RU2476597C2 - Method of identification of elements having ability to terminate transcripts - Google Patents
Method of identification of elements having ability to terminate transcripts Download PDFInfo
- Publication number
- RU2476597C2 RU2476597C2 RU2009122892/10A RU2009122892A RU2476597C2 RU 2476597 C2 RU2476597 C2 RU 2476597C2 RU 2009122892/10 A RU2009122892/10 A RU 2009122892/10A RU 2009122892 A RU2009122892 A RU 2009122892A RU 2476597 C2 RU2476597 C2 RU 2476597C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cistron
- transcripts
- ability
- terminate
- elements
- Prior art date
Links
Images
Abstract
Description
Суть изобретенияThe essence of the invention
Предлагается способ, используемый для конструирования трансгенных конструкций, содержащих эффективно работающие регуляторные элементы, в биотехнологии, молекулярной биологии. Сущность изобретения: способ идентификации терминирующих последовательностей ДНК путем использования репортерной системы на основе бицистронной модели, транзиентно экспрессированной в культурах клеток с целью использования идентифицированных элементов для предотвращения нежелательной экспрессии с интегрированных в геном генетических конструкций.A method is proposed that is used to construct transgenic constructs containing efficient regulatory elements in biotechnology and molecular biology. SUMMARY OF THE INVENTION: a method for identifying DNA termination sequences by using a replicator system based on a bicistronic model transiently expressed in cell cultures to use identified elements to prevent unwanted expression from genetic constructs integrated into the genome.
Описание изобретенияDescription of the invention
Настоящее изобретение относится к области молекулярной биологии и биотехнологии, в частности к методам идентификации регуляторных последовательностей ДНК, которые обладают способностью обрывать новосинтезирующиеся транскрипты. Известны методы, которые могут детально описывать обрывы транскриптов. Применение этих методов ограничено тем, что анализ транскриптов требует проведения громоздких и длительных серий экспериментов, в частности выделение мРНК с последующими Нозерн-блот гибридизациями, ОТ-ПЦР и т.п. Таким образом, применение известных методов ограничивается исследованием активности нескольких регуляторных элементов. В то же время не имеется способов быстрого скрининга элементов на способность обрывать транскрипты, необходимых при создании продуктов в биотехнологии, сельском хозяйстве, медицине. В результате проверка последовательности на способность терминировать транскрипцию занимает много времени. Кроме того, используемые методы дорогостоящи и хороши лишь при детальном изучении механизмов терминации транскрипции. Они не являются гарантией остановки нежелательной транскрипции в трансфецированных геномах, что приводит к выработке нежелательных продуктов и снижает ценность полученных продуцентов. Поэтому поиск эффективных терминаторов транскрипции является актуальной задачей.The present invention relates to the field of molecular biology and biotechnology, in particular to methods for identifying regulatory DNA sequences that have the ability to break off newly synthesized transcripts. Known methods that can describe clipping transcripts in detail. The use of these methods is limited in that transcript analysis requires cumbersome and lengthy series of experiments, in particular, isolation of mRNA followed by Northern blot hybridization, RT-PCR, etc. Thus, the application of known methods is limited to the study of the activity of several regulatory elements. At the same time, there are no methods for quickly screening elements for the ability to break transcripts needed when creating products in biotechnology, agriculture, and medicine. As a result, checking the sequence for the ability to terminate transcription takes a lot of time. In addition, the methods used are expensive and good only in a detailed study of the mechanisms of transcription termination. They are not a guarantee of stopping unwanted transcription in transfected genomes, which leads to the production of unwanted products and reduces the value of the resulting producers. Therefore, the search for effective transcription terminators is an urgent task.
Существует способ идентификации терминации транскрипции - 3'RACE (Rapid Amplification of cDNA 3' Ends). Однако применение данного метода ограничивается определением только точки разрыва транскрипта, в то же время эффективность прохождения процесса терминации остается неизвестной. Кроме этого техника 3'RACE требует проведения дорогостоящих и занимающих продолжительное время серий экспериментов (выделение молекул РНК, получение из них кДНК, проведение полимеразной цепной реакции со специфичными праймерами, клонирование полученных фрагментов в плазмиды с последующим секвенированием) (продукт для постановки данного способа предлагают многие фирмы, например Clontech (U.S. Patents 5962271, 5962272)). Существуют бицистронные вектора для наработки целевых белков в культурах клеток (U.S. Patents 6096505, 6319707, 6143520). Но они не используются для идентификации элементов, обладающих способностью терминировать транскрипты. Наиболее близким к предлагаемому является способ RPA (Ribonuclease Protection Assay) (U.S. Patent 5770370), но его применение ограничено сложностью экспериментальных подходов (выделение молекул РНК, подготовка нескольких меченых РНК-зондов, гибридизация проб с последующей ферментативной обработкой, электрофорезом, переносом на мембрану и детекцией меченых молекул), кроме этого применяя данный метод нельзя узнать, насколько корректными формируются 3' концы молекул РНК при использовании тестируемой терминирующей последовательности и окажутся ли синтезированные молекулы РНК способны к транспорту из ядра в цитоплазму и последующей трансляции.There is a way to identify transcription termination - 3'RACE (Rapid Amplification of cDNA 3 'Ends). However, the application of this method is limited to determining only the breakpoint of the transcript, at the same time, the efficiency of the termination process remains unknown. In addition, the 3'RACE technique requires costly and time-consuming series of experiments (isolation of RNA molecules, preparation of cDNA from them, polymerase chain reaction with specific primers, cloning of the obtained fragments into plasmids, followed by sequencing) (many people offer this method firms, for example, Clontech (US Patents 5962271, 5962272)). There are bicistronic vectors for producing target proteins in cell cultures (U.S. Patents 6096505, 6319707, 6143520). But they are not used to identify elements with the ability to terminate transcripts. Closest to the proposed method is the RPA (Ribonuclease Protection Assay) (US Patent 5770370), but its application is limited by the complexity of experimental approaches (isolation of RNA molecules, preparation of several labeled RNA probes, hybridization of samples, followed by enzymatic treatment, electrophoresis, transfer to the membrane and detection of labeled molecules), besides this, using this method it is impossible to find out how correct the 3 'ends of RNA molecules are formed when using the test termination sequence and whether they will be synthesized e RNA molecules are capable of transport from the nucleus to the cytoplasm and subsequent translation.
