RU2458691C2 - Лечение посттравматического стрессового расстройства - Google Patents

Лечение посттравматического стрессового расстройства Download PDF

Info

Publication number
RU2458691C2
RU2458691C2 RU2010106014/15A RU2010106014A RU2458691C2 RU 2458691 C2 RU2458691 C2 RU 2458691C2 RU 2010106014/15 A RU2010106014/15 A RU 2010106014/15A RU 2010106014 A RU2010106014 A RU 2010106014A RU 2458691 C2 RU2458691 C2 RU 2458691C2
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
nepicastat
difluoro
thioxo
aminomethyl
dihydro
Prior art date
Application number
RU2010106014/15A
Other languages
English (en)
Other versions
RU2010106014A (ru
Inventor
Том ВОЙВОДЕ (US)
Том ВОЙВОДЕ
Марк МОРАН (US)
Марк Моран
Original Assignee
Синошиа Терапьютикс
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Синошиа Терапьютикс filed Critical Синошиа Терапьютикс
Publication of RU2010106014A publication Critical patent/RU2010106014A/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2458691C2 publication Critical patent/RU2458691C2/ru

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/535—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with at least one nitrogen and one oxygen as the ring hetero atoms, e.g. 1,2-oxazines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/41—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
    • A61K31/4164—1,3-Diazoles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/18—Antipsychotics, i.e. neuroleptics; Drugs for mania or schizophrenia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Heterocyclic Carbon Compounds Containing A Hetero Ring Having Nitrogen And Oxygen As The Only Ring Hetero Atoms (AREA)

Abstract

Группа изобретений относится к медицине и касается способов лечения и диагностики посттравматического стрессового расстройства у пациента, а также способа повышения способности пациента переживать травматическое событие, при этом не страдая от посттравматического стрессового расстройства. Пациенту вводят терапевтически эффективное количество (S)-5-аминометил-1-(5,7-дифтор-1,2,3,4-тетрагидронафт-2-ил)-2,3-дигидро-2-тиоксо-1Н-имидазола (непикастата), (R)-5-аминометил-1-(5,7-дифтор-1,2,3,4-тетрагидронафт-2-ил)-2,3-дигидро-2-тиоксо-1Н-имидазола, их фармацевтически приемлемой соли или их смеси. Группа изобретений обеспечивает расширение арсенала способов лечения посттравматического стрессового расстройства. 3 н. и 15 з.п. ф-лы, 187 ил., 25 пр.

Description

Перекрестная ссылка на родственные заявки
По настоящей заявке испрашивается приоритет согласно 35 U.S.C. $ 119(e) на основании предварительной заявки на выдачу патента США с регистрационным номером 60/935036, «TREATMENT OF POSTTRAUMATIC STRESS DISORDER», поданной 23 июля 2007, которая включена в настоящее описание посредством ссылки в полном объеме.
Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение, в общем, относится к способам лечения посттравматического стрессового расстройства и, более конкретно, к способам лечения посттравматического стрессового расстройства с использованием соединения A, ингибирующего дофамин-β-гидроксилазу. Также предлагаются способы повышения устойчивости пациента при введении терапевтически эффективного количества соединения A. Также предлагаются способы диагностики посттравматического стрессового расстройства у пациента посредством введения пациенту терапевтически эффективного количества соединения A и оценки, по меньшей мере, одного признака, симптома или кластера симптомов посттравматического стрессового расстройства; и диагностирования посттравматического стрессового расстройства у пациента, если соединение A уменьшает, по меньшей мере, один признак, симптом и кластер симптомов посттравматического стрессового расстройства.
Уровень техники
Тревожные расстройства являются наиболее широко встречающимися расстройствами среди психиатрических заболеваний, требующими огромных экономических затрат. Кроме генерализованного тревожного расстройства к ним относятся посттравматическое стрессовое расстройство, паническое расстройство, обсессивно-компульсивное расстройство и социальные, а также другие фобии.
Посттравматическое стрессовое расстройство может быть тяжелым и хроническим, при этом некоторые исследования свидетельствуют о распространенности от 1,3% до 7,8% в общей популяции. Посттравматическое стрессовое расстройство обычно следует после причиняющего психологические страдания травматического события. Такими событиями могут быть, например, боевые действия, террористические акты, физическое нападение, сексуальное насилие, автомобильные катастрофы и стихийные бедствия. Ответ на такое событие может представлять собой сильный страх, беспомощность или ужас. Большинство людей восстанавливаются после травматического события и возвращаются к нормальной жизни. Напротив, у страдающих посттравматическим стрессовым расстройством симптомы сохраняются и могут ухудшаться со временем, не давая вернуться к нормальной жизни.
Психотерапия в настоящее время является основой лечения посттравматического расстройства. Способы включают когнитивно-поведенческую терапию, экспозиционную терапию и десенсибилизацию и коррекцию переработки информации с помощью движения глаз. Медикаментозное лечение может повышать эффективность психотерапии. Селективные ингибиторы обратного захвата серотонина (SSRI), такие как сертралин (Zoloft®) и пароксетин (Paxil®), являются единственными лекарственными средствами, одобренными Администрацией по контролю за продуктами питания и лекарствами для лечения ПТСР. С применением SSRI ассоциированы многие нежелательные побочные эффекты и признаки. К ним относятся проблемы, касающиеся взаимодействий лекарственных средств, побочные эффекты, проявляющиеся в желудочно-кишечном тракте, побочные эффекты в половой сфере, суицидальное мышление, острые анксиогенные эффекты и медленное начало действия. Некоторые трициклические антидепрессанты (TCA) и ингибиторы монаминоксидаз (MAOI), по-видимому, обладают некоторой эффективностью, но переносимость у пациентов низкая вследствие высокой частоты побочных эффектов. В случае MAOI требуются ограничения диеты, и они связаны со случаями гипертензии. TCA имеет антихолинергические и сердечно-сосудистые побочные эффекты. Ламотригин, блокатор натриевых каналов, обладал некоторой эффективностью при лечении посттравматического стрессового расстройства в небольшом плацебо-контролируемом исследовании. Трудности в применении ламотригина вследствие необходимости титрования и риска развития синдрома Стивена-Джонса, опасной для жизни сыпи, делает его плохим кандидатом для терапевтического применения.
Существует необходимость в разработке средств лечения посттравматического стрессового расстройства, которые являются безопасными и эффективными.
Дофамин является катехоламинным нейромедиатором, главным образом, встречающимся наряду со специфичными дофаминергическими рецепторами в центральной нервной системе. Норэпинефрин представляет собой циркулирующий катехоламин, который действует на адренергические рецепторы в центральной и периферической системах. Дофамин-β-гидроксилаза (DBH) катализирует превращение дофамина в норэпинефрин и встречается как в центральных, так и в периферических симпатических нейронах. Ингибирование DBH одновременно повышает уровни дофамина, блокируя его метаболизм, и уменьшает уровни норэпинефрина, блокируя его синтез. Непикастат ((S)-5-аминометил-1-(5,7-дифтор-1,2,3,4-тетрагидронафт-2-ил)-2,3-дигидро-2-тиоксо-1H-имидазолгидрохлорид) является ингибитором DBH.
Сущность изобретения
В настоящем изобретении предлагаются способы лечения пациента, у которого диагностировано посттравматическое стрессовое расстройство, посредством введения пациенту терапевтически эффективного количества соединения A.
Также предлагаются способы повышения устойчивости пациента посредством введения терапевтически эффективного количества соединения A.
Также предлагаются способы диагностики посттравматического стрессового расстройства у пациента посредством введения пациенту терапевтически эффективного количества соединения A и оценки, по меньшей мере, одного признака, симптома или кластера симптомов посттравматического стрессового расстройства; и диагностирования посттравматического стрессового расстройства у пациента, если соединение A уменьшает, по меньшей мере, один признак, симптом и кластер симптомов посттравматического стрессового расстройства.
Описание чертежей
На фигуре 1 подробно показаны отдельные ферментные анализы.
На фигуре 2 показано влияние непикастата на содержание норадреналина и дофамина в ткани брыжеечной артерии (a), левого желудочка (b) и коры головного мозга (c) SHR.
На фигуре 3 показано влияние непикастата на соотношение дофамин/норадреналин в ткани брыжеечной артерии (a), левого желудочка (b) и коры головного мозга (c) SHR.
На фигуре 4 показано влияние непикастата на содержание норадреналина и дофамина в ткани почечной артерии, левого желудочка и коры головного мозга собак породы бигль.
На фигуре 5 показано влияние непикастата на соотношение дофамин/норадреналин в ткани почечной артерии, левого желудочка и коры головного мозга собак породы бигль.
На фигуре 6 показано влияние непикастата на концентрации в плазме норадреналина (a), дофамина (b) и соотношение дофамин/норадреналин (c) у собак породы бигль.
На фигуре 7 показано влияние непикастата и (R)-5-аминометил-1-(5,7-дифтор-1,2,3,4-тетрагидронафт-2-ил)-2,3-дигидро-2-тиоксо-1H-имидазолгидрохлорида в дозе 30 мг·кг-1 перорально, на содержание норадреналина, содержание дофамина и соотношение дофамин/норадреналин в брыжеечной артерии, левом желудочке и коре головного мозга SHR.
На фигуре 8 показаны структуры 1 2a (непикастата) и 2b ((R)-5-аминометил-1-(5,7-дифтор-1,2,3,4-тетрагидронафт-2-ил)-2,3-дигидро-2-тиоксо-1H-имидазолгидрохлорида).
На фигуре 9 показана химическая схема.
На фигуре 10 показана таблица, описывающая взаимодействие непикастата на DBH и ряд выбранных ферментов и рецепторов.
На фигуре 11 показано влияние непикастата на соотношение DA/NE в тканях SHR (A) и нормальных собак породы бигль (B).
На фигуре 12 показано влияние хронического введения непикастата на соотношение DA/NE в плазме нормальных собак породы бигль.
На фигуре 13 показано влияние перорально вводимого непикастата на среднее артериальное давление у SHR.
На фигуре 14 показаны концентрации (пг/мл) свободного основания норэпинефрина и дофамина в образцах плазмы, собранных из периферической вены пациентов с ЗСН в положении лежа во время ежедневного перорального введения плацебо в течение 3 месяцев.
На фигуре 15 показаны концентрации (пг/мл) свободного основания норэпинефрина и дофамина в образцах плазмы, собранных из периферической вены пациентов с ЗСН в положении лежа во время ежедневного перорального введения 20 мг свободного основания непикастата в течение 3 месяцев.
На фигуре 16 показаны концентрации (пг/мл) свободного основания норэпинефрина и дофамина в образцах плазмы, собранных из периферической вены пациентов с ЗСН в положении лежа во время ежедневного перорального введения 40 мг свободного основания непикастата в течение 3 месяцев.
На фигуре 17 показаны концентрации (пг/мл) свободного основания норэпинефрина и дофамина в образцах плазмы, собранных из периферической вены пациентов с ЗСН в положении лежа во время ежедневного перорального введения 60 мг свободного основания непикастата в течение 3 месяцев.
На фигуре 18 показаны концентрации (пг/мл) свободного основания норэпинефрина и дофамина в образцах плазмы, собранных из периферической вены пациентов с ЗСН в положении лежа во время ежедневного перорального введения 80 мг свободного основания непикастата в течение 3 месяцев.
На фигуре 19 показаны концентрации (пг/мл) свободного основания норэпинефрина и дофамина в образцах плазмы, собранных из периферической вены пациентов с ЗСН в положении лежа во время ежедневного перорального введения 120 мг свободного основания непикастата в течение 3 месяцев.
На фигуре 20 показаны концентрации (пг/мл) свободного основания норэпинефрина в образцах плазмы, собранных из артериальной вены и коронарного синуса катетеризованных пациентов с ЗСН во время ежедневного перорального введения плацебо в течение 3 месяцев.
На фигуре 21 показаны концентрации (пг/мл) свободного основания дофамина в образцах плазмы, собранных из артериальной вены (легочного ствола) и коронарного синуса катетеризованных пациентов с ЗСН во время ежедневного перорального введения плацебо в течение 3 месяцев.
На фигуре 22 показаны концентрации (пг/мл) свободного основания норэпинефрина в образцах плазмы, собранных из артериальной вены катетеризованных пациентов с ЗСН во время ежедневного перорального введения 20 мг свободного основания непикастата в течение 3 месяцев.
На фигуре 23 показаны концентрации (пг/мл) свободного основания дофамина в образцах плазмы, собранных из артериальной вены катетеризованных пациентов с ЗСН при ежедневном пероральном введении 20 мг свободного основания непикастата в течение 3 месяцев.
На фигуре 24 показаны концентрации (пг/мл) свободного основания норэпинефрина в образцах плазмы, собранных из артериальной вены катетеризованных пациентов с ЗСН во время ежедневного перорального введения 40 мг свободного основания непикастата в течение 3 месяцев.
На фигуре 25 показаны концентрации (пг/мл) свободного основания дофамина в образцах плазмы, собранных из артериальной вены катетеризованных пациентов с ЗСН во время ежедневного перорального введения 40 мг свободного основания непикастата в течение 3 месяцев.
На фигуре 26 показаны концентрации (пг/мл) свободного основания норэпинефрина в образцах плазмы, собранных из артериальной вены катетеризованных пациентов с ЗСН во время ежедневного перорального введения 60 мг свободного основания непикастата в течение 3 месяцев.
На фигуре 27 показаны концентрации (пг/мл) свободного основания дофамина в образцах плазмы, собранных из артериальной вены катетеризованных пациентов с ЗСН во время ежедневного перорального введения 60 мг свободного основания непикастата в течение 3 месяцев.
На фигуре 28 представлены данные, которые следует не учитывать при дальнейшем статистическом анализе, с указанием причины такого действия.
На фигуре 29 показаны фармакокинетические параметры непикастата у крыс.
На фигуре 30 показана концентрация непикастата в плазме самцов крыс после единичной пероральной дозы 10 мг/кг непикастата.
На фигуре 31 показана концентрация непикастата в плазме самцов крыс после единичной пероральной дозы 30 мг/кг непикастата.
На фигуре 32 показана концентрация непикастата в плазме самцов крыс после единичной пероральной дозы 100 мг/кг непикастата.
На фигуре 33 показана средняя концентрация непикастата в плазме крыс после единичной пероральной дозы 10, 30 или 100 мг/кг непикастата. Значения представляют собой средние значения для трех крыс в каждой временной точке.
На фигуре 34 показана линейная зависимость между дозой и значениями AUC для непикастата в плазме.
На фигуре 35 показана концентрация непикастата в плазме самок крыс после единичной пероральной дозы 30 мг/кг непикастата.
На фигуре 36 показаны средние концентрации непикастата в плазме и головном мозге самцов крыс после единичной пероральной дозы 10 мг/кг непикастата.
На фигуре 37 показана концентрация непикастата в головном мозге самцов крыс после единичной пероральной дозы 10 мг/кг непикастата.
На фигуре 38 показана концентрация норэпинефрина в брыжеечной артерии.
На фигуре 39 показана концентрация дофамина в брыжеечной артерии.
На фигуре 40 показана концентрация дофамина/норэпинефрина в брыжеечной артерии.
На фигуре 41 показаны уровни норэпинефрина в левом желудочке крыс.
На фигуре 42 показаны уровни дофамина в левом желудочке крыс.
На фигуре 43 показаны уровни дофамина/норэпинефрина в левом желудочке крыс.
На фигуре 44 показана концентрация дофамина (мкг/г массы сырого вещества) в коре головного мозга SHR, отложенная на графике в виде функции дозы. Ткань собирали через шесть часов после третьей из трех пероральных доз, вводимых с 12-часовыми интервалами (n=9).
На фигуре 45 показана концентрация норэпинефрина (мкг/г сырой массы) в коре головного мозга SHR, отложенная на графике в виде функции дозы. Ткань собирали через шесть часов после третьей из трех пероральных доз, вводимых с 12-часовыми интервалами (n=9).
На фигуре 46 показана концентрация дофамина/норэпинефрина (мкг/мкг сырой массы) в коре головного мозга SHR, отложенная на графике в виде функции дозы. Ткань собирали через шесть часов после третьей из трех пероральных доз, вводимых с 12-часовыми интервалами (n=9).
На фигуре 47 показана концентрация дофамина (мкг/г сырой массы) в левом желудочке SHR, отложенная на графике в виде функции дозы. Ткань собирали через шесть часов после третьей из трех пероральных доз, вводимых с 12-часовыми интервалами (n=9).
На фигуре 48 показана концентрация норэпинефрина (мкг/г сырой массы) в левом желудочке SHR, отложенная на графике в виде функции дозы. Ткань собирали через шесть часов после третьей из трех пероральных доз, вводимых с 12-часовыми интервалами (n=9).
На фигуре 49 показана концентрация дофамина/норэпинефрина (мкг/мкг сырой массы) в левом желудочке SHR, отложенная на графике в виде функции дозы. Ткань собирали через шесть часов после третьей из трех пероральных доз, вводимых с 12-часовыми интервалами (n=9).
На фигуре 50 показана концентрация дофамина (мкг/г сырой массы) в брыжеечной артерии SHR, отложенная на графике в виде функции дозы. Ткань собирали через шесть часов после третьей из трех пероральных доз, вводимых с 12-часовыми интервалами (n=9).
На фигуре 51 показана концентрация норэпинефрина (мкг/г сырой массы) в брыжеечной артерии SHR, отложенная на графике в виде функции дозы. Ткань собирали через шесть часов после третьей из трех пероральных доз, вводимых с 12-часовыми интервалами (n=9).
На фигуре 52 показана концентрация дофамина/норэпинефрина (мкг/мкг сырой массы) в брыжеечной артерии SHR, отложенная на графике в виде функции дозы. Ткань собирали через шесть часов после третьей из трех пероральных доз, вводимых с 12-часовыми интервалами (n=9).
На фигуре 53 показана концентрация дофамина (мкг/г сырой массы) в коре головного мозга SHR после введения непикастата, (R)-5-аминометил-1-(5,7-дифтор-1,2,3,4-тетрагидронафт-2-ил)-2,3-дигидро-2-тиоксо-1H-имидазолгидрохлорида или наполнителя дH2O, или SKF102698 или наполнителя ПЭГ 400:дH2O (1:1). Ткань собирали через шесть часов после третьей из трех пероральных доз, вводимых с 12-часовыми интервалами (n=9).
На фигуре 54 показана концентрация норэпинефрина (мкг/г сырой массы) в коре головного мозга SHR после введения непикастата, (R)-5-аминометил-1-(5,7-дифтор-1,2,3,4-тетрагидронафт-2-ил)-2,3-дигидро-2-тиоксо-1H-имидазолгидрохлорида или наполнителя дH2O, или SKF102698 или наполнителя ПЭГ 400:дH2O (1:1). Ткань собирали через шесть часов после третьей из трех пероральных доз, вводимых с 12-часовыми интервалами (n=9).
На фигуре 55 показана концентрация дофамина/норэпинефрина (мкг/мкг сырой массы) в коре головного мозга SHR после введения непикастата, (R)-5-аминометил-1-(5,7-дифтор-1,2,3,4-тетрагидронафт-2-ил)-2,3-дигидро-2-тиоксо-1H-имидазолгидрохлорида или наполнителя дH2O, или SKF102698 или наполнителя ПЭГ 400:дH2O (1:1). Ткань собирали через шесть часов после третьей из трех пероральных доз, вводимых с 12-часовыми интервалами (n=9).
На фигуре 56 показана концентрация дофамина (мкг/г сырой массы) в левом желудочке SHR после введения непикастата, (R)-5-аминометил-1-(5,7-дифтор-1,2,3,4-тетрагидронафт-2-ил)-2,3-дигидро-2-тиоксо-1H-имидазолгидрохлорида или наполнителя дH2O, или SKF102698 или наполнителя ПЭГ 400:дH2O (1:1). Ткань собирали через шесть часов после третьей из трех пероральных доз, вводимых с 12-часовыми интервалами (n=9).
На фигуре 57 показана концентрация норэпинефрина (мкг/г сырой массы) в левом желудочке SHR после введения непикастата, (R)-5-аминометил-1-(5,7-дифтор-1,2,3,4-тетрагидронафт-2-ил)-2,3-дигидро-2-тиоксо-1H-имидазолгидрохлорида или наполнителя дH2O, или SKF102698 или наполнителя ПЭГ 400:дH2O (1:1). Ткань собирали через шесть часов после третьей из трех пероральных доз, вводимых с 12-часовыми интервалами (n=9).
На фигуре 58 показана концентрация дофамина/норэпинефрина (мкг/мкг сырой массы) в левом желудочке SHR после введения непикастата, (R)-5-аминометил-1-(5,7-дифтор-1,2,3,4-тетрагидронафт-2-ил)-2,3-дигидро-2-тиоксо-1H-имидазолгидрохлорида или наполнителя дH2O, или SKF102698 или наполнителя ПЭГ 400:дH2O (1:1). Ткань собирали через шесть часов после третьей из трех пероральных доз, вводимых с 12-часовыми интервалами (n=9).
На фигуре 59 показана концентрация дофамина (мкг/г сырой массы) в брыжеечной артерии SHR после введения непикастата, (R)-5-аминометил-1-(5,7-дифтор-1,2,3,4-тетрагидронафт-2-ил)-2,3-дигидро-2-тиоксо-1H-имидазолгидрохлорида или наполнителя дH2O, или SKF102698 или наполнителя ПЭГ 400:дH2O (1:1). Ткань собирали через шесть часов после третьей из трех пероральных доз, вводимых с 12-часовыми интервалами (n=9).
На фигуре 60 показана концентрация норэпинефрина (мкг/г сырой массы) в брыжеечной артерии SHR после введения непикастата, (R)-5-аминометил-1-(5,7-дифтор-1,2,3,4-тетрагидронафт-2-ил)-2,3-дигидро-2-тиоксо-1H-имидазолгидрохлорида или наполнителя дH2O, или SKF102698 или наполнителя ПЭГ 400:дH2O (1:1). Ткань собирали через шесть часов после третьей из трех пероральных доз, вводимых с 12-часовыми интервалами (n=9).
На фигуре 61 показана концентрация дофамина/норэпинефрина (мкг/мкг сырой массы) в брыжеечной артерии SHR после введения непикастата, (R)-5-аминометил-1-(5,7-дифтор-1,2,3,4-тетрагидронафт-2-ил)-2,3-дигидро-2-тиоксо-1H-имидазолгидрохлорида или наполнителя дH2O, или SKF102698 или наполнителя ПЭГ 400:дH2O (1:1). Ткань собирали через шесть часов после третьей из трех пероральных доз, вводимых с 12-часовыми интервалами (n=9).
На фигуре 62 показаны уровни катехоламина в коре головного мозга, полосатом теле и брыжеечной артерии.
На фигуре 63 показаны уровни трийодтиронина в сыворотке.
На фигуре 64 показаны уровни тироксина в сыворотке.
На фигуре 65 показаны концентрации дофамина и норэпинефрина в мозговом слое почки собаки в ответ на непикастат.
На фигуре 66 показана концентрация дофамина и норэпинефрина в корковом веществе почки собаки в ответ на непикастат.
На фигуре 67 показано влияние плацебо или непикастата на уровни DA в плазме (пг/мл) у нормальных собак породы бигль.
На фигуре 68 показано влияние плацебо или непикастата на уровни NE в плазме (пг/мл) у нормальных собак породы бигль.
На фигуре 69 показано влияние плацебо или непикастата на соотношение DA/NE в плазме нормальных собак породы бигль.
На фигуре 70 показано влияние плацебо или непикастата на уровни EPI в плазме (пг/мл) у нормальных собак породы бигль.
На фигуре 71 показано влияние хронического введения (14,5 суток) непикастата на уровни NE, DA и EPI в плазме нормальных собак породы бигль. N=8 на группу. *p<0,05 по сравнению с плацебо.
На фигуре 72 показано влияние концентраций (нг/мл) свободного основания непикастата и RS 47831 в образцах плазмы, собранных после перорального введения RS 25560-197 (2 мг/кг; дважды в сутки) собакам породы бигль в течение 14,5 суток.
На фигуре 73 показаны уровни дофамина в почечной артерии у собак.
На фигуре 74 показаны уровни норэпинефрина в почечной артерии у собак. Собакам перорально вводили 0, 5, 15 или 30 мг/кг в капсулах дважды в сутки в течение 4,5 суток и образцы ткани собирали через 6 часов после конечного введения. N=8, *p<0,01 по сравнению с плацебо (среднее±SD).
На фигуре 75 показаны уровни дофамина в почечной артерии собак. Собакам перорально вводили капсулы 0, 5, 15 или 30 мг/кг в капсулах дважды в сутки в течение 4,5 суток и образцы ткани собирали через 6 часов после конечного введения. N=8, *p<0,01 по сравнению с плацебо (среднее±SD).
На фигуре 76 показаны уровни дофамина в коре головного мозга у собак. Собакам перорально вводили 0, 5, 15 или 30 мг/кг в капсулах дважды в сутки в течение 4,5 суток и образцы ткани собирали через 6 часов после конечного введения. N=8, *p<0,01; M 0,05<p<0,10 по сравнению с плацебо (среднее±SD).
На фигуре 77 показаны уровни норэпинефрина в коре головного мозга у собак. Собакам перорально вводили 0, 5, 15 или 30 мг/кг в капсулах дважды в сутки в течение 4,5 суток и образцы ткани собирали через 6 часов после конечного введения. N=8, *p<0,01 по сравнению с плацебо (среднее±SD).
На фигуре 78 показаны уровни соотношения дофамин/норэпинефрин в коре головного мозга у собак. Собакам перорально вводили 0, 5, 15 или 30 мг/кг в капсулах дважды в сутки в течение 4,5 суток и образцы ткани собирали через 6 часов после конечного введения. N=8, *p<0,01 по сравнению с плацебо (среднее±SD).
На фигуре 79 показаны уровни дофамина в левом желудочке у собак. Собакам перорально вводили 0, 5, 15 или 30 мг/кг в капсулах дважды в сутки в течение 4,5 суток и образцы ткани собирали через 6 часов после конечного введения. N=8, *p<0,01 по сравнению с плацебо (среднее±SD).
На фигуре 80 показаны уровни норэпинефрина в левом желудочке у собак. Собакам перорально вводили 0, 5, 15 или 30 мг/кг в капсулах дважды в сутки в течение 4,5 суток и образцы ткани собирали через 6 часов после конечного введения. N=8, *p<0,01 по сравнению с плацебо (среднее±SD).
На фигуре 81 показаны уровни дофамина/норэпинефрина в левом желудочке у собак. Собакам перорально вводили 0, 5, 15 или 30 мг/кг в капсулах дважды в сутки в течение 4,5 суток и образцы ткани собирали через 6 часов после конечного введения. N=8, *p<0,01 по сравнению с плацебо (среднее±SD).
На фигуре 82 показаны уровни дофамина в корковом веществе почки собак. Собакам перорально вводили 0, 5, 15 или 30 мг/кг в капсулах дважды в сутки в течение 4,5 суток и образцы ткани собирали через 6 часов после конечного введения. N=8, *p<0,01 по сравнению с плацебо (среднее±SD).
На фигуре 83 показаны уровни норэпинефрина в корковом веществе почек у собак. Собакам перорально вводили 0, 5, 15 или 30 мг/кг в капсулах дважды в сутки в течение 4,5 суток и образцы ткани собирали через 6 часов после конечного введения. N=8, *p<0,01 по сравнению с плацебо (среднее±SD).
На фигуре 84 показаны уровни дофамина/норэпинефрина в корковом веществе почек у собак. Собакам перорально вводили 0, 5, 15 или 30 мг/кг в капсулах дважды в сутки в течение 4,5 суток и образцы ткани собирали через 6 часов после конечного введения. N=8, *p<0,01 по сравнению с плацебо (среднее±SD).
На фигуре 85 показаны уровни дофамина в мозговом слое почек у собак. Собакам перорально вводили 0, 5, 15 или 30 мг/кг в капсулах дважды в сутки в течение 4,5 суток и образцы ткани собирали через 6 часов после конечного введения. N=8, *p<0,01; M, 0,05<p<0,10 по сравнению с плацебо (среднее±SD).
На фигуре 86 показаны уровни норэпинефрина в мозговом слое почек у собак. Собакам перорально вводили 0, 5, 15 или 30 мг/кг в капсулах дважды в сутки в течение 4,5 суток и образцы ткани собирали через 6 часов после конечного введения. N=8, *p<0,01; M, 0,05<p<0,10 по сравнению с плацебо (среднее±SD).
На фигуре 87 показаны уровни дофамина/норэпинефрина в мозговом слое почек у собак. Собакам перорально вводили 0, 5, 15 или 30 мг/кг в капсулах дважды в сутки в течение 4,5 суток и образцы ткани собирали через 6 часов после конечного введения. N=8, *p<0,01 по сравнению с плацебо (среднее±SD).
На фигуре 88 показана концентрация непикастата в ткани. Собакам перорально вводили 0, 5, 15 или 30 мг/кг в капсулах дважды в сутки в течение 4,5 суток и образцы ткани собирали через 6 часов после конечного введения. N=8 (только средние значения).
На фигуре 89 показаны концентрации непикастата в плазме на 5 день. Собакам перорально вводили 0, 5, 15 или 30 мг/кг в капсулах дважды в сутки в течение 4,5 суток и образцы ткани собирали через 6 часов после конечного введения. N=8 (только средние значения).
На фигуре 90 показана площадь под кривой (AUC) концентраций непикастата в плазме на 4 день, 0-8 часов. Собакам перорально вводили 0, 5, 15 или 30 мг/кг в капсулах дважды в сутки. N=8 (только средние значения).
На фигуре 91 показаны данные связывания β-адренергических рецепторов.
На фигуре 92 показано влияние непикастата на % ингибирования ферментативной активности.
На фигуре 93 показана активность бычьей DBH, выраженная в процентах ингибирования, отложенных на графике в виде функции log концентрации ингибитора.
На фигуре 94 показана активность DBH человека, выраженная в процентах ингибирования, отложенных на графике в виде функции log концентрации ингибитора.
На фигуре 95 показана IC50 трех ингибиторов DBH по отношению к активности DBH быка и человека (среднее±SE).
На фигуре 96 показаны график Лайнуивера-Берка для данных ингибирования DBH быка (A) и график кажущейся Km в зависимости от концентрации ингибитора (B).
На фигуре 97 показана схема исследований для определения аффинности непикастата в анализах связывания.
На фигуре 98 показан профиль рецепторов непикастата.
На фигуре 99 показаны суммарные данные о ректальной температуре (градусы по Цельсию).
На фигуре 100 показаны суммарные данные клинических наблюдений и тестов на поведение животных, обработанных наполнителем.
На фигуре 101 показаны суммарные данные клинических наблюдений и тестов на поведение животных, обработанных 30 мг/кг непикастата.
На фигуре 102 показаны суммарные данные клинических наблюдений и тестов на поведение животных, обработанных 100 мг/кг непикастата.
На фигуре 103 показаны суммарные данные клинических наблюдений и тестов на поведение животных, обработанных 300 мг/кг непикастата.
На фигуре 104 показан эксперимент по исследованию влияния непикастата на моторную активность: горизонтальная активность во временных точках 0,5 и 1 час.
На фигуре 105 показан эксперимент по исследованию влияния непикастата на моторную активность: горизонтальная активность во временных точках 1,5 и 2 часа.
