10.07.1996; опубл. 20.06.2000.
12. N. Pekel, О. Guven Investigation of complex formation between poly(N-vinyl imidazole) and various metal ions using the molar ratio method // Colloid Polym Sci. - 1999. V.277. - P.570.
13. Эскин В.Б., Магарик С.Я., Кураев У.Б., Рудковская Г.Д. // Высокомол. Соединения. 1978. Том (А) XX №10, 2219-2223.
14. Патент №2202801 РФ, МПК7 G01N 33/556; G01N 33/531. Способ приготовления эритроцитарного антигенного диагностикума / В.В. Анненков, С.И. Лещук, В.А. Круглова, Н.Л. Мазяр, С.М. Попкова, Е.А. Шмелева; Иркутский госуд. ун-т; Ин-т эпидем. и микробиол. ВСНЦ СО РАМН. - №98106367/14; заявл. 07.04.1998; опубл. 20.04.2003.
15. А.с. 1578143 (СССР). Сополимер 5-изопропенилтетразола и N-винилпирролидона, обладающий свойствами иммуноадъюванта поверхностного антигена вирусного гепатита В / В.В. Анненков, С.И. Лещук, В.А. Круглова, Ананьев В.А., Ветрова М.М., Аксаментов И.В.; Иркутский государственный университет, Институт эпидемиологии и микробиологии Вост. - Сиб. филиала СО АМН СССР // Заявл. 18.07.88; опубл. 15.07.90, бюл. №26.
16. Патент №2111013 РФ. Способ получения антител к арбовирусам комплекса Калифорнийского энцефалита и Батаи / Анненков В.В., Круглова В.А. и др. Иркутский государственный ун-т; Иркутский науч.-иссл. противочумный ин-т Сибири и Дальнего Востока // Заявл. 22.12.92, опубл. 20.05.98, бюл. №14.
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИТЕЛ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ФРАКЦИЙ ПОЛИ-1-ВИНИЛИМИДАЗОЛА В КАЧЕСТВЕ ИММУНОАДЪЮВАНТА
Таблица | ||
Адъювант (молекулярная масса) | Титры антител в РПГА (log2) | |
0,001 мг/мл поли-1-винилимидазола | 0,01 мг/мл поли-1-винилимидазола | |
Поли-1-винилимидазол нефракционированный | 1:8(3) | 1:16(4) |
Поли-1-винилимидазол (65000) | 1:8(3) | 1:16(4) |
Поли-1-винилимидазол (32000) | 1:32(5) | 1:32(5) |
Поли-1-винилимидазол (14500) | 1:64(6) | 1:32(5) |
Поли-1-винилимидазол (8800) | 1:16(4) | 1:16(4) |
Поли-1-винилимидазол (6000) | 1:8(3) | 1:8(3) |
Адъювант Фрейнда | 1:8(3) | 1:8(3) |
Физиологический раствор (контроль) | 1:8(3) | 1:8(3) |
Claims (4)
1. Способ получения антител с использованием поли-1-винилимидазола в качестве иммуноадъюванта, отличающийся тем, что для этого используют узкие фракции поли-1-винилимидазола молекулярной массы 8800-32000, полученные дробным осаждением из раствора нефракционированного образца поли-1-винилимидазола.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что фракционирование поли-1-винилимидазола проводят из этанольного раствора используя в качестве осадителей ацетон и гексан.
3. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве антигена используют клеточные стенки коринебактерий дифтерии (вакцинный препарат "Кодивак").