Задачей изобретения являлось создание эффективного способа идентификации элементов, способных терминировать транскрипцию. Для решения этой задачи был разработан способ идентификации элементов, обладающих способностью терминировать транскрипты, включающий в себя: подготовку тестируемых на способность терминировать транскрипты элементов; создание репортерной бицистронной системы, предназначенной для транзиентной трансфекции в культуру клеток и содержащей бицистронную матрицу следующей структуры: расположенные под общим промотором друг за другом открытые рамки считывания маркерных белков цистрон 1 и цистрон 2, за последним цистроном встроен известный терминатор транскрипции; между цистронами встроены стоп-кодоны и участок для внутренней инициации трансляции (IRES); тестируемый на способность терминировать транскрипты элемент встраивается между стоп-кодонами цистрона 1 и участком для внутренней инициации трансляции; расположенный в теле плазмиды ген устойчивости к антибиотику для отбора клеток, содержащих данную плазмиду; трансфекцию репортерной системой подходящего типа клеток с последующим культивированием и регистрацией полученных данных люминесценции или флуоресценции, в зависимости от типа используемой бицистронной системы.The objective of the invention was the creation of an effective method for identifying elements capable of terminating transcription. To solve this problem, a method was developed for identifying elements with the ability to terminate transcripts, which includes: preparing test for the ability to terminate transcripts of elements; creation of a reporter bicistronic system designed for transient transfection into cell culture and containing a bicistronic matrix of the following structure: open reading frames of marker proteins cistron 1 and cistron 2 located under a common promoter, behind the last cistron a well-known transcription terminator is integrated; stop codons and a section for internal translation initiation (IRES) are built in between cistrons; the element tested for the ability to terminate transcripts is inserted between the stop codons of cistron 1 and the site for internal translation initiation; the antibiotic resistance gene located in the body of the plasmid for selecting cells containing the plasmid; transfection with a reporter system of a suitable cell type, followed by culturing and recording the obtained luminescence or fluorescence data, depending on the type of bicistronic system used.
Поставленная задача решалась использованием рекомбинантной плазмиды, предназначенной для транзиентной трансфекции в культуру клеток. Данная плазмида содержит бицистронную модель, состоящую из расположенных друг за другом открытых рамок считывания для двух белков, между которыми встроены стоп-кодоны и участок для внутренней инициации трансляции. Такой химерный ген находится под контролем эффективно работающего в данной культуре клеток промотора.The problem was solved using a recombinant plasmid designed for transient transfection into cell culture. This plasmid contains a bicistronic model consisting of open reading frames for two proteins located one after another, between which stop codons and a site for internal translation initiation are inserted. Such a chimeric gene is under the control of a promoter that works effectively in a given cell culture.
Пример 1. Способ идентификации элементов, обладающих способностью терминировать транскрипты, используемый для конструирования рекомбинантной плазмиды pAcRrFExample 1. A method for identifying elements with the ability to terminate transcripts used to construct the recombinant plasmid pAcRrF
Была создана рекомбинантная плазмида pAcRrF (фиг.1), предназначенная для транзиентной трансфекции в культуру клеток дрозофилы S2 (Schneider 2). Данная плазмида содержала бицистронную модель, состоящую из расположенных друг за другом открытых рамок считывания для люцифераз медузы и светлячка, между которыми встроены стоп-кодоны и участок для внутренней инициации трансляции. Такой химерный ген находился под контролем актинового промотора, который способен эффективно работать в культуре клеток S2.A recombinant plasmid pAcRrF was created (FIG. 1), intended for transient transfection into Drosophila S2 cell culture (Schneider 2). This plasmid contained a bicistronic model consisting of open reading frames arranged one after another for jellyfish and firefly luciferases, between which stop codons and a site for internal translation initiation were integrated. Such a chimeric gene was under the control of an actin promoter that is able to work efficiently in S2 cell culture.