На фигуре 106 показан эксперимент по исследованию влияния непикастата на моторную активность: горизонтальная активность во временных точках 2,5 и 3 часа.
На фигуре 107 показан эксперимент по исследованию влияния непикастата на моторную активность: горизонтальная активность во временных точках 3,5 и 4 часа.
На фигуре 108 показан эксперимент по исследованию влияния непикастата на моторную активность: количество передвижений во временных точках 0,5 и 1 час.
На фигуре 109 показан эксперимент по исследованию влияния непикастата на моторную активность: количество передвижений во временных точках 1,5 и 2 часа.
На фигуре 110 показан эксперимент по исследованию влияния непикастата на моторную активность: количество передвижений во временных точках 2,5 и 3 часа.
На фигуре 111 показан эксперимент по исследованию влияния непикастата на моторную активность: количество передвижений во временных точках 3,5 и 4 часа.
На фигуре 112 показан эксперимент по исследованию влияния непикастата на моторную активность: период покоя (секунды) во временных точках 0,5 и 1 час.
На фигуре 113 показан эксперимент по исследованию влияния непикастата на моторную активность: период покоя (секунды) во временных точках 1,5 и 2 часа.
На фигуре 114 показан эксперимент по исследованию влияния непикастата на моторную активность: период покоя (секунды) во временных точках 2,5 и 3 часа.
На фигуре 115 показан эксперимент по исследованию влияния непикастата на моторную активность: период покоя (секунды) во временных точках 3,5 и 4 часа.
На фигуре 116 показан эксперимент по исследованию влияния DBHI на моторную активность: горизонтальная активность.
На фигуре 117 показан эксперимент по исследованию влияния DBHI на моторную активность: количество передвижений.
На фигуре 118 показан эксперимент по исследованию влияния DBHI на моторную активность: период покоя (секунды).
На фигуре 119 показаны суммарные статистические данные и оценка значимости для максимальной реакции вздрагивания.
На фигуре 120 показаны суммарные статистические данные и оценка значимости для максимальной реакции вздрагивания.
На фигуре 121 показаны суммарные статистические данные и оценка значимости для максимальной реакции вздрагивания.
На фигуре 122 показаны суммарные статистические данные и оценка значимости для максимальной реакции вздрагивания.
На фигуре 123 показано действие непикастата и H2O с течением времени в отношении максимальной реакции вздрагивания.
На фигуре 124 показано действие непикастата и H2O с течением времени в отношении средней реакции вздрагивания.
На фигуре 125 показано действие ПЭГ и SKF с течением времени в отношении максимальной реакции вздрагивания.
На фигуре 126 показано действие ПЭГ и SKF с течением времени в отношении средней реакции вздрагивания.
На фигуре 127 показано действие клонидина и H2O с течением времени в отношении максимальной реакции вздрагивания.
На фигуре 128 показано действие клонидина и H2O с течением времени в отношении средней реакции вздрагивания.
На фигуре 129 показана способность к реакции вздрагивания на акустический сигнал до обработки и исходные данные для каждой крысы.
На фигуре 130 показана способность к реакции вздрагивания на акустический сигнал до обработки и исходные данные для каждой крысы.
На фигуре 131 показано отсутствие влияния DBHI, непикастата и SKF 102698 на внутреннюю температуру тела.
На фигуре 132 показаны средние внутренние температуры тела (в градусах по Цельсию) исходного уровня и в 1 день.
На фигуре 133 показаны средние внутренние температуры тела (в градусах по Цельсию) на 5 день и 1 день.
На фигуре 134 показано влияние SKF 102698 на спонтанную моторную активность.
На фигуре 135 показана спонтанная моторная активность в период 0-15 и 15-30 минут.
На фигуре 136 показана спонтанная моторная активность в период 30-45 и 45-60 минут.
На фигуре 137 показано отсутствие влияния непикастата на спонтанную моторную активность.
На фигуре 138 показано отсутствие влияния DBHI-соединений SKF 102698 и непикастата на преимпульсное ингибирование.
На фигуре 139 показаны суммарные статистические данные и P-значения для общих попарных сравнений обработок в отношении преимпульсного ингибирования у крыс.
На фигуре 140 показаны суммарные статистические данные и P-значения для попарных сравнений обработок в пределах временного интервала в отношении преимпульсного ингибирования в процентах у крыс (для 1-15 вздрагиваний).
На фигуре 141 показаны суммарные статистические данные и P-значения для попарных сравнений обработок в пределах временного интервала в отношении преимпульсного ингибирования в процентах у крыс (для 31-45 вздрагиваний).
На фигуре 142 показано уменьшение способности к реакции вздрагивания на акустический сигнал, вызываемое DBHI SKF-102698, но не непикастатом.
На фигуре 143 показаны суммарные статистические данные и P-значения для общих парных сравнений обработок в отношении способности к реакции вздрагивания на акустический сигнал у крыс.
На фигуре 144 показаны суммарные статистические данные и P-значения для попарных сравнений обработок в пределах временного интервала в отношении способности к реакции вздрагивания на акустический сигнал у крыс (для 1-15 вздрагиваний).
На фигуре 145 показаны суммарные статистические данные и P-значения для попарных сравнений обработок в пределах временного интервала в отношении способности к реакции вздрагивания на акустический сигнал у крыс (для 31-45 вздрагиваний).
На фигуре 146 показано влияние SKF 102698 на изменение массы тела.
На фигуре 147 показано отсутствие влияния непикастата на изменение массы тела.
На фигуре 148 показаны результаты пероральной доставки у обезьян.
На фигуре 149 показаны результаты пероральной доставки у обезьян.
На фигуре 150 показана шкала оценки клинического состояния (CRS), используемая в указанных исследованиях.
На фигуре 151 суммированы схемы повреждения для животных групп A, B, C и D.
На фигуре 152 суммированы схемы повреждений для животных групп A, B, C и D.
На фигуре 153 показаны IRAM (A) и CRS (B) для обработки плацебо.
На фигуре 154 показаны IRAM (A) и CRS (B) для группы B.
На фигуре 155 показаны IRAM (A) и CRS (B) для группы C.
На фигуре 156 показаны IRAM (A) и CRS (B) для группы D.
На фигуре 157 показано сравнение обработки плацебо с тремя концентрациями непикастата.
На фигуре 158 показано сравнение обработки плацебо с тремя концентрациями непикастата.
На фигуре 159 показано сравнение CRS после повреждения МФТП (до обработки) с обработкой L-ДОФА и плацебо для группы A.
На фигуре 160 показан критерий Фридмана и описательная статистика для группы A.
На фигуре 161 показан апостериорный анализ с использованием критерия Даннета для группы A.
На фигуре 162 показано сравнение CRS после повреждения МФТП (до обработки) с обработкой L-ДОФА и непикастатом для группы B.
На фигуре 163 показан критерий Фридмана и описательная статистика для группы B.
На фигуре 164 показан апостериорный анализ с использованием критерия Даннета для группы B.
На фигуре 165 показано сравнение CRS после повреждения МФТП (до обработки) с обработкой L-ДОФА и непикастатом для группы C.
На фигуре 166 показан критерий Фридмана и описательная статистика для группы C.
На фигуре 167 показан апостериорный анализ с использованием критерия Даннета для группы C.
На фигуре 168 показано сравнение CRS после повреждения МФТП (до обработки) с обработкой L-ДОФА и непикастатом для группы D.
На фигуре 169 показан критерий Фридмана и описательная статистика для группы D.
На фигуре 170 показан апостериорный анализ с использованием критерия Даннета для группы D.
На фигуре 171 показана оценка активности в группах.
На фигуре 172 показана описательная статистика для групп обработки.
На фигуре 173 показан исходный уровень частоты сердечных сокращений и среднего артериального давления.
На фигуре 174 показано влияние непикастата на частоту сердечных сокращений у находящихся в сознании SHR, предварительно обработанных SCH-23390 или наполнителем.
На фигуре 175 показано влияние непикастата на среднее артериальное давление у SHR, предварительно обработанных SCH-23390 или наполнителем.
На фигуре 176 показано среднее кровяное давление в четырех группах крыс в день перед началом обработки лекарственными средствами.
На фигуре 177 показана частота сердечных сокращений в четырех группах крыс в день перед началом обработки лекарственными средствами.
На фигуре 178 показаны моторные активности (в произвольных единицах) в четырех группах крыс в день перед началом обработки лекарственными средствами.
На фигуре 179 показано среднее кровяное давление в четырех группах крыс в 1 день обработки лекарственными средствами.
На фигуре 180 показано среднее кровяное давление в четырех группах крыс на 2 день обработки лекарственными средствами.
На фигуре 181 показано среднее кровяное давление в четырех группах крыс на 3 день обработки лекарственными средствами.
На фигуре 182 показано среднее кровяное давление в четырех группах крыс на 7 день обработки лекарственными средствами.
На фигуре 183 показаны частоты сердечных сокращений в четырех группах крыс на 2 день обработки лекарственными средствами.
На фигуре 184 показаны моторные активности (в произвольных единицах) в четырех группах крыс на 3 день обработки лекарственными средствами.
На фигуре 185 показаны изменения массы тела в четырех группах крыс во время первых 6 дней обработки.
На фигуре 186 показаны уровни значимости среднего кровяного давления для каждой временной точки.
На фигуре 187 показаны уровни значимости среднего кровяного давления для каждой временной точки.
Подробное описание
В используемом в настоящем описании смысле подразумевается, что следующие слова и фразы имеют значение, которое указано ниже, за исключением случая, когда контекст, в котором они указаны, диктует иное.
В используемом в настоящем описании смысле «соединение A» включает непикастат (((S)-5-аминометил-1-(5,7-дифтор-1,2,3,4-тетрагидронафт-2-ил)-2,3-дигидро-2-тиоксо-1H-имидазолгидрохлорид)), ((R)-5-аминометил-1-(5,7-дифтор-1,2,3,4-тетрагидронафт-2-ил)-2,3-дигидро-2-тиоксо-1H-имидазолгидрохлорид) и их смеси, а также их фармацевтически приемлемые соли.
«Фармацевтически приемлемые соли» включают без ограничения соли неорганических кислот, такие как гидрохлорат, фосфат, дифосфат, гидробромат, сульфат, сульфинат, нитрат и подобные соли; а также соли органических кислот, такие как малат, малеат, фумарат, тартрат, сукцинат, цитрат, ацетат, лактат, метансульфонат, п-толуолсульфонат, 2-гидроксиэтилсульфонат, бензоат, салицилат, стеарат и алканоат, такой как ацетат, HOOC-(CH2)n-COOH, где n равно 0-4, и подобные соли.
Кроме того, если соединение получают в виде кислотно-аддитивной соли, то свободное основание может быть получено подщелачиванием раствора кислой соли. Напротив, если продукт является свободным основанием, то аддитивная соль, в частности фармацевтически приемлемая аддитивная соль, может быть получена растворением свободного основания в подходящем органическом растворителе и обработкой раствора кислотой обычными способами получения кислотно-аддитивных солей из соединений, представляющих собой основания. Специалистам в данной области будут известны различные методики синтеза, которые могут быть использованы для получения нетоксичных фармацевтически приемлемых аддитивных солей.
В используемом в настоящем описании смысле термин «лечение» относится к любому способу, посредством которого, по меньшей мере, один признак, симптом или кластер симптомов заболевания или расстройства изменяют полезным для пациента образом, так чтобы предотвратить или задержать появление, уменьшить распространение или частоту, уменьшить тяжесть или интенсивность, замедлить прогрессирование, предотвратить рецидив или ослабить симптомы или ассоциированные симптомы заболевания или расстройства. Например, в случае посттравматического стрессового расстройства лечение расстройства в некоторых вариантах может вызывать уменьшение, по меньшей мере, одного из показателей, частоты и интенсивности, по меньшей мере, одного из признаков, симптомов и кластеров симптомов посттравматического стрессового расстройства.
В используемом в настоящем описании смысле фраза «диагностировано посттравматическое стрессовое расстройство (ПТСР)» относится к наличию признака, симптома или кластера симптомов, которые являются показателями посттравматического стрессового расстройства, психиатрического расстройства, запускаемого травматическим событием. Не ограничивающими примерами таких травматических событий являются боевые действия, террористические акты, физическое нападение, сексуальное насилие, автомобильные катастрофы и стихийные бедствия.
В справочнике по диагностике и статистике психических расстройств, в IV переработанной редакции (DSM-IV-TR), руководстве для специалистов в области психического здоровья, в котором перечислены категории психических расстройств и критериев, посттравматическое стрессовое расстройство классифицируют как тревожное расстройство. Согласно DSM-IV-TR диагноз ПТСР может быть поставлен в том случае, если:
1) пациент был участником, свидетелем или сталкивался с событием или событиями, которые включают реальную смерть, или серьезное повреждение, или угрозу смерти или серьезного повреждения, или угрозу физической целостности самого пациента или других людей, и реакция пациента включала сильный страх, беспомощность или ужас;
2) вследствие травматического события у пациента наблюдается по меньшей мере 1 симптом повторного переживания/вторжения, 3 симптома избегания/блокировки и 2 симптома гипервозбуждения, и продолжительность симптомов составляет более 1 месяца; и
3) симптомы вызывают клинически значимый дистресс или нарушение в социальной, профессиональной или других сферах деятельности.
В некоторых вариантах, если расстройство пациента удовлетворяет критериям DSM-IV-TR, у пациента диагностируют посттравматическое стрессовое расстройство. В некоторых вариантах, если пациент имеет, по меньшей мере, один признак, симптом или кластер симптомов посттравматического стрессового расстройства, у пациента диагностируют посттравматическое стрессовое расстройство. В некоторых вариантах используют шкалу для измерения признака, симптома или кластера симптомов посттравматического стрессового расстройства и посттравматическое стрессовое расстройство диагностируют на основе измерения с использованием такой шкалы. В некоторых вариантах используют «балл» по шкале для диагностики или оценки признака, симптома или кластера симптомов посттравматического стрессового расстройства. В некоторых вариантах в «баллах» можно измерить, по меньшей мере, один из показателей: частоту, интенсивность или тяжесть признака, симптома или кластера симптомов посттравматического стрессового расстройства.
В используемом в настоящем описании смысле термин «шкала» относится к способу измерения, по меньшей мере, одного признака, симптома или кластера симптомов посттравматического стрессового расстройства у пациента. В некоторых вариантах шкала может быть основана на интервью или опросе. Неограничивающими примерами шкалы являются применяемая клиницистом шкала ПТСР (CAPS), применяемая клиницистом шкала ПТСР, часть 2 (CAPS-2), применяемая клиницистом шкала ПТСР для детей и подростков (CAPS-CA), шкала оценки влияния травматического события (IES), шкала оценки влияния травматического события - пересмотренная (IES-R), шкала общего клинического впечатления (CGI), шкала общего клинического впечатления о тяжести заболевания (CGI-S), шкала общего клинического впечатления об улучшении (CGI-I), шкала общей оценки ПТСР Дьюка (DGRP), шкала общей оценки улучшения при ПТСР Дьюка (DGRP-I), шкала тревоги Гамильтона (HAM-A), структурированный опросник для оценки ПТСР (SI-PTSD), опросник для оценки ПТСР (PTSD-I), шкала симптомов ПТСР (PSS-I), малый международный нейропсихиатрический опросник (MINI), шкала оценки депрессии Монтгомери-Асберга (MADRS), шкала депрессии Бека (BDI), шкала депрессии Гамильтона (HAM-D), пересмотренная шкала Гамильтона для оценки депрессии (RHRSD), большой опросник для оценки депрессии (MDI), шкала оценки депрессии пожилого и старческого возраста (GDS-30) и индекс депрессии у детей (CDI).
В используемом в настоящем описании смысле термины «признак» и «признаки» относятся к объективным данным о расстройстве. В некоторых вариантах признак может представлять собой физиологическое проявление или реакцию организма в случае расстройства. В некоторых вариантах признак может относиться к частоте сердечных сокращений, температуре тела, характеру и интенсивности дыхания, кровному давлению. В некоторых вариантах признаки могут быть ассоциированы с симптомами. В некоторых вариантах признаки могут быть показателями симптомов.
В используемом в настоящем описании смысле термины «симптом» и «симптомы» относятся к субъективным показателям, которые характеризуют расстройство. Симптомы посттравматического стрессового расстройства могут относиться, например, без ограничения к повторяющимся и навязчивым воспоминаниям о травматическом событии, повторяющимся и причиняющим страдания снам о травматическом событии, таким действиям и ощущениям, как если бы травматическое событие происходило вновь, дистрессу при напоминании о травматическом событии, физиологической реактивности в ситуациях, напоминающих травматическое событие, попыткам по избеганию мыслей и чувств, связанных с травмой, попыткам избегать действий или ситуаций, неспособности вспомнить о травме или аспектах травмы, заметно сниженному интересу в значимых видах деятельности, чувствам отстраненности или отчужденности от других людей, сниженной выраженности аффекта, чувству отсутствия перспективы в будущем, социальной тревожности, тревожности в незнакомом окружении, трудности с засыпанием или плохому сну, раздражительности или вспышкам гнева, затруднениям с концентрацией внимания, сверхнастороженности и чрезмерной реакции испуга. В некоторых вариантах потенциально угрожающие стимулы могут вызывать гипервозбуждение или тревожность. В некоторых вариантах физиологическая реактивность проявляется, по меньшей мере, в одном из следующих признаков: нарушенное дыхание, аномальная частота сердечных сокращений, аномальное кровяное давление, аномальное функционирование специальных видов чувствительности и аномальное функционирование органов чувств. В некоторых вариантах сниженная выраженность аффекта характеризуется уменьшенным или ограниченным диапазоном или интенсивностью чувств или проявлением чувств, и чувство отсутствия перспективы в будущем может проявляться в том, что пациент думает о том, что у него не будет карьерного роста, женитьбы, детей или нормальной продолжительности жизни. В некоторых вариантах у детей и подростков могут проявляться такие симптомы посттравматического стрессового расстройства, как, например и без ограничения, дезорганизованное или возбужденное поведение, периодически повторяющиеся игры, которые отображают аспекты травмы, ночные кошмары, в которых отсутствует распознаваемое содержание и специфичное для травмы повторяющееся поведение. В некоторых вариантах симптом может представлять собой стресс, ассоциированный с воспоминаниями.
В используемом в настоящем описании смысле термин «кластер симптомов» относится к набору признаков, симптомов или набору признаков и симптомов, которые сгруппированы вместе вследствие их взаимосвязи друг с другом или их одновременного проявления. Например, в некоторых вариантах посттравматическое стрессовое расстройство характеризуется тремя кластерами симптомов: повторного переживания/вторжения, избегания/блокировки и гипервозбуждения.
В используемом в настоящем описании смысле термин «повторное переживание/вторжение» относится, по меньшей мере, к одному из следующих признаков: повторяющимся и навязчивым воспоминаниям о травматическом событии, повторяющимся и причиняющим страдания снам о травматическом событии, таким действиям и ощущениям, как если бы травматическое событие происходило вновь, дистрессу при напоминании о травматическом событии и физиологической реактивности в ситуациях, напоминающих травматическое событие. В некоторых вариантах физиологическая реактивность проявляется, по меньшей мере, в одном из следующих признаков: нарушенное дыхание, аномальная частота сердечных сокращений, аномальное кровяное давление, аномальное функционирование специальных видов чувствительности и аномальное функционирование органов чувств.
В используемом в настоящем описании смысле термин «избегание/блокировка» относится, по меньшей мере, к одному из следующих признаков: попытки избегать мыслей или чувств, связанных с травмой, попытки избегать действий или ситуаций, неспособность вспомнить о травме или аспектах травмы, заметно сниженный интерес в значимых видах деятельности, чувства отстраненности или отчужденности от других людей, сниженная выраженность аффекта и чувство отсутствия перспективы в будущем. Сниженная выраженность аффекта характеризуется уменьшенным или ограниченным диапазоном или интенсивностью чувств или проявлением чувств. Чувство отсутствия перспективы в будущем может проявляться в том, что пациент думает о том, что у него не будет карьерного роста, женитьбы, детей или нормальной продолжительности жизни. Избегание/блокировка также могут проявляться в социальной тревожности и тревожности в незнакомом окружении.
В используемом в настоящем описании смысле термин «гипервозбуждение» относится, по меньшей мере, к одному из следующих признаков: трудности с засыпанием или плохому сну, раздражительности или вспышкам гнева, затруднениям с концентрацией внимания, сверхнастороженности и чрезмерной реакции испуга. Потенциально угрожающие стимулы могут вызывать гипервозбуждение или тревожность.
В используемом в настоящем описании смысле термин «значимо» относится к набору наблюдений или событий, которые слишком тесно коррелируют, чтобы их можно было приписать случайности. Например, в некоторых вариантах «значимо изменяет», «значимо снижает» и «значимо увеличивает» относится к изменениям или эффектам, которые вероятно нельзя приписать случайности. В некоторых вариантах можно использовать статистические способы, чтобы определить, можно ли данные назвать «значимо» измененными, уменьшенными, увеличенными или измененными.
Пациенты, у которых диагностировано посттравматическое стрессовое расстройство, могут ощущать состояние «боевой готовности», беспокойство и сильную тревогу. Депрессия, тревожность, острые тревожные состояния с реакцией паники и биполярное расстройство часто ассоциированы с посттравматическим стрессовым расстройством. Также распространено злоупотребление алкоголем и лекарственными веществами. В некоторых вариантах расстройства, сочетаемые с посттравматическим стрессовым расстройством, могут, например, включать без ограничения депрессию, злоупотребление алкоголем и злоупотребление лекарственными веществами.
В используемом в настоящем описании смысле термин «применяемая клиницистом шкала ПТСР (CAPS)» относится к способу измерения для диагностики и оценки посттравматического стрессового синдрома. CAPS представляет собой структурированный опросник из 30 пунктов, который соответствует критериям DSM-IV для ПТСР. Разработаны различные варианты такого способа измерения.
В используемом в настоящем описании смысле термин «применяемая клиницистом шкала ПТСР, часть 1 (CAPS-1)» означает вариант CAPS, который оценивает ПТСР в данный момент и за период существования, и также известен как CAPS-DX (для диагностики).
В используемом в настоящем описании смысле термин «применяемая клиницистом шкала ПТСР, часть 2 (CAPS-2)» относится к варианту CAPS, используемому для оценки симптоматики в течение недели, предшествующей тестированию, у пациентов с посттравматическим стрессовым расстройством и также названному CAPS-SX (для симптоматики).
В используемом в настоящем описании смысле термин «применяемая клиницистом шкала ПТСР для детей и подростков (CAPS-CA)» относится к варианту CAPS, разработанному для детей и подростков.
В используемом в настоящем описании смысле термин «шкала оценки влияния травматического события (IES)» относится к шкале, разработанной Mardi Horowitz, Nancy Wilner и William Alvarez для субъективной оценки стресса, связанного с конкретным событием. Такая шкала основана на собственной оценке пациентом и может быть использована для получения показателей с течением времени, чтобы наблюдать состояние пациента.
В используемом в настоящем описании смысле термин «шкала оценки влияния травматического события - пересмотренная (IES-R)» относится к новой редакции IES, разработанной Daniel S. Weiss и Charles Marmar для оценки кластера симптомов гипервозбуждения в случае ПТСР.
В используемом в настоящем описании смысле термин «шкала общего клинического впечатления (CGI)» относится к шкале психиатрической оценки. Пациентов опрашивают и используют CGI для оценки тяжести заболевания (CGI-S), общего улучшения (CGI-I) и коэффициента эффективности.
В используемом в настоящем описании смысле термин «шкала общего клинического впечатления о тяжести заболевания (CGI-S)» относится к оценке текущих симптомов у пациента. В общем, шкала рассчитана на семь пунктов в диапазоне от 1 балла (норма) до 7 (очень тяжелая форма заболевания). Тяжесть заболевания пациента сравнивают с тяжестью заболевания у других пациентов. Например, шкалу CGI-S можно использовать для оценки состояния пациента после лечения соединением A, и может быть проведено сравнение оценки в баллах до и после лечения.
В используемом в настоящем описании смысле термин «шкала общего клинического впечатления об улучшении (CGI-I)» относится к сравнению текущего состояния пациента с его состоянием на исходном уровне. В общем, шкала рассчитана на семь пунктов в диапазоне от 1 (очень значительное улучшение) до 7 (очень значительное ухудшение). Шкалу CGI-I можно использовать, например, для оценки улучшения в случае посттравматического стрессового расстройства в ответ на лечение соединением A.
В используемом в настоящем описании смысле термин «коэффициент эффективности» относится к оценке, полученной на основе CGI, и позволяет сравнить состояние пациента исходного уровня с отношением текущей терапевтической пользы к тяжести побочных эффектов. В общем, шкала основана на четырех пунктах в диапазоне от 1 (нет) до 4 (превосходство терапевтического эффекта). При оценке посттравматического стрессового расстройства индекс эффективности позволяет, например, оценивать соотношения риска и пользы лечения таким терапевтическим средством, как соединение A.
В используемом в настоящем описании смысле термин «шкала общей оценки ПТСР Дьюка (DGRP)» относится к шкале, которая позволяет измерять тяжесть и улучшение по каждому из трех кластеров симптомов ПТСР: повторного переживания/вторжения, избегания/блокировки и гипервозбуждения, а также тяжесть ПТСР в общем.
В используемом в настоящем описании смысле термин «шкала общей оценки улучшения при ПТСР Дьюка (DGRP-I)» относится к шкале, используемой для того, чтобы отличить реагирующих на лечение пациентов (DGRP-I - 1 (очень значительное улучшение) и 2 (значительное улучшение)) от не реагирующих на лечение пациентов (DGRP-I>2), например лечение соединением A в случае посттравматического стрессового расстройства.
В используемом в настоящем описании смысле термин «шкала тревоги Гамильтона (HAM-A) относится к шкале, разработанной Максом Гамильтоном в 1959, для диагностики и количественной оценки симптомов тревоги и посттравматического стрессового расстройства. Шкала состоит из 14 пунктов, каждый из которых определяется серией симптомов. Не было разработано стандартизованных вопросов, чтобы получить информацию от пациентов, или специфичных поведенческих инструкций для определения оценки пункта в баллах. Значение в баллах каждого пункта ранжируется по 5-балльной шкале от 0 (отсутствует) до 4 (в тяжелой степени). В пункты включена оценка тревожного настроения, страхов, интеллектуальных нарушений, соматических симптомов, например, в мускулатуре, сердечно-сосудистых симптомов, напряжения, инсомнии, депрессивного настроения, соматических сенсорных симптомов, респираторных симптомов, желудочно-кишечных симптомов, автономных симптомов, симптомов мочеполовой системы и поведения во время оценки. Например, уменьшение оценки HAM-A в баллах может показывать улучшение состояния в случае расстройства, такого как посттравматическое стрессовое расстройство.
В используемом в настоящем описании смысле термины «структурированный опросник для оценки ПТСР (SI-PTSD), опросник для оценки ПТСР (PTSD-I), шкала симптомов ПТСР (PSS-I), малый международный нейропсихиатрический опросник (MINI), шкала оценки депрессии Монтгомери-Асберга (MADRS), шкала депрессии Бека (BDI), шкала депрессии Гамильтона (HAM-D), пересмотренная шкала Гамильтона для оценки депрессии (RHRSD), большой опросник для оценки депрессии (MDI), шкала оценки депрессии пожилого и старческого возраста (GDS-30) и индекс депрессии у детей (CDI)» относятся к дополнительным шкалам, которые позволяют диагностировать, оценивать, измерять признак, симптом, кластер симптомов посттравматического стрессового расстройства, тревожности или депрессии.
В используемом в настоящем описании смысле термин «оценка в баллах» относится к оценке в баллах, по меньшей мере, одного пункта или параметра, измеряемого по шкале, которая характеризует, по меньшей мере, один признак, симптом или кластер симптомов, относящихся к психиатрическим симптомам, тревожности или посттравматическому стрессовому расстройству. В некоторых вариантах оценка в баллах позволяет измерять частоту, интенсивность или тяжесть признака, симптома, кластера симптомов, ассоциированного симптома или влияние посттравматического стрессового расстройства на повседневную жизнь. В некоторых вариантах «оценка в баллах», которая позволяет оценивать посттравматическое стрессовое расстройство, может быть значимо изменена, например, в результате лечения посттравматического стрессового расстройства.
В используемом в настоящем описании смысле термин «оценка в конечной точке» относится к оценке способом, который оценивает посттравматическое стрессовое расстройство во время или после лечения.
В используемом в настоящем описании смысле термин «оценка исходного уровня» относится к оценке способом, который оценивает посттравматическое стрессовое расстройство перед началом лечения.
В используемом в настоящем описании смысле термин «общая оценка» относится к сумме оценок в баллах, полученной способом, который оценивает посттравматическое стрессовое расстройство. В некоторых вариантах общая оценка представляет собой сумму баллов оценки, по меньшей мере, одного из симптомов, кластера симптомов, ассоциированных симптомов, влияния на повседневную жизнь, эффективности и улучшения.
В используемом в настоящем описании смысле термин «рецидив» относится к повторному появлению или ухудшению, по меньшей мере, одного симптома заболевания или расстройства у пациента.
В используемом в настоящем описании смысле фраза «терапевтически эффективное количество» относится к количеству, достаточному для обеспечения терапевтического результата по отношению, по меньшей мере, к одному признаку, симптому или ассоциированному симптому заболевания, расстройства или состояния. Заболеванием, расстройством или состоянием является, например, ПТСР.
В используемом в настоящем описании смысле фраза «повышение устойчивости» относится к повышению способности пациента переживать травматическое событие, при этом не страдая от посттравматического стрессового расстройства, или с развитием такого расстройства, но с меньшей симптоматикой после травматического события или меньшим нарушением нормальной активности в повседневной жизни. В некоторых вариантах повышение устойчивости может уменьшать один из признаков, симптомов или кластеров симптомов посттравматического стрессового расстройства.
В используемом в настоящем описании смысле термин «совместное введение» относится к схеме дозирования первого средства, которая перекрывается со схемой дозирования второго средства, или к одновременному введению первого средства и второго средства. Схема дозирования характеризуется количеством, частотой и продолжительностью введения доз. Две схемы дозирования перекрываются, если между началом первого и началом второго введения первого средства вводят второе средство.
В используемом в настоящем описании смысле термин «средство» относится к веществу, включая без ограничения химическое соединение, такое как малая молекула или сложное органическое соединение, белок, например антитело или фрагмент антитела, или белок, содержащий фрагмент антитела, или генетическую конструкцию, которая действует на уровне ДНК или мРНК в организме.
В используемом в настоящем описании смысл термин «дофамин-β-гидроксилазная активность» относится к превращению дофамина в норэпинефрин, опосредованному дофамин-β-гидроксилазой. Активность дофамин-β-гидроксилазы можно анализировать, измеряя уровни дофамина или норэпинефрина.
В используемом в настоящем описании смысле термин «модулирует» относится к изменению активности, функции или признака. Например, средство может модулировать уровни фактора посредством повышения или уменьшения уровней фактора.
В используемом в настоящем описании смысле термин катехоламин относится к соединению, которое содержит аминогруппу, связанную с катехолом, и которое служит в качестве гормона или нейромедиатора. В качестве примера и без ограничения катехоламинами являются дофамин и норэпинефрин.
