RU2465593C1 - Способ количественного определения антиоксидантной активности микроорганизмов - Google Patents
Способ количественного определения антиоксидантной активности микроорганизмов Download PDFInfo
- Publication number
- RU2465593C1 RU2465593C1 RU2011127872/15A RU2011127872A RU2465593C1 RU 2465593 C1 RU2465593 C1 RU 2465593C1 RU 2011127872/15 A RU2011127872/15 A RU 2011127872/15A RU 2011127872 A RU2011127872 A RU 2011127872A RU 2465593 C1 RU2465593 C1 RU 2465593C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- antioxidant activity
- microorganisms
- butanol
- antioxidant
- solution
- Prior art date
Links
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к микробиологии и клинической лабораторной диагностике. Способ количественного определения антиоксидантной активности микроорганизмов заключается в том, что оценивается антиоксидантная активность бульонной культуры микроорганизмов или взвеси клеток микроорганизмов, выращенных на твердой питательной среде. В качестве окисляемой среды используется раствор лецитина, а в качестве инициаторов перекисного окисления: клетки Staphylococcus aureus, аскорбиновая кислота, ионы железа (II) (в виде водного раствора железа сульфата). Определение антиоксидантной активности по способности ингибировать перекисное окисление липидов проводят добавлением концентрированной ортофосфорной кислоты, и 1% раствора 2-тиобарбитуровой кислоты в диметилсульфоксиде и этаноле (1:1). Окрашенный комплекс экстрагируют н-бутанолом и, отделив бутанольную фазу, спектрофотометрируют, учитывая единицы пропускания при 550 нм, где в качестве кюветы сравнения используют кювету с н-бутанолом. Параллельно приготавливают два контроля, где в пробирки, содержащие субстрат окисления - лецитин, добавлено вещество с известной антиоксидантной активностью, а в другой инициированное перекисное окисление осуществляется без добавления антиоксиданта. Полученные значения антиоксидантного статуса рассчитываются в единицах антиоксидантной активности. 1 пр.
Description
Изобретение относится к микробиологии и клинической лабораторной диагностике и может быть использовано как вариант для определения антиоксидантного потенциала микроорганизмов при оценке антиоксидантного статуса и микроэкологических особенностей организма человека.
Описание изобретения
Изобретение относится к микробиологии и клинической лабораторной диагностике и может быть использовано как вариант определения антиоксидантного потенциала микроорганизмов при оценке микробного статуса организма человека. Типовые патологические процессы, такие как гипоксия и воспаление, свойственные и развивающиеся при большинстве соматических и инфекционных заболеваниях, тяжелых травмах и ранениях, всегда сопровождаются избыточным образованием активных форм кислорода, что приводит к усилению процессов перекисного окисления липидов, входящих в состав клеточных мембран [1]. Существенный вклад в поддержании окислительно-восстановительного баланса организма вносит нормальная микрофлора [2].
Известен способ RU №2112241, C1 6G01N 33/48, G01N 33/50 (дата публикации формулы изобретения 1998.05.27) определения концентрации малонового диальдегида с помощью тиобарбитуровой кислоты (ТБК). В данном способе для анализа используют минимальное количество сыворотки крови или гомогената (0,2-0,5 мл), растворение ТБК и инкубацию образца проводят в присутствии Тритона Х-100, смесь перемешивают с постоянной частотой колебаний (120 качаний в мин), реакцию останавливают дигидрокверцетином; перед определением оптической плотности образца добавляют трилон Б и смесь этанола с хлороформом в соотношении (7:3). В основе метода лежит реакция между малоновым диальдегидом (МДА) и тиобарбитуровой кислотой, которая при высокой температуре и кислом значении рН протекает с образованием окрашенного триметинового комплекса, содержащего одну молекулу МДА и две молекулы тиобарбитуровой кислоты. Максимум поглощения комплекса приходится на 532 нм. Рабочий раствор тиобарбитуровой кислоты (ТБК) готовят путем растворения навески ТБК 864 мг в 100 мл смеси, содержащей 1% раствор тритона Х-100 и 8,2 М раствор этанола.
Однако данный способ обладает рядом недостатков: он не учитывает специфики метаболизма микроорганизмов, для повышения растворимости липидных фракций и 2-тиобарбитуровой кислоты предлагается использовать специальный реактив (полиоксиэтилен-п-(трет-октил) фенол (Тритон Х-100)), а также реактив, требующий особых условий хранения и работы (трихлорметан). Наиболее близким к заявляемому является способ выявления у микроорганизмов протективного действия в эффекте Фентона RU 2279079, С2 G01N 33/483, C12Q 1/02.