Рекомбинантная плазмидная ДНК pAcRrF кодирует 2 цистрона люцифераз медузы (933 п.н.) и светлячка (1650 п.н.) под контролем актинового промотора (2438 п.н.), содержащая между цистронами сайт для внутренней посадки рибосомы (IRES) из гена rpr (299 п.н.); выше rpr IRES расположен уникальный сайт рестрикции EcoRV; гены и генетические маркеры: ген bla, обеспечивающий синтез β-лактамазы; бицистрон FR, обеспечивающий синтез люцифераз медузы и светлячка.Recombinant plasmid DNA pAcRrF encodes 2 cystrons of jellyfish luciferase (933 bp) and a firefly (1650 bp) under the control of the actin promoter (2438 bp), which contains between the cistrons a site for internal ribosome insertion (IRES) from the gene rpr (299 bp); above rpr IRES is a unique EcoRV restriction site; genes and genetic markers: bla gene, which provides the synthesis of β-lactamase; FR bicistron, providing synthesis of jellyfish and firefly luciferase.
В качестве маркерных генов в данном случае использовались Renilla (медуза) и Firefly (светлячок) люциферазы. Первый цистрон представлен люциферазой медузы, второй - светлячка. Выше первого цистрона находится актиновый промотор, для которого показано, что он эффективно работает в культуре клеток S2. Между цистронами помещен rpr IRES. В этой системе подобран эффективно работающий IRES элемент из гена reaper, не обладающий субпромоторной активностью. Конструкции с терминирующими элементами были получены путем встройки выше IRES'а по сайту EcoRV элементов в прямой и обратной ориентациях, чтобы определить, присуща ли тестируемым терминаторам полярность действия и насколько эффективно они работают.In this case, Renilla (jellyfish) and Firefly (firefly) of luciferase were used as marker genes. The first cistron is represented by jellyfish luciferase, the second is a firefly. Above the first cistron is the actin promoter, for which it has been shown that it works effectively in S2 cell culture. Between cistrons placed rpr IRES. In this system, an efficiently working IRES element from the reaper gene is selected that does not have subpromotor activity. The constructions with terminating elements were obtained by inserting elements in the forward and reverse orientations above the IRES on the EcoRV site to determine whether the tested terminators have a polarity of action and how efficiently they work.
Известна плазмида рАс5.1, способная транзиентно экспрессироваться в культуре клеток S2 и содержащая актиновый промотор и SV40 терминатор, со встроенным между ними полилинкером.The known plasmid pAC5.1, capable of transiently expressed in S2 cell culture and containing the actin promoter and SV40 terminator, with a polylinker inserted between them.
A) Получение моноцистронной плазмидыA) Obtaining a monocistronic plasmid
В плазмиду рАс5.1, обработанную рестриктазой XbaI, встраивается ген люциферазы светлячка длиной 1650 п.н. (pAcF).A firefly luciferase gene of 1650 bp was inserted into the pAC15.1 plasmid treated with the restriction enzyme XbaI. (pAcF).
В плазмиду рАс5.1, обработанную рестриктазой XbaI, встраивается ген люциферазы медузы длиной 936 п.н. (pAcR).A 936 bp jellyfish luciferase gene was inserted into the plasmid pAC5.1 treated with XbaI restrictase. (pAcR).
Б) Конструирование бицистронной плазмидыB) Construction of a bicistronic plasmid
В моноцистронную плазмиду pAcF по сайту рестрикции EcoRI, выше люциферазы светлячка, встраивается ген люциферазы медузы длиной 936 п.н. Таким образом, получается рекомбинантная плазмида pAcRF, на которой синтезируется мРНК, содержащая открытые рамки для трансляции двух белков. Однако транслируется по кэп-зависимому механизму только первый цистрон (люцифераза медузы). Для того чтобы с одной молекулы мРНК можно было получить 2 белка, необходимо встроить между цистронами участок для внутренней посадки рибосомы. В качестве такого участка был выбран элемент из гена reaper, который встраивался в бицистронную плазмиду по сайту XhoI (pAcRrF). В этом участке отсутствуют сайты сплайсинга и нет субпромоторной активности. Поэтому в результате транскрипции образуется одна длинная молекула мРНК, содержащая в себе 2 цистрона, с которых синтезируются 2 белка (люциферазы медузы и светлячка).In the monocistronic plasmid pAcF at the EcoRI restriction site, above the firefly luciferase, a 936 bp jellyfish luciferase gene is inserted. Thus, a recombinant plasmid pAcRF is obtained, on which mRNA is synthesized, which contains open frames for the translation of two proteins. However, only the first cistron (jellyfish luciferase) is transmitted by a cap-dependent mechanism. In order to get 2 proteins from one mRNA molecule, it is necessary to insert a section between the cistrons for the internal landing of the ribosome. An element from the reaper gene that was inserted into the bicistronic plasmid at the XhoI site (pAcRrF) was chosen as such a site. There are no splicing sites in this section and no subpromotor activity. Therefore, as a result of transcription, one long mRNA molecule is formed, containing 2 cistrons, from which 2 proteins are synthesized (jellyfish luciferase and firefly).