В настоящем изобретении предлагаются способы лечения пациента, у которого диагностировано посттравматическое стрессовое расстройство. Способы включают введение пациенту терапевтически эффективного количества соединения A.
В некоторых вариантах способы дополнительно включают совместное введение терапевтически эффективного количества, по меньшей мере, одного другого средства, выбранного из бензодиазепина, селективного ингибитора обратного захвата серотонина (SSRI), ингибитора обратного захвата серотонина-норэпинефрина (SNRI), ингибитора обратного захвата норэпинефрина (NRI), антагониста серотонин-5-гидрокситриптамина 1A (5HT1A), ингибитора дофамин-β-гидроксилазы, антагониста рецептора аденозина A2A, ингибитора моноаминоксидазы (MAOI), блокатора натриевых (Na) каналов, блокатора кальциевых каналов, антагониста центральных и периферических альфа-адренергических рецепторов, агониста центральных альфа-адренергических рецепторов, антагониста центральных или периферических бета-адренергических рецепторов, антагониста рецептора NK-I, антагониста кортикотропин-рилизинг фактора (CRF), атипичного антидепрессанта/антипсихотического средства, трициклического средства, противосудорожного средства, антагониста глутамата, агониста гамма-аминомасляной кислоты (GABA) и частичного агониста D2.
В некоторых вариантах, по меньшей мере, одно другое средство представляет собой SSRI, выбранный из пароксетина, сертралина, циталопрама, эсциталопрама и флуоксетина.
В некоторых вариантах, по меньшей мере, одно другое средство представляет собой SNRI, выбранный из дулоксетина, миртазапина и венлафаксина.
В некоторых вариантах, по меньшей мере, одно другое средство представляет собой NRI, выбранный из бупропиона и атомоксетина.
В некоторых вариантах, по меньшей мере, одно другое средство представляет собой дисульфирам.
В некоторых вариантах, по меньшей мере, одно другое средство представляет собой антагонист рецептора аденозина A2A истрадефиллин.
В некоторых вариантах, по меньшей мере, одно другое средство представляет собой блокатор натриевого канала, выбранный из ламотригина, карбамазепина, окскарбазепина и вальпроата.
В некоторых вариантах, по меньшей мере, одно другое средство представляет собой блокатор кальциевого канала, выбранный из ламотригина и карбамазепина.
В некоторых вариантах, по меньшей мере, одно другое средство представляет собой антагонист центральных и периферических альфа-адренергических рецепторов празозин.
В некоторых вариантах, по меньшей мере, одно другое средство представляет собой агонист центральных альфа-адренергических рецепторов клонидин.
В некоторых вариантах, по меньшей мере, одно другое средство представляет собой антагонист центральных или периферических бета-адренергических рецепторов пропранолол.
В некоторых вариантах, по меньшей мере, одно другое средство представляет собой атипичный антидепрессант/антипсихотическое средство, выбранное из оланзепина, рисперидона и кветиапина.
В некоторых вариантах, по меньшей мере, одно другое средство представляет собой трициклическое средство, выбранное из амитриптилина, амоксапина, дезипрамина, доксепина, имипрамина, нортриптилина, протиптилина и тримипрамина.
В некоторых вариантах, по меньшей мере, одно другое средство представляет собой противосудорожное средство, выбранное из ламотригина, карбамазепина, окскарбазепина, вальпроата, топирамата и леветирацетама.
В некоторых вариантах, по меньшей мере, одно другое средство представляет собой антагонист глутамата топирамата.
В некоторых вариантах, по меньшей мере, одно другое средство представляет собой агонист GABA, выбранный из вальпроата и топирамата.
В некоторых вариантах, по меньшей мере, одно другое средство представляет собой частичный агонист D2 арипипразол.
В некоторых вариантах пациент имеет аномальные уровни, по меньшей мере, одного катехоламина в головном мозге.
В некоторых вариантах соединение A снижает активность дофамин-β-гидроксилазы в головном мозге пациента.
В некоторых вариантах соединение A модулирует уровни, по меньшей мере, одного катехоламина в головном мозге пациента.
В некоторых вариантах, по меньшей мере, один катехоламин является норэпинефрином, и соединение A уменьшает уровни норэпинефрина в головном мозге пациента.
В некоторых вариантах, по меньшей мере, один катехоламин является дофамином, и соединение A повышает уровни дофамина в головном мозге пациента.
В некоторых вариантах соединение A уменьшает стресс, ассоциированный с воспоминаниями пациента.
В некоторых вариантах соединение A уменьшает, по меньшей мере, один из показателей, частоту и интенсивность, по меньшей мере, одного признака посттравматического стрессового расстройства у пациента.
В некоторых вариантах соединение A уменьшает, по меньшей мере, один из показателей, частоту и интенсивность, по меньшей мере, одного из симптомов посттравматического стрессового расстройства у пациента.
В некоторых вариантах соединение A уменьшает, по меньшей мере, один из показателей, частоту и интенсивность, по меньшей мере, одного кластера симптомов посттравматического стрессового расстройства у пациента, при этом кластер симптомов выбран из повторного переживания/вторжения, избегания/блокировки и гипервозбуждения.
В некоторых вариантах повторное переживание/вторжение включает, по меньшей мере, повторяющиеся и навязчивые воспоминания о травматическом событии, повторяющиеся и причиняющие страдания сны о травматическом событии, такие действия и ощущения, как если бы травматическое событие происходило вновь, дистресс при напоминании о травматическом событии и физиологическую реактивность в ситуациях, напоминающих травматическое событие.
В некоторых вариантах физиологическая реактивность включает, по меньшей мере, один из следующих признаков: нарушенное дыхание, аномальную частоту сердечных сокращений, аномальное кровяное давление, аномальное функционирование специальных видов чувствительности и аномальное функционирование, по меньшей мере, одного органа чувств.
В некоторых вариантах, по меньшей мере, один из специальных видов чувствительности выбран из чувства зрения, слуха, осязания, обоняния, вкуса.
В некоторых вариантах, по меньшей мере, один орган чувств выбран из глаза, уха, кожи, носа, языка и глотки.
В некоторых вариантах избегание/блокировка включает себя, по меньшей мере, один из следующих признаков: попытки избегать мыслей или чувств, связанных с травмой, попытки избегать действий или ситуаций, неспособность вспомнить о травме или аспектах травмы, заметно сниженный интерес в значимых видах деятельности, чувства отстраненности или отчужденности от других людей, сниженную выраженность аффекта, чувство отсутствия перспективы в будущем, социальную тревожность и тревожность, связанную с незнакомым окружением.
В некоторых вариантах гипервозбуждение включает, по меньшей мере, один из следующих признаков: трудность с засыпанием или плохой сон, раздражительность или вспышки гнева, затруднение с концентрацией внимания, сверхнастороженность, чрезмерная реакция испуга и тревожность в результате действия потенциально угрожающих стимулов.
В некоторых вариантах соединение A не снижает физическую способность пациента соответствующим образом и быстро отвечать на потенциально угрожающие стимулы.
В некоторых вариантах соединение A уменьшает трудности, связанные с плохим сном, в результате снижения стресса, ассоциированного с воспоминанием и сновидениями.
В некоторых вариантах пациент является ребенком или подростком.
В некоторых вариантах соединение A уменьшает, по меньшей мере, один из показателей, частоту и интенсивность, по меньшей мере, одного признака или симптома посттравматического стрессового расстройства у пациента, при этом признак или симптом выбран из дезорганизованного или возбужденного поведения, периодически повторяющихся игр, которые отображают аспекты травмы, ночных кошмаров, в которых отсутствует распознаваемое содержание, и специфичного для травмы повторяющегося поведения.
В некоторых вариантах соединение A уменьшает частоту возникновения, по меньшей мере, одного расстройства, встречающегося в сочетании с посттравматическим стрессовым расстройством, выбранного из злоупотребления лекарственными веществами, злоупотребления алкоголем и депрессии у пациента.
В некоторых вариантах соединение A вводят пациенту один раз или два раза в сутки.
В некоторых вариантах соединение A не вызывает, по меньшей мере, одного из симптомов, сонливости, апатии или изменения психических и физических способностей.
В некоторых вариантах соединение A вводят пациенту до или сразу после травматического события.
В некоторых вариантах, по меньшей мере, один признак, симптом или кластер симптомов синдрома посттравматического стресса диагностируют или оценивают, используя, по меньшей мере, одну из следующих шкал: применяемую клиницистом шкалу ПТСР (CAPS), применяемую клиницистом шкалу ПТСР, часть 2 (CAPS-2), применяемую клиницистом шкалу ПТСР для детей и подростков (CAPS-CA), шкалу оценки влияния травматического события (IES), шкалу оценки влияния травматического события - пересмотренную (IES-R), шкалу общего клинического впечатления (CGI), шкалу общего клинического впечатления о тяжести заболевания (CGI-S), шкалу общего клинического впечатления об улучшении (CGI-I), шкалу общей оценки ПТСР Дьюка (DGRP), шкалу общей оценки улучшения при ПТСР Дьюка (DGRP-I), шкалу тревоги Гамильтона (HAM-A), структурированный опросник для оценки ПТСР (SI-PTSD), опросник для оценки ПТСР (PTSD-I), шкалу симптомов ПТСР (PSS-I), малый международный нейропсихиатрический опросник (MINI), шкалу оценки депрессии Монтгомери-Асберга (MADRS), шкалу депрессии Бека (BDI), шкалу депрессии Гамильтона (HAM-D), пересмотренную шкалу Гамильтона для оценки депрессии (RHRSD), большой опросник для оценки депрессии (MDI), шкалу оценки депрессии пожилого и старческого возраста (GDS-30) и индекс депрессии у детей (CDI).
В некоторых вариантах соединение A значимо уменьшает оценку в баллах, по меньшей мере, по одной из шкал CAPS, CAPS-2, CAPS-CA, IES, IES-R, CGI, CGI-S, CGI-I, DGRP, DGRP-I, HAM-A, SI-ПТСР, ПТСР-I, PSS-I, MADRS, BDI, HAM-D, RHRSD, MDI, GDS-30 и CDI.
В некоторых вариантах соединение A значимо уменьшает оценку в конечной точке по сравнению с оценкой исходного уровня, по меньшей мере, по одной из шкал CAPS, CAPS-2, IES, IES-R и HAMA.
В некоторых вариантах соединение A значимо увеличивает долю отвечающих пациентов по шкале CGI-I, имеющих оценку в баллах по шкале CGI-I, по меньшей мере, 1 (очень значительное улучшение) и 2 (значительное улучшение).
В некоторых вариантах соединение A увеличивает долю отвечающих пациентов по шкале DGRP-I, имеющих оценку в баллах по шкале DGRP-I, по меньшей мере, 1 (очень значительное улучшение) и 2 (значительное улучшение).
В некоторых вариантах общая оценка, составляющая по меньшей мере 65 баллов, по меньшей мере, по одной из шкал CAPS и CAP-2, является показателем посттравматического стрессового расстройства.
В некоторых вариантах общая оценка, составляющая, по меньшей мере, 18 баллов по шкале HAM-A, является показателем тревожного расстройства.
В некоторых вариантах оценка, составляющая, по меньшей мере, 3 балла, по меньшей мере, по одной из шкал CGI-I и DGRP-I, является показателем посттравматического стрессового расстройства.
Также предлагаются способы лечения посттравматического стрессового расстройства у пациента. Способы включают диагностику пациента, имеющего посттравматическое стрессовое расстройство; введение пациенту терапевтически эффективного количества соединения A; оценку, по меньшей мере, одного из признаков, симптомов и кластеров симптомов посттравматического стрессового расстройства; и определение того, что состояние при синдроме посттравматического стресса улучшается, если соединение A уменьшает, по меньшей мере, один из признаков, симптомов и кластеров симптомов посттравматического стрессового расстройства.
В некоторых вариантах способ включает совместное введение терапевтически эффективного количества, по меньшей мере, одного другого средства, выбранного из бензодиазепина, селективного ингибитора обратного захвата серотонина (SSRI), ингибитора обратного захвата серотонина-норэпинефрина (SNRI), ингибитора обратного захвата норэпинефрина (NRI), антагониста серотонин-5-гидрокситриптамина 1A (5HT1A), ингибитора дофамин-β-гидроксилазы, антагониста рецептора аденозина A2A, ингибитора моноаминоксидазы (MAOI), блокатора натриевых (Na) каналов, блокатора кальциевых каналов, антагониста центральных и периферических альфа-адренергических рецепторов, агониста центральных альфа-адренергических рецепторов, антагониста центральных или периферических бета-адренергических рецепторов, антагониста рецептора NK-I, антагониста кортикотропин-рилизинг фактора (CRF), атипичного антидепрессанта/антипсихотического средства, трициклического средства, противосудорожного средства, антагониста глутамата, агониста гамма-аминомасляной кислоты (GABA) и частичного агониста D2.
В некоторых вариантах соединение A уменьшает, по меньшей мере, один из показателей, частоту и интенсивность, по меньшей мере, одного признака посттравматического стрессового расстройства у пациента.
В некоторых вариантах соединение A уменьшает, по меньшей мере, один из показателей, частоту и интенсивность, по меньшей мере, одного симптома посттравматического стрессового расстройства у пациента.
В некоторых вариантах соединение A уменьшает, по меньшей мере, один из показателей, частоту и интенсивность, по меньшей мере, одного кластера симптомов посттравматического стрессового расстройства у пациента, при этом кластер симптомов выбран из повторного переживания/вторжения, избегания/блокировки и гипервозбуждения.
В некоторых вариантах по меньшей мере один признак, симптом или кластер симптомов синдрома посттравматического стресса диагностируют или оценивают, используя, по меньшей мере, одну из следующих шкал: применяемую клиницистом шкалу ПТСР (CAPS), применяемую клиницистом шкалу ПТСР, часть 2 (CAPS-2), применяемую клиницистом шкалу ПТСР для детей и подростков (CAPS-CA), шкалу оценки влияния травматического события (IES), шкалу оценки влияния травматического события - пересмотренную (IES-R), шкалу общего клинического впечатления (CGI), шкалу общего клинического впечатления о тяжести заболевания (CGI-S), шкалу общего клинического впечатления об улучшении (CGI-I), шкалу общей оценки ПТСР Дьюка (DGRP), шкалу общей оценки улучшения при ПТСР Дьюка (DGRP-I), шкалу тревоги Гамильтона (HAM-A), структурированный опросник для оценки ПТСР (SI-PTSD), опросник для оценки ПТСР (PTSD-I), шкалу симптомов ПТСР (PSS-I), малый международный нейропсихиатрический опросник (MINI), шкалу оценки депрессии Монтгомери-Асберга (MADRS), шкалу депрессии Бека (BDI), шкалу депрессии Гамильтона (HAM-D), пересмотренную шкалу Гамильтона для оценки депрессии (RHRSD), большой опросник для оценки депрессии (MDI), шкалу оценки депрессии пожилого и старческого возраста (GDS-30) и индекс депрессии у детей (CDI).
Также предлагаются способы повышения устойчивости у пациента. Способы включают введение терапевтически эффективного количества соединения A.
В некоторых вариантах способ включает совместное введение терапевтически эффективного количества, по меньшей мере, одного другого средства, выбранного из бензодиазепина, селективного ингибитора обратного захвата серотонина (SSRI), ингибитора обратного захвата серотонина-норэпинефрина (SNRI), ингибитора обратного захвата норэпинефрина (NRI), антагониста серотонин-5-гидрокситриптамина 1A (5HT1A), ингибитора дофамин-β-гидроксилазы, антагониста рецептора аденозина A2A, ингибитора моноаминоксидазы (MAOI), блокатора натриевых (Na) каналов, блокатора кальциевых каналов, антагониста центральных и периферических альфа-адренергических рецепторов, агониста центральных альфа-адренергических рецепторов, антагониста центральных или периферических бета-адренергических рецепторов, антагониста рецептора NK-I, антагониста кортикотропин-рилизинг фактора (CRF), атипичного антидепрессанта/антипсихотического средства, трициклического средства, противосудорожного средства, антагониста глутамата, агониста гамма-аминомасляной кислоты (GABA) и частичного агониста D2.
В некоторых вариантах соединение A уменьшает, по меньшей мере, один из показателей, частоту и интенсивность, по меньшей мере, одного признака посттравматического стрессового расстройства у пациента.
В некоторых вариантах соединение A уменьшает, по меньшей мере, один из показателей, частоту и интенсивность, по меньшей мере, одного симптома посттравматического стрессового расстройства у пациента.
В некоторых вариантах соединение A уменьшает, по меньшей мере, один из показателей, частоту и интенсивность, по меньшей мере, одного кластера симптомов посттравматического стрессового расстройства у пациента, при этом кластер симптомов выбран из повторного переживания/вторжения, избегания/блокировки и гипервозбуждения.
В некоторых вариантах по меньшей мере один признак, симптом или кластер симптомов синдрома посттравматического стресса диагностируют или оценивают, используя, по меньшей мере, одну из следующих шкал: применяемую клиницистом шкалу ПТСР (CAPS), применяемую клиницистом шкалу ПТСР, часть 2 (CAPS-2), применяемую клиницистом шкалу ПТСР для детей и подростков (CAPS-CA), шкалу оценки влияния травматического события (IES), шкалу оценки влияния травматического события - пересмотренную (IES-R), шкалу общего клинического впечатления (CGI), шкалу общего клинического впечатления о тяжести заболевания (CGI-S), шкалу общего клинического впечатления об улучшении (CGI-I), шкалу общей оценки ПТСР Дьюка (DGRP), шкалу общей оценки улучшения при ПТСР Дьюка (DGRP-I), шкалу тревоги Гамильтона (HAM-A), структурированный опросник для оценки ПТСР (SI-PTSD), опросник для оценки ПТСР (PTSD-I), шкалу симптомов ПТСР (PSS-I), малый международный нейропсихиатрический опросник (MINI), шкалу оценки депрессии Монтгомери-Асберга (MADRS), шкалу депрессии Бека (BDI), шкалу депрессии Гамильтона (HAM-D), пересмотренную шкалу Гамильтона для оценки депрессии (RHRSD), большой опросник для оценки депрессии (MDI), шкалу оценки депрессии пожилого и старческого возраста (GDS-30) и индекс депрессии у детей (CDI).
Также предлагаются способы диагностики посттравматического стрессового расстройства у пациента. Способы включают введение пациенту терапевтически эффективного количества соединения A и оценку, по меньшей мере, одного признака, симптома или кластера симптомов посттравматического стрессового расстройства; и диагностику посттравматического стрессового расстройства у пациента, если соединение A уменьшает, по меньшей мере, один из признаков, симптомов и кластеров симптомов посттравматического стрессового расстройства.
В некоторых вариантах пациентом является ребенок, подросток или взрослый человек.
Различные шкалы позволяют оценивать посттравматическое стрессовое расстройство (ПТСР) и действие руфинамида и других терапевтических средств при лечении и профилактике расстройства. К таким шкалам, например, относятся без ограничения применяемая клиницистом шкала ПТСР (CAPS), применяемая клиницистом шкала ПТСР, часть 2 (CAPS-2), применяемая клиницистом шкала ПТСР для детей и подростков (CAPS-CA), шкала оценки влияния травматического события (IES), шкала оценки влияния травматического события - пересмотренная (IES-R), шкала общего клинического впечатления (CGI), шкала общего клинического впечатления о тяжести заболевания (CGI-S), шкала общего клинического впечатления об улучшении (CGI-I), шкала общей оценки ПТСР Дьюка (DGRP), шкала общей оценки улучшения при ПТСР Дьюка (DGRP-I), шкала тревоги Гамильтона (HAM-A), структурированный опросник для оценки ПТСР (SI-PTSD), опросник для оценки ПТСР (PTSD-I), шкала симптомов ПТСР (PSS-I), малый международный нейропсихиатрический опросник (MINI), шкала оценки депрессии Монтгомери-Асберга (MADRS), шкала депрессии Бека (BDI), шкала депрессии Гамильтона (HAM-D), пересмотренная шкала Гамильтона для оценки депрессии (RHRSD), большой опросник для оценки депрессии (MDI), шкала оценки депрессии пожилого и старческого возраста (GDS-30) и индекс депрессии у детей (CDI). Такие показатели обычно оценивают с помощью интервью или опросников. В некоторых вариантах вводят не все части шкалы. В некоторых вариантах шкалы используют для диагностики и оценки признаков, симптомов, ассоциированных симптомов или влияния ПТСР на повседневную жизнь. В некоторых вариантах используют одну или несколько шкал для диагностики, оценки или подтверждения посттравматического стрессового расстройства у пациента. В некоторых вариантах шкалы позволяют измерять признаки, симптомы, кластеры симптомов посредством оценки в баллах, по меньшей мере, одного из показателей, частоты и интенсивности, признаков, симптомов или кластеров симптомов.
Примерами шкал для оценки посттравматического стрессового расстройства являются варианты CAPS, включая CAPS, CAPS-1 и CAPS-2, которые оценивают 17 базовых симптомов ПТСР по следующим пунктам:
1. Повторяющиеся и навязчивые воспоминания о травме.
2. Дистресс при напоминании о травме.
3. Действия и ощущения, как если бы травматическое событие происходило вновь.
4. Повторяющиеся и вызывающие дистресс сны о травматическом событии.
5. Попытки избежать мыслей или чувств.
6. Попытки избежать действий или ситуаций.
7. Неспособность вспомнить о травме или аспектах травмы.
8. Заметно сниженный интерес в значимых видах деятельности.
9. Чувства отстраненности или отчужденности от других людей.
10. Сниженная выраженность аффекта.
11. Чувство отсутствия перспективы в будущем.
12. Трудность с засыпанием или плохой сон.
13. Раздражительность или вспышки гнева.
14. Затруднения с концентрацией внимания.
15. Сверхнастороженность.
16. Чрезмерная реакция испуга.
17. Физиологическая реактивность.
Вопросы также нацелены на выявление воздействия симптомов на социальную и профессиональную деятельность или повседневную жизнь, на выявление улучшения симптомов по сравнению с предыдущей оценкой CAPS, общей достоверности ответов, общей тяжести ПТСР и частоты и интенсивности ассоциированных симптомов. При этом используют следующие пункты:
18. Влияние на социальное функционирование.
19. Влияние на профессиональное функционирование.
20. Общее улучшение (по сравнению с более ранним случаем измерения).
21. Достоверность оценки.
22. Общее улучшение.
23. Вина за содеянное или упущенное.
24. Вина выжившего.
25. Склонность к убийству.
26. Разочарование во властях.
27. Чувство безнадежности.
28. Нарушение памяти.
29. Уныние и депрессия.
30. Чувство ошеломления.
Чтобы оценить частоту симптомов, опрашивающий последовательно задает стандартные вопросы, при необходимости разъясняя и перефразируя. В качестве примера и без ограничения используют следующие стандартные вопросы: Возникали ли у вас когда-нибудь нежелательные воспоминания о травматическом событии? Какими они были? Что вы помните? Если вопрос необходимо перефразировать, интервьюер может задать такой вопрос как: Возникали ли воспоминания когда-нибудь, когда вы были в сознании или только во сне? или: Как часто эти воспоминания всплывали у вас в прошлом месяце (на прошлой неделе)? Оценка 0 указывает, что воспоминания не возникали, 1 означает один или два раза, 2 означает один или два раза в неделю, 3 означает несколько раз в неделю, и 4 означает почти каждый день.
Для оценки интенсивности симптомов интервьюер может задать стандартные вопросы, такие как, в качестве примера и без ограничения: Насколько сильное страдание и дискомфорт такие воспоминания причиняют вам? Могли ли вы выбросить их из головы и подумать о чем-нибудь другом? Как сильно вы пытались сделать это? Как сильно они мешают вашей жизни? Оценка 0 означает отсутствие, 1 означает слабый, минимальный дистресс или нарушение активности, 2 указывает умеренный, дистресс явно присутствует, но с ним еще можно справиться, некоторое нарушение активности, 3 означает тяжелый существенный дистресс, трудность в освобождении от воспоминаний, заметное нарушение активности; и 4 обозначает экстремальный инвалидизирующий дистресс, неспособность переключиться на другие мысли, неспособность продолжать активную деятельность.
В некоторых вариантах используемое правило оценки засчитывает симптом как имеющий место, если он имеет частоту, по меньшей мере, равную 1, и интенсивность, по меньшей мере, равную 2. В некоторых вариантах оценку тяжести в баллах подсчитывают, суммируя оценки частоты и интенсивности для каждого симптома.
В некоторых вариантах вычисляют суммарную или общую оценку по всем пунктам, имеющимся в варианте CAPS. В некоторых вариантах вычисляют суммарную оценку для каждого кластера симптомов. В некоторых вариантах вычисляют суммарную оценку для базовых симптомов ПТСР. В некоторых вариантах оценку в конечной точке сравнивают с оценкой исходного уровня, чтобы определить тяжесть посттравматического стрессового расстройства. В некоторых вариантах значимое уменьшение оценки в баллах в конечной точке по сравнению с оценкой исходного уровня рассматривают как улучшение при ПТСР. В некоторых вариантах общая оценка по шкале CAPS, CAPS-1, CAPS-2 или CAPS-CA выше 65 баллов является показателем ПТСР.
Другим примером является шкала IES, которая позволяет оценивать по 15 пунктам: 7 пунктов измеряют симптомы вторжения и 8 пунктов измеряют симптомы избегания. В пункты для самооценки включены вопросы: как часто каждый из следующих комментариев оказывается верным: я думал об этом, когда не имел это в виду, я не позволял себе расстраиваться, когда я думал об этом или когда мне что-то напоминало об этом, я пытался стереть это из памяти, у меня были проблемы с засыпанием или плохим сном из-за видений или мыслей об этом, так как они приходили мне в голову, на меня накатывались сильные ощущения по этому поводу, у меня были сны об этом, я держался вдалеке от напоминаний об этом, это ощущалось так, как будто никогда не происходило, или не было реально, я пытался не говорить на эту тему, картины этого события неожиданно появлялись в моих мыслях, другие вещи заставляли меня думать об этом, я осознавал, что у меня все еще очень много переживаний по этому поводу, но я не справлялся с ними, я пытался не думать об этом, любое напоминание возвращало связанные с этим событием ощущения, и мои чувства были как будто заблокированы. В общем, пункты оцениваются по шкале из четырех баллов: 0 (совсем нет), 1 (редко), 3 (иногда) и 5 (часто). Сумма баллов дает общую оценку тяжести симптомов или общего субъективного стресса. Было предложено, что оценка от 0 до 8 находится в субклиническом диапазоне, 9-25 означает невысоком уровень, 26-43 означает средний уровень и больше 44 означает высокий уровень стресса.
В некоторых вариантах вычисляют суммарную или общую оценку по всем пунктам IES. В некоторых вариантах вычисляют суммарную оценку для каждого кластера симптомов. В некоторых вариантах оценку в конечной точке сравнивают с оценкой базового уровня, чтобы определить изменение тяжести ПТСР. В некоторых вариантах уменьшение оценки в конечной точке на 30% по сравнению с оценкой исходного уровня рассматривают как улучшение при ПТСР.
IES-R, пересмотренный IES, изменен IES разделением пункта в исходном IES «у меня были трудности с засыпанием и плохой сон» на два пункта: «у меня были трудности с засыпанием» и «у меня был плохой сон»» и добавлением шести пунктов к пунктам IES. Добавлены следующие пункты: я чувствовал раздражение и гнев, я чувствовал несдержанность и легко пугался, я действовал или чувствовал так, как будто я вернулся в то время, у меня были нарушения концентрации внимания, напоминания об этом событии вызывали у меня физические реакции, такие как потение, затрудненное дыхание, тошнота или учащенное сердцебиение, и я чувствовал настороженность или состояние «боевой готовности». Система оценки также изменялась от 0 (совсем нет), 1 (немного), 2 (средне), 3 (довольно сильно) и 4 (очень сильно).
В некоторых вариантах вычисляют суммарную или общую оценку по всем пунктам IES-R. В некоторых вариантах вычисляют суммарную оценку для каждого кластера симптомов. В некоторых вариантах оценку в конечной точке сравнивают с оценкой исходного уровня, чтобы определить изменение тяжести посттравматического стрессового расстройства. В некоторых вариантах значимое снижение оценки в конечной точке по сравнению с оценкой исходного уровня по шкале IES-R рассматривают как улучшение при посттравматическом стрессовом расстройстве.
По шкале DGRP-I эффективность соединения A в лечении посттравматического стрессового расстройства можно оценить, измеряя увеличение доли отвечающих пациентов по шкале DGRP-I, имеющих оценку DGRP-I, равную 1 (очень значительное улучшение) или 2 (значительное улучшение). В некоторых вариантах оценка, составляющая, по меньшей мере, 3 по шкале DGRP-I, является показателем посттравматического стресса.
По шкале CGI эффективность соединения A в лечении посттравматического стрессового расстройства можно оценить, используя CGI-S, CGI-I и индекс эффективности. Например, в некоторых вариантах увеличение доли пациентов, отвечающих на вопросы CGI-I, имеющих оценку по шкале CGI-I, равную 1 (очень значительное улучшение) или 2 (значительное улучшение) после лечения, показывает, что лечение является эффективным. В некоторых вариантах оценка по шкале CGI-I, по меньшей мере равная 3, является показателем посттравматического стрессового расстройства. В некоторых вариантах индекс эффективности по шкале CGI может измерять эффективность соединения A в лечении посттравматического стрессового расстройства.
В случае HAM-A для оценки тревожности или посттравматического стрессового расстройства обычно вычисляют суммарную или общую оценку по всем пунктам HAM-A. В некоторых вариантах оценку в конечной точке сравнивают с оценкой исходного уровня по шкале HAM-A, чтобы определить изменение тяжести тревожности и посттравматического стрессового расстройства. В некоторых вариантах значимое уменьшение оценки в конечной точке по сравнению с оценкой исходного уровня по шкале HAM-A рассматривают как улучшение в случае тревожности и посттравматического стрессового расстройства. В некоторых вариантах общая оценка HAM-A, составляющая, по меньшей мере, 18 баллов, является показателем тревожности и посттравматического стрессового расстройства.
В общем, соединение A или его фармацевтически приемлемое производное будут введены в терапевтически эффективных количествах либо отдельно, либо в сочетании с другим терапевтическим средством. Фармацевтические композиции будут применимы, например, для лечения посттравматического стрессового расстройства.
Фармацевтически приемлемыми производными являются кислоты, основания, простые и сложные эфиры енолов, сложные эфиры, гидраты, сольваты и формы пролекарств. Производное выбирают так, чтобы его фармакокинетические свойства были лучше в отношении, по меньшей мере, одной характеристики, чем у соответствующего нейтрального средства. Соединение A может быть преобразовано в производные до приготовления композиции.
Терапевтически эффективное количество соединения A или фармацевтически приемлемого производного может варьировать в зависимости от тяжести посттравматического стрессового расстройства, возраста и относительного состояния здоровья субъекта, эффективности применяемого соединения и других факторов. В некоторых вариантах терапевтически эффективное количество составляет примерно от 0,1 миллиграмма на кг (мг/кг) массы тела в сутки до примерно 50 мг/кг массы тела в сутки. В других вариантах количество составляет примерно от 1,0 до примерно 10 мг/кг/сутки. Следовательно, в некоторых вариантах терапевтически эффективное количество для человека, имеющего массу 70 кг, составляет примерно от 7,0 до примерно 3500 мг/сутки, тогда как в других вариантах количество составляет примерно от 70 до примерно 700 мг/сутки.