В заявляемом способе выявления у микроорганизмов протективного действия в эффекте Фентона исследуемую культуру микроорганизмов выращивают в жидкой питательной среде, отделяют супернатант от микробных клеток центрифугированием, параллельно готовят контроль, представляющий жидкую питательную среду, далее каждую из проб обрабатывают хлороформом и отделяют супернатант от хлороформа центрифугированием, затем в опытную пробу и контроль добавляют тест-культуру Staphylococcus aureus ГИСК №201108, инкубируют, отделяют клетки тест-культуры центрифугированием и готовят из них микробную взвесь, в каждую из проб добавляют раствор пероксида водорода и инкубируют, отделяют клетки тест-культуры центрифугированием, добавляют к ним питательную среду, инкубируют, измеряют оптическую плотность выросших культур в опытной и контрольной пробах, определяют степень прироста биомассы тест-культуры в опыте. Недостатком данного способа является использование в качестве показателя протективного эффекта микроорганизмов только степень прироста клеточной массы по оптической плотности. Поэтому способ не учитывает кинетических показателей, возникающих при добавлении в исследуемую систему прооксидантов. Способ характеризует длительность и относительная многостадийность. Результаты эксперимента требуют нескольких стадий инкубации, которые должны подбираться с учетом физиологии микроорганизмов. Рассматриваемый способ не позволяет определять количественные характеристики, отражающие антиоксидантный потенциал микроорганизмов, входящих в состав микробиоценоза человека. Определение протективного действия у исследуемой культуры в эффекте Фентона, по этому способу, возможно только при наличии в среде малых концентраций пероксида водорода.
Задачей предлагаемого изобретения является усовершенствование известного способа определения антиоксидантной активности, а также возможность использования предлагаемого способа для определения антиоксидантного статуса у микроорганизмов, не продуцирующих пероксид водорода и/или инактивирующих его ферментов.
Сущностью способа является определение антиоксидантного статуса микроорганизмов по их способности блокировать реакцию перекисного окисления липидов и/или ингибировать фосфолипазы.
Способ определения антиоксидантной активности микроорганизмов заключается в том, что оценивается антиоксидантная активность бульонных культур микроорганизмов или взвеси микроорганизмов в физиологическом растворе, выращенных на плотной питательной среде. В предлагаемом способе в качестве окисляемой среды используется раствор лецитина. Известно, что под действием фосфолипаз от лецитина отщепляется одна из жирных кислот, превращая его в лизолецитин. Данный продукт обладает высокой токсичностью в отношении клеток, вызывая их некроз [1]. По предлагаемому способу перекисное окисление лецитина запускается добавлением к нему суспензии клеток микроорганизмов - продуцентов фосфолипаз, выделенных от обследуемого, а при их отсутствии используется известный музейный штамм с фосфолипазной активностью. Далее, в среду последовательно добавляются водный раствор аскорбиновой кислоты, ионы железа (II) (в виде раствора железа сульфата). После этого анализируемые образцы инкубируют в течение 30 мин при температуре 42°С, при постоянном встряхивании. После этого в исследуемый образец вносят концентрированную ортофосфорную кислоту до рН 1, и 1% раствор 2-тиобарбитуровой кислоты в диметилсульфоксиде и этаноле (1:1). Реакционную смесь нагревают в водяной бане при t=70°C в течение 20 мин, охлаждают в темном месте до температуры +4°С и добавляют 3 мл н-бутанола, тщательно перемешивают, центрифугируют при 3 тыс. об/мин, отделяют бутанольную фазу и спектрофотометрируют, учитывая минимум пропускания при 550 нм. При спектрофотометрировании кюветой сравнения является кювета с н-бутанолом. В заявляемом способе используется несколько контролей: контроль максимально-возможной перекисной реакции (для осуществляемого исследования), для этого используют образец лецитина с инициированным окислением без антиоксиданта и контроль ингибирования перекисного окисления, где в качестве образцов сравнения используют эквимолярные количества вещества с известной антиоксидантной активностью. Для сравнения антиоксидантного статуса веществ в гидрофильной фазе использован водный раствор 6-метил-2-этил-пиридин-3-ола, а у веществ с липофильными свойствами в качестве образца сравнения используется токоферола ацетата - масляный раствор.
Количественно антиоксидантную активность выражают в условных единицах антиоксидантной активности (Еаоа), рассчитанных по формуле
где
Еаоа - единицы антиоксидантной активности,
IA - интенсивность светового потока (в единицах пропускания), прошедшего через слой поглощающего раствора исследуемого образца при 550 нм,
IB - интенсивность светового потока (в единицах пропускания), прошедшего через слой поглощающего раствора питательной среды при 550 нм,
IC - интенсивность светового потока (в единицах пропускания), прошедшего через слой поглощающего раствора контроля с индуцированным окислением при 550 нм,
10 - коэффициент перевода в единицы объема,
IE - молярный коэффициент триметинового комплекса в единицах пропускания 0,413 ммоль·см-1,
ID - интенсивность светового потока (в единицах пропускания), прошедшего через слой поглощающего раствора контроля с известным антиоксидантом при 550 нм.