B) Получение тестовых конструкций для проверки эффективности работы терминаторовB) Obtaining test constructs to verify the effectiveness of terminators
В бицистронную плазмиду pAcRrF (фиг.1) в разных оринетациях (прямой и обратной соответственно) по сайту EcoRV были встроены охарактеризованные терминаторы вируса SV40 (pAcRSV40drF и pAcRSV40rrF), OpIE2 бакуловируса OpMNPV (pAcROPIE2drF и pAcROPIE2rrF) и ty из гена yellow дрозофилы (pAcR tydrF и pAcR tyrrF). Если данные элементы способны эффективно терминировать транскрипцию, в данной модельной системе будет преимущественно синтезироваться молекула мРНК, содержащая только первый цистрон, и нарабатываться в большом количестве будет только люцифераза медузы.Characterized SV40 virus terminators (pAcRSV40drF and pAcRSV40rrF), OpIE2 baculovirus OpMNPrfrrA and yellowPrrfrprrprr and pARcRprfrprrr and pAcROPIE2drrfrprrr and pAcROPIE2drfrprfr and pAcROPIE2drfrprfr and pAcROPIE2drFrprfr and pAcROPIE2drFrprfr and pAcROVIE and pAcR tyrrF). If these elements are able to effectively terminate transcription, in this model system the mRNA molecule containing only the first cistron will be predominantly synthesized and only jellyfish luciferase will be produced in large quantities.
Пример 2. Способ идентификации элементов, обладающих способностью терминировать транскрипты, используемый для анализа работы бицистронной системы в культуре клеток S2Example 2. A method for identifying elements with the ability to terminate transcripts used to analyze the operation of the bicistronic system in S2 cell culture
Подготовленные плазмиды с конструкциями были трансфецированы при помощи липофекции в эмбриональную культуру клеток дрозофилы S2. Данная культура клеток Drosophila Schneider S2 поддерживается при температуре 27°С в бессывороточной среде HyQ SFX (Hyclone). Пересев проводится 1 раз в неделю до концентрации 0,5·106 клеток/мл. Для трансфекции берут 1 мл суспензии клеток (2×106 клеток). За два часа до трансфекции клетки промывают средой. Трансфекцию проводят с использованием трансфецирующего реагента Cellfectin (Invitrogen). На 1 трансфекцию берут 1 мкг ДНК. Смешивают ее со 100 мкл среды. Берут 5 мкл Cellfectin, предварительно ресуспендированного, и смешивают со 100 мкл среды. Оба раствора смешивают и инкубируют 1 час при комнатной температуре. Добавляют 800 мкл среды и переносят в чашки с клетками, выращивают клетки 12 часов, после добавляют 1 мл среды. Через 72 часа после трансфекции проводят детекцию уровней активности люцифераз. Непосредственно с чашек Петри, в которых инкубируют клетки, отбирают среду, а клетки промывают фосфатно-солевым буфером, затем заливают лизирующим буфером (500 мкл на 35 мм чашку) из набора производства Promega (Dual Luciferase Reporter Assay System). Затем чашки Петри инкубируют при комнатной температуре при покачивании в течение 20 мин. После этого полученный лизат осветляют центрифугированием, пробы разносят в планшет из белого непрозрачного пластика и добавляют субстрат для детекции люциферазы светлячка. В люминометре проводят измерение активности данной люциферазы, после этого добавляют субстрат для люциферазы медузы, который одновременно ингибирует активность люциферазы светлячка. Таким образом, в одной и той же пробе последовательно и независимо измеряют активности двух люцифераз - светлячка и медузы. Анализ на люминометре проводят с 10-секундным измерением. Специфический сигнал определяют по отношению активности люциферазы светлячка к активности люциферазы медузы. Фоновый уровень определяют по уровню люминесценции контрольных нетрансфецированных клеток. В табл.1 представлены полученные значения для каждой конструкции.The prepared plasmids with the constructs were transfected by lipofection into the embryonic culture of Drosophila S2 cells. This cell culture of Drosophila Schneider S2 is maintained at a temperature of 27 ° C in serum-free medium HyQ SFX (Hyclone). Reseeding is carried out once a week to a concentration of 0.5 · 10 6 cells / ml. For transfection take 1 ml of a suspension of cells (2 × 10 6 cells). Two hours before transfection, the cells are washed with medium. Transfection is performed using a Cellfectin transfection reagent (Invitrogen). For 1 transfection take 1 μg of DNA. Mix it with 100 μl of medium. Take 5 μl of Cellfectin, previously resuspended, and mix with 100 μl of medium. Both solutions are mixed and incubated for 1 hour at room temperature. 800 μl of medium is added and transferred to a plate with cells, cells are grown for 12 hours, after which 1 ml of medium is added. 72 hours after transfection, luciferase activity levels are detected. Medium was taken directly from the Petri dishes in which the cells were incubated, and the cells were washed with phosphate-buffered saline, then poured with lysis buffer (500 μl per 35 mm dish) from the Promega kit (Dual Luciferase Reporter Assay System). Then the Petri dishes are incubated at room temperature while shaking for 20 minutes. After that, the resulting lysate is clarified by centrifugation, the samples are spread into a plate of white opaque plastic, and a substrate is added to detect firefly luciferase. In the luminometer, the activity of this luciferase is measured, after which a substrate for jellyfish luciferase is added, which simultaneously inhibits the firefly luciferase activity. Thus, in the same sample, the activities of two luciferases — firefly and jellyfish — are measured sequentially and independently. Analysis on the luminometer is carried out with a 10-second measurement. A specific signal is determined by the ratio of firefly luciferase activity to jellyfish luciferase activity. The background level is determined by the luminescence level of the control untransfected cells. Table 1 presents the obtained values for each design.