Специалист в области лечения таких заболеваний сможет установить терапевтически эффективное количество соединения A для посттравматического стрессового расстройства без излишнего экспериментирования и на основе имеющихся личных знаний и описания настоящей заявки. В общем, в качестве примера и без ограничения соединение A будет вводиться в виде фармацевтических композиций одним из следующих путей: пероральным, системным (например, трансдермальным, интраназальным или с помощью суппозитория) или парентеральным (например, внутримышечным, внутривенным или подкожным). Композиции, в качестве примера и без ограничения, имеют форму таблеток, пилюль, капсул, полутвердых веществ, порошков, композиций замедленного высвобождения, растворов, суспензий, эликсиров, аэрозолей или любой другой подходящей композиции и состоят, в общем, из соединения A в сочетании, по меньшей мере, с одним фармацевтически приемлемым эксципиентом. Подходящие эксципиенты, в качестве примера и без ограничения, являются нетоксичными, помогают введению и не оказывают неблагоприятного влияния на терапевтическую эффективность соединения. Такой эксципиент может представлять собой, например, любое твердое вещество, жидкость, полутвердое вещество или в случае аэрозольной композиции газообразный эксципиент, который обычно доступен специалисту в данной области.
Твердые фармацевтические эксципиенты включают в качестве примера и без ограничения крахмал, целлюлозу, тальк, глюкозу, лактозу, сахарозу, желатин, солод, рис, муку, мел, силикагель, стеарат магния, стеарат натрия, моностеарат глицерина, хлорид натрия, сухое обезжиренное молоко и тому подобное. Жидкие и полутвердые эксципиенты могут быть выбраны, например и без ограничения, из воды, этанола, глицерина, пропиленгликоля и различных масел, включая масла, полученные из нефти, животные, растительные или синтетические масла (например, арахисовое масло, соевое масло, минеральное масло, кунжутное масло и т.д.). Предпочтительные жидкие носители, особенно в случае инъекционных растворов, включают в качестве примера и без ограничения воду, физиологический раствор соли, водный раствор декстрозы и гликоли. Сжатые газы могут быть использованы для рассеивания соединения в аэрозольной форме. Инертными газами, подходящими для такой цели, в качестве примера и без ограничения являются азот, диоксид углерода, закись азота и т.д.
Кроме того, фармацевтические композиции в качестве примера и без ограничения могут содержать консерванты, солюбилизаторы, стабилизаторы, увлажнители, эмульгаторы, подсластители, красители, корригенты, соли для варьирования осмотического давления, буферы, маскирующие средства или антиоксиданты. В некоторых вариантах композиции могут содержать и другие терапевтически ценные вещества. Другие подходящие фармацевтические носители и композиции описаны в A. R. Alfonso Remington's Pharmaceutical Sciences 1985, 17th ed. Easton, Pa.: Mack Publishing Company.
Количество соединения A в композиции может широко варьировать в зависимости, например, от типа композиции, размера единичной дозы, вида эксципиента и других факторов, известных специалистам в области фармацевтических наук. В общем, конечная композиция будет содержать от 10% мас. до 90% мас. соединения, предпочтительно от 25% мас. до 75% мас., при этом остальная часть представлена эксципиентом или эксципиентами. Предпочтительно фармацевтическую композицию вводят в единичной дозированной форме для длительного лечения или в единичной дозированной форме без ограничения, в частности, когда требуется ослабление симптомов.
Соединение A или его фармацевтически приемлемое производное вводят одновременно, перед или после введения одного или нескольких указанных выше средств.
Далее изобретение проиллюстрировано следующими неограничивающими примерами.
ПРИМЕРЫ
Пример 1
Проводили клиническое исследование, чтобы продемонстрировать эффективность и переносимость соединения A при лечении посттравматического стрессового расстройства (ПТСР).
Дизайн исследования включал 8-недельное рандомизированное, двойное слепое, плацебо-контролируемое испытание соединения A для лечения ПТСР.
После подписания согласия на основе полной информированности и отбора на основе удовлетворения критериям включения/исключения пациентов случайным образом распределяли по группам, получающим либо соединение A, либо плацебо в течение 8 недель. В ходе исследования фармацевт сохраняет протокол рандомизации и контролирует порядок приема плацебо или соединения A в похожих таблетках. Симптомы у пациентов, побочные эффекты и соблюдение схемы оценивают один раз в две недели.
На основании симптоматики и появления побочных эффектов исследователь может увеличивать количество лекарственного средства, добавляя по 20-40 мг, пока это переносимо, вплоть до достижения максимальной терапевтической пользы. Прием дозы осуществляют один раз в сутки, если только прием дважды в сутки не переносится лучше. Соблюдение схемы оценивают по подсчету таблеток на 4 неделе и 8 неделе.
Пациенты получают поддерживающую клиническую помощь во время визитов в клинику. Исследователь доступен по телефону 24 часа в сутки для экстренных случаев. При необходимости пациенты могут проходить осмотр чаще.
Эффективность измеряют, используя следующие шкалы для оценки:
- глобальную оценку функционирования (GAF);
- применяемую клиницистом шкалу ПТСР (CAPS);
- шкалу общего клинического впечатления о тяжести заболевания (CGI-S);
- шкалу общего клинического впечатления об улучшении (CGI-I);
- шкалу травм Дэвидсона (DTS);
- шкалу тревоги Гамильтона (HAM-A);
- шкалу оценки депрессии Монтгомери-Асберга (MADRS);
- шкалу оценки исхода лечения ПТСР (TOP-8).
Использовали следующие критерии для включения субъекта в исследование:
- диагноз ПТСР, который подтверждается при использовании малого международного нейропсихиатрического опросника (MINI) и CAPS;
- возраст 13 лет или старше;
- отсутствие злоупотребления или зависимости от веществ в течение предыдущих 4 недель (за исключением никотина и кофеина);
- отсутствие приема психотропных лекарственных средств в течение 2 недель (за исключением 4 недель для флуоксетина);
- клинически нормальные результаты физического и лабораторного обследования (допустимо превышение функциональных проб печени (LFT) до 2,5 раз от нормального предела);
- женщины, способные к деторождению, должны использовать одобренные с медицинской точки зрения способы контрацепции, такие как презерватив, пероральные противозачаточные средства, депо-провера или диафрагму со спермицидами;
- письменное информированное согласие;
- мужчины или женщины любой расы или этнического происхождения.
Для исключения субъекта из исследования использовали следующие критерии:
- в анамнезе биполярное расстройство I, психотическое или когнитивное расстройство;
- активно суицидальный, гомицидальный или психотический;
- в анамнезе чувствительность к соединению A;
- нестабильное общее состояние здоровья;
- оценка >6 на вопрос №10 в MADRS в отношении суицидального мышления;
- женщины, которые являются беременными, планируют забеременеть или кормящие грудью во время исследования.
Требуется удовлетворение только одному критерию для выхода, чтобы выйти из исследования.
Используют следующие критерии для выхода:
- завершение исследования;
- тяжелые и непереносимые побочные эффекты лечения соединением A или плацебо;
- острое развитие суицидального мышления, гомицидального мышления или психотических симптомов;
- ухудшение симптомов, которые измеряют оценкой 7 (очень сильное ухудшение) по шкале CGI-I;
- участник ясно просит о выходе из исследования;
- необходимость в дополнительных психотропных лекарственных средствах, отличных от лекарственного средства, используемого в исследовании, или вспомогательного лекарственного средства, которое указано в протоколе, для контролирования психиатрических симптомов у субъектов;
- беременность, возникающая у субъекта во время исследования;
- мнение исследователя, что оставаться в исследовании больше не в интересах пациента.
Пример 2
Клиническое исследование проводили для того, чтобы продемонстрировать эффективность и переносимость соединения A при использовании для профилактики ПТСР.
Дизайн исследования включал открытое рандомизированное, двойное слепое, плацебо-контролируемое испытание соединения A для профилактики ПТСР. После подписания согласия на основе полной информированности и отбора на основе удовлетворения критериям включения/исключения пациентов случайным образом распределяли по группам, получающим либо соединение A, либо плацебо в течение 8 недель. В ходе исследования фармацевт сохраняет протокол рандомизации и контролирует порядок приема плацебо или соединения A в похожих таблетках. Симптомы у пациентов, побочные эффекты и соблюдение схемы оценивают один раз в две недели.
На основании симптоматики и появления побочных эффектов исследователь может увеличивать количество лекарственного средства, добавляя по 20-40 мг, пока это переносимо, вплоть до достижения максимальной терапевтической пользы. Прием дозы осуществляют один раз в сутки, если только прием дважды в сутки не переносится лучше. Соблюдение схемы оценивают по подсчету таблеток на 4 неделе и 8 неделе.
Пациенты получают поддерживающую клиническую помощь во время визитов в клинику. Исследователь доступен по телефону 24 часа в сутки для экстренных случаев. При необходимости пациенты могут проходить осмотр чаще.
Эффективность измеряют, используя следующие шкалы для оценки:
- глобальную оценку функционирования (GAF);
- применяемую клиницистом шкалу ПТСР (CAPS);
- шкалу общего клинического впечатления о тяжести заболевания (CGI-S);
- шкалу общего клинического впечатления об улучшении (CGI-I);
- шкалу травм Дэвидсона (DTS);
- шкалу тревоги Гамильтона (HAM-A);
- шкалу оценки депрессии Монтгомери-Асберга (MADRS);
- шкалу оценки исхода лечения ПТСР (TOP-8);
- справочник по диагностике и статистике IV (DSM-IV).
Использовали следующие критерии для включения субъекта в исследование:
- отсутствие ПТСР, подтвержденное при использовании MINI и CAPS;
- возраст 13 лет или старше;
- отсутствие злоупотребления/зависимости от веществ в течение предыдущих 4 недель (за исключением никотина и кофеина);
- отсутствие приема психотропных лекарственных средств в течение 2 недель (за исключением 4 недель для флуоксетина);
- клинически нормальные результаты физического и лабораторного обследования (допустимо превышение LFT до 2,5 раз от нормального предела);
- женщины, способные к деторождению, должны использовать одобренные с медицинской точки зрения способы контрацепции (такие, как презерватив, пероральные противозачаточные средства, депо-провера или диафрагму со спермицидами);
- письменное информированное согласие;
- мужчины или женщины любой расы или этнического происхождения.
Для исключения субъекта из исследования использовали следующие критерии:
- ПТСР в анамнезе;
- биполярное расстройство I, психотическое или когнитивное расстройство в анамнезе;
- активно суицидальный, гомицидальный или психотический;
- в анамнезе чувствительность к соединению A;
- нестабильное общее состояние здоровья;
- оценка >6 на вопрос №10 в MADRS в отношении суицидального мышления;
- женщины, которые являются беременными, планируют забеременеть или кормящие грудью во время исследования.
Требуется удовлетворение только одному критерию для выхода, чтобы выйти из исследования. Используют следующие критерии для выхода:
- завершение исследования;
- тяжелые и непереносимые побочные эффекты лечения соединением A или плацебо;
- острое развитие суицидального мышления, гомицидального мышления или психотических симптомов;
- появление признаков или симптомов, совместимых с диагнозом ПТСР;
- участник ясно просит о выходе из исследования;
- необходимость в дополнительных психотропных лекарственных средствах, отличных от лекарственного средства, используемого в исследовании, или вспомогательного лекарственного средства, которое указано в протоколе, для контролирования психиатрических симптомов у субъектов;
- беременность, возникающая у субъекта во время исследования;
- мнение исследователя, что оставаться в исследовании больше не в интересах пациента.
Пример 3
Проводили клиническое исследование, чтобы продемонстрировать эффективность и переносимость комбинированной терапии с использованием соединения A при лечении ПТСР.
Дизайн исследования включал 8-недельное рандомизированное, двойное слепое, плацебо-контролируемое испытание соединения A для лечения ПТСР. После подписания согласия на основе полной информированности и отбора на основе удовлетворения критериям включения/исключения пациентов случайным образом распределяли по группам, получающим либо соединение A, либо плацебо в течение 8 недель. Пациенты также могли получать терапевтически эффективные дозы празозина, вальпроата, карбамазепина или топирамата в сочетании с соединением A или плацебо.
В ходе исследования фармацевт сохраняет протокол рандомизации и контролирует порядок приема плацебо или соединения A в похожих таблетках. Симптомы у пациентов, побочные эффекты и соблюдение схемы оценивают один раз в две недели. На основании симптоматики и появления побочных эффектов исследователь может увеличивать количество лекарственного средства, добавляя по 20-40 мг, пока это переносимо, вплоть до достижения максимальной терапевтической пользы. Прием дозы осуществляют один раз в сутки, если только прием дважды в сутки не переносится лучше. Соблюдение схемы оценивают по подсчету таблеток на 4 неделе и 8 неделе.
Пациенты получают поддерживающую клиническую помощь во время визитов в клинику. Исследователь доступен по телефону 24 часа в сутки для экстренных случаев. При необходимости пациенты могут проходить осмотр чаще.
Эффективность измеряют, используя следующие шкалы для оценки:
- глобальную оценку функционирования (GAF);
- применяемую клиницистом шкалу ПТСР (CAPS);
- шкалу общего клинического впечатления о тяжести заболевания (CGI-S);
- шкалу общего клинического впечатления об улучшении (CGI-I);
- шкалу травм Дэвидсона (DTS);
- шкалу тревоги Гамильтона (HAM-A);
- шкалу оценки депрессии Монтгомери-Асберга (MADRS);
- шкалу оценки исхода лечения ПТСР (TOP-8).
Использовали следующие критерии для включения субъекта в исследование:
- диагноз ПТСР, подтверждаемый при использовании MINI и CAPS;
- возраст 13 лет или старше;
- отсутствие злоупотребления/зависимости от веществ в течение предыдущих 4 недель (за исключением никотина и кофеина);
- отсутствие приема психотропных лекарственных средств в течение 2 недель (за исключением 4 недель для флуоксетина);
- клинически нормальные результаты физического и лабораторного обследования (допустимо превышение LFT до 2,5 раз от нормального предела);
- женщины, способные к деторождению, должны использовать одобренные с медицинской точки зрения способы контрацепции (такие, как презерватив, пероральные противозачаточные средства, депо-провера или диафрагму со спермицидами);
- письменное информированное согласие;
- мужчины или женщины любой расы или этнического происхождения.
Для исключения субъекта из исследования использовали следующие критерии:
- в анамнезе биполярное расстройство I, психотическое или когнитивное расстройство;
- активно суицидальный, гомицидальный или психотический;
- в анамнезе чувствительность к соединению A;
- нестабильное общее состояние здоровья;
- оценка >6 на вопрос №10 в MADRS в отношении суицидального мышления;
- женщины, которые являются беременными, планируют забеременеть или кормящие грудью во время исследования.
Требуется удовлетворение только одному критерию для выхода, чтобы выйти из исследования.
Используют следующие критерии для выхода:
- завершение исследования;
- тяжелые и непереносимые побочные эффекты лечения соединением A или плацебо;
- острое развитие суицидального мышления, гомицидального мышления или психотических симптомов;
- ухудшение симптомов, которые измеряют оценкой 7 (очень сильное ухудшение) по шкале CGI-I;
- участник ясно просит о выходе из исследования;
- необходимость в дополнительных психотропных лекарственных средствах, отличных от лекарственного средства, используемого в исследовании, или вспомогательного лекарственного средства, которое указано в протоколе, для контролирования психиатрических симптомов у субъектов;
- беременность, возникающая у субъекта во время исследования;
- мнение исследователя, что оставаться в исследовании больше не в интересах пациента.
Пример 4
Проводили клиническое исследование, чтобы продемонстрировать эффективность и переносимость соединения A при лечении ПТСР у детей.
Дизайн исследования включал 8-недельное рандомизированное, двойное слепое, плацебо-контролируемое испытание соединения A для лечения ПТСР.
После подписания согласия на основе полной информированности и отбора на основе удовлетворения критериям включения/исключения пациентов случайным образом распределяли по группам, получающим либо соединение A, либо плацебо в течение 8 недель. В ходе исследования фармацевт сохраняет протокол рандомизации и контролирует порядок приема плацебо или соединения A в похожих таблетках. Симптомы у пациентов, побочные эффекты и соблюдение схемы введения оценивают один раз в две недели.
На основании симптоматики и появления побочных эффектов исследователь может увеличивать количество лекарственного средства, добавляя по 20-40 мг, пока это переносимо, вплоть до достижения максимальной терапевтической пользы. Прием дозы осуществляют один раз в сутки, если только прием дважды в сутки не переносится лучше. Соблюдение схемы оценивают по подсчету таблеток на 4 неделе и 8 неделе.
Пациенты получают поддерживающую клиническую помощь во время визитов в клинику. Исследователь доступен по телефону 24 часа в сутки для экстренных случаев. При необходимости пациенты могут проходить осмотр чаще.
Эффективность измеряют, используя следующие шкалы для оценки:
- глобальную оценку функционирования (GAF);
- применяемую клиницистом шкалу ПТСР (CAPS);
- применяемую клиницистом шкалу ПТСР (CAPS-CA);
- шкалу общего клинического впечатления о тяжести заболевания (CGI-S);
- шкалу общего клинического впечатления об улучшении (CGI-I);
- шкалу травм Дэвидсона (DTS);
- шкалу тревоги Гамильтона (HAM-A);
- шкалу оценки депрессии Монтгомери-Асберга (MADRS);
- шкалу оценки исхода лечения ПТСР (TOP-8).
Использовали следующие критерии для включения субъекта в исследование:
- диагноз ПТСР, который подтверждается при использовании MINI и CAPS;
- возраст 12 лет или моложе;
- отсутствие злоупотребления/зависимости от веществ в течение предыдущих 4 недель (за исключением никотина и кофеина);
- отсутствие приема психотропных лекарственных средств в течение 2 недель (за исключением 4 недель для флуоксетина);
- клинически нормальные результаты физического и лабораторного обследования (допустимо превышение LFT до 2,5 раз от нормального предела);
- женщины, способные к деторождению, должны использовать одобренные с медицинской точки зрения способы контрацепции (такие, как презерватив, пероральные противозачаточные средства, депо-провера или диафрагму со спермицидами);
- письменное информированное согласие;
- пациенты мужского и женского пола любой расы или этнического происхождения.
Для исключения субъекта из исследования использовали следующие критерии:
- в анамнезе биполярное расстройство I, психотическое или когнитивное расстройство;
- активно суицидальный, гомицидальный или психотический;
- в анамнезе чувствительность к соединению A;
- нестабильное общее состояние здоровья;
- оценка >6 на вопрос №10 в MADRS в отношении суицидального мышления;
- женщины, которые являются беременными, планируют забеременеть или кормящие грудью во время исследования.
Требуется удовлетворение только одному критерию для выхода, чтобы выйти из исследования. Используют следующие критерии для выхода:
- завершение исследования;
- тяжелые и непереносимые побочные эффекты лечения соединением A или плацебо;
- острое развитие суицидального мышления, гомицидального мышления или психотических симптомов;
- ухудшение симптомов, которые измеряют оценкой 7 (очень сильное ухудшение) по шкале CGI-I;
- участник ясно просит о выходе из исследования;
- необходимость в дополнительных психотропных лекарственных средствах, отличных от лекарственного средства, используемого в исследовании, или вспомогательного лекарственного средства, которое указано в протоколе, для контролирования психиатрических симптомов у субъектов;
- беременность, возникающая у субъекта во время исследования;
- мнение исследователя, что оставаться в исследовании больше не в интересах пациента.
Пример 5
Активность дофамин-β-гидроксилазы быка и человека оценивали, измеряя превращение тирамина в октопамин. Дофамин-β-гидроксилазу надпочечника быка получали из Sigma Chemicals (St Louis, MO, USA), тогда как дофамин-β-гидроксилазу человека очищали из культуральной среды линии клеток нейробластомы SK-N-SH. Анализ осуществляли при pH 5,2 и температуре 32ºC в среде, содержащей 0,125 М NaAc, 10 мМ фумарата, 0,5-2 мкМ CuSO4, 0,1 мг·мл-1 каталазы, 0,1 мМ тирамина и 4 мМ аскорбата. В типичном анализе к реакционной смеси добавляли 0,5-1 миллиединиц фермента и затем добавляли субстратную смесь, содержащую каталазу, тирамин и аскорбат, чтобы инициировать реакцию (конечный объем 200 мкл). Образцы инкубировали в присутствии или в отсутствие непикастата (S-энантиомера) или (R)-5-аминометил-1-(5,7-дифтор-1,2,3,4-тетрагидронафт-2-ил)-2,3-дигидро-2-тиоксо-1H-имидазолгидрохлорида (R-энантиомера) в подходящей концентрации при 37ºC в течение 30-40 минут. Реакцию гасили раствором для остановки реакции, содержащим 25 мм EDTA и 240 мкМ 3-гидрокситирамина (внутренний стандарт). Образцы анализировали в отношении октопамина обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ) с использованием регистрации в ультрафиолете при 280 нМ. ВЭЖХ осуществляли при скорости потока 1 мл·мин-1, используя колонку LiChroCART 125-4 RP-18 и изократическое элюирование 10 мМ уксусной кислотой, 10 мМ 1-гептансульфоновой кислотой, 12 мМ фосфатом тетрабутиламмония и 10% метанолом. Остаточную активность в процентах вычисляли на основании контролей, корректировали с использованием внутренних стандартов и подгоняли к кривой нелинейной зависимости концентрация-ответ по четырем параметрам.
Активность непикастата по отношению к двенадцати выбранным ферментам и рецепторам определяли, используя принятые анализы. Подробное описание анализов связывания радиолигандов отдельными рецепторами можно найти в Wong et al. (1993). Краткое описание принципа, лежащего в основе каждого ферментного анализа, приведено на фигуре 1. Данные о связывании анализировали, используя многократную подгонку кривой к логистическому уравнению, содержащему четыре параметра. Значения Ki вычисляли на основе значений IC50, используя уравнение Ченга-Прусофа. Ингибирующую ферменты активность выражали в виде IC50 (концентрация, необходимая для получения 50% ингибирования активности фермента). В исследовании использовали самцов SHR (15-16-недельного возраста, Charles River, Wilmington, MA, USA). В день исследования животных взвешивали и случайным образом распределяли на группы дозирования, получавшие либо наполнитель (контроль), либо соответствующую дозу непикастата (3, 10, 30 или 100 мг·кг-1, перорально) или (R)-5-аминометил-1-(5,7-дифтор-1,2,3,4-тетрагидронафт-2-ил)-2,3-дигидро-2-тиоксо-1H-имидазолгидрохлорида (30 мг·кг-1, перорально) последовательно три раза с двенадцатичасовыми интервалами. Через шесть часов после третьей дозы крыс анестезировали галотаном, обезглавливали и быстро собирали ткани (коры головного мозга, брыжеечной артерии и левого желудочка), взвешивали, помещали в охлажденную на льду перхлорную кислоту (0,4 М), замораживали в жидком азоте и хранили при -70ºC вплоть до последующего анализа. Чтобы количественно определить концентрации норадреналина и дофамина, ткани гомогенизировали краткосрочной обработкой ультразвуком и центрифугировали при 13000 об/мин в течение 30 минут при 4ºC. Надосадок с добавлением 3,4-дигидроксибензиламина (внутренний стандарт) анализировали в отношении норадреналина и дофамина с помощью ВЭЖХ, используя электрохимическое детектирование.
В исследовании использовали самцов собак породы бигль (10-16 кг, Marshall Farms USA Inc., North Rose, NY, USA). В день исследования собак взвешивали и случайным образом распределяли на группы для перорального дозирования, получавшие либо пустые капсулы (контроль), либо соответствующую дозу непикастата (0,05, 0,5, 1,5 или 5 мг·кг-1; перорально, дважды в сутки) в течение 5 суток. Через шесть часов после первой дозы на 5 день собак подвергали эвтаназии пентобарбиталом и быстро собирали ткани (коры головного мозга, почечной артерии, левого желудочка). Затем ткани обрабатывали и анализировали в отношении норадреналина и дофамина, как описано выше.
Самцов собак породы бигль случайным образом распределяли на группы для перорального дозирования, получавшие либо пустые капсулы (контроль), либо непикастат (2 мг·кг-1, перорально, дважды в сутки) в течение 15 суток. Ежедневно отбирали образцы венозной крови через шесть часов после первой дозы для измерения концентраций дофамина и норадреналина в плазме. Образцы собирали в пробирки, содержащие гепарин и глутатион, центрифугировали при -4ºC и отделенную плазму хранили при -70ºC вплоть до анализа.
Синтезировали непикастат ((S)-5-аминометил-1-(5,7-дифтор-1,2,3,4-тетрагидронафт-2-ил)-1,3-дигидроимидазол-2-тионгидрохлорид) и соответствующий R-энантиомер ((R)-5-аминометил-1-(5,7-дифтор-1,2,3,4-тетрагидронафт-2-ил)-2,3-дигидро-2-тиоксо-1H-имидазолгидрохлорид). В исследованиях с использованием SHR лекарственные средства растворяли в дистиллированной воде и дозы вводили перорально через иглу для искусственного питания. В исследованиях на собаках лекарственными средствами заполняли капсулы и дозы вводили перорально. Все дозы выражены в виде эквивалента свободного основания.
Все данные выражены в виде среднего значения±стандартная ошибка среднего. Данные о катехоламинах в ткани и плазме анализировали, используя непараметрический однофакторный дисперсионный анализ (ANOVA) или двухфакторный ANOVA соответственно с последующим попарным сравнением с использованием критерия Фишера LSD. P<0,05 считали статистически значимым.
Непикастат (S-энантиомер) и (R)-5-аминометил-1-(5,7-дифтор-1,2,3,4-тетрагидронафт-2-ил)-2,3-дигидро-2-тиоксо-1H-имидазолгидрохлорид (R-энантиомер) вызывали зависимое от концентрации ингибирование активности дофамин-β-гидроксилазы быка и человека. Рассчитанные значения IC50 в случае непикастата составляли 8,5±0,8 нМ и 9,0±0,8 нМ для фермента быка и человека соответственно. (R)-5-Аминометил-1-(5,7-дифтор-1,2,3,4-тетрагидронафт-2-ил)-2,3-дигидро-2-тиоксо-1H-имидазолгидрохлорид был немного менее эффективным (IC50 25,1±0,6 нМ и 18,3±0,6 нМ для фермента быка и человека соответственно), чем непикастат.
Непикастат имел очень низкую аффинность (IC50 или Ki>10 мкМ) для ряда других ферментов (тирозингидроксилазы, ацетил-CoA-синтетазы, ацил-CoA-холестеринацилтрансферазы, Ca2+/кальмодулин-зависимой протеинкиназы II, циклооксигеназы-I, HMG-CoA-редуктазы, нейтральной эндопептидазы, синтазы оксида азота, фосфодиэстеразы III, фосфолипазы A2 и протеинкиназы C) и рецепторов нейромедиаторов (адренорецепторов б1A, б1B, б2A, б2B, в1 и в2, мускариновых рецепторов M1, дофаминовых рецепторов D1 и D2, опиоидных рецепторов м, рецепторов серотонина 5-HT1A, 5-HT2A и 5-HT2C).
Содержание катехоламинов исходного уровня в тканях (мкг·г-1 сырой массы) контрольных животных составляло: в брыжеечной артерии (норадреналин, 10,40±1,03; дофамин, 0,25±0,02), левом желудочке (норадреналин, 1,30±0,06; дофамин, 0,02±0,00) и коре головного мозга (норадреналин, 0,76±0,03; дофамин, 0,14±0,01). Непикастат вызывал зависимое от дозы уменьшение содержания норадреналина и увеличение содержания дофамина и отношения дофамин/норадреналин в трех исследованных тканях (фигуры 2 и 3). На фигуре 2 показано влияние непикастата на содержание норадреналина (O) и дофамина (□) в ткани брыжеечной артерии (A), левого желудочка (B) и коры головного мозга (C) SHR. Данные выражены в виде среднего значения±стандартная ошибка среднего; n=7-9 на группу. *p<0,05 по сравнению с контролем (0). На фигуре 3 показано влияние непикастата на соотношение дофамин/норадреналин в ткани брыжеечной артерии (O), левого желудочка (□) и коры головного мозга (∆) SHR. Данные выражены в виде среднего значения±стандартная ошибка среднего, n=7-9 на группу. *p<0,05 по сравнению с контролем (0).
Такие изменения достигали статистической значимости (p<0,05) при дозах ≥3 мг·кг-1 в брыжеечной артерии и левом желудочке, но в коре головного мозга только при дозах 30 и 100 мг·кг-1. В случае самой высокой исследованной дозы (100 мг·кг-1, перорально) уменьшение содержания норадреналина составляло 47%, 35%, 42%, и увеличение содержания дофамина составляло 820%, 800% и 86% в брыжеечной артерии, левом желудочке и коре головного мозга соответственно. При тестировании в дозе 30 мг·кг-1, перорально, S-энантиомер (непикастат) вызывал значимо более сильные изменения содержания катехоламинов по сравнению с R-энантиомером ((R)-5-аминометил-1-(5,7-дифтор-1,2,3,4-тетрагидронафт-2-ил)-2,3-дигидро-2-тиоксо-1H-имидазолгидрохлоридом) в брыжеечной артерии и левом желудочке (фигура 7). На фигуре 7 показано влияние непикастата и (R)-5-аминометил-1-(5,7-дифтор-1,2,3,4-тетрагидронафт-2-ил)-2,3-дигидро-2-тиоксо-1H-имидазолгидрохлорида в дозе 30 мг·кг-1, вводимых перорально, на содержание норадреналина, содержание дофамина и отношение дофамин/норадреналин в брыжеечной артерии, левом желудочке и коре головного мозга SHR. Данные выражены в виде среднего значения±стандартная ошибка среднего. n=9 на группу. *p<0,05 по сравнению с контролем, #p<0,05 по сравнению с непикастатом.
Содержание катехоламинов исходного уровня в тканях (мкг·г-1 сырой массы) контрольных животных составляло: в почечной артерии (норадреналин, 10,7±1,05; дофамин, 0,22±0,01), левом желудочке (норадреналин, 2,11±0,18; дофамин, 0,07±0,03) и коре головного мозга (норадреналин, 0,26±0,02; дофамин, 0,03±0,00). По сравнению с контрольными животными непикастат вызывал зависимое от дозы уменьшение содержания норадреналина и увеличение содержания дофамина и отношения дофамин/норадреналин в трех исследованных тканях (фигуры 4 и 5). На фигуре 4 показано влияние непикастата на содержание норадреналина (O) и дофамина (□) в тканях почечной артерии (A), левого желудочка (B) и коры головного мозга (C) собак породы бигль. Данные выражены в виде среднего значения±стандартная ошибка среднего; n=8 на группу. *p<0,05 по сравнению с контролем (0). На фигуре 5 показано влияние непикастата на соотношение дофамин/норадреналин в ткани почечной артерии (O), левого желудочка (□) и коры головного мозга (∆) собак породы бигль. Данные выражены в виде среднего значения±стандартная ошибка среднего, n=8 на группу. *p<0,05 по сравнению с контролем (0).