4. Способ по п.1, отличающийся тем, что фракции поли-1-винилимидазола используют в виде растворов концентрации 0,001 мг/мл.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2012145704/10A RU2534558C2 (ru) | 2012-10-25 | 2012-10-25 | Способ получения антител на основе фракций поли-1-винилимидазола |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2012145704/10A RU2534558C2 (ru) | 2012-10-25 | 2012-10-25 | Способ получения антител на основе фракций поли-1-винилимидазола |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2012145704A RU2012145704A (ru) | 2014-04-27 |
RU2534558C2 true RU2534558C2 (ru) | 2014-11-27 |
Family
ID=50515438
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2012145704/10A RU2534558C2 (ru) | 2012-10-25 | 2012-10-25 | Способ получения антител на основе фракций поли-1-винилимидазола |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2534558C2 (ru) |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
SU1578143A1 (ru) * | 1988-07-18 | 1990-07-15 | Иркутский государственный университет | Сополимер 5-изопропенилтетразола и N-винилпирролидона, обладающий свойствами иммуноадъюванта поверхностного антигена вирусного гепатита В |
RU2150958C1 (ru) * | 1996-07-10 | 2000-06-20 | Научно-исследовательский институт детских инфекций | Способ лечения детей с затяжным и длительным бактерионосительством токсигенных коринебактерий дифтерии (ткд) |
RU2202801C2 (ru) * | 1998-04-07 | 2003-04-20 | Иркутский государственный университет | Способ приготовления эритроцитарного антигенного диагностикума |
RU2205408C1 (ru) * | 2001-10-18 | 2003-05-27 | Иркутский институт химии им. А.Е. Фаворского СО РАН | Иммуноадъювантная активность поли-1-винилимидазола и способ получения антител к коринебактериям дифтерии на его основе |
-
2012
- 2012-10-25 RU RU2012145704/10A patent/RU2534558C2/ru active
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
SU1578143A1 (ru) * | 1988-07-18 | 1990-07-15 | Иркутский государственный университет | Сополимер 5-изопропенилтетразола и N-винилпирролидона, обладающий свойствами иммуноадъюванта поверхностного антигена вирусного гепатита В |
RU2150958C1 (ru) * | 1996-07-10 | 2000-06-20 | Научно-исследовательский институт детских инфекций | Способ лечения детей с затяжным и длительным бактерионосительством токсигенных коринебактерий дифтерии (ткд) |
RU2202801C2 (ru) * | 1998-04-07 | 2003-04-20 | Иркутский государственный университет | Способ приготовления эритроцитарного антигенного диагностикума |
RU2205408C1 (ru) * | 2001-10-18 | 2003-05-27 | Иркутский институт химии им. А.Е. Фаворского СО РАН | Иммуноадъювантная активность поли-1-винилимидазола и способ получения антител к коринебактериям дифтерии на его основе |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
RU2012145704A (ru) | 2014-04-27 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Zhivaki et al. | Inflammasomes within hyperactive murine dendritic cells stimulate long-lived T cell-mediated anti-tumor immunity | |
Zhang et al. | Eimeria tenella: expression profiling of toll-like receptors and associated cytokines in the cecum of infected day-old and three-week old SPF chickens | |
EP3957312A1 (en) | Manganese combination for immunological enhancement | |
JP7018941B2 (ja) | 直鎖または分枝ポリアクリル酸ポリマーアジュバントを含む新規な免疫原性処方物 | |
JP6796146B2 (ja) | 水酸化アルミニウムゲル−塩化ナトリウム複合免疫学的アジュバント、並びにその調製方法及びその使用 | |
CN111420044B (zh) | 一种四价流感病毒亚单位疫苗及其制备方法 | |
Dong et al. | Poria cocos polysaccharide induced Th1-type immune responses to ovalbumin in mice | |
CN110711247A (zh) | 一种含有BCG-CpG-DNA佐剂的狂犬病疫苗组合物 | |
CN115120713A (zh) | 氢氧化铝-CpG寡核苷酸-多肽复合佐剂、疫苗及制备方法和用途 | |
CN103948910A (zh) | 免疫调节多肽zl-1在制备抗肿瘤药物中的用途 | |
RU2534558C2 (ru) | Способ получения антител на основе фракций поли-1-винилимидазола | |
Abou Elazab et al. | Zymosan A enhances humoral immune responses to soluble protein in chickens | |
RU2378011C1 (ru) | Способ профилактики бруцеллеза крупного рогатого скота | |
CN114364396B (zh) | 铜绿假单胞菌疫苗在抗烧烫伤感染中的应用 | |
RU2396978C1 (ru) | Способ профилактики развития лейкоза крупного рогатого скота | |
Domer | In vivo and in virto cellular responses to cytoplasmic and cell wall antigens of Histoplasma capsulatum in artificially immunized or infected guinea pigs | |
CN105381458A (zh) | 阳离子聚合物作为疫苗佐剂的应用 | |
RU2755638C2 (ru) | Способ повышения противоопухолевой резистентности, антиоксидантного и иммуностимулирующего воздействия на организм | |
US20180264050A1 (en) | (en) potentiated t-cell modulator able to modulate immune response, method for extracting, testing and counting a dialysable leucocyte extract from shark spleen to produce same, and therapeutic use thereof | |
CN109125264B (zh) | 一种抗感染抗肿瘤的粘膜免疫制剂 | |
RU2624503C1 (ru) | Способ профилактики вирусных болезней птиц | |
KR20140060053A (ko) | 인플루엔자 백신용 면역증강제 | |
RU2765270C1 (ru) | Композиция растворимых мономерных и олигомерных фрагментов пептидогликана клеточной стенки грамотрицательных бактерий, способы ее получения и применения | |
RU2753265C1 (ru) | Способ получения гипериммунной сыворотки крови кролика к диметилсульфоксид-антигену Yersinia pseudotuberculosis с использованием в качестве адьюванта гидроксиапатита | |
RU2764467C1 (ru) | Способ получения специфического иммуномодулятора |