Выбранный IRES способен эффективно запускать трансляцию цистрона Firefly люциферазы, почти в 60 раз усиливая эффективность трансляции. Таким образом, в разработанной модели получается значение, четко отличимое от контроля. При встройке различных терминирующих элементов выше rpr IRES'а происходит резкое снижение активности люциферазы светлячка. При этом стоит отметить, что используемые вирусные терминаторы оказались способны терминировать транскрипты после первого цистрона как в прямой, так и в обратной ориентациях. Тем не менее небольшая полярность действия была детектирована для каждого элемента. В то же время терминатор, взятый из генома дрозофилы, в котором он специфически терминирует транскрипт гена yellow, способен эффективно работать только в нативной, геномной, ориентации относительно промотора. Таким образом, можно сделать вывод, что, используя данную модельную систему, можно быстро и эффективно идентифицировать элементы на способность терминировать транскрипцию.The chosen IRES is able to efficiently trigger the translation of Firefly luciferase cistron, increasing the translation efficiency by almost 60 times. Thus, in the developed model, a value is obtained that is clearly distinguishable from control. When various termination elements are inserted above the IRES rpr, a sharp decrease in the firefly luciferase activity occurs. It should be noted that the viral terminators used were able to terminate transcripts after the first cistron in both direct and reverse orientations. Nevertheless, a small polarity of action was detected for each element. At the same time, the terminator taken from the Drosophila genome, in which it specifically terminates the yellow gene transcript, is able to work effectively only in the native, genomic, orientation relative to the promoter. Thus, we can conclude that, using this model system, it is possible to quickly and efficiently identify elements for the ability to terminate transcription.
Пример 3. Способ идентификации элементов, обладающих способностью терминировать транскрипты, используемый для конструирования рекомбинантной плазмиды pCMV_RFP_EMCV_eGFPExample 3. A method for identifying elements with the ability to terminate transcripts used to construct the recombinant plasmid pCMV_RFP_EMCV_eGFP
Была также создана рекомбинантная плазмида pCMV_RFP_EMCV_eGFP (фиг.2), предназначенная для транзиентной трансфекции в культуры клеток млекопитающих. Данная плазмида содержит бицистронную модель, состоящую из расположенных друг за другом открытых рамок считывания для красного и зеленого флуоресцентных белков, между которыми встроены стоп-кодоны и участок для внутренней инициации трансляции вируса энцефаломиокардита. Такой химерный ген находится под контролем цитомегаловирусного промотора, который способен эффективно работать в широком спектре клеточных линий млекопитающих.A recombinant plasmid pCMV_RFP_EMCV_eGFP was also created (FIG. 2) for transient transfection into mammalian cell cultures. This plasmid contains a bicistronic model consisting of open reading frames for red and green fluorescent proteins located one after another, between which stop codons and a site for internal translation initiation of the encephalomyocarditis virus are inserted. Such a chimeric gene is under the control of the cytomegalovirus promoter, which is able to efficiently work in a wide range of mammalian cell lines.
Рекомбинантная плазмидная ДНК pCMV_RFP_EMCV_eGFP кодирует 2 цистрона красного флуоресцентного белка (761 п.н.) и зеленого флуоресцентного белка (727 п.н.) под контролем цитомегаловирусного промотора (589 п.н.), содержащая между цистронами сайт для внутренней посадки рибосомы (IRES) из вируса энцефаломиокардита (EMCV) (596 п.н.); выше EMCV IRES расположен уникальный сайт рестрикции Xhol; гены и генетические маркеры: ген neoR, обеспечивающий устойчивость к антибиотику неомицину; бицистрон RG, обеспечивающий синтез красного и зеленого флуоресцентных белков.The recombinant plasmid DNA pCMV_RFP_EMCV_eGFP encodes 2 cistrons of red fluorescent protein (761 bp) and green fluorescent protein (727 bp) under the control of the cytomegalovirus promoter (589 bp) containing a site between the cystrons of the IR site for landing of ribes ) from encephalomyocarditis virus (EMCV) (596 bp); above EMCV IRES, Xhol's unique restriction site is located; genes and genetic markers: the neo R gene, which provides antibiotic resistance to neomycin; bicistron RG, providing the synthesis of red and green fluorescent proteins.