Указанные изменения достигали статистической значимости (p<0,05) при дозах ≥0,1 мг·кг-1·сутки-1 в трех тканях. При самой высокой исследованной дозе (5 мг·кг-1, дважды в сутки, перорально) уменьшение содержания норадреналина составляло 88%, 91% и 96%, и увеличение содержания дофамина составляло 627%, 700% и 166% в почечной артерии, левом желудочке и коре головного мозга соответственно. Концентрации катехоламинов исходного уровня в двух группах животных значимо не отличались друг от друга: концентрации норадреналина и дофамина в плазме составляли 460,3±59,6 и 34,4±11,9 пг·мл -1 соответственно в контрольной группе и 401,9±25,5 и 41,1±8,8 пг·мл -1 соответственно в группе, обработанной непикастатом. По сравнению с контрольной группой непикастат (2 мг·кг-1, дважды в сутки, перорально) вызывал значимое уменьшение концентраций в плазме норадреналина и увеличение концентраций в плазме дофамина и отношения дофамин/норадреналин (фигура 6). На фигуре 6 показано влияние непикастат на концентрации в плазме норадреналина (A), дофамина (B) и отношения дофамин/норадреналин (C) у собак породы бигль. Контрольные собаки (O); обработанные непикастатом собаки (●). Данные выражены в виде среднего значения±стандартная ошибка среднего; n=8 на группу. *p<0,05 по сравнению с контролем. Пик снижения (52%) концентрации норадреналина в плазме наблюдали на 6 день введения доз, тогда как пик увеличения (646%) концентрации дофамина в плазме наблюдали на 7 день введения доз.
Ингибирующее модулирование функции симпатических нервов с помощью фармакологических средств является привлекательной терапевтической методикой для лечения застойной сердечной недостаточности, так как повышенная активность такой системы вовлечена в прогрессирующее ухудшение заболевания. Цель настоящего исследования заключалась в фармакологической характеристике влияния непикастата, соединения, которое модулирует синтез норадреналина в симпатических нервах посредством ингибирования фермента дофамин-β-гидроксилазы.
Показано, что непикастат является сильным ингибитором дофамин-β-гидроксилазы человека и быка in vitro. Ингибирующее влияние соединения было стереоспецифичным, так как S-энантиомер (непикастат) был в небольшой степени, но значимо более эффективным, чем R-энантиомер ((R)-5-аминометил-1-(5,7-дифтор-1,2,3,4-тетрагидронафт-2-ил)-2,3-дигидро-2-тиоксо-1H-имидазолгидрохлорид), непикастат проявлял более высокую степень избирательности в отношении дофамин-β-гидроксилазы, так как соединение обладало незначительной аффинностью к двенадцати другим ферментам и тринадцати рецепторам нейромедиаторов.
Можно было ожидать, что ингибирование дофамин-β-гидроксилазы in vivo приведет к повышенным уровням субстрата (дофамина) и пониженным уровням продукта (норадреналина) в тканях, которые имеют норадренергическую иннервацию. Такое предположение было подтверждено в экспериментах, в которых исследовали влияние непикастата на уровни катехоламинов в центральных и периферических тканях in vivo. И у SHR и у собак породы бигль непикастат вызывал зависимое от дозы уменьшение содержания норадреналина и увеличение содержания дофамина в периферических (брыжеечной или почечной артерии, левом желудочке) и центральных (коре головного мозга) тканях. В этом отношении (R)-5-аминометил-1-(5,7-дифтор-1,2,3,4-тетрагидронафт-2-ил)-2,3-дигидро-2-тиоксо-1H-имидазолгидрохлорид был менее эффективным, чем непикастат, что согласуется с более низким значением IC50 первого энантиомера по отношению к ферменту. Хотя отношение дофамин/норадреналин было также повышено, по-видимому, при этом не было стехиометрической замены норадреналина дофамином. Наиболее вероятным объяснением такого наблюдения является то, что уровни дофамина в ткани могут быть недооценены вследствие внутринейронного метаболизма дофамина.
Способность непикастата изменять уровни катехоламинов в коре головного мозга свидетельствует о том, что лекарственное средство проникает через гематоэнцефалический барьер. У собак величина изменений уровней катехоламинов в коре головного мозга, по-видимому, сравнима с изменениями в периферических тканях. Однако у SHR непикастат в низких дозах (≤10 мг·кг-1) вызывал значимые изменения содержания норадреналина и дофамина в периферических тканях, не влияя на катехоламины в коре головного мозга. Это свидетельствует о том, что, по меньшей мере, у SHR лекарственное средство обладает небольшой периферической избирательностью. Авторы также показали, что непикастат ослабляет опосредованные симпатическими нервами ответы сердечно-сосудистой системы и снижает кровяное давление у SHR, не влияя на моторную активность (Hegde et al., 1996 a и b); указанные наблюдения будут опубликованы в виде отдельной рукописи.
Концентрация норадреналина в плазме является важным показателем общей активности симпатических нервов, хотя на указанный параметр могут влиять изменения захвата нейронами и изменения метаболического клиренса катехоламинов. Концентрации норадреналина в плазме исходного уровня неожиданно повышались у собак, что вероятно является отражением начального стресса, индуцированного процедурой отбора образцов крови посредством флеботомии. Тем не менее, по сравнению с контрольной группой непикастат вызывал значимое снижение концентраций норадреналина в плазме, что согласуется с пониженным синтезом и высвобождением медиаторов, хотя нельзя не учитывать непрямое воздействие, вторичное по отношению к облегчению захвата нейронами или метаболическому клиренсу. Так как высвобождаемый норадреналин представляет собой небольшую долю суммарного пула норадреналина в нейронах, то ингибитор биосинтеза норадреналина может влиять на высвобождение норадреналина только после того, как существующий пул катехоламина будет в достаточной мере истощен. Соответственно, уменьшение концентраций норадреналина в плазме достигает статистической значимости не раньше, чем по прошествии 4 дней введения доз непикастата, что свидетельствует о постепенном модулировании симпатической нервной системы. Следует понимать, что при отдельном измерении концентраций норадреналина в плазме не учитываются регионарные различия в высвобождении норадреналина (Esler et al., 1984), что подчеркивает необходимость в измерениях специфичной для органов степени спилловера норадреналина в будущих исследованиях.
Растущее количество данных свидетельствует о том, что хроническая активация симпатической нервной системы при застойной сердечной недостаточности является неадекватной реакцией. Такая точка зрения подтверждается клиническими испытаниями, которые показали положительный эффект карведилола у пациентов с застойной сердечной недостаточностью в отношении длительной заболеваемости и смертности. Однако следует отметить, что для большинства пациентов действительно требуется некоторый уровень симпатической импульсации для поддержания гомеостаза сердечно-сосудистой системы. Действительно, терапевтическая ценность β-блокаторов, включая карведилол, может быть ограничена их склонностью вызывать нарушение гемодинамики, особенно во время начала терапии. Указанный нежелательный эффект, который возникает в результате внезапного прекращения симпатической поддержки, делает необходимым тщательное титрование дозы. Ингибиторы дофамин-β-гидроксилазы, такие как непикастат, могут не иметь такого нежелательного эффекта по следующим причинам. Во-первых, такой класс лекарственных средств может уменьшить, но не отменить высвобождение норадреналина, и, во-вторых, они вызывают постепенное модулирование системы, тем самым устраняя необходимость в титровании дозы. Другим преимуществом непикастата по сравнению с β-блокаторами является то, что он повышает уровни дофамина, который посредством агонизма рецепторов дофамина может оказывать благотворное влияние на функцию почек, например расширение сосудов почки, диурез и натрийурез.
Итак, непикастат является эффективным, избирательным и перорально активным ингибитором дофамин-β-гидроксилазы, который может быть полезен при лечении сердечно-сосудистых расстройств, ассоциированных со сверхактивацией симпатической нервной системы.
Пример 6
Синтез непикастата (2a) (фигура 8 и фигура 9). Пероральное введение 2a спонтанно гипертензивным крысам (SHR) и нормальным собакам вызывало сильное и зависимое от дозы увеличение соотношений дофамин (DA)/норэпинефрин (NE) в тканях периферических артерий (почечной или брыжеечной), левого желудочка и коры головного мозга. Хроническое пероральное введение 2a нормальным собакам также вызывало длительное увеличение отношения DA/NE в плазме. У находящихся в сознании SHR острое пероральное введение 2a вызывало зависимое от дозы и продолжительное (>4 часов) противогипертоническое действие, а также ослабление прессорных реакций в ответ на стимуляцию преганглионарных симпатических нервов. Уровни T3 и T4 в сыворотке не изменялись под влиянием дозы (6,2 мг/кг, перорально, дважды в сутки в течение 10 суток), которая повышала отношение дофамин/норэпинефрин в брыжеечной артерии. Благодаря способности сильно модулировать симпатическую импульсацию к тканям сердечно-сосудистой системы 2a в настоящее время проходит клиническую оценку в качестве средства для лечения застойной сердечной недостаточности.
Застойная сердечная недостаточность (ЗСН) является лидирующей причиной смертности в Соединенных Штатах. ЗСН характеризуется заметной активацией симпатической нервной системы (СНС) и системы ренин-ангиотензин (RAS). Одновременная активация указанных двух нейрогормональных систем в большой мере вовлечена в сохранение и прогрессирование ЗСН. Терапевтическое вмешательство, которое блокирует эффекты таких нейрогормональных систем, вероятно может благоприятно изменить естественный ход ЗСН. Действительно, показано, что ингибиторы ангиотензин-превращающего фермента (ACE), которые блокируют образование ангиотензина II, уменьшают заболеваемость и смертность среди пациентов с ЗСН. Однако ингибиторы ACE обладают ограниченной непрямой способностью ослаблять СНС. Ингибирование СНС антагонистами β-адренорецепторов является многообещающим подходом, который в настоящее время подвергается клинической оценке. Альтернативной методикой прямого модулирования СНС является ингибирование биосинтеза норэпинефрина (NE) посредством ингибирования дофамин-β-гидроксилазы (DBH), фермента, ответственного за превращение NE в дофамин (DA). Можно предполагать, что ингибирование DBH приведет к уменьшению уровней NE в тканях и повышению уровней DA в тканях, тем самым увеличивая отношение DA/NE в тканях. Указанный способ имеет возможные преимущества по сравнению с использованием антагонистов β-адренорецепторов, такие как пониженная стимуляция α-адренорецепторов и повышенные уровни DA, что может вызывать расширение сосудов почек, натрийурез и сниженное высвобождение альдостерона. Используемые ранее ингибиторы DBH, такие как фузаровая кислота и SKF 102698, имеют недостатки, такие как низкая эффективность и специфичность, которые препятствуют их клинической разработке в качестве средств для лечения сердечной недостаточности.
В настоящем примере показано, что 2a (непикастат) является мощным и избирательным ингибитором DBH, родственным SKF 10269. Получение 2a (схема I) основано на хиральном превращении тетралона 3 (получаемого в катализируемой AlCl3 реакции Фриделя-Крафтса 3,5-дифторфенилацетилхлорида с этиленом в CH2Cl2 при -65ºC) в условиях, описанных Терашима (Terashima7) (LAH, (-)-1R,2S-N-метилэфедрин, 2-этиламинопиридин), с получением R-(+)-тетралола 4a (92-95% ee). Превращение 4a в R-(+)-мезилат 5a с последующим взаимодействием с азидом натрия давало смесь (9:1) азида 6a и дигидронафталина 7. Азид гидрировали и продукт обрабатывали безводным HCl, получая S-(-)-амингидрохлорид 8a, превращаемый в реакции Штрекера (комплекс формальдегида-бисульфита и KCN) в S-(-)-аминонитрил 9a. Образование гетероцикла 10a осуществляли последовательным диформилированием аминонитрила 9a с последующей обработкой тиоциановой кислотой. Конкурирующий гидролиз нитрила давал сопоставимые количества первичного амида 11a. Восстановление нитрила 10a до амина 2a (93-96% ee) осуществляли, используя LAH в ТГФ. Энантиомер 2b (91,6% ee) получали таким же путем, как описано выше, используя (+)-1S,2R-N-метилэфедрин в качестве хирального вспомогательного вещества при восстановлении кетона 3 в реакции Терашима. Абсолютная конфигурация хирального центра в 4a,b, и следовательно 2a,b, была основана на приоритете групп, описанном ранее в литературе для S-(-)-2-тетралола.
Показано, что тетралин 2a является конкурентным ингибитором DBH быка (IC50=8,5±0,8 нМ) и человека (IC50=9,0±0,8 нМ). R-энантиомер 2b (IC50=25,1±0,6 нМ; 18,3±0,6 нМ) и 1 (IC50=67,0±4,2 нМ; 85,0±3,7 нМ) являются более слабыми ингибиторами ферментов быка и человека соответственно. Соединение 2a имело слабую аффинность по отношению к ряду других ферментов и рецепторов нейромедиаторов (фигура 10). Полученные данные свидетельствуют, что 2a является сильным и высокоизбирательным ингибитором DBH in vitro. Кроме того, S-энантиомер является примерно в 2-3 раза более сильным, чем R-энантиомер, что свидетельствует о стереоизбирательности.
Биохимические эффекты 2a, 2b и 1 in vivo оценивали у спонтанно гипертензивных крыс (SHR) и нормальных собак породы бигль. Пероральное введение 2a давало зависимое от дозы увеличение соотношения DA/NE в артерии (брыжеечной или почечной), левом желудочке и коре головного мозга у SHR (фиг. 11A) и собак (фиг. 11B). При самой высокой тестированной дозе (100 мг/кг у SHR и 5 мг/кг у собак) максимальное увеличение отношения DA/NE составляло 14-, 11- и 3,2-кратное увеличение (у SHR) и 95-, 151- и 80-кратное увеличение (у собак) в артерии, левом желудочке и коре головного мозга соответственно. При тестировании дозы 30 мг/кг у SHR SKF 102698 (1) увеличивал отношение DA/NE в 5,5 раз, 3,5 раза и 2,7 раза, тогда как 2a в такой же дозе увеличивал отношение в 8,3, 7,5 и 1,5 раза в брыжеечной артерии, левом желудочке и коре головного мозга соответственно. R-энантиомер 2b в дозе 30 мг/кг вызывал у SHR только 2,6-, 3,5- и 1,1-кратное увеличение отношения DA/NE в брыжеечной артерии, левом желудочке и коре головного мозга соответственно. Полученные данные свидетельствуют, что 2a вызывает ожидаемые биохимические эффекты как у SHR, так и у собак, но более эффективно у последних. Кроме того, 2a является более эффективным, чем его R-энантиомер 2b и SKF 102698 (1), у SHR.
Хроническое влияние 2a (14,5 дней обработки) на отношение DA/NE в плазме исследовали у нормальных собак. Пероральное введение 2a (2 мг/кг; дважды в сутки) приводило к значимому увеличению отношения DA/NE, которое достигало пикового эффекта примерно на 6-7 день, затем выходило на плато на новом устойчивом уровне в течение периода с 7 по 14 день (фиг. 12).
Затем оценивали гемодинамическую активность 2a in vivo у находящихся в сознании ограниченных в движении SHR, модели, имеющей высокую симпатическую импульсацию к тканям сосудов и сердца. Введение пероральных доз 2a приводило к зависимому от дозы противогипертоническому эффекту (фиг. 13). Максимальное уменьшение среднего кровяного давления 53±4 мм Hg (33% снижение по сравнению с контролем, в котором использовали наполнитель) наблюдали в случае дозы 10 мг/кг. Ответ сначала был медленным, достигая плато к 3-4 часу. Точная причина утраты противогипертонической эффективности в самой высокой дозе (30 мг/кг) в настоящее время не ясна. Частота сердечных сокращений значимо не изменялась, за исключением небольшого, но значимого снижения в случае дозы 10 и 30 мг/кг (9,8 и 10,5% соответственно). После такого исследования у крыс разрушали проводящие пути спинного мозга и оценивали влияние 2a на прессорную реакцию в ответ на стимуляцию преганглионарных нейронов (PNS) спинного мозга через 5 часов после введения дозы. Кривая зависимости частота-прессорный ответ значимо сдвигалась (p<0,05) вправо зависимым от дозы образом (максимальный сдвиг ~ 5-кратный на кривой зависимости частота-ответ). Ответ в виде частоты сердечных сокращений на PNS значимо не изменялся. Полученные данные свидетельствуют, что 2a ингибирует симпатическую импульсацию к сосудам, что является возможным механизмом его противогипертонического действия у SHR.
Так как гетероциклическая часть 2a структурно сходна с метимазолом, известным сильным супрессором функции щитовидной железы к млекопитающих, то оценивали влияние 2a на функцию щитовидной железы в дозах 2,0 и 6,2 мг/кг, перорально, дважды в сутки у крыс Sprague-Dawley, испытывающих дефицит йода (n=9-12), в течение 10 дней. Метимазол (1 мг/кг, перорально, дважды в сутки), использованный в качестве позитивного контроля, вызывал значимое уменьшение уровней T3 (3 день, 31%, p<0,05; 7 и 9 дни, 42 % и 44%, p<0,01) и T4 (3 и 7 дни, 46% и 58%, p<0,01) в сыворотке через 4 часа после введения дозы, тогда как 2a не оказывал значимого влияния на протяжении исследования (3, 7 и 9 дни). Обе дозы 2a значимо увеличивали отношение DA/NE в брыжеечной артерии (p<0,01 по сравнению с контролями, в которых использовали наполнитель), но не в коре головного мозга через 4 часа после конечной дозы на 10 день.
Данные, полученные в таком исследовании, свидетельствуют, что 2a (непикастат) является эффективным, избирательным и перорально активным ингибитором DBH. Соединение также не оказывает значимого влияния на поведение в животных моделях, и полученные данные будут предметом будущей публикации. Так как соединение 2a (непикастат) эффективно модулирует симпатическую импульсацию к тканям сердца и сосудов, то в настоящее время указанное соединение находится в разработке в качестве средства для лечения ЗСН.
На фигуре 9 показано a(a) i: SOCl2; ii: AlCl3, CH2Cl2, этилен, -65ºC; (b) (-)-1R,2S-N-метилэфедрин, 2-этиламинопиридин, 1 М LAH в Et2O,<-60ºC для R-энантиомера или (+)-1S,2R-N-метилэфедрин, 2-этиламинопиридин, 1 М LAH в Et2O,<-60ºC для S-энантиомера; (c) MsCl, Et2O, Et3N, -15ºC; (d) NaN3, ДМСО, 50ºC; (e) i: H2, 10% Pd/C, EtOAc, 60 фунтов на кв. дюйм (0,42 МПа); ii: 1 М HCl/Et2O; (f) NaOH, комплекс формальдегид-бисульфит натрия, KCN, H2O, 50-80ºC; (g) i: n-бутилформиат, 120ºC; ii: J-BuOK, этилформиат, ТГФ, -15ºC; iii: 1 М HCl, EtOH, KSCN; (h) i: 1 М LAH в ТГФ, 20ºC; ii: HCl/Et2O, MeOH.
На фигуре 10 показана таблица, описывающая взаимодействие непикастата с DBH и ряд выбранных ферментов и рецепторов.
Фигура 11: (A) - Влияние 2a на отношение DA/NE в тканях спонтанно гипертензивных крыс. Животным вводили пероральные дозы с 12-часовым интервалом и собирали ткани через 6 часов после третьей дозы. *p<0,05 по сравнению с плацебо (наполнитель).
(B) - Влияние 2a на отношение DA/NE в тканях нормальных собак породы бигль. Животным вводили пероральные дозы дважды в сутки в течение 4,5 суток и ткани собирали через 6 часов после первой дозы на 5 день. *p<0,05 по сравнению с плацебо (пустая капсула).
Концентрации DA и NE оценивали, используя ВЭЖХ с электрохимическим детектированием. Все данные выражены в виде среднего значения±стандартная ошибка среднего, n=9 на группу.
Фигура 12: Влияние хронического введения 2a на отношение DA/NE в плазме нормальных собак породы бигль. Животным вводили пероральные дозы дважды в сутки в течение 14,5 суток. Образцы крови брали каждый день через 6 часов после первой дозы. 2a вызывал значимое увеличение (p<0,05) отношения DA/NE во всех временных точках по сравнению с группой, принимающей плацебо. Концентрации DA и NE в плазме оценивали, используя ВЭЖХ с электрохимическим детектированием. Все данные выражены в виде среднего значения±стандартная ошибка среднего, n=8 на группу.
Фигура 13: Влияние перорально вводимого 2a на среднее артериальное давление у находящихся в сознании ограниченных в движении спонтанно гипертензивных крыс (SHR). SHR слегка анестезировали эфиром и обеспечивали приборами для измерения артериального давления и ведения лекарственного средства. Животных помещали в приспособления для фиксирования и давали возможность восстановиться в течение 30-40 минут. После получения измерений исходного уровня животных обрабатывали перорально либо наполнителем, либо соответствующей дозой 2a и непрерывно регистрировали гемодинамические параметры в течение 4 часов. 2a вызывал значимое (p<0,05) снижение среднего артериального давления во всех дозах и временных точках, за исключением 0,3 мг/кг (180, 210 и 240 мин) и 1 мг/кг (30, 210 и 240 мин). Все данные выражены в виде среднего значения±стандартная ошибка среднего, n=6-8 на группу.
Точки плавления определяли на капиллярном устройстве для определения точки плавления Uni-Melt Thomas Hoover или используя ячейку Mettler FB 81HT с процессором Mettler FP90 и не корректировали. Масс-спектры получали на спектрометре либо Finnigan MAT 8230 (в случае ионизации электронным ударом или химической ионизации), либо Finnigan MAT TSQ70 (в случае LSIMS). Спектры 1H-ЯМР регистрировали на спектрометре Bruker ACF300, AM300, AMX300 или EM390 и химически сдвиги получали в м.д. (δ), используя тетраметилсилан в качестве внутреннего стандарта. ИК-спектры регистрировали на спектрометре Nicolet SPC FT-IR. УФ-спектры регистрировали на спектрометре Varian Cary 3 для УФ-видимой области, Leeman Labs Inc. Оптические вращения измеряли на поляриметре Perkin-Elmer, модель 141. Измерения с использованием хиральной ВЭЖХ осуществляли на колонке Regis Chiral AGP (4,6×100 мм), элюируя смесью 2% ацетотрил-98% 20 мМ KH2PO4 (pH 4,7), 1 мл/мин при 20ºC.
5,7-Дифтор-2-тетралон (3). SOCl2 (100 мл) добавляли одной порцией к 3,5-дифторфенилуксусной кислоте (100 г, 0,58 моль) и после перемешивания в течение 15 часов летучие вещества выпаривали при пониженном давлении. Полученный маслянистый хлорангидрид растворяли в CH2Cl2 (200 мл) и по каплям добавляли к механически перемешиваемой суспензии AlCl3 (154 г, 1,16 моль) в CH2Cl2 (1,0 л). Перемешиваемую суспензию охлаждали до внутренней температуры -65ºC на бане, содержащей сухой лед/ацетон, и раствор хлорангидрида добавляли с такой скоростью, чтобы поддерживать внутреннюю температуру <-60ºC. После завершения добавления газ этилен барботировали через реакционную смесь с высокой скоростью в течение 10 минут при -65ºC. Реакционной смеси давали возможность нагреться до 0ºC в течение 2 часов с перемешиванием и затем охлаждали до -10ºC и обрабатывали H2O (500 мл), сначала по каплям, затем добавляя быстро. Органический слой отделяли, промывали насыщенным раствором соли (100 мл) и сушили над MgSO4. Упаривание при пониженном давлении давало темный маслянистый остаток, который подвергали дистилляции в вакууме по Кюгельрору, собирая вещество, кипящее в интервале 90-110ºC (1,0-0,7 мм Hg). Дистиллят повторно подвергали дистилляции при 100-105ºC (0,3 мм Hg), получая 3 в виде белого твердого вещества (73,6 г, 0,40 моль; 70%): т.пл. 46ºC; ИК (KBr) 1705 см -1 ; 1 H ЯМР (CDCl 3 ) δ 2,55 (т, J=7,5 Гц, 2H), 3,10 (т, J=7,5 Гц, 2H), 3,58 (с, 2H), 6,70 (м 2H); MS m/z 182 (M + ). Аналитически вычислено для C 10 H 8 F 2 O: C, 65,93; H, 4,42. Найдено: C, 65,54; H, 4,42.
(R)-(+)-2-гидрокси-5,7-дифтор-1,2,3,4-тетрагидронафталин (4a). Раствор (-)-1R,2S-N-метилэфедрина (81,3 г, 0,454 моль) в безводном Et2O (1,1 л) по каплям добавляли (45 мин) к 1,0 М алюмогидриду лития (416 мл, 0,416 моль) в Et2O со скоростью, достаточной для поддержания слабой дефлегмации. После завершения добавления реакционную смесь кипятили с обратным холодильником в течение 1 часа, затем давали возможность остыть до комнатной температуры. Раствор 2-этиламинопиридина (111 г, 0,98 моль) в безводном Et2O (100 мл) добавляли (45 мин) с такой скоростью, чтобы поддерживать слабую дефлегмацию. Реакционную смесь кипятили с обратным холодильником еще в течение 1 часа, за это время появлялась светлая желтовато-зеленая суспензия. Смесь охлаждали до внутренней температуры -65ºC, используя баню, содержащую сухой лед-ацетон, и по каплям добавляли раствор 5,7-дифтор-2-тетралона (23,0 г, 126 ммоль) в Et2O (125 мл) со скоростью, позволяющей поддерживать внутреннюю температуру ниже -60ºC. После завершения добавления смесь перемешивали при температуре от -65ºC до -68ºC в течение 3 часов и гасили добавлением MeOH (100 мл), поддерживая внутреннюю температуру ниже -60ºC. Реакционную смесь перемешивали еще в течение 10 минут при -65ºC и давали возможность нагреться примерно до -20ºC. Затем добавляли 3н. раствор HCl (2 л) с такой скоростью, чтобы ограничить температуру до <35ºC. После перемешивания с повышенной скоростью, чтобы достичь полного растворения, слои разделяли и эфирный слой промывали насыщенным раствором соли (200 мл) и сушили (MgSO4). Раствор в эфире упаривали при пониженном давлении и остаток растворяли в теплом Et2O (20 мл) с последующим добавлением гексана (200 мл). Затравленный раствор охлаждали на бане со льдом и выдерживали при 0ºC в течение 1 часа, после чего полученные осажденные кристаллы собирали и сушили в вакууме, получая спирт 4a (10,9 г, 47%): т.пл. 85ºC; [α]25 D +38,1º (с=1,83, CHCl3); 93,4% ее по данным хиральной ВЭЖХ: 1H ЯМР (CDCl3) δ 1,70 (ушир.с, 1H), 1,76-1,88 (м, 2H), 1,99-2,06 (м, 2H), 2,63-3,08 (м, 3H), 4,15 (м, 1H), 6,60 (м, 2H). Аналитически вычислено для C10H10F2O: C, 65,21; H, 5,47. Найдено: C, 65,38: H, 5,42. Спектры для (S)-энантиомера 4b были идентичными: т.пл. 84-85ºC; [α]25 D -37,8° (c=1,24, CHCl3); 92,4% ее по данным хиральной ВЭЖХ. Аналитически вычислено для C10H10F2O: C, 65,21; H, 5,47. Найдено: C, 65,47; H, 5,39.
(R)-(+)-2-метансульфонилокси-5,7-дифтор-1,2,3,4-тетрагидронафталин (5a). Раствор R-(+)-5,7-дифтор-2-тетралол 4a (59,0 г, 320 ммоль) и Et3N (74,2 мл, 53,9 г, 530 ммоль) в безводном Et2O (1,78 л) охлаждали (-15ºC), используя баню со смесью лед-MeOH, и обрабатывали в атмосфере аргона при перемешивании MsCl (37,2 мл, 55,3 г, 480 ммоль) в течение 5-10 минут. Через 5 часов реакция была завершена (по данным ТСХ), и добавляли воду, чтобы растворить твердые вещества. Добавляли небольшое количество EtOAc, чтобы полностью растворить твердые вещества. Органическую фазу отделяли и промывали последовательно 1н. HCl, водным раствором NaHCO3, насыщенным раствором соли и сушили над MgSO4. Выпаривание растворителя давало не совсем белое твердое вещество 5a (87,1 г, 332 ммоль), непосредственно используемое на следующей стадии. При растирании небольшого образца в i-Pr2O получали образец для анализа: т.пл. 78,8-80,5°C; [α]25 D +16,8° (c=1,86, CHCl3); 1H ЯМР δ 2,13-2,28 (м, 2H), 2,78-2,96 (м, 2H), 3,07 (с, 3H), 3,09 (дд, J=17,1 Гц, 4,7, 1H), 3,20 (дд, J=17,2, 4,7 Гц, 1H), 5,20 (м, 1H), 6,67 (м, 2H). Аналитически вычислено для C11H12F2O3S: C, 50,37; H, 4,61. Найдено: C, 50,41; H, 4,64. Спектры для (S)-энантиомера 5b являются идентичными: т.пл 79,9-80,9°C; [α]25 D -16,6° (c=2,23, CHCl3). Аналитически вычислено для C11H12F2O3S: C, 50,37; H, 4,61. Найдено: C, 50,41; H, 4,65.
(S)-(-)-2-амино-5,7-дифтор-1,2,3,4-тетрагидронафталингидрохлорид (8a). Азид натрия (40,0 г, 0,62 моль) добавляли к ДМСО (1 л) при перемешивании вплоть до получения прозрачного раствора. Одной порцией добавляли мезилат 5a (138 г, 0,53 моль) и смесь нагревали при 50ºC в течение 16 часов в атмосфере N2. Реакционную смесь разбавляли H2O (1,8 л) и экстрагировали пентаном (4×250 мл), затем объединенные экстракты в пентане последовательно промывали H2O (2×100 мл), насыщенным раствором соли (100 мл) и сушили над MgSO4. Выпаривание растворителя при пониженном давлении давало летучее масло, которое подвергали быстрой хроматографии на диоксиде кремния, используя пентан в качестве элюента и получая дигидронафталин 7 (8,50 г, 51,2 ммоль) в виде летучего масла. Дальнейшее элюирование смесью пентан/CH2Cl2 (9:1) давало азид 6a (101 г, 483 ммоль) в виде бесцветного масла: ИК (CHCl3) 2103 см-1; m/z 111 (M+). Азид 6a растворяли в EtOAc (1200 мл) и гидрировали над 10% Pd/C (6 г) в сосуде Пара объемом 2,5 л (60 фунтов на кв. дюйм (0,42 МПа)) в течение 6 часов. После каждого часа сосуд вакуумировали и снова заполняли водородом, чтобы удалить выделяемый N2. Полученную смесь фильтровали через целит, перемешивали с раствором HCl в эфире (1н., 500 мл) и мелкодисперсный осадок отфильтровывали и промывали EtOAc и затем безводным эфиром (фильтрование занимало примерно 4 часа). Влажное твердое вещество переносили в круглодонную колбу и оставшийся растворитель удаляли в вакууме, получая белое твердое вещество 3 (90,4 г, 412 ммоль; 77,9%): т.пл. >280°C; [α]25 D -60,2° (c=2,68, MeOH); 1H ЯМР (d6-ДМСО) δ 1,79 (м, 1H), 2,33 (м, 1H), 2,63 (м, 1H), 2,83-2,92 (м, 2H), 3,14 (дд, J=16,7, 5,0 Гц, 1H), 3,46 (м, 1H), 6,93 (д, J=9,4 Гц, 1H), 7,00 (дт, J=9,4, 2,5 Гц, 1H). Аналитически вычислено для C10H12ClF2N: C, 54,68; H, 5,51; N, 6,37. Найдено: C, 54,31; H, 5,52; N, 6,44. Спектры (R)-энантиомера идентичны: т.пл. >280°C; [α]25 D +58,5° (c=1,63, MeOH). Аналитически вычислено для C10H12ClF2N: C, 54,68; H, 5,51; N, 6,37. Найдено: C, 54,64; H, 5,51; N, 6,40.