Пример 1.
Культуру Staphylococcus aureus, выделенную из кишечного микробиоценоза обследуемого, выращивали на мясо-пептонном агаре при 37°С в течение 48 ч. Затем суспендировали в стерильном 0,9% растворе натрия хлорида и стандартизировали по стандарту мутности до 109 микробных тел в 1 мл.
Выделенный из каловых масс этого же пациента штамм Bifidobacterium breve, выращивали в жидкой питательной среде Блаурокка. В день исследований готовили растворы: лецитина 0,1%, аскорбиновой кислоты 0,79М, сульфата железа 0,07М на бидистиллированной, свежепрокипяченой и охлажденной до комнатной температуры воде.
В опытные пробирки добавляли по 0,5 мл раствора лецитина, 0,3 мл бактериального субстрата, исследуемого на антиоксидантную активность - В.breve, и 0,8 мл раствора аскорбиновой кислоты. Реакцию образования свободных радикалов инициировали добавлением 0,8 мл раствора железа сульфата. Пробирки помещали в термостат при постоянном встряхивании на 30 мин. В качестве контроля эталонного антиоксиданта использовали 0,3 мл раствора эмоксипина. В качестве контроля максимально возможного перекисного окисления использовали пробирку с образцом лецитина, где инициирован процесс в отсутствии антиоксиданта. Исследуемые пробирки помещали в термостат на 30 мин, при температуре 42°С, при постоянном встряхивании. После этого в исследуемые образцы последовательно вносили 0,2 мл концентрированной ортофосфорной кислоты и 0,8 мл 1% раствора 2-тиобарбитуровой кислоты. Полученную реакционную смесь нагревали в водяной бане при t=70°C в течение 20 мин, охлаждали в темном месте до температуры +4°С и при тщательном перемешивании добавляли 3 мл н-бутанола. Полученную эмульсию центрифугировали при 3 тыс. об/мин, аккуратно отделяли бутанольную фазу, которую спектрофотометрировали на спектрофотометре СФ-2000, учитывая единицы пропускания при 550 нм. В качестве кюветы сравнения использовали кювету с н-бутанолом. Подставив полученные значения в формулу, рассчитали, что для анализируемого штамма Bifidobacterium breve антиоксидантная активность составила 3,03 Еаоа.
Источники информации
1. Шанин В.Ю. Клиническая патофизиология. С-Пб.: «Специальная литература», 1998, 569 с.
2. Шендеров Б.А. Медицинская микробная экология и функциональное питание, в 3-х т. / Б.А.Шендеров. - М.: Грань, 2001, т.3, 288 с.
Claims (1)
- Способ количественного определения антиоксидантной активности микроорганизмов заключается в том, что оценивается антиоксидантная активность бульонной культуры микроорганизмов или взвеси клеток микроорганизмов, выращенных на твердой питательной среде, отличающийся тем, что в качестве окисляемой среды используется раствор лецитина, а в качестве инициаторов перекисного окисления: последовательно добавляются суспензия клеток Staphylococcus aureus в физиологическом растворе, раствор аскорбиновой кислоты, ионы железа (II) (в виде водного раствора железа сульфата), инкубируют в течение 30 мин, при температуре t=42°C, при постоянном встряхивании, после этого закисляют до рН 1 добавлением концентрированной ортофосфорной кислоты и 1%-ного раствора 2-тиобарбитуровой кислоты в диметилсульфоксиде и этаноле (1:1), нагревают в водяной бане при t=70°C в течение 20 мин, охлаждают, добавляют 3 мл н-бутанола, тщательно перемешивают, центрифугируют при 3 тыс. об/мин, отделяют бутанольную фазу и спектрофотометрируют, учитывая единицы пропускания при 550 нм, где в качестве кюветы сравнения используют кювету с н-бутанолом, а в качестве контролей используют пробирки, в которые к субстрату окисления - лецитину в одну добавлено вещество с известной антиоксидантной активностью, а в другой инициированное перекисное окисление осуществляется без добавления антиоксиданта.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2011127872/15A RU2465593C1 (ru) | 2011-07-06 | 2011-07-06 | Способ количественного определения антиоксидантной активности микроорганизмов |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2011127872/15A RU2465593C1 (ru) | 2011-07-06 | 2011-07-06 | Способ количественного определения антиоксидантной активности микроорганизмов |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2465593C1 true RU2465593C1 (ru) | 2012-10-27 |
Family
ID=47147572