В качестве маркерных генов в данном случае использовались красный и зеленый флуоресцентные белки. Первый цистрон представлен геном красного флуоресцентного белка, второй - зеленого флуоресцентного белка. Выше первого цистрона находится цитомегаловирусный промотор, для которого показано, что он эффективно работает в обширном спектре культур клеток млекопитающих. Между цистронами помещен EMCV IRES. Данный элемент способен эффективно работать в культурах клеток и не обладает при этом субпромоторной активностью. Конструкции с терминирующими элементами были получены путем встройки выше IRES'а по сайту EcoRV элементов в прямой и обратной ориентациях, чтобы определить, присуща ли тестируемым терминаторам полярность действия и насколько эффективно они работают.In this case, red and green fluorescent proteins were used as marker genes. The first cistron is represented by the gene of the red fluorescent protein, the second by the green fluorescent protein. Above the first cistron is the cytomegalovirus promoter, for which it has been shown that it works effectively in a wide range of mammalian cell cultures. Between the cistrons is placed EMCV IRES. This element is able to work effectively in cell cultures and does not possess subpromotor activity. The constructions with termination elements were obtained by inserting elements in the forward and reverse orientations above the IRES site on the EcoRV site to determine whether the tested terminators have a polarity of action and how efficiently they work.
Известна плазмида pEGFPN1, способная транзиентно экспрессироваться в культуре клеток млекопитающих и содержащая цитомегаловирусный промотор, ген зеленого флуоресцентного белка и SV40 терминатор.Known plasmid pEGFPN1, capable of transiently expressed in a culture of mammalian cells and containing a cytomegalovirus promoter, a gene for green fluorescent protein and SV40 terminator.
А) Конструирование бицистронной плазмидыA) Construction of a bicistronic plasmid
В моноцистронную плазмиду pEGFPN1 по сайту рестрикции Есо47III, выше гена зеленого флуоресцентного белка, встраивается ген красного флуоресцентного белка длиной 761 п.н. Таким образом, получается рекомбинантная плазмида pCMV_RFP_eGFP, на которой синтезируется мРНК, содержащая открытые рамки для трансляции двух белков. Однако транслируется по кэп-зависимому механизму только первый цистрон (красный флуоресцентный белок). Для того чтобы с одной молекулы мРНК можно было получить 2 белка, необходимо встроить между цистронами участок для внутренней посадки рибосомы. В качестве такого участка был выбран элемент из вируса энцефаломиокардита (EMCV), который встраивался в бицистронную плазмиду по сайтам EcoRI-SalI (pCMV_RFP_EMCV_eGFP). В этом участке отсутствуют сайты сплайсинга и нет субпромоторной активности. Поэтому в результате транскрипции образуется одна длинная молекула мРНК, содержащая в себе 2 цистрона, с которых синтезируются 2 белка (красный и зеленый флуоресцентные белки).The monocistronic plasmid pEGFPN1 at the Eco47III restriction site, upstream of the green fluorescent protein gene, incorporates a 761 bp red fluorescent protein gene. Thus, a recombinant plasmid pCMV_RFP_eGFP is obtained, on which mRNA is synthesized that contains open frames for the translation of two proteins. However, only the first cistron (red fluorescent protein) is transmitted by the cap-dependent mechanism. In order to get 2 proteins from one mRNA molecule, it is necessary to insert a section between the cistrons for the internal ribosome landing. An element from encephalomyocarditis virus (EMCV), which was inserted into the bicistronic plasmid at EcoRI-SalI sites (pCMV_RFP_EMCV_eGFP), was chosen as such a site. There are no splicing sites in this section and no subpromotor activity. Therefore, as a result of transcription, one long mRNA molecule is formed, containing 2 cistrons, from which 2 proteins are synthesized (red and green fluorescent proteins).
Б) Получение тестовых конструкций для проверки эффективности работы терминаторовB) Obtaining test designs to verify the effectiveness of terminators
В бицистронную плазмиду pCMV_RFP_EMCV_eGFP (фиг.2) в разных ориентациях (прямой и обратной соответственно) по сайту XhoI были встроены охарактеризованные терминаторы вируса SV40, а также терминаторы из β- и γ-глобиновых генов человека. Если данные элементы способны эффективно терминировать транскрипцию, в данной модельной системе будет преимущественно синтезироваться молекула мРНК, содержащая только первый цистрон, и зеленый флуоресцентный белок нарабатываться не будет.In the bicistronic plasmid pCMV_RFP_EMCV_eGFP (Fig. 2) in different orientations (direct and reverse, respectively), the characterized SV40 virus terminators and terminators from human β and γ globin genes were inserted at the XhoI site. If these elements are able to effectively terminate transcription, in this model system the mRNA molecule containing only the first cistron will be predominantly synthesized, and the green fluorescent protein will not be produced.
Пример 4. Способ идентификации элементов, обладающих способностью терминировать транскрипты, используемый для анализа работы бицистронной системы в культурах клеток СНО-K1 и НЕK293Example 4. A method for identifying elements with the ability to terminate transcripts used to analyze the operation of the bicistronic system in cell cultures CHO-K1 and HEK293
Подготовленные плазмиды с конструкциями были трансфецированы при помощи липофекции в культуры клеток млекопитающих. Работу проводили на культурах клеток яичника китайского хомячка СНО-K1 и рака почки человека НЕK293Т. Клетки выращивали в среде ДМЕМ, содержащей 8% фетальной бычьей сыворотки ("HyClone", США) и антибиотики (пенициллин, стрептомицин) в стандартной концентрации. Клетки культивировали при температуре 37°С в атмосфере 5%-ного СO2 и высокой влажности.Prepared plasmids with constructs were transfected by lipofection into mammalian cell cultures. The work was carried out on cultures of Chinese hamster ovary cells CHO-K1 and human kidney cancer HEK293T. Cells were grown in DMEM medium containing 8% fetal bovine serum (HyClone, USA) and antibiotics (penicillin, streptomycin) in standard concentration. Cells were cultured at a temperature of 37 ° C in an atmosphere of 5% CO 2 and high humidity.