(S)-(-)-(5,7-дифтор-1,2,3,4-тетрагидронафт-2-ил)(цианометил)амин (9a). Гидрохлорид амина 8a (50,27 г, 229 ммоль) обрабатывали раствором NaOH (10,0 г, 250 ммоль) в воде (150 мл), затем добавляли несколько дополнительных гранул NaOH, достаточных для получения раствора. Добавляли дополнительно количество воды (300 мл) и смесь помещали на баню с температурой 50ºC и обрабатывали комплексом формальдегида с бисульфитом натрия (30,8 г, 230 ммоль). После перемешивания смеси в течение 30 минут добавляли KCN (15,0 г, 230 ммоль). Реакционную смесь перемешивали еще в течение 1 часа при 80ºC, охлаждали до комнатной температуры и экстрагировали EtOAc, получая масло (51,3 г), которое отверждалось. ТСХ (5% MeOH-CH2Cl2) показала наличие примерно 10-15% оставшегося исходного амина. Хроматография на диоксиде кремния давала 9a (39,4 г) и исходный свободный амин (7,12 г), который на воздухе быстро образовывал карбонат. Повторное использование указанного амина давало дополнительно 5,35 г продукта. Суммарный выход (44,8 г, 202 ммоль; 87,5%): т.пл. 73,1-76,5°C; [α]25 D -58,0° (c=1,63, CHCl3); 1H ЯМР (CHCl3) δ 1,50 (ушир.с, 1H), 1,70 (м, 1H), 2,05 (м, 1H), 2,55-3,04 (м, 4H), 3,22 (м, 1H), 3,70 (с, 2H), 6,62 (м, 2H); MS m/z 222 (M+). Аналитически вычислено для C12H12F2N2: C, 64,85; H, 5,44; N, 12,60. Найдено: C, 65,07; H, 5,47; N, 12,44. Спектры (R)-энантиомера идентичны: т.пл. 64,4-73,6°C; [α]25 D +52,3° (c=2,12, CHCl3). Аналитически вычислено для C12H12F2N2: C, 64,85; H, 5,44; N, 12,60. Найдено: C, 65,14; H, 5,54; N, 12,53.
(S)-(-)-1-(5,7-дифтор-1,2,3,4-тетрагидронафт-2-ил)-5-циано-2,3-дигидро-2-тиоксо-1H-имидазол (10a). Нитрил 9a (44,7 г, 201 ммоль) в бутилформиате (240 мл) кипятили с обратным холодильником (баня 120ºC) в атмосфере N2 в течение 19 часов и затем растворитель удаляли при пониженном давлении. Добавляли толуол и упаривали, чтобы удалить последние следовые остатки растворителя, и остаток сушили в условиях высокого вакуума, получая масло (53,2 г). Полученный формамид и этилформиат (48,7 мл, 44,7 г, 604 ммоль) в безводном ТГФ (935 мл) охлаждали в смеси лед/MeOH (-15ºC) и перемешивали, добавляя при этом t-BuOK (1 М в ТГФ, 302 мл, 302 ммоль) в течение 20 минут. После перемешивания реакционной смеси в течение 18 часов растворитель выпаривали, остаток растворяли в 1н. HCl (990 мл) и этаноле (497 мл) и обрабатывали KSCN (78,1 г, 804 ммоль). Смесь перемешивали в течение 135 минут при 85ºC и затем помещали на баню со льдом, получая осадок. Отфильтрованное твердое вещество загружали в виде взвеси в 10% MeOH/CH2Cl2 на колонку с диоксидом кремния (1 кг), упакованную с использованием гексана. Элюирование смесью 10% ацетон/CH2Cl2 давало 10a (18,05 г, 62,1 ммоль; 30,8%): т.пл. 240,7-249,2°C; [∀]25 D -69,1° (c=1,18, ДМСО); 1H ЯМР (d6-ДМСО) δ 2,18 (ушир.м, 1H), 2,47 (м, 1H), 2,75 (м, 1H), 3,03-3,35 (м, 3H), 5,19 (м, 1H), 6,94 (д, J=9,3 Гц, 1H), 7,03 (дт, J=9,3, 2,4 Гц, 1H), 8,29 (с, 1H), 13,3 (ушир.с, 1H); MS m/z 291 (M+). Аналитически вычислено для C14H11F2N3S: C, 57,72; H, 3,80; N, 14,42. Найдено: C, 57,82; H, 3,92; N, 14,37. Дальнейшее элюирование колонки смесью 1:1 MeOH/CH2Cl2 давало первичный амид 11a: т.пл. 261,9-262,7°C; [∀]25 D -90,5° (c=0,398); ИК (KBr) 1593, 1630 см-1; 1H ЯМР (d6-ДМСО) δ 2,14 (м, 1H), 2,15-2,28 (м, 1H), 2,74-3,05 (м, 4H), 5,64 (м, 1H), 6,90 (д, J=9,2 Гц, 1H), 7,05 (дт, J= 9,5, 2,4 Гц, 1H), 8,73 (с, 1H), 9,70 (ушир.с, 1H), 13,7 (ушир.с, 1H); MS m/z 309 (M+). Аналитически вычислено для C14H13F2N3OS·0,25H2O: C, 53,57; H, 4,33; N, 13,39. Найдено: C, 53,32; H, 3,96; N, 13,24. Спектры (R)-энантиомера 10b идентичны: т.пл. 243,1-244,7°C; [∀]25 D +74,9° (c=2,14, ДМСО). Аналитически вычислено для C14H11F2N3S: C, 57,72; H, 3,80; N, 14,42. Найдено: C, 57,85; H, 3,85; N, 14,45.
(S)-1-(5,7-Дифтор-1,2,3,4-тетрагидронафт-2-ил)-5-аминометил-2,3-дигидро-2-тиоксо-1H-имидазол. Указанный выше нитрил (5,00 г, 17,2 ммоль) в ТГФ (75 мл) перемешивали в атмосфере аргона на бане со льдом вплоть до получения гомогенного раствора. По каплям добавляли раствор LAH в ТГФ (1 М, 34,3 мл, 34,3 ммоль) в течение 10 минут, затем раствор перемешивали в течение 30 минут при 0ºC и позволяли достичь комнатной температуры в течение 1,5 часов. Реакционную смесь снова охлаждали до 0ºC и обрабатывали насыщенным раствором тартрата натрия-калия, пока смесь не становилась легко перемешиваемой. Дополнительно добавляли раствор тартрата (30 мл), затем 10% MeOH/CH2Cl2 (200 мл) и смесь перемешивали в течение 15 минут и обрабатывали водой (100-150 мл). Органический слой отделяли и водную фазу экстрагировали смесью 10% MeOH/CH2Cl2 (2×125 мл). Объединенные экстракты промывали, сушили (MgSO4) и упаривали. Хроматография остатка (5,2 г) на диоксиде кремния с использованием элюирования смесью 5% MeOH/CH2Cl2 давала 2a в виде свободного амина (2,92 г, 9,89 ммоль; 58%): т.пл. 170°C; [∀]25 D -11,0° (c=1,59, ДМСО). Аналитически вычислено для C14H15F2N3S·0,25H2O: C, 56,07; H, 5,21; N, 14,01. Найдено: C, 56,11; H, 5,10; N, 14,14.
(S)-1-(5,7-дифтор-1,2,3,4-тетрагидронафт-2-ил)-5-аминометил-2,3-дигидро-2-тиоксо-1H-имидазолгидрохлорид (2a). Гидрохлоридную соль получали добавлением раствора HCl в эфире (1 М, 20 мл, 20 ммоль) к свободному амину 2a (3,12 г, 10,6 ммоль), который был растворен в MeOH (250 мл) при нагревании. Растворитель частично удаляли при пониженном давлении и вытесняли совместным упариванием с EtOAc несколько раз без упаривания досуха. Полученный осадок обрабатывали EtOAc (150 мл) и эфиром (150 мл), отфильтровывали, промывали эфиром и сушили в атмосфере азота и затем в условиях высокого вакуума при 78ºC в течение 20 часов, получая гидрохлоридную соль (3,87 г): т.пл. 245°C (dec); [α]25 D +9,65° (c=1,70, ДМСО); (93% ее по данным хиральной ВЭЖХ); 1H ЯМР (T=320 K, ДМСО) δ 2,07 (м, 1H), 2,68-3,08 (м, 4H), 4,09 (м, 3H), 4,77 (м, 1H), 6,84 (м, 2H), 7,05 (с, 1H), 8,57 (ушир.с, 3H), 12,4 (ушир.с, 1H). Аналитически вычислено для C14H16ClF2N3S·0,5H2O: C, 49,33; H, 5,03; N, 12,33. Найдено: C, 49,44; H, 4,96; N, 12,18. Спектры (R]-энантиомера 2b идентичны; т.пл. 261-263°C; [∀]25 D -10,8° (c=1,43, ДМСО), 91,6% ее по данным хиральной ВЭЖХ. Аналитически вычислено для C14H16ClF2N3S·0,35H2O: C, 49,73; H, 4,98; N, 12,42. Найдено: C, 49,80; H, 4,93; N, 12,39.
Анализ активности DBH in vitro. Активность DBH анализировали, измеряя превращение тирамина в октопамин. DBH быка из надпочечников получали из Sigma Chemical Co (St Louis, MO). Секретируемую DBH человека очищали из культуральной среды линии клеток нейробластомы SK-N-SH. Анализ осуществляли при pH 5,2 и 32ºC в растворе, содержащем 0,125 М NaOAc, 10 мМ фумарата, 0,5-2 мкМ CuSO4, 0,1 мг/мл каталазы, 0,1 мМ тирамина и 4 мМ аскорбата. В типичном анализе в реакционную смесь добавляли 0,5-1 миллиединиц фермента и затем добавляли субстратную смесь, содержащую каталазу, тирамин и аскорбат, чтобы инициировать реакцию (конечный объем 200 мкл). Образцы инкубировали в отсутствие или в присутствии ингибитора в соответствующей концентрации при 37ºC в течение 30-40 минут. Реакцию гасили раствором для остановки реакции, содержащим 25 мМ EDTA и 240 мкМ 3-гидрокситирамина (внутренний стандарт). Образцы анализировали в отношении октопамина обращенно-фазовой ВЭЖХ с использованием Уф-детектора при 280 нМ. Остаточную активность в процентах вычисляли на основе контролей (без ингибитора), корректировали, используя внутренние стандарты, и подгоняли к кривой нелинейной зависимости концентрация-ответ по четырем параметрам, чтобы получить значения IC50.
Анализ in vitro выбранных ферментов и рецепторов нейромедиаторов. Активность 2a по отношению к одиннадцати разным ферментам определяли, используя принятые анализы (PanLabs Inc., Foster City, CA). Аффинность 2a к тринадцати выбранным рецепторам определяли в анализах связывания радиолиганда, используя стандартные способы фильтрования и подготовки мембран. Данные о связывании анализировали, используя многократную подгонку кривой к логистическому уравнению, содержащему четыре параметра. Значения Ki вычисляли на основе значений IC50, используя уравнение Ченга-Прусофа.
Биохимические исследования in vivo на спонтанно гипертензивных крысах (SHR) и нормальных собаках. В исследовании использовали самцов SHR (15-16-недельного возраста, Charles River, Wilmington, MA). В день исследования животных взвешивали и случайным образом распределяли по группам, получающим либо плацебо (наполнитель), либо соответствующую дозу 2a, 2b или 1. Каждая крыса получала дозу перорально три раза с 12-часовыми интервалами, начиная утром. Чрез 6 часов после третьей дозы крыс анестезировали галотаном, обезглавливали и быстро собирали ткани (коры головного мозга, брыжеечной артерии и левого желудочка), взвешивали, помещали в охлажденную на льду 0,4 М перхлорную кислоту, замораживали в жидком азоте и хранили при -70ºC вплоть до анализа. Концентрации NE и DA в тканях анализировали с помощью ВЭЖХ, используя электрохимическую регистрацию.
В исследовании использовали самцов собак породы бигль (10-16 кг, Marshall Farms USA Inc., North Rose, NY). В день исследования собак взвешивали и случайным образом распределяли на группы, получавшие либо плацебо (пустую капсулу), либо соответствующую дозу 2a. Каждая собака получала дозу два раза в сутки в течение 4,5 суток. Через 6 часов после первой дозы на 5 день собак подвергали эвтаназии пентобарбиталом и быстро собирали ткани (коры головного мозга, почечной артерии, левого желудочка), взвешивали, помещали в охлажденную на льду 0,4 М перхлорную кислоту, замораживали в жидком азоте и хранили при -70ºC вплоть до анализа. Концентрации NE и DA в тканях анализировали с помощью ВЭЖХ, используя электрохимическую регистрацию.
На собаках проводили отдельное исследование, чтобы определить влияние хронического введения 2a на отношение DA/NE в плазме. Животных случайным образом распределяли на группы, получавшие перорально либо плацебо (пустую капсулу), либо 2a (2 мг/кг, дважды в сутки) в течение 14,5 суток. Ежедневно отбирали образцы крови через 6 часов после первой дозы для измерения концентраций DA и NE в плазме. Образцы собирали в пробирки, содержащие гепарин и глутатион, центрифугировали при -4ºC и хранили при -70ºC вплоть до анализа.
Гемодинамическое исследование у SHR. В исследовании использовали самцов SHR (15-16-недельного возраста). Животных подвергали легкой анестезии эфиром и вводили катетеры в левую бедренную артерию и вену для измерения кровяного давления и введения лекарственного средства соответственно. Животных помещали в приспособления для фиксирования и давали возможность восстановиться в течение 30-40 минут. После получения измерений исходного уровня животных обрабатывали перорально либо наполнителем, либо соответствующей дозой 2a и непрерывно регистрировали гемодинамические параметры в течение 4 часов. Затем животных анестезировали пентобарбиталом, помещали на грелку-подушку (37ºC) и вентилировали, используя респиратор для грызунов Harvard. После введения атропина (1 мг/кг, в/в) и тубокурарина (1 мг/кг, в/в) у животных разрушали проводящие пути спинного мозга через орбиту глаза стержнем из нержавеющей стали. Через стержень для разрушения спинного мозга осуществляли стимуляцию электрическими импульсами по 1 мсек и 80 В с разной частотой (0,15, 0,45, 1,5, 5, 15 Гц), чтобы получить кривые зависимости частота-прессорная реакция.
Пример 7
Концентрации дофамина и норэпинефрина определяли в 942 образцах плазмы, собранных от пациентов с застойной сердечной недостаточностью (ЗСН). Цели настоящего исследования:
1) оценить влияние различных доз непикастата на трансмиокардиальные уровни катехоламинов (артерио-коронарный синус) и уровни катехоламинов в коронарном синусе через четыре недели и оценить безопасность и переносимость непикастата в течение 12 недель;
2) оценить влияние непикастата на изменения по сравнению с исходным уровнем:
a) уровней катехоламинов в плазме (венозной) через четыре недели и 12 недель;
b) качества жизни (QoL), симптомов ЗСН, глобальных оценок и класса по NYHA через четыре недели и 12 недель;
c) гемодинамических параметров, включая минутный сердечный выброс, сосудистое системное сопротивление, MVO2, давление в легочной артерии и давление заклинивания в легочной артерии через четыре недели;
d) необходимости в госпитализации и изменения доз лекарственных средств для лечения ЗСН через 12 недель;
e) кровяного давления и частоты сердечных сокращений через четыре и 12 недель;
f) теста с шестиминутной ходьбой через четыре недели и 12 недель;
g) фракции выброса левого желудочка, конечно-систолического объема левого желудочка и конечно-дистолического объема левого желудочка на 12 неделе.
Образцы крови брали у пациентов из периферической вены, при этом они лежали на спине, через 2 часа после введения дозы на 4 и 12 неделе. Кроме того, образцы у пациентов, находящихся в лежачем положении, собирали в 0 день (т.е. день перед началом введения доз) в момент времени, соответствующий 2 часам после введения дозы. Кроме того, группу пациентов подвергали катетеризации, при этом катетеры вводили в правую половину сердца и коронарный синус, на 4 неделе через 2 часа после введения дозы и в 0 день (т.е. день перед началом введения доз) в момент времени, соответствующий 2 часам после ведения дозы. Образцы крови в трех повторах собирали из артериальной вены таких пациентов.
Концентрации свободного основания дофамина и норэпинефрина определяли радиоферментным способом. Способ включает инкубацию образцов плазмы с катехол-O-метилтрансферазой и меченым тритием S-аденозилметионином. После завершения инкубации O-метилированные катехоламины экстрагировали из плазмы способом экстракции жидкости жидкостью и затем разделяли, используя тонкослойную хроматографию. Отмечали соответствующие полосы каждого катехоламина и затем переносили во флаконы для сцинтилляционного счета. Предел количественного определения таким способом составляет 1 пг дофамина или норэпинефрина в миллилитре плазмы. Линейный диапазон составляет от 1 до 333000 пг дофамина или норэпинефрина в миллилитре плазмы, при этом используют аликвоты от 0,045 мл до 1 мл. Полное описание способа можно найти в публикации «Radioenzymatic Microassay for Simultaneous Estimations of Dopamine, Norepinephrine and Epinephrine in Plasma, Urine and Tissues» by Benedict et al. (Clinical Chemistry, Vol. 31, No. 11, 1985, p. 1861-1864).
Объединенный образец плазмы человека использовали в качестве образца для контроля качества (QC) и анализировали один раз каждый день во время стандартного применения способа, чтобы контролировать эффективность способа.
Результаты анализов не рандомизировали, и результаты представлены на фигурах 14-27. После завершения анализа образцов осуществляли оценку результатов. На фигуре 28 показана таблица, в которой представлены данные, которые следует не учитывать при дальнейшем статистическом анализе, с указанием причины такого действия.
Пример 8
Доклинические фармакологические исследования in vitro и in vivo проводили, используя непикастат. В исследованиях in vitro оценивали способность соединения ингибировать активность DBH и аффинность его связывания с выбранными рецепторами. Исследования in vivo подразделяли на четыре категории: 1)биохимические эффекты (т.е. способность снижать уровни норэпинефрина и увеличивать уровни дофамина в тканях), 2) влияние на функции щитовидной железы, 3) влияние на сердечно-сосудистую систему и 4) влияние на поведение.
Непикастат является сильным ингибитором DBH быка и человека. IC50 для непикастата по отношению к DBH человека составляла 9 нМ (CL 6960), значимо ниже, чем для ингибитора DBH SKF 102698 (85 нМ). S-энантиомер RS-непикастата (называемый RS-непикастат-197) был более эффективным, чем R-энантиомер (18 нМ), называемый (R)-5-аминометил-1-(5,7-дифтор-1,2,3,4-тетрагидронафт-2-ил)-2,3-дигидро-2-тиоксо-1H-имидазолгидрохлоридом.
Проводили скрининг аффинности связывания непикастата с выбранными рецепторами. Непикастат имел аффинность связывания менее 5,0 по отношению к M1, D1 и D2 и 5HT1A, 2A и 2C. Содержащий N-ацил метаболит непикастата у крыс и обезьян также не проявлял аффинности связывания с такими рецепторами. Таким образом, непикастат и его первичный метаболит RS-47831-007 не являются сильными ингибиторами перечисленных выше рецепторов.
Реакция сокращения аорты в ответ на фенилэфрин in vitro нарушена у спонтанно гипертензивных крыс (SHR) по сравнению с крысами Wistar-Kyoto с нормальным давлением. Ежедневное лечение непикастатом (10 мг/кг, перорально) крыс SHR в течение 21 дня восстанавливало способность отвечать на фенилэфрин до значений, сравнимых со значениями для крыс Wistar-Kyoto.
В общем, непикастат был эффективным ингибитором DBH у крыс и собак. Пероральное или внутривенное введение приводило к значимому (p<0,05) снижению содержания норэпинефрина, увеличению содержания дофамина и увеличению уровней отношения дофамин/норэпинефрин в тканях сердца, брыжеечной или почечной артерии и коры головного мозга у обоих видов.
В исследованиях с использованием самцов спонтанно гипертензивных крыс (SHR) непикастат значимо снижал уровни норэпинефрина и увеличивал уровни дофамина и отношение дофамин/норэпинефрин в брыжеечной артерии, начиная с 0,5 до 4 часов после перорального или внутривенного введения в дозе 6,2 мг/кг. Значимые изменения таких параметров также наблюдали в левом желудочке самцов крыс Sprague-Dawley через 6 часов после второй из двух внутривенных инъекций (15 мг/кг), вводимых с интервалом 12 часов. Содержание катехоламинов в тканях на протяжении 24 часов исследовали у самцов SHR после перорального введения либо 10, либо 30 мг/кг соответственно. Увеличение отношения дофамин/норэпинефрин было значимым во временной точке 1 час и было длительным (12 часов в случае 10 мг/кг в брыжеечной артерии и 24 часа в случае 30 мг/кг в левом желудочке). Значимые изменения уровней дофамина и норэпинефрина в брыжеечной артерии наблюдали после 10 дней введения самцам крыс Sprague-Dawley доз 2,0 и 6,2 мг/кг перорально дважды в сутки, при этом значимых эффектов не наблюдали в коре головного мозга. У крыс SHR, которым вводили дозы 1 или 10 мг/кг/сутки перорально в течение либо 7, либо 25 дней, наблюдали значимые увеличения уровня дофамина и отношения дофамин/норэпинефрин в брыжеечной артерии и коре головного мозга. Вместе взятые результаты свидетельствуют о том, что непикастат приводил к значимому снижению норэпинефрина и повышению дофамина и отношения дофамин/норэпинефрин в брыжеечной артерии у крыс при остром или хроническом (до 25 дней) введении доз.
Обнаружено, что эффекты непикастата у самцов крыс SHR и Sprague-Dawley зависели от дозы в случае оценки через 6 часов после единичной пероральной дозы 0,3, 1, 3, 10, 30 и 100 мг/кг. У SHR имели место значимые изменения отношения дофамин/норэпинефрин в брыжеечной артерии при использовании дозы 0,3 мг/кг, в левом желудочке при 3,0 мг/кг и в коре головного мозга при 10 мг/кг. У крыс Sprague-Dawley имели место значимые увеличения отношения дофамин/норэпинефрин в брыжеечной артерии при использовании дозы 3,0 мг/кг, в левом желудочке при 1,0 мг/кг и в коре головного мозга только при 100 мг/кг. Во втором исследовании зависимости «доза-ответ» крысам SHR вводили три дозы с 12-часовыми интервалами либо 3,0, 10, 30, либо 100 мг/кг и ткань собирали через шесть часов после третьей дозы. Непикастат вызывал значимое зависимое от дозы снижение уровня норэпинефрина (10 мг/кг) и увеличение уровня дофамина (3,0 мг/кг) и отношения дофамин/норэпинефрин (3,0 мг/кг) в левом желудочке и брыжеечной артерии. Влияние непикастата на концентрации дофамина и норэпинефрина и отношение дофамин/норэпинефрин в коре головного мозга было значимым только при дозах 30 и 100 мг/кг. Сходные значимые зависимые от дозы эффекты в левом желудочке наблюдали у самок крыс Wistar, которым вводили дозы непикастата в течение 7 суток с питьевой водой (0,3, 0,6 и 1,0 мг/мл). Итак, непикастат был менее эффективным в ингибировании DBH в коре головного мозга крыс (60-100 мг/кг/сутки), чем в левом желудочке и брыжеечной артерии (1-6 мг/кг/сутки).
Непикастат (S-энантиомер) был значимо более эффективным, чем R-энантиомер, в левом желудочке и брыжеечной артерии у SHR после трех доз, вводимых с 12-часовыми интервалами (30 мг/кг, перорально). Непикастат был значимо более эффективным, чем ингибитор DBH SKF 102698 в снижении уровня норэпинефрина и увеличении уровня дофамина и отношения дофамин/норэпинефрин в левом желудочке и брыжеечной артерии у SHR после единичной дозы или трех доз по 30 мг/кг. Соотношения эффективностей в левом желудочке и брыжеечной артерии, полученные в указанных исследованиях in vivo, строго соответствовали соотношениям, полученным в исследованиях in vitro с использованием очищенного фермента DBH (см. выше). Однако непикастат оказывал значимо меньшее влияние, чем SKF 102698, в снижении уровней норэпинефрина и увеличении уровней дофамина в коре головного мозга. Показано, что норэпинефрин стимулирует высвобождение ренина и увеличение активности ренина в плазме. Поэтому представляла интерес оценка того, может ли снижение уровней норэпинефрина непикастатом приводить к снижению активности ренина в плазме. Однако непикастат (30 и 100 мг/кг/сутки, перорально в течение 5 суток) не изменял активность ренина в плазме у самцов SHR. Таким образом, непикастат при введении в дозах, которые снижают уровни норэпинефрина в тканях, не изменяет активность ренина в плазме у SHR.
Непикастат вызывал значимое снижение уровней норэпинефрина и увеличение отношения дофамин/норэпинефрин, но не изменял уровни дофамина в брыжеечной артерии самцов собак породы бигль через 5 часов после введения в дозе 30 мг/кг интрадуоденально. Когда непикастат вводили самцам собак породы бигль в течение 4,5 суток (5, 15 и 30 мг/кг дважды в сутки или 10, 30 и 60 мг/кг/сутки), имело место значимое снижение уровня норэпинефрина и увеличение уровня дофамина и отношения дофамин/норэпинефрин в почечной артерии, корковом веществе почки и в мозговом слое почки, при этом ответ выходил на плато, начиная с дозы 10 мг/кг/сутки и продолжаясь при дозе 60 мг/кг/сутки. Сходные результаты наблюдали в левом желудочке, за исключением того, что не было значимого увеличения уровня дофамина. В коре головного мозга уровень норэпинефрина значимо снижался при дозах 30 и 60 мг/кг/сутки, а уровень дофамина и отношение дофамин/норэпинефрин значимо увеличивались при всех дозах. Итак, непикастат является сильным перорально активным ингибитором DBH у собак в дозах, составляющих, по меньшей мере, 10 мг/кг/сутки.
Непикастат имеет структурное сходство с метимазолом, сильным ингибитором пероксидазы щитовидной железы in vivo. Непикастат в дозах 4 или 12,4 мг/кг/сутки, перорально, не оказывал влияния на уровни в сыворотке трийодтирамина или тироксина у самцов крыс Sprague-Dawley, которых кормили кормом с низким содержание йода и вводили дозы в течение 10 суток, тогда как метимазол (2 мг/кг/сутки) значимо уменьшал уровни в сыворотке трийодтирамина или тироксина. Таким образом, непикастат в отличие от метимазола не влиял на уровни в сыворотке трийодтирамина или тироксина.
Непикастат индуцировал значимый противогипертонический эффект в течение 4 часов у находящихся в сознании ограниченных в движении SHR (1,0-30 мг/кг, перорально) и значимо уменьшал частоту сердечных сокращений (10 и 30 мг/кг). Противогипертоническое действие непикастата у находящихся в сознании, ограниченных в движении крыс SHR (10 мг/кг, перорально) не было ослаблено предварительной обработкой антагонистом рецепторов дофамина (DA-I) SCH-23390. Непикастат (10 мг/кг) также снижал кровяное давление через 4 часа после введения дозы у находящихся в сознании, ограниченных в движении крыс Wistar-Kyoto, имеющих нормальное давление; однако снижение давления было меньше (-13 мм Hg), чем у SHR (-46 мм Hg). Полученные результаты, вместе взятые, свидетельствуют, что непикастат вызывает снижение кровяного давления и у крыс SHR, и у крыс с нормальным давлением, хотя противогипертоническое действие было более выражено у SHR. Противогипертоническое действие у SHR, по-видимому, не опосредовано рецепторами DA-I.
Непикастат также значимо снижал гипертензивные и тахикардические реакции в ответ на стимуляцию преганглионарных симпатических нервов у SHR с разрушенными проводящими путями спинного мозга через 5 часов после введения дозы (3 мг/кг перорально). Таким образом, непикастат уменьшает повышение кровяного давления в ответ на стимуляцию симпатических нервов.
Острое внутривенное лечение анестезированных SHR непикастатом (3,0 мг/кг, внутривенно) снижало среднее артериальное давление в течение 3-часового периода, но не снижало почечный кровоток или не изменяло образование мочи или выделение с мочой натрия или калия. Рассчитанное сопротивление сосудов почки снижалось после введения дозы. Была предпринята попытка использовать антагонист DA-I SCH-23390 для оценки того, опосредовано ли сосудорасширяющее действие непикастата в почках рецепторами DA-I. Однако указанное соединение снижало кровяное давление при введении отдельно, таким образом, делая невозможной интерпретацию результатов. В общем, непикастат не нарушал функцию почек у анестезированных крыс SHR и не снижал почечный кровоток, несмотря на то что он вызывал снижение артериального кровяного давления.
Ежедневная обработка непикастатом (1 и 10 мг/кг, перорально) у SHR в течение 21 дня не изменяла частоту сердечных сокращений или систолическое кровяное давление, измеряемое непрямым способом с использованием хвостовой манжеты. Однако непикастат (10 мг/кг, перорально) индуцировал значимый противогипертонический эффект, когда крыс ограничивали в движении и их кровяное давление измеряли непосредственно через артериальную канюлю.
Непикастат значимо снижал кровяное давление у SHR, измеряемое с помощью телеметрических датчиков кровяного давления, в дозах 30 и 100 мг/кг/сутки в течение 30 суток, но не вызывал значимых эффектов в дозах 3 и 10 мг/кг/сутки. Эффекты в случае доз 30 и 100 мг/кг/сутки длились на протяжении 24-часового периода после введения единичной дозы, и утраты эффекта не наблюдали на протяжении 30 суток. Частота сердечных сокращений не возрастала и моторная активность не подвергалась влиянию. Сочетание дозы ингибитора ангиотензин-превращающего фермента эналаприла (1 мг/кг, перорально), которая не могла снизить кровяное давление, с непикастатом (30 мг/кг) вызывало усиление противогипертонических эффектов непикастата в течение 30 суток дозирования и приводило к значимому снижению массы левого желудочка. Уменьшение массы левого желудочка не происходило при действии только одного эналаприла. Таким образом, 30-дневное лечение SHR непикастатом в дозе 30 и 100 мг/кг/сутки приводило к снижению кровяного давления и в сочетании с эналаприлом дополнительно снижало кровяное давление наряду с уменьшением массы левого желудочка.
Снижающее кровяное давление действие непикастата у крыс Wistar с нормальным давлением, снабженных радиотелеметрическими датчиками кровяного давления, было меньше, чем эффект, наблюдаемый у крыс SHR в случае доз 30 и 100 мг/кг/сутки в течение 7 суток. При использовании дозы 30 мг/кг/сутки пиковое снижение кровяного давления составляло -10 мм Hg по сравнению с -20 у SHR. При дозе 100 мг/кг/сутки пиковое снижение кровяного давления составляло -17 мм Hg по сравнению с -42 у SHR. Таким образом, непикастат оказывал более значительное понижающее кровяное давление действие у крыс SHR, чем у крыс с нормальным давлением.