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2011127872/15A RU2465593C1 (ru) | 2011-07-06 | 2011-07-06 | Способ количественного определения антиоксидантной активности микроорганизмов |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2465593C1 (ru) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2526125C1 (ru) * | 2013-08-14 | 2014-08-20 | Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт лекарственных и ароматических растений Россельхозакадемии (ГНУ ВИЛАР Россельхозакадемии) | СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИОКСИДАНТНОЙ АКТИВНОСТИ ЭФИРНОГО МАСЛА РАСТИТЕЛЬНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ in vitro |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2279079C2 (ru) * | 2004-08-09 | 2006-06-27 | Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН | Способ выявления у микроорганизмов протективного действия в эффекте фентона |
US20070231836A1 (en) * | 2004-09-09 | 2007-10-04 | Carraway Robert E | Screening assays for antioxidants and antiproliferative compounds |
-
2011
- 2011-07-06 RU RU2011127872/15A patent/RU2465593C1/ru not_active IP Right Cessation
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2279079C2 (ru) * | 2004-08-09 | 2006-06-27 | Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН | Способ выявления у микроорганизмов протективного действия в эффекте фентона |
US20070231836A1 (en) * | 2004-09-09 | 2007-10-04 | Carraway Robert E | Screening assays for antioxidants and antiproliferative compounds |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
Лабораторные исследования в ветеринарии. / Под ред. В.Я. АНТОНОВА. - М.: Колос, 1971, с.420-457. * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2526125C1 (ru) * | 2013-08-14 | 2014-08-20 | Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт лекарственных и ароматических растений Россельхозакадемии (ГНУ ВИЛАР Россельхозакадемии) | СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИОКСИДАНТНОЙ АКТИВНОСТИ ЭФИРНОГО МАСЛА РАСТИТЕЛЬНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ in vitro |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Xie et al. | Functionalized gold nanoclusters identify highly reactive oxygen species in living organisms | |
Eixler et al. | Phosphorus storage in Chlorella vulgaris (Trebouxiophyceae, Chlorophyta) cells and its dependence on phosphate supply | |
Tanoi et al. | Effects of carbon source on growth and morphology of Botryococcus braunii | |
CN103805170B (zh) | 一种用于识别硫化氢的特异性荧光探针及其应用 | |
CN104995310B (zh) | 快速、低样品体积胆固醇和甘油三酯测定 | |
Fairbridge et al. | The direct colorimetric estimation of reducing sugars and other reducing substances with tetrazolium salts | |
CN103923640B (zh) | 一种苯并噻唑类识别硫化氢的荧光探针及其应用 | |
Camkerten et al. | Evaluation of blood oxidant/antioxidant balance in dogs with sarcoptic mange | |
Ma et al. | A two-photon fluorescent probe with lysosome targetability for imaging endogenous superoxide anion in living cells, zebrafish and pneumonia tissue | |
CN109651249A (zh) | 一种检测细胞内质网半胱氨酸的荧光探针及其合成和应用 | |
RU2465593C1 (ru) | Способ количественного определения антиоксидантной активности микроорганизмов | |
Sun et al. | Organism and molecular-level responses of superoxide dismutase interaction with 2-pentanone | |
Kodicek | Estimation of nicotinic acid in animal tissues, blood and certain foodstuffs: Applications1 | |
Purwati et al. | Correlation of serum nitric oxide and urine malondialdehyde levels in non-hemodialysis chronic kidney disease patients | |
CN104655857B (zh) | 一种微生物细胞内多聚磷酸盐的定量检测方法 | |
CN107356567A (zh) | 一种从厌氧氨氧化污泥中提取和测定亚铁血红素的方法 | |
CN103232358B (zh) | 用于检测新霉素的囊泡探针、用途及制备方法 | |
RU2708164C1 (ru) | Способ определения токсичности материалов | |
RU2262705C2 (ru) | Способ определения антигемоглобиновой активности микроорганизмов | |
CN107884349B (zh) | 一种微生物体内超氧阴离子自由基的测定方法 | |
RU2786802C1 (ru) | Способ определения активности лизоцима в ротовой жидкости | |
RU2146053C1 (ru) | Способ определения прооксидантной активности биологического материала | |
RU2355359C1 (ru) | Способ определения амилолитической активности ферментов микрофлоры в кишечнике птицы | |
RU2688117C1 (ru) | Способ оценки про- и антимикробных свойств проб | |
RU2689359C1 (ru) | Способ определения бактерицидных свойств материалов |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20130707 |
|
NF4A | Reinstatement of patent |
Effective date: 20150627 |
|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20160707 |