За сутки до проведения трансфекции клетки рассаживали на чашки Петри диаметром 6 см в количестве около 8×105 клеток на чашку. При такой плотности рассева через 24 часа клетки достигали 90-95%-ной конфлюэнтности. Непосредственно перед проведением трансфекции культуральную среду в чашках заменяли свежей полной средой для культивирования (с сывороткой). Трансфекцию проводили с помощью реагента Lipofectamin 2000 согласно инструкции производителя. Для трансфекции использовали по 4 мкг кольцевой ДНК, представляющей собой исследуемые генно-инженерные конструкции. ДНК растворяли в 250 мкл среды DMEM без сыворотки. Lipofectamin 2000 перед использованием аккуратно перемешивали и для каждой реакции растворяли 10 мкл реагента в 250 мкл среды DMEM без сыворотки. После этого объединяли раствор ДНК с раствором Lipofectamin 2000 и оставляли при комнатной температуре на 20 мин. Затем в каждую чашку добавляли по 500 мкл комплексов ДНК-Lipofectamin 2000, перемешивали, покачивая чашку, и помещали в инкубатор. Спустя 24 часа клетки рассаживали на 2 культуральные чашки Петри диаметром 6 см в концентрации 2×104 кл./мл и на 1 чашку Петри диаметром 6 см в концентрации 105 кл./мл. Затем спустя еще 24 часа проводили детекцию на проточном цитофлуориметре. В качестве контрольных клеток для анализа использовали нетрансфецированные клетки СНО-K1 и НЕK293Т.The day before transfection, the cells were seated on Petri dishes with a diameter of 6 cm in an amount of about 8 × 10 5 cells per cup. At this sieving density, after 24 hours, the cells reached 90-95% confluency. Immediately prior to transfection, the culture medium in the dishes was replaced with fresh, complete culture medium (with serum). Transfection was performed using Lipofectamin 2000 reagent according to the manufacturer's instructions. For transfection, 4 μg of circular DNA was used, which represents the studied genetic engineering constructs. DNA was dissolved in 250 μl of serum-free DMEM. Lipofectamin 2000 was carefully mixed before use and 10 μl of reagent was dissolved in 250 μl of serum-free DMEM for each reaction. After that, the DNA solution was combined with Lipofectamin 2000 solution and left at room temperature for 20 minutes. Then, 500 μl of DNA-Lipofectamin 2000 complexes were added to each dish, mixed by shaking the dish, and placed in an incubator. After 24 hours, the cells were seeded into 2 culture Petri dishes with a diameter of 6 cm at a concentration of 2 × 10 4 cells / ml and 1 Petri dish with a diameter of 6 cm at a concentration of 10 5 cells / ml. Then, after another 24 hours, detection was carried out on a flow cytometer. Non-transfected CHO-K1 and HEK293T cells were used as control cells for analysis.
В табл.2 представлены полученные значения для каждой конструкции в культуре клеток СНО-K1, в табл.3 - в культуре клеток НЕK293.Table 2 presents the obtained values for each construct in the CHO-K1 cell culture, and in Table 3 - in the HEK293 cell culture.
Результаты измерений контрольных конструкций показали, что созданной бицистронной моделью можно успешно пользоваться в культуре клеток. Так, моноцистронные системы показали, что уровень флуоресценции eGFP в транзиентных экспериментах успешно детектируется уже через 48 часов после трансфекции (конструкт pEGFPN1) и превышает пороговое значение аутофлуоресценции приблизительно в 6 раз. Крайне важным моментом при работе с создаваемой бицистронной системой является доказательство того, что второй цистрон не способен экспрессироваться за счет реинициации рибосомой за стоп-кодоном первого цистрона. Для этого был тестирован конструкт (pCMV_RFP_eGFP), и он продемонстрировал практически недетектируемый сдвиг относительно порогового значения интенсивности флуоресценции. Таким образом, контрольные конструкты показали правомерность использования данной модели. Можно сделать вывод, что данная система не дает артефактов, связанных с перекрыванием спектров флуоресценции.The measurement results of the control structures showed that the created bicistronic model can be successfully used in cell culture. Thus, monocistronic systems have shown that the level of eGFP fluorescence in transient experiments is successfully detected 48 hours after transfection (construct pEGFPN1) and exceeds the threshold value of autofluorescence by about 6 times. An extremely important point when working with the created bicistronic system is the proof that the second cistron is not able to be expressed due to reinitiation of the ribosome behind the stop codon of the first cistron. For this, the construct (pCMV_RFP_eGFP) was tested, and it showed a practically undetectable shift relative to the threshold value of fluorescence intensity. Thus, control constructs showed the legitimacy of using this model. It can be concluded that this system does not produce artifacts associated with overlapping fluorescence spectra.