Исследования у нормальных анестезированных собак показали отсутствие сердечно-сосудистых эффектов непикастата после острого внутривенного введения доз (1-10 мг/кг, внутривенно) без изменений артериального давления, давления в левом желудочке (включая максимальное значение dp/dt), частоты сердечных сокращений, минутного сердечного выброса или почечного кровотока в течение периода времени, составляющего до пяти часов, после введения дозы. Сходное отсутствие эффекта наблюдали у хронически обследуемых с помощью аппаратуры находящихся в сознании собак в течение 12 часов после единичной дозы (3-30 мг/кг внутривенно).
Непикастат (30 мг/кг интрадуоденально) не вызывал значимого ингибирования ни снижения почечного кровотока в ответ на прямую стимуляцию почечных нервов, ни увеличения артериального давления в ответ на окклюзию сонной артерии вплоть до 5 часов после введения дозы анестезированным самцам собак породы бигль. Однако непикастат вызывал значимое снижение уровней норэпинефрина и увеличение отношения дофамин/норэпинефрин, но не уровней дофамина в брыжеечной артерии через 5 часов после введения дозы. Таким образом, хотя уровни норэпинефрина в тканях были значимо снижены, не было значимого ингибирования индуцируемых симпатической нервной системой функциональных ответов.
Когда непикастат вводили самцам собак породы бигль в течение 4,5 суток в дозе 10 мг/кг/сутки, не было статистически значимого снижения степени повышения кровяного давления и частоты сердечных сокращений в ответ на окклюзию сонной артерии у анестезированных животных. Обработка непикастатом значимо уменьшала повешение частоты сердечных сокращений в ответ на внутривенное введение тирамина, но вызывала только слабое и не значимое ингибирование повышения кровяного давления. Таким образом, хроническое введение непикастата в дозе, которая, как было показано, приводит к максимальному снижению уровней норэпинефрина в тканях, не оказывало большого ингибирующего влияния на индуцируемые симпатической нервной системой функциональные ответы.
Непикастат не оказывал значимого влияния на грубое моторное поведение у мышей после введения высоких доз 1,0-30 мг/кг перорально и не влиял на локомоторную активность у мышей (10-100 мг/кг внутрибрюшинно). Введение высоких доз крысам не влияло на локомоторную активность или реакцию вздрагивания на акустический сигнал (3-100 мг/кг внутрибрюшинно).
Не наблюдали воздействия на поведение крыс после 10 дней введения доз 10, 30 и 100 мг/кг/сутки перорально (AT 6867). Также не наблюдали влияния на ректальную температуру. Моторная активность и рефлекс вздрагивания на акустические сигналы значимо снижались при обработке ингибитором DBH SKF102698 (100 мг/кг/сутки, перорально) и агонистом α-адренергических рецепторов центрального действия клонидином (20 мг/кг, дважды в сутки, перорально). Моторная активность также не изменялась на протяжении 30 суток введения доз крысам SHR (3-100 мг/кг/сутки, перорально) (AT 6829). Таким образом, непикастат не вызывал регистрируемых изменений поведенческих эффектов, опосредованных центральной нервной системой, у крыс.
Непикастат является сильным конкурирующим ингибитором DBH человека in vitro, а у крыс и собак in vivo. У крыс пероральная обработка непикастатом приводила к появлению значимых признаков ингибирования DBH в сердце и брыжеечной артерии в дозе 6 мг/кг/сутки. В отличие от другого ингибитора DBH, SKF 102698, непикастат проявлял некоторую избирательность по отношению к левому желудочку и брыжеечной артерии по сравнению с корой головного мозга. Не наблюдали влияния непикастата на поведение крыс. У собак зависимость ингибирования DBH в виде плато наблюдали в случае дозы 10 мг/кг/сутки в сердце, почечной артерии и почке; была идентифицирована минимальная доза для значимого эффекта, непикастат значимо снижал гипертензивный ответ на стимуляцию симпатических нервов у крыс (3 мг/кг перорально) и значимо снижал кровяное давление на протяжении суток в случае введения дозы один раз в сутки (30 мг/кг/сутки перорально) в течение 30 суток у SHR. В заключение, непикастат является сильным ингибитором DBH, который модулирует действие симпатической нервной системы.
Пример 9
Исследования, описанные в настоящем примере, были направлены на оценку фармакокинетики более высоких пероральных доз непикастата, чтобы сравнить фармакокинетику у самцов и самок крыс и чтобы определить проникновение непикастата в ЦНС посредством количественной оценки уровней непикастата в головном мозге.
Самцов крыс (CrI: CD BR Vaf+) массой 180-220 г не кормили в течение ночи перед введением доз и 4 часа после введения дозы. Дозы готовили в воде, содержащей 2% 1-гидроксипропилметилцеллюлозы (вязкость 50 сантипуаз), 1% бензилового спирта и 0,6% Tween 80 (все реагенты получены из Sigma Chemical Company). Концентрация лекарственного средства в растворах доз составляла 5, 15 и 50 мг/мл для доз 10, 30 и 100 мг/кг соответственно и была подтверждена с помощью жидкостной хроматографии (ЖХ). Доза 5 мг/мл представляла собой прозрачный раствор, а более высокие концентрации выглядели как прозрачная суспензия. Объемы доз составляли 2,0 мл/кг. В разных временных точках после введения доз получали образцы крови с помощью пункции сердца гепаринизированными шприцами и получали плазму, используя центрифугирование. Головной мозг крыс вырезали хирургическим путем и все образцы замораживали при -20ºC вплоть до анализа.
Аликвоты плазмы (0,05 или 0,5 мл) смешивали с внутренним стандартом (50 мкл метанола, содержащего 5 мкг/мл монофтор-содержащего аналога непикастата и 5 мг/мл дитиотреитола). Образцы смешивали с 200 мМ натрий-фосфатного буфера, pH 7,0, (0,5 мл) и экстрагировали 3 мл смеси этилацетат/гексан (1/1, об./об.). Органическую фазу, содержащую определяемые в анализе вещества, снова экстрагировали 250 мкл 250 мМ уксусной кислоты и аликвоты водной фазы объемом 100 мкл анализировали с помощью ЖХ. В системе ЖХ использовали колонку C8 Keystone Hypersil BDS, 15 см, при температуре окружающей среды. Подвижная фаза A представляла собой 12,5 мМ фосфат калия, pH 3,0, с 5 мМ додекансульфоновой кислоты, и подвижная фаза B представляла собой ацетонитрил. Композиция растворителей содержала 40% B, и ее прокачивали со скоростью 1 мл/мин. Регистрацию осуществляли по УФ-поглощению при 261 нм. Концентрации аналитов определяли на основе стандартной кривой, полученной при анализе плазмы необработанных крыс с добавлением известных концентраций аналита. Данные о концентрации в плазме выражены в виде микрограмм (свободного основания) в миллилитре.
Головной мозг в течение короткого периода времени промывали физиологическим раствором, промокали бумажным полотенцем, затем взвешивали (1,5-2,0 г). Добавляли внутренний стандарт (50 мкл метанола, содержащего 20 мкг/мл монофтор-содержащего аналога непикастата) и головной мозг гомогенизировали в 5 мл 200 мМ фосфата натрия, pH 7,0, содержащего 0,5 мг/мл дитиотреитола. Аликвоты гомогената (2 мл) экстрагировали, используя 10 мл смеси этилацетат/гексан (1/1, об./об.). Органическую фазу осторожно подвергали повторной экстракции, используя 150 мкл 250 мМ уксусной кислоты.
После добавления к водной фазе 100 мкл метанола (чтобы диспергировать эмульсию) аликвоты объемом 100 мкл анализировали с помощью ЖХ, как описано для плазмы. Уровни в головном мозге выражены в виде микрограмм (свободного основания) на грамм ткани головного мозга.
Фармакокинетические параметры рассчитывали на основании средних концентраций в плазме. Время полужизни в плазме (T1/2) вычисляли как 0,693/β, где β означает константу скорости элиминации, определяемую на основании данных линейной регрессии зависимости log концентрации в плазме от времени в пределах конечной линейной части данных. Площади под кривой зависимости концентрации в плазме от времени (AUC) от нуля до момента времени последней количественно определяемой концентрации в плазме вычисляли по правилу трапеции. AUC нуля до бесконечности (AUCобщая) вычисляли как:
AUCобщая=AUC (0-Cпоследняя)+Cпоследняя/β, где Cпоследняя означает последнюю количественно определяемую концентрацию в плазме.
На фигуре 29 показаны фармакокинетические параметры непикастата в плазме и головном мозге крыс.
Концентрации непикастата в плазме самцов крыс, получавших единичные пероральные дозы 10, 30 или 100 мг/кг, показаны на фигурах 30-32 и изображены на графике на фигуре 33. Концентрации непикастата в плазме увеличивались с возрастанием дозы, и зависимость между AUCобщая и дозой была линейной (фигура 34). Период полуэлиминации, по-видимому, немного увеличивался при более высоких дозах (1,70, 2,09 и 3,88 часа после пероральной дозы 10, 30 и 100 мг/кг у самцов крыс соответственно). После введения пероральной дозы непикастата 30 мг/кг самкам крыс AUCобщая для непикастата в плазме была на 77% больше у самок крыс, чем у самцов крыс, получавших эквивалентную дозу непикастата (фигуры 33 и 35). Уровни непикастата в головном мозге (выраженные в мкг/г) сначала были ниже, чем уровни в плазме (выраженные в мкг/мл). Однако, начиная с момента 2 часов после введения дозы, концентрации непикастата в головном мозге превышали концентрации в плазме (фигуры 36-37).
Уровни непикастата в плазме самцов крыс возрастали с увеличением доз от 10 до 100 мг/кг на основании значений AUCобщая.
Уровни непикастата в плазме были выше у самок крыс, чем у самцов крыс после введения пероральной дозы 30 мг/кг.
После введения пероральной дозы непикастата 10 мг/кг самцам крыс уровни непикастата в головном мозге сначала были ниже, чем уровни в плазме, но через 2 часов уровни непикастата в головном мозге были выше, чем в плазме.
Пример 10
Целью настоящего исследования было определение 24-часовой временной зависимости влияния непикастата (10 мг/кг) на уровни дофамина и норэпинефрина в брыжеечной артерии после единичной пероральной дозы у спонтанно гипертензивных крыс. Уровни катехоламинов измеряли через 1, 2, 4, 6, 8, 12, 16 и 24 часа после единичного перорального введения либо непикастата (10 мг/кг), либо наполнителя (дH2O; 10 мл/кг).
Самцам спонтанно гипертензивных крыс (SHR) 16-17-недельного возраста массой 300-400 грамм давали корм и воду без ограничения. Животных взвешивали и вечером перед исследованием случайным образом распределяли в одну из следующих групп обработки (n=9 на группу): единичное пероральное введение непикастата в дозе 10 мг/кг или единичное пероральное введение наполнителя (10 мл/кг) для забоя во временных точках 1, 2, 4, 6, 8, 12, 16 или 24 часа. Непикастат синтезировали в виде гидрохлоридной соли в Institute of Organic Chemistry, Syntex Discovery Research и получали из Syntex Central Compound Inventory. Непикастат растворяли в наполнителе (дH2O), получая пероральную дозу, которую можно было вводить многократно в объеме 10 мл/кг. Все дозы непикастата вводили в эквивалентах свободного основания и готовили утром в день введения. Животным вводили дозу поминутно утром в день забоя. Во временных точках 1, 2, 4, 6, 8, 12, 16 и 24 часа после введения 9 обработанных животных и 9 животных, получавших наполнитель, анестезировали галотаном, обезглавливали и быстро собирали левые желудочки и брыжеечные артерии и взвешивали. Брыжеечную артерию помещали в 0,5 мл 0,4 М перхлорной кислоты в центрифужной пробирке, а левый желудочек помещали в пустую пробирку для кризаморозки. Обе ткани немедленно замораживали в жидком азоте и хранили при -70ºC. Уровни катехоламинов в брыжеечной артерии определяли, используя ВЭЖХ с электрохимическим детектированием. В момент обезглавливания брали образцы плазмы, посредством сливания крови из тушки в пробирку, содержащую гепарин, и центрифугирования при 4ºC.
Каждую группу обработки сравнивали с группой, получавшей наполнитель, в каждой временной точке. Осуществляли двухфакторный дисперсионный анализ (ANOVA), оценивающий эффекты обработки, сбора и их взаимодействие. Однофакторный ANOVA с использованием фактора обработки осуществляли для каждой временной точки сбора. Попарный анализ обработанных животных и животных, получавших наполнитель, в каждой временной точке осуществляли, используя способ Фишера LSD, чтобы контролировать вероятность ошибочного решения. Уровни норэпинефрина были значимо (p<0,05) ниже, чем в случае использования только наполнителя во временной точке 4 часа. Уровни были ниже (0,05<p<0,1) во временной точке, соответствующей 6 часам (фиг. 38). Уровни дофамина были значимо (p<0,05) выше, чем уровни в случае использования наполнителя, во временных точках сбора 2 и 6 часов (фиг. 39). Отношение дофамин/норэпинефрин было значимо (p<0,05) выше, чем такое отношение у животных, обработанных наполнителем, во временных точках 1, 2, 4, 6 и 12 часов (фиг. 40).
В общем, непикастат оказывал некоторое статистически значимое влияние на уровни норэпинефрина или дофамина в брыжеечной артерии после единичного перорального введения в дозе 10 мг/кг спонтанно гипертензивным крысам в точках 1, 2, 4, 6, 8, 12, 16 или 24 часа после введения дозы. Однако соответственное увеличение отношений дофамин/норэпинефрин наблюдали, главным образом, в первые 12 часов обработки. Во временных точках сбора 16 и 24 часа не наблюдали изменений ни в одном из трех параметров.
Пример 11
Целью настоящего исследования было определение влияния внутривенного введения непикастата (далее называемого непикастатом) на уровни дофамина и норэпинефрина в левом желудочке крыс Sprague-Dawley. Животные получали два внутривенных (в/в) введения с 12-часовым интервалом либо наполнителя (75% пропиленгликоль + 25% ДМСО; 1,0 мл/кг), либо 15 мг/кг непикастата. Уровни норэпинефрина и дофамина в ткани измеряли через шесть часов после последнего введения соединения.
Самцам крыс Sprague-Dawley 16-17-недельного возраста массой 300-400 грамм давали корм и воду без ограничения. Животных взвешивали и вечером перед исследованием случайным образом распределяли в одну из следующих групп обработки (n=10 на группу): наполнитель (1 мл/кг) или непикастат в дозе 15 мг/кг. Непикастат синтезировали в Institute of Organic Chemistry, Syntex Discovery Research и получали из Syntex Central Compound Inventory. Непикастат растворяли в наполнителе (75% пропиленгликоль + 25% ДМСО), получая объем дозы 1,0 мл/кг. Непикастат вводили в эквивалентах свободного основания и готовили вечером перед первым введением.
Каждой крысе вводили дозу внутривенно в хвостовую вену вечером перед сбором. Введение дозы повторяли через 12 часов на следующее утро. Через шесть часов после последнего введения крыс анестезировали галотаном, обезглавливали и быстро собирали левые желудочки и взвешивали. Желудочек помещали в 1,0 мл охлажденной на льду перхлорной кислоты. Ткани немедленно замораживали в жидком азоте и хранили при -70ºC. Концентрации дофамина и норэпинефрина в ткани анализировали, используя высокоэффективную жидкостную хроматографию с электрохимическим детектированием.
Однофакторный дисперсионный анализ (ANOVA), оценивающий основной эффект обработки, осуществляли для норэпинефрина. Критерий Краскала-Уоллиса использовали для дофамина и их отношения, главным образом вследствие неоднородной дисперсии данных в группах обработки. Последующие попарные сравнения между крысами, обработанными непикастатом, и крысами, обработанными наполнителем, осуществляли используя критерий Фишера LSD. Корректировку Бонферрони осуществляли при всех p-значениях, чтобы гарантировать общую вероятность ошибки типа 1 принятия решения («пропуск цели») 5%.
Непикастат, вводимый в дозе 15 мг/кг, значимо (p<0,01) снижал уровни норэпинефрина на 51% (фигура 41), значимо (p<0,01) повышал уровни дофамина на 472% (фигура 42) и значимо (p<0,01) увеличивал отношение дофамин/норэпинефрин на 1117% (фигура 43) по сравнению с животными, обработанными наполнителем.
Итак, внутривенное введение непикастата приводило к значимому ингибированию DBH в левом желудочке крыс Sprague-Dawley.
Пример 12
В настоящем исследовании анализировали эффективность непикастата в изменении уровней дофамина и норэпинефрина в коре головного мозга, левом желудочке и брыжеечной артерии самцов спонтанно гипертензивных крыс (SHR). Животные получали три дозы с 12-часовыми интервалами: 3, 10, 30 или 100 мг/кг, перорально.
В настоящем исследовании также сравнивали эффективность S-энантиомера (непикастата) с R-энантиомером ((R)-5-аминометил-1-(5,7-дифтор-1,2,3,4-тетрагидронафт-2-ил)-2,3-дигидро-2-тиоксо-1H-имидазолгидрохлоридом) после трех доз (30 мг/кг).
В настоящем исследовании также сравнивали эффекты непикастата и SKF 102698, ингибитора DBH, который, как показано ранее, является перорально активным у крыс.
Соединения готовили и вводили в виде эквивалента свободного основания. Непикастат, (R)-5-аминометил-1-(5,7-дифтор-1,2,3,4-тетрагидронафт-2-ил)-2,3-дигидро-2-тиоксо-1H-имидазолгидрохлорид и SKF 102698 получали из Syntex Central Compound Inventory. Непикастат растворяли в соответствующем количестве наполнителя (дH2O) в случае непикастата и ПЭГ 400:дH2O, 50:50 об.:об. в случае SKF102698. Дозы 3, 10, 30 и 100 мг/кг непикастата и 30 мг/кг SKF 102698 готовили в объемах дозирования 10,0 мл/кг.
Самцам спонтанно гипертензивных крыс (SHR) (Charles River Labs) 15-16-недельного возраста давали корм и воду без ограничения. Животных взвешивали и случайным образом распределяли в одну из следующих групп обработки: 1) наполнитель дистиллированная вода (дH2O) или непикастат в дозе 3, 10, 30 и 100 мг/кг, 2) (R)-5-аминометил-1-(5,7-дифтор-1,2,3,4-тетрагидронафт-2-ил)-2,3-дигидро-2-тиоксо-1H-имидазолгидрохлорид в дозе 30 мг/кг в дистиллированной воде или 3) наполнитель ПЭГ 400:дH2O или RS-2643 1-000 в дозе 30 мг/кг. Каждая крыса получала пероральную дозу (перорально с использованием иглы для искусственного питания) три раза с 12-часовыми интервалами, начиная утром. Через шесть часов после третьей дозы крыс анестезировали галотаном, обезглавливали и быстро собирали кору головного мозга, брыжеечную артерию и левый желудочек, взвешивали, помещали в охлажденную на льду 0,4 М перхлорную кислоту, замораживали в жидком азоте и хранили при -70ºC. Концентрации дофамина и норэпинефрина в тканях анализировали высокоэффективной жидкостной хроматографией, используя электрохимическую регистрацию.
Проводили четыре серии статистического анализа. В первой серии сравнивали крыс, обработанных разными дозами непикастата и (R)-5-аминометил-1-(5,7-дифтор-1,2,3,4-тетрагидронафт-2-ил)-2,3-дигидро-2-тиоксо-1H-имидазолгидрохлоридом в дозе 30 мг/кг, с контрольными животными, обработанными наполнителем. Непараметрический однофакторный дисперсионный анализ (ANOVA) с использованием фактора «доза» и фактора объединения данных в блоки «день» проводили для каждой ткани и линии отдельно. Представлены общие результаты. Попарный анализ между обработанными животными и контролями в случае каждой дозы осуществляли, используя критерий Даннета, чтобы контролировать вероятность ошибочного решения. Во втором статистическом тесте сравнивали SKF 102698 с группой, обработанной наполнителем ПЭГ-дH2O, используя непараметрический t-критерий. В третьем статистическом тесте сравнивали (R)-5-аминометил-1-(5,7-дифтор-1,2,3,4-тетрагидронафт-2-ил)-2,3-дигидро-2-тиоксо-1H-имидазолгидрохлорид с непикастатом в дозе 30 мг/кг, используя непараметрический t-критерий. В четвертом статистическом анализе сравнивали RS25560-197 с SKF 102698 в дозе 30 мг/кг. Так как использовали два разных наполнителя, то вычисляли линейный контраст, который позволяет найти разницу между полученными различиями следующим образом:
Изменение=(30 мг/кг-наполнитель)непикастат-(30 мг/кг-наполнитель)SKF102698
Указанная новая переменная была проверена в отношении равенства нулю способом общих линейных моделей SAS.
Все данные на фигурах представлены с указанием ± стандартного отклонения.
Концентрация дофамина в коре головного мозга была значимо (p<0,05) выше (фигура 44), концентрация норэпинефрина была значимо (p<0,05) ниже (фигура 45) и отношения дофамин/норэпинефрин были значимо (p<0,05) больше (фигура 46), чем при использовании наполнителя, при дозах непикастата 30 и 100 мг/кг.
Концентрация дофамина в левом желудочке была значимо (p<0,05) выше, чем в случае наполнителя, при использовании доз 3, 10, 30 и 100 мг/кг (фигура 47). Концентрация норэпинефрина была значимо (p<0,05) ниже, чем в случае наполнителя, при использовании доз 10, 30 и 100 мг/кг (фигура 48). Отношение дофамин/норэпинефрин в левом желудочке было значимо (p<0,05) больше, чем в случае наполнителя, при использовании доз непикастата 3, 10, 30 и 100 мг/кг (фигура 49).
Концентрация дофамина в брыжеечной артерии SHR была значимо (p<0,05) выше, чем в случае наполнителя при использовании доз 3, 10, 30 и 100 мг/кг (фигура 50). Концентрация норэпинефрина не была значимо меньше (p>0,05), чем в случае наполнителя, при использовании доз 10, 30 и 100 мг/кг (фигура 51). Отношения дофамин/норэпинефрин в брыжеечной артерии были значимо (p<0,05) больше, чем в случае наполнителя при всех дозах непикастата (фигура 52).
В коре головного мозга по сравнению с обработкой наполнителем (R)-5-аминометил-1-(5,7-дифтор-1,2,3,4-тетрагидронафт-2-ил)-2,3-дигидро-2-тиоксо-1H-имидазолгидрохлорид приводил к значимому увеличению уровней как дофамина (фигура 53), так и норэпинефрина (фигура 54) (p<0,01) и не влиял на отношение дофамин/норэпинефрин (фигура 55). Уровни норэпинефрина были значимо ниже при использовании непикастата по сравнению с использованием (R)-5-аминометил-1-(5,7-дифтор-1,2,3,4-тетрагидронафт-2-ил)-2,3-дигидро-2-тиоксо-1H-имидазолгидрохлорида (p<0,01) (фигура 54).
В левом желудочке по сравнению с обработкой наполнителем (R)-5-аминометил-1-(5,7-дифтор-1,2,3,4-тетрагидронафт-2-ил)-2,3-дигидро-2-тиоксо-1H-имидазолгидрохлорид приводил к значимому повышению уровня дофамина (фигура 56) и увеличению отношения дофамин/норэпинефрин (фигура 58) (p<0,01), но значимо не снижал уровни норэпинефрина (фигура 57). Непикастат был значимо более эффективным (p<0,01), чем (R)-5-аминометил-1-(5,7-дифтор-1,2,3,4-тетрагидронафт-2-ил)-2,3-дигидро-2-тиоксо-1H-имидазолгидрохлорид в снижении уровней норэпинефрина (фигура 57) и повышении уровней дофамина и отношения дофамин/норэпинефрин (фигуры 56 и 58).
В брыжеечной артерии по сравнению с обработкой наполнителем (R)-5-аминометил-1-(5,7-дифтор-1,2,3,4-тетрагидронафт-2-ил)-2,3-дигидро-2-тиоксо-1H-имидазолгидрохлорид приводил к значимому увеличению уровня дофамина (фигура 59) и отношения дофамин/норэпинефрин (фигура 61) (p<0,01), но значимо не снижал уровни норэпинефрина (фигура 60). Непикастат был значимо более эффективным (p<0,01), чем (R)-5-аминометил-1-(5,7-дифтор-1,2,3,4-тетрагидронафт-2-ил)-2,3-дигидро-2-тиоксо-1H-имидазолгидрохлорид в снижении уровней норэпинефрина (фигура 60) и повышении уровней дофамина и отношения дофамин/норэпинефрин (фигуры 59 и 61).
При сравнении непикастата с SKF 102698 в дозе 30 мг/кг в коре головного мозга концентрация дофамина в коре головного мозга была значимо выше (p<0,01) по сравнению с обработкой наполнителем в случае использования SKF 102698 в дозе 30 мг/кг (фигура 53). Увеличение по сравнению с обработкой наполнителем было выше в случае SKF102698, чем в случае непикастата (p<0,01). Концентрация норэпинефрина была значимо ниже по сравнению с обработкой наполнителем в случае SKF 102698, и снижение было больше в случае SKF 102698, чем в случае непикастата (p<0,01) (фигура 44). Отношения дофамин/норэпинефрин в коре головного мозга были значимо (p<0,01) выше по сравнению с обработкой наполнителем в случае SKF 102698 (фигура 55), и увеличение по сравнению с обработкой наполнителем было выше в случае SKF 102698, чем в случае непикастата (p<0,01).
Концентрация дофамина в левом желудочке была значимо выше (p<0,01) по сравнению с обработкой наполнителем в случае использования SKF 102698 (фигура 56), и увеличение по сравнению с обработкой наполнителем было выше в случае непикастата, чем в случае SKF 102698 (p<0,01). Концентрация норэпинефрина не отличалась от концентрации при использовании наполнителя в случае обработки SKF 102698, однако обработка непикастатом значимо снижала уровни норэпинефрина по сравнению с обработкой наполнителем в большей степени, чем в случае SKF 102698 (p<0,01) (фигура 57). Отношения дофамин/норэпинефрин в левом желудочке были значимо (p<0,05) выше по сравнению с обработкой наполнителем в случае использования SKF102698 (фигура 58), и увеличение по сравнению с обработкой наполнителем было больше в случае непикастата, чем в случае SKF 102698 (p<0,05).
Концентрация дофамина в брыжеечной артерии была значимо выше по сравнению с обработкой наполнителем в случае использования SKF 102698 (фигура 59), и увеличение по сравнению с обработкой наполнителем было больше в случае непикастата, чем в случае SKF 102698. Концентрация норэпинефрина была значимо ниже по сравнению с обработкой наполнителем при обработке SKF 102698, и обработка непикастатом значимо снижала уровни норэпинефрина по сравнению с обработкой наполнителем в большей степени, чем в случае SKF102698 (фигура 60). Отношения дофамин/норэпинефрин в левом желудочке были значимо выше по сравнению с обработкой наполнителем в случае SKF 102698 (фигура 61), и увеличение по сравнению с обработкой наполнителем было больше в случае непикастата, чем в случае SKF 102698.
Итак, данные показывают, что непикастат является сильным ингибитором DBH in vivo в брыжеечной артерии, левом желудочке и коре головного мозга SHR через шесть часов после третьей из трех пероральных доз, вводимых с 12-часовыми интервалами. S-энантиомер, непикастат, был более эффективным, чем R-энантиомер ((R)-5-аминометил-1-(5,7-дифтор-1,2,3,4-тетрагидронафт-2-ил)-2,3-дигидро-2-тиоксо-1H-имидазолгидрохлорид), во всех трех тканях в дозе 30 мг/кг. Кроме того, непикастат был более эффективным, чем SKF 102698, в брыжеечной артерии и левом желудочке, но менее эффективным в коре головного мозга после трех доз по 30 мг/кг, вводимых в течение 24 часов.
Пример 13
Непикастат готовили и вводили в эквиваленте свободного основания. Непикастат и метимазол растворяли в наполнителе (66,7% пропиленгликоль:33,3% дH20), получая растворы доз в соответствующих концентрациях, так что все дозы можно было вводить в объеме 1,0 мл/кг.
Самцов крыс Sprague-Dawley массой 180-200 грамм содержали на диете с низким содержанием йода (Purina, 5891C, Lot 1478, 0,066±0,042 мг йода/кг образца) без ограничения 14 дней перед обработкой. Животных взвешивали и случайным образом распределяли в одну из следующих групп обработки (n=12 на группу): непикастат в дозе 2,0 мг/кг, непикастат в дозе 6,2 мг/кг, R, метимазол в дозе 1 мг/кг или наполнитель 1 мл/кг. Каждая группа крыс получала пероральную дозу вечером и на следующее утро, примерно с интервалом в 12 часов на протяжении 10 дней.
Через четыре часа после второй дозы на 10 день крыс анестезировали галотаном, обезглавливали и собирали и взвешивали кору головного мозга, полосатое тело и брыжеечную артерию. Образцы тканей не собирали из групп, обработанных метимазолом, так как они служили только в качестве позитивных контролей для определения функции щитовидной железы. Брыжеечную артерию, кору головного мозга и полосатое тело немедленно помещали в 0,4 М охлажденную на льду перхлорную кислоту и анализировали в отношении уровней норэпинефрина и дофамина в тот же день, используя ВЭЖХ.
Образцы крови из орбитального синуса отбирали на -3, 0, 3, 7 и 9 день (0 день является первым днем введения дозы). Образцы сыворотки анализировали в отношении уровней T3 и T4, используя радиоиммуноанализ.
Чтобы статистически оценить изменения уровней T3 и T4, рассчитывали изменение по сравнению с исходным уровнем во временной точке -3 день. Проводили непараметрический двухфакторный внутригрупповой дисперсионный анализ (ANOVA). Также осуществляли однофакторный ANOVA для определения того, имеется ли значимое отличие от контроля. Осуществляли попарные анализы между контролями и каждой группой обработки, используя способ LSD Фишера, чтобы контролировать вероятность ошибочного решения. Для статистического анализа уровней катехоламинов осуществляли однофакторный ANOVA, используя фактор «доза». Попарные анализы между группами обработки и контролями для каждой дозы осуществляли, используя способ LSD Фишера, чтобы контролировать вероятность ошибочного решения.
Уровни норэпинефрина в коре головного мозга обработанных непикастатом животных значимо не отличались (p>0,05) от обработанного наполнителем контроля при использовании доз 2,0 и 6,2 мг/кг. Уровни норэпинефрина в брыжеечной артерии были значимо (p<0,05) ниже в группах, получавших дозы 2,0 и 6,2 мг/кг, и уровни норэпинефрина в полосатом теле были в небольшой степени (p<0,10) ниже в обеих группах, получавших дозы 2,0 и 6,2 мг/кг, по сравнению с контрольной группой, обработанной наполнителем (фигура 62).
Уровни дофамина во всех трех тканях в группах, получавших дозу непикастата либо 2,0, либо 6,2 мг/кг, значимо не отличались (p>0,05) от контроля, для которого использовали наполнитель (фигура 62).