Выбранный IRES способен эффективно запускать трансляцию цистрона зеленого флуоресцентного белка, почти в 100 раз усиливая эффективность трансляции в клетках СНО-K1 и в 10 раз - в клетках НЕK293. Таким образом, в разработанной модели получается значение, четко отличимое от контроля. При встройке различных терминирующих элементов выше IRES'а происходит резкое снижение количества ярко светящихся клеток. При этом стоит отметить, что используемый терминатор вируса SV40 подтвердил свою биполярность действия. В то же время терминаторы из глобинового локуса человека согласно полученным данным способны эффективно работать только в нативной, геномной, ориентации относительно промотора. Таким образом, можно сделать вывод, что используя данную модельную систему, можно быстро и эффективно идентифицировать элементы на способность терминировать транскрипцию.The selected IRES is able to efficiently trigger the translation of cistron green fluorescent protein, increasing the translation efficiency by almost 100 times in CHO-K1 cells and 10 times in HEK293 cells. Thus, in the developed model, a value is obtained that is clearly distinguishable from control. When various termination elements are inserted above IRES, there is a sharp decrease in the number of brightly glowing cells. It is worth noting that the SV40 virus terminator used has confirmed its bipolarity of action. At the same time, according to the data obtained, terminators from the human globin locus are able to work effectively only in the native, genomic, orientation relative to the promoter. Thus, we can conclude that using this model system, we can quickly and efficiently identify elements for the ability to terminate transcription.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2009122892/10A RU2476597C2 (en) | 2009-06-16 | 2009-06-16 | Method of identification of elements having ability to terminate transcripts |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2009122892/10A RU2476597C2 (en) | 2009-06-16 | 2009-06-16 | Method of identification of elements having ability to terminate transcripts |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2009122892A RU2009122892A (en) | 2010-12-27 |
| RU2476597C2 true RU2476597C2 (en) | 2013-02-27 |
Family
ID=44055232
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2009122892/10A RU2476597C2 (en) | 2009-06-16 | 2009-06-16 | Method of identification of elements having ability to terminate transcripts |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2476597C2 (en) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5770370A (en) * | 1996-06-14 | 1998-06-23 | David Sarnoff Research Center, Inc. | Nuclease protection assays |
| US6143520A (en) * | 1995-10-16 | 2000-11-07 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Expression vectors and methods of use |
| EA007905B1 (en) * | 2001-11-16 | 2007-02-27 | Байоджен Айдек Инк. | Polycistronic expression of antibodies |
-
2009
- 2009-06-16 RU RU2009122892/10A patent/RU2476597C2/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6143520A (en) * | 1995-10-16 | 2000-11-07 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Expression vectors and methods of use |
| US5770370A (en) * | 1996-06-14 | 1998-06-23 | David Sarnoff Research Center, Inc. | Nuclease protection assays |
| EA007905B1 (en) * | 2001-11-16 | 2007-02-27 | Байоджен Айдек Инк. | Polycistronic expression of antibodies |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2009122892A (en) | 2010-12-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US9994858B2 (en) | Constructs for gene expression analysis | |
| JP4489424B2 (en) | Chromosome-based platform | |
| AU2002242474A1 (en) | Novel expression vectors | |
| Rusconi et al. | A novel expression assay to study transcriptional activators | |
| US7157571B2 (en) | Hepatoma specific chimeric regulatory sequence | |
| Díaz-Triviño et al. | Analysis of a plant transcriptional regulatory network using transient expression systems | |
| JP6960409B2 (en) | promoter | |
| RU2476597C2 (en) | Method of identification of elements having ability to terminate transcripts | |
| WO1999031277A1 (en) | Expression cloning and single cell detection of phenotype | |
| AU2021252110A1 (en) | Methods for the selection of nucleic acid sequences | |
| CN110295170B (en) | Long-chain RNA Lnc-13814 for regulating follicular development of laying duck and application thereof | |
| JP2016514477A (en) | Methods and constructs for expressing bioactive proteins in mammalian cells | |
| CN104845994B (en) | A kind of expression and its application that activated gene in situ is realized using genome editing technique | |
| CN112877360B (en) | Construction method of circular RNA luciferase reporter plasmid for detecting IRES activity | |
| RU2396343C2 (en) | Genetically modified mouse fibroblast line nih/3t3-174 | |
| CN111206034B (en) | New application of pig GADD45a gene and construction and application of high-expression cell line | |
| CN114807145B (en) | Leader sequence for improving cap-independent translation efficiency and application thereof | |
| CN110317809B (en) | Long-chain RNA Lnc-30215 for regulating follicular development of laying duck and application thereof | |
| Bailey | The rapid selection and isolation of high-producing clones using a metallothionein-based mammalian expression system | |
| TW201809666A (en) | Method of detecting bio-toxicity by using ubiquitin | |
| Salzberg | Molecular Characterization of the Human RAI1 Promoter | |
| WO2000037682A1 (en) | Method for augmenting expression of a foreign gene | |
| CA2295475A1 (en) | Complementation trap | |
| AU2006288394A1 (en) | Sequence capable of enhancing the expression of gene under moderately low temperature |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20130203 |
|
| NF4A | Reinstatement of patent |
Effective date: 20140110 |
|
| PC41 | Official registration of the transfer of exclusive right |
Effective date: 20170503 |
|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20180617 |