Отношение дофамин/норэпинефрин в коре головного мозга и полосатом теле в случае доз 2,0 и 6,2 мг/кг RS-25560-197 значимо не отличалось (p>0,05) от основанного на наполнителе контроля, тогда как отношение в брыжеечной артерии при использовании непикастата в дозе 2,0 и 6,2 мг/кг было значимо (p<0,05) выше, чем в контроле, в котором использовали наполнитель (фигура 62).
Дозы непикастата 2,0 или 6,2 мг/кг не влияли на функцию щитовидной железы по данным изменения уровней свободного T3 или общего T4 в сыворотке крыс. Доза 1,0 мг/кг метимазола, позитивного контроля, значимо (p<0,05) снижала уровни T3 на протяжении всех дней обработки (фигура 63) и уровни T4 на 3 и 7 день (фигура 64) по сравнению контролем, в котором использовали обработку наполнителем. Уровни T4 у обработанных метимазолом животных были только незначительно (p<0,10) ниже на девятый день.
Непикастат (2,0 или 6,2 мг/кг) не вызывал никаких значимых (p>0,05) изменений уровней дофамина, или норэпинефрина, или отношения дофамин/норэпинефрин по сравнению с наполнителем. В полосатом теле наблюдали малозначимое (p<0,10) снижение уровня норэпинефрина в группе, получавшей дозу 6,2 мг/кг, но других значимых изменений не наблюдали. В брыжеечной артерии обе дозы непикастата, 2,0 и 6,2 мг/кг, вызывали значимо (p<0,05) более низкие уровни норэпинефрина и значимо (p<0,05) более высокое отношение дофамин/норэпинефрин по сравнению с контролем, без значимых изменений уровней дофамина. Таким образом, непикастат, по-видимому, является эффективным ингибитором дофамин-β-гидроксилазы in vivo, при этом более сильное влияние наблюдается в брыжеечной артерии, чем в коре головного мозга или полосатом теле, после 10 дней введения доз крысам Sprague-Dawley.
Пример 14
Настоящее исследование осуществляли для того, чтобы определить концентрации дофамина и норэпинефрина в мозговом слое почки и корковом веществе почки собак, которым вводили дозы непикастата. Взрослых самцов собак породы бигль случайным образом распределяли на четыре группы по 8 собак на группу и перорально вводили дозы непикастата. Непикастат вводили в дозах 5, 15 и 30 мг/кг, помещенный в отдельные капсулы. Наполнителем служила пустая капсула. Каждая собака получала 2 дозы ежедневно, утром и вечером (с интервалом 8-10 часов) в течение четырех суток. На пятый день каждая собака получала одну дозу утром, и собак подвергали эвтаназии через шесть часов после последней дозы. Образцы мозгового слоя почки и коркового вещества почки быстро собирали, взвешивали, помещали в холодную 0,4 М перхлорную кислоту, замораживали в жидком азоте и хранили при -70ºC.
Чтобы количественно оценить концентрации норэпинефрина (NE) и дофамина (D), каждую ткань гомогенизировали краткосрочной обработкой ультразвуком в 0,4 М перхлорной кислоте. После ультразвуковой обработки гомогенаты центрифугировали при 13000 об/мин в микроцентрифуге в течение 30 минут при 4°C. Аликвоту каждого надосадка извлекали и в нее добавляли 3,4-дигидроксибензиламин (DHBA) в качестве внутреннего стандарта. Экстракт из каждого образца подвергали разделению с помощью ВЭЖХ и использованием электрохимической регистрации. Способ имеет количественный предел определения 2,0 нг/мл и линейный диапазон от 2,0 нг/мл до 400 нг/мл для каждого аналита.
Результаты анализов представлены на фигурах 65 и 66. Каждое определение аналита нормализовали по отношению к массе образца ткани и выражали в микрограммах аналита на грамм ткани. В таблицах указаны концентрации дофамина, норэпинефрина и отношения концентрации дофамина к концентрации норэпинефрина (D/NE), полученные для каждой собаки. Кроме того, рассчитанные средние значения и стандартные отклонения для каждого аналита и отношение D/NE представлены для каждой группы обработки.
Пример 15
В исследовании использовали самцов собак породы бигль (Marshall farms, North Rose, NY) массой 9-16 кг. Животные получали воду без ограничения, а корм получали один раз в сутки в ~10,00 утра. Животных случайным образом распределяли в одну из следующих групп обработки (n=8/группу): плацебо (пустая капсула) или непикастат в дозе 2 мг/кг дважды в сутки (4 мг/кг/сутки). Каждое животное получало 2 дозы ежедневно, утром и вечером (с интервалом 8-10 часов). Ежедневные образцы крови (10 мл) брали через 6 часов после утренней дозы для измерения уровней непикастата и катехоламинов в плазме. Кровь собирали в пробирки, содержащие гепарин и глутатион, и центрифугировали при -4ºC, вся процедура сбора занимала около 1 часа. Плазму отделяли и делили на два образца, один для измерения катехоламинов в плазме, а другой для анализа непикастата.
Также от собак получали образцы ткани в конце исследования в том случае, когда считали необходимым анализ катехоламинов в ткани в последней точке. На 15 день через 6 часов после утренней дозы брали конечный образец крови (10 мл). Собак анестезировали пентобарбиталом натрия (40 мг/кг, внутривенно), помещали на стол для вскрытия и подвергали эвтаназии с помощью второй инъекции пентобарбитала (80 мг/кг, внутривенно). Осуществляли быструю билатеральную транс-торакотомию и разрез брюшной стенки. Брали биопсии из почечной артерии и левого желудочка. Череп вскрывали, чтобы обнажить лобную долю коры головного мозга и взять биопсию. Образцы ткани взвешивали, помещали в охлажденную на льду 0,4 М перхлорную кислоту, замораживали в жидком азоте и хранили при -70ºC вплоть до анализа.
NE, DA и EPI в плазме анализировали, используя ВЭЖХ с электрохимическим детектированием. Концентрацию непикастата в плазме определяли с помощью ВЭЖХ с электрохимическим детектированием.
Преобразования Бокса-Кокса показали, что логарифм является подходящим преобразованием, стабилизирующим дисперсию; поэтому все анализы осуществляли, используя log-значения. BQL (нижний предел количественного определения) концентрации дофамина у собаки 1 на 10 день был принят равным 0; 1n(0) было задано как отсутствие. Анализ осуществляли, используя смешанную модель (используя PROC MIXED), при этом фиксированными категориальными переменными были день и обработка, а собака в пределах обработки была случайным фактором. В случае фиксированных эффектов включали взаимодействие между днем и обработкой, так как различие между группами, получавшими лекарственное средство и плацебо, варьировали в разные дни. Контрасты вычисляли, используя оператор CONTRAST, который корректно учитывает остаточные члены для каждого конкретного контраста. В частности, контрасты, сравнивающие группу обработки с группой лекарственного средства, используют средний квадрат фактора «собака» для его остаточного члена, тогда как сравнения, используемые для установления стационарного состояния, все являются сравнениями внутри групп собак и требуют среднего квадрата ошибки.
Период времени стационарного состояния вычисляли, используя преобразование Гельмерта (см. руководство SAS PROC GLM). Такие преобразования сравнивают каждое среднее значение обработки со средним из средних значений обработки во временных точках, следующих далее. Стационарный период определяют для того, чтобы начать в первой временной точке после максимального времени, в котором контраст Гельмерта является статистически значимым. Однако в связи с тем, что такой способ не может выявить гладко меняющийся процесс, который, по-видимому, может иметь место в данном случае, также вычисляли наклон концентрации аналита в стационарном периоде. Наклон в стационарном периоде вычисляли для каждой собаки отдельно, получая один наклон на животное. Затем вычисляли одномерную статистику для наклонов, при этом доверительные интервалы нормальной теории были построены на среднем наклоне, и была проверена гипотеза равного нулю наклона и вычислено p-значение нормальной теории. Такой анализ наклона использовали в качестве основы для определения того, являлся ли стационарный период периодом изменения концентрации.
При сравнении с группой, получавшей плацебо, показано, что непикастат (2 мг/кг, дважды в сутки) вызывал значимое снижение в плазме NE (в 2,1 раза) и EPI (в 1,91 раза) и значимо увеличивал уровень в плазме DA (в 7,5 раз) и отношение DA/NE (в 13,6 раз) (см. фигуру 67-71). Максимальные снижения NE и EPI в плазме наблюдали на 6 день и 8 день соответственно, тогда как максимальные увеличения в плазме DA и отношения DA/NE наблюдали на 7 день и 6 день соответственно. Влияние на NE, DA и EPI в плазме достигало стационарного уровня примерно на 4, 8 и 6 день введения доз соответственно. Изменения в плазме DA и отношения DA/NE значимо отличались от плацебо во все дни после введения доз. Изменения в плазме NE значимо отличались от плацебо на 4-9 день и 11-13 день после введения доз. Изменения в плазме EPI значимо отличались от плацебо на 7-9 день и 12 день после введения доз.
Введение непикастата (2 мг/кг, дважды в сутки) давало значимые уровни в плазме собаки в течение всех дней (фигура 72). Максимальные уровни наблюдали на 2 день после введения дозы. Не выявлено значимых уровней N-ацетил-содержащего метаболита непикастата ни в один из дней.
Хроническое (14,5 дней) введение непикастата (2 мг/кг, дважды в сутки, перорально) вызывало значимое снижение в плазме NE и EPI и значимое увеличение в плазме DA и отношения DA/NE. Указанные изменения отражают ингибирование симпатоадреналовой системы посредством ингибирования фермента дофамин-β-гидроксилазы.
Пример 16
Непикастат взвешивали и помещали в капсулы (размер 13 - Torpac; East Hanover, NJ), получая дозы 5, 15 и 30 мг/кг в капсуле (капсулы давали дважды в сутки, получая дозы 10, 30 и 60 мг/кг/сутки). Исходную массу собак использовали для определения дозы для каждого животного. Собакам, получавшим 0 мг/кг/сутки, давали пустые капсулы (плацебо). Все дозы непикастата вводили в эквивалентах свободного основания.
Тридцать две собаки породы бигль массой 10-12 кг случайным образом распределяли на 4 следующие группы обработки (n=8 на группу): непикастат в дозе 0 мг/кг/сутки (плацебо), 10 мг/кг/сутки (5 мг/кг дважды в сутки), 30 мг/кг (15 мг/кг дважды в сутки) или 60 мг/кг/сутки (30 мг/кг дважды в сутки). Собаки с номерами 1-16 входили в группу дозирования A, собаки с номерами 17-32 входили в группу дозирования B. Заключительные хирургические операции для сбора тканей проводили в течение 2 дней, при этом в день исследовали 16 собак. За 2 или 3 дня до первого введения соединения каждую собаку взвешивали и брили области кожи, покрывающие обе головные вены, подкожную и яремную вены. Дозирование состояло из перорального введения одной капсулы, через 8-10 часов после которой вводили вторую капсулу. Собакам вводили дозы по схеме в 1-3 дни. На 4 день перед введением утренней дозы брали 3 мл крови из яремной вены для определения исходных уровней соединения в плазме. Затем собаке вводили утреннюю дозу и через 1, 2, 4 и 8 часов после введения дозы брали по 3 мл дополнительных образцов крови для определения уровней соединения в плазме. Образцы крови помещали в пробирки, содержащие гепарин, центрифугировали при 4ºC и хранили при -20ºC вплоть до анализа. Затем вводили вечернюю дозу согласно схеме. В день хирургической операции водили утреннюю дозу согласно схеме. Примерно через 6 часов после утренней дозы брали конечный образец крови объемом 3 мл из яремной вены для определения уровней соединения в плазме. Затем собаку анестезировали пентобарбиталом Na (~40 мг/кг), вводимым внутривенно в головную или подкожную вену и переносили в комнату для вскрытия, где вводили дополнительную дозу пентобарбитала Na (~80 мг/кг, внутривенно). Затем быстро извлекали левый желудочек, почечную артерию, почку, мозговой слой почки, корковое вещество почки и кору головного мозга, взвешивали, помещали в 2 мл охлажденной на льду 0,4 М перхлорной кислоты, замораживали в жидком азоте и хранили при 70ºC вплоть до анализа в отношении катехоламинов с помощью ВЭЖХ, используя электрохимическую детекцию. Все образцы тканей делили на 2 части, вторую часть немедленно замораживали в жидком азоте и хранили при -70ºC для определения уровней соединения в ткани. Третий образец стенки левого желудочка немедленно замораживали в жидком азоте и хранили при -70ºC для использования в исследованиях связывания рецептора.
Желудочки гомогенизировали в буфере, содержащем 50 мМ трис-HCl, 5 мМ Na2EDTA (pH 7,4 при 4ºC), используя дезинтегратор ткани Polytron P-10 (параметр установки 10, 2 импульса по 15 секунд). Гомогенаты центрифугировали при 500×g в течение 10 минут и надосадки хранили на льду. Осадки промывали, ресуспендируя и центрифугируя при 500×g и надосадки объединяли. Объединенные надосадки центрифугировали при 48000×g в течение 20 минут. Осадки промывали, ресуспендируя и центрифугируя один раз в буфере для гомогенизации и два раза в буфере, содержащем 50 мМ трис-HCl, 0,5 мМ EDTA (pH 7,4 при 4ºC). Мембраны хранили при -70ºC до необходимости в их использовании. Эксперименты по насыщению проводили, используя [3H]-CGP-12177 в буфере, содержащем 50 мМ трис-HCl, 0,5 мМ EDTA (pH 7,4 при 32ºC). Неспецифичное связывание определяли, используя 10 мкМ изопротеренол. Готовили пробирки для определения общего связывания, неспецифичного связывания и общего счета для восьми концентраций [3H]-CGP-12177 в диапазоне от 0,016 нМ до 2 нМ. Образцы инкубировали при 32ºC в течение 60 минут. Образцы фильтровали через плоские фильтры из стекловолокна GF/B, предварительно обработанные 0,1% PEI, используя устройство для сбора клеток Brandel. Образцы промывали водой комнатной температуры три раза по 3 секунды. Сцинтилляционную жидкость аквазол добавляли в каждый флакон и определяли радиоактивность, используя жидкостной сцинтилляционный счетчик. Изотермы насыщающего связывания анализировали после пересчета общих концентраций лиганда в концентрации свободного лиганда (общий-связанный=свободный). Отдельные изотермы насыщения были получены для каждой ткани. Мембраны анализировали в отношении белка, используя способ связывания белка Bio-Rad и используя гамма-глобин в качестве стандарта. Плотности рецепторов выражали на мг белка в виде среднего значения для каждой группы обработки. Уровни катехоламинов в тканях анализировали, сравнивая группы, обработанные непикастатом, с группами, обработанными плацебо (контроль). Непараметрический однофакторный дисперсионный анализ (ANOVA) с использованием фактора «доза» осуществляли для каждой ткани и каждого измерения катехоламинов отдельно. Парные анализы обработанных групп и контролей для каждой дозы осуществляли, используя критерий Даннета, чтобы контролировать вероятность ошибочного решения. Критерий Стьюдента-Ньюмана-Кейлса и критерий LSD Фишера использовали для проверки достоверности. Анализ уровней соединения в ткани и плазме осуществляли 2 путями. Во-первых, использовали отдельные t-критерии для сравнения каждого уровня дозы с факторизованным уровнем сравниваемой в паре дозы для каждого параметра. Например, трехкратный уровень соединения, присутствующего в случае дозы 10 мг/кг в конкретной ткани или в плазме, должен быть сравним с уровнем соединения, наблюдаемым в группе, обрабатываемой дозой 30 мг/кг. Кроме того, вычисляли линейный ортогональный контраст для всех трех доз в контексте однофакторного ANOVA. Использовали попарный t-тест, чтобы определить какие-либо различия в связывании между группой обработки наполнителем и группой обработки непикастатом в дозе 10 мг/кг/сутки.
В почечной артерии непикастат, вводимый в дозах 10, 30 и 60 мг/кг/сутки, значимо (p<0,01) снижал уровни норэпинефрина на 86%, 81% и 85% соответственно (фигура 73). Уровни дофамина были значимо (p<0,01) повышены при дозах 10, 30 и 60 мг/кг/сутки на 180%, 273% и 268% соответственно (фигура 74). Дозы 10, 30 и 60 мг/кг/сутки непикастата значимо (p<0,01) увеличивали отношение дофамин/норэпинефрин на 1711%, 1767% и 1944% соответственно, по сравнению с плацебо (фигура 75).
После введения непикастата в дозе 10 и 60 мг/кг/сутки уровни дофамина значимо (p<0,01) возрастали, 632% и 411% соответственно в коре головного мозга (фигура 76). Отношение дофамин/норэпинефрин значимо (p<0,01) увеличивалось до 531% после введения непикастата в дозе 10 мг/кг/сутки и до 612% после введения 60 мг/кг/сутки непикастата (фигура 78). Уровни норэпинефрина значимо (p>0,01) изменялись при указанных 2 дозах (фигура 77). В случае дозы 30 мг/кг/сутки уровень норэпинефрина значимо (p<0,01) снижался на 63%, а отношение значимо (p<0,01) увеличивалось на 86%, тогда как уровни дофамина возрастали менее значимо (0,05<p<0,10) до 174% по сравнению с плацебо (фигуры 76-78). После введения непикастата в дозе 10, 30 и 60 мг/кг/сутки уровни норэпинефрина значимо (p<0,01) снижались на 85%, 58% и 79% соответственно в левом желудочке (фигура 80). Отношение дофамин/норэпинефрин значимо (p<0,01) увеличивалось, 852%, 279% и 607% соответственно, по сравнению с животными, получавшими плацебо (фигура 81). Не наблюдали значимых изменений уровней дофамина в случае использования 10, 30 и 60 мг/кг/сутки непикастата (фигура 79).
В корковом веществе почки по сравнению с плацебо уровни норэпинефрина значимо снижались (p<0,01) на 86%, 66% и 85 соответственно после доз непикастата 10, 30 и 60 мг/кг/сутки (фигура 83). Уровни дофамина значимо (p<0,01) возрастали, 156%, 502% и 208% соответственно, при указанных дозах (фигура 82). Отношение дофамин/норэпинефрин значимо (p<0,01) увеличивалось, на 1653%, 1440% и 1693% соответственно, при дозах 10, 30 и 60 мг/кг/сутки (фигура 84). В мозговом слое почки отношения дофамин/норэпинефрин значимо (p<0,01) возрастали на 555%, 636% и 677% соответственно, при дозах непикастата 10, 30 и 60 мг/кг/сутки по сравнению с плацебо (фигура 87). Уровни дофамина значимо (p<0,01) возрастали на 522% в случае дозы 30 мг/кг/сутки и менее значимо (0,05<p<0,10) возрастали, 150% и 156% соответственно, при 10 и 60 мг/кг/сутки (фигура 85). Уровни норэпинефрина значимо (p<0,01) снижались на 72% после введения 10 мг/кг/сутки непикастата по сравнению с плацебо и менее значимо (0,05<p<0,10) снижались на 69% после введения 60 мг/кг/сутки (фигура 86).
Статистический анализ показал, что концентрация непикастата в плазме, полученная на 4 день, и в ткани и в плазме, полученная на 5 день, была пропорциональна в случае сравнения каждого уровня дозы с факторизованными уровнями сравниваемой в паре дозы. Поэтому точки доз определяли как линейные, за следующими исключениями (значимый результат может свидетельствовать о том, что данные являются нелинейными):
мозговой слой почки: 3×10<30 (p<0,05);
мозговой слой почки: 6×10<60 (p=0,077);
плазма (4 день): 2×30>60 (p=0,076).
На 5 день уровни непикастата во всех исследованных тканях были выше, чем уровни в плазме (фигуры 88-90).
Результаты показали отсутствие различия между образцами левого желудочка из группы, обработанной 10 мг/кг/сутки непикастата, и группы, обработанной наполнителем (фигура 91).
Пример 17
Оценивали активность непикастата в отношении ряда ферментов, включая тирозингидроксилазу, синтазу NO, фосфодиэстеразу III, фосфолипазу A2, нейтральную эндопептидазу, Ca2+/кальмодулин-зависимую протеинкиназу II, ацетил-CoA-синтетазу, ацилтрансферазу ацил-CoA-холестерина, HMG-CoA-редуктазу, протеинкиназу (неселективную) и циклооксигеназу-I. Как показано на фигуре 92, непикастат имел IC50>10 мкМ в случае всех 12 исследованных ферментов, поэтому является высокоизбирательным (>1000-кратным) ингибитором дофамин-β-гидроксилазы.
Пример 18
DBH быка из надпочечников получали из Sigma Chemical Co (St Louis, MO). Секретируемую DBH человека очищали из культуральной среды линии клеток нейробластомы SK-N-SH и использовали для получения данных об ингибировании. Колонку с сефарозой, на которой иммобилизован лектин чечевицы, содержащую 35 мл геля, готовили и уравновешивали, используя 50 мМ KH2PO4, pH 6,5, 0,5 M NaCl. Колонку элюировали 35 мл раствора, содержащего 10% метил-α,D-маннопиранозид в 50 мМ KH2PO4, pH 6,5, 0,5 M NaCl, со скоростью 5 мл/мин. Фракции, содержащие большую часть ферментативных активностей, объединяли и концентрировали, используя ячейку с мешалкой Amicon и мембрану YM30. Метил-α,D-маннопиранозид удаляли посредством замены буфера на 50 мМ KH2PO4, pH 6,5, 0,1 М NaCl. Концентрированный раствор фермента делили на аликвоты и хранили при -25°C.
Анализ ВЭЖХ использовали для измерения активности DBH, используя тирамин и аскорбат в качестве субстратов. Способ основан на разделении и количественной оценке тирамина и октопамина обращенно-фазовой ВЭЖХ-хроматографией (Feilchenfeld, N. B., Richter, H. & Waddell, W.H. (1982). Anal. Biochem: A time-resolved assay of dopamine β-hydroxilase activity utilizating high-pressure liquid chromatography. 122: 124-128.). Анализ осуществляли при pH 5,2 и 37°C в растворе, содержащем 0,125 М NaAc, 10 мМ фумарата, 0,5-2,0 мкМ CuSO4, 0,1 мг/мл каталазы (6500 единиц, Boeringer Mannheim, Indianapolis, IN), 0,1 мМ тирамина и 4 мМ аскорбата. В типичном анализе 0,5-1,0 миллиединиц фермента добавляли к реакционной смеси и затем добавляли субстратную смесь, содержащую каталазу, тирамин и аскорбат, чтобы инициировать реакцию (конечный объем 200 мкл). Образцы инкубировали при 37°C в течение 30-40 минут. Реакции гасили раствором для остановки реакции, содержащим 25 мМ EDTA и 240 мкМ 3-гидрокситирамин (внутренний стандарт). Образцы (150 мкл) загружали в автоматическое устройство для отбора проб Gilson и анализировали посредством ВЭЖХ с использованием УФ-детекции при 280 нм. Компьютерную программу PC-1000 (Thermo Separations products, Fremont, CA) использовали для сбора и анализа данных. ВЭЖХ осуществляли, устанавливая расход 1 мл/мин, используя колонку LiChroCART 125-4 RP-18 и изократическое элюирование раствором, содержащим 10 мМ уксусную кислоту, 10 мМ 1-гептансульфоновую кислоту, 12 мМ фосфат тетрабутиламмония и 10% метанол. Остаточную активность в процентах вычисляли на основе контроля без ингибитора, корректировали с использованием внутренних стандартов и подгоняли к нелинейной кривой зависимости «доза-ответ» по 4 параметрам, получая значения IC50.
Очистка [ 14 C]-тирамина. Гидрохлорид [14C]-тирамина очищали на колонке C18 с небольшой загрузкой (две колонки объединяли в одну), которую промывали 2 мл MeOH, 2 мл 50 мМ KH2PO4, pH 2,3, 30% ацетонитрилом и затем 4 мл 50 мМ KH2PO4, pH 2,3. Использовали вакуумный коллектор (Speed Mate 30, из Applied Separations) для промывки и элюирования колонки с использованием вакуума. После загрузки [14C]тирамина колонку промывали 6 мл 50 мМ KH2PO4, pH 2,3, и элюировали 2 мл 50 мМ KH2PO4, содержащего 30% ацетонитрила. Элюат подвергали лиофилизации, чтобы удалить ацетонитрил, ресуспендировали в H2O и хранили при -20°C.
Анализ ферментов радиоактивным способом. Ферментативную активность анализировали, используя [14C]тирамин в качестве субстрата и колонку C18 для отделения продукта. Анализ осуществляли в объеме 200 мл, содержащем 100 мМ NaAc, pH 5,2, 10 мМ фумаровой кислоты, 0,5 мкМ CuSO4, 4 мМ аскорбиновой кислоты, 0,1 мг/мл каталазы и различные концентрации тирамина. Общий счет каждой реакционной смеси составлял -150000 имп./мин. DBH быка (0,18 нг для каждой реакции) смешивали с тирамином и ингибитором в буфере для проведения реакции при 37°C. Реакцию инициировали добавлением смеси аскорбат/каталаза и инкубировали при 37°C в течение 30 минут. Реакцию останавливали добавлением 100 мл 25 мМ EDTA, 50 мМ KH2PO4, pH 2,3. Всю смесь загружали на колонку C18 для небольшой загрузки (две объединяли в одну), которую предварительно промывали MeOH и уравновешивали 50 мМ KH2PO4, pH 2,3. Элюирование во флаконы для сцинтилляции осуществляли, дважды используя по 1 мл буфера KH2PO4, pH 2,3, затем 2 мл такого же буфера. Во флаконы для сцинтилляции добавляли сцинтилляционную жидкость ReadySafe (16 мл) и образцы считали в отношении 14C-радиоактивности.
Концентрации непикастата 0, 1, 2, 4, 8 нМ использовали для исследования кинетики ингибирования при следующих концентрациях тирамина: 0,5, 1, 2, 3, 4 мМ. 14C-счет был идентичным в каждой реакции, осуществляемой, как описано выше. Пустой контроль без фермента использовали для получения фона. Данные корректировали по отношению к фону, преобразовали в активность, выраженную в нмоль/мин, и изображали графически (1/V в зависимости от 1/S). Km вычисляли на основе наклонов и отрезков, отсекаемых на оси Y, и использовали линейную регрессию для получения значения Ki.
Значения IC50 для SKF102698, непикастата и (R)-5-аминометил-1-(5,7-дифтор-1,2,3,4-тетрагидронафт-2-ил)-2,3-дигидро-2-тиоксо-1H-имидазолгидрохлорида по отношению к DBH человека и быка получали, используя анализ ВЭЖХ при концентрации субстратов 0,1 мМ тирамина, 4 мМ аскорбата при pH 5,2 и 37ºC. Все три соединения вызывали зависимое от дозы ингибирование активности DBH как в случае фермента быка, так и в случае фермента человека (фигуры 93 и 94).
Значения IC50 для непикастата, (R)-5-аминометил-1-(5,7-дифтор-1,2,3,4-тетрагидронафт-2-ил)-2,3-дигидро-2-тиоксо-1H-имидазолгидрохлорида и SKF 102698 приведены на фигуре 95. S-энантиомер (непикастат) был в 3 раза более эффективным, чем R-энантиомер ((R)-5-аминометил-1-(5,7-дифтор-1,2,3,4-тетрагидронафт-2-ил)-2,3-дигидро-2-тиоксо-1H-имидазолгидрохлорид, против DBH быка и в 2 раза против фермента человека. Непикастат был в 8 раз более эффективнее, чем SKF 102698, против фермента быка и в 9 раз против DBH человека.
На фигуре 96 показаны график Лайнуивера-Берка для данных ингибирования DBH быка (верхняя панель) и график кажущейся Km в зависимости от концентрации ингибитора (нижняя панель). На основании графика определено значение Km, равное 0,6 мМ. Непикастат (1-8 нМ) вызывал большой сдвиг Km, который можно прогнозировать для конкурентного ингибитора. Ингибирование DBH быка непикастатом, по-видимому, является конкурентным с действием тирамина. Значение Ki 4,7±0,4 нМ вычисляли, используя линейную регрессию.
Непикастат является сильным ингибитором DBH человека и быка. Он в 8-9 раз более эффективен, чем SKF 102698. Непикастат (S-энантиомер) в 2-3 раза более эффективен, чем (R)-5-аминометил-1-(5,7-дифтор-1,2,3,4-тетрагидронафт-2-ил)-2,3-дигидро-2-тиоксо- 1H-имидазолгидрохлорид (R-энантиомер). Ингибирование DBH быка непикастатом, по-видимому, конкурирует с действием тирамина, при этом Ki составляет 4,7±0,4 нМ.
Пример 19
Аффинность непикастата определяли в анализах связывания, описанных на фигуре 97. Использовали стандартные способы, основанные на связывании радиолиганда при фильтровании.
Данные конкурентного связывания анализировали подгонкой построенной итеративно кривой к логистическому уравнению, содержащему четыре параметра. Прямым способом получали коэффициенты Хилла и IC50. pKi (-log Ki)конкурирующих лигандов вычисляли на основании значений IC50, используя уравнение Ченга-Прусофа.
Непикастат обладал умеренной аффинностью к альфа1-рецепторам (pKi 6,9-6,7). Аффинность по отношению ко всем другим исследованным рецепторам была относительно низкой (pKi<6,2) (фигура 98).
Пример 20
Наполнитель и порошкообразный моногидрат непикастата получали из Center for Pharmaceutical Development, Syntex Preclinical Research and Development. Во время внесения дозы готовили композицию непикастата в концентрации 60-мг/мл смешиванием наполнителя с порошком непикастата с последующим встряхиванием. Композиции, имеющие концентрацию непикастата 6 и 20 мг/мл, готовили разведением композиции 60 мг/мл наполнителем. Композиции, содержащие перерастворенный непикастат, сохраняли эффективность на протяжении всего применения. Водный наполнитель и композиции непикастата содержали гидроксипропилметилцеллюлозу, бензиловый спирт и полисорбат 80.
Выбор дозы был основан на исследовании острой токсичности, в котором мышам вводили единичные пероральные дозы 250, 1000 или 2500 мг/кг непикастата. Клинические признаки токсичности и смерть наблюдали при дозах 1000 и 2500 мг/кг.
Единичную пероральную дозу наполнителя или композицию непикастата вводили каждой мыши посредством принудительного питания, используя интубатор для грызунов. Пероральный путь был выбран потому, что он является предполагаемым клиническим путем введения. Объемы доз вычисляли на основе индивидуальной массы тела, регистрируемой перед введением доз (данные о массе тела не приведены в таблице в данной публикации). Корм и воду переставали давать мышам за 2,5-3,5 часа перед введением доз, вместо 1,5 часов, как указано в протоколе. Указанное отклонение не влияло на достоверность исследования.
Результаты клинического обследования регистрировали перед введением доз. Начиная с 60 минут после введения дозы мышей в каждой группе обработки оценивали группами до 3 мышей на протяжении интервала времени, составляющего примерно 10 минут, проводя клиническое обследование и указанные в протоколе поведенческие тесты.1 Одна мышь в группе, получавшей 30 мг/кг, и 1 мышь в группе, получавшей 100 мг/кг, погибли после введения дозы, и они были исключены из исследования. Выживших мышей подвергали эвтаназии и выводили из исследования в конце периода обследования/тестирования.
Мышам в группах по 6 самцов вводили единичные пероральные дозы 0 (наполнитель), 30, 100 или 300 мг/кг непикастата, используя зонд для принудительного питания. Клиническое обследование и поведенческие тесты начинали через 60 минут после введения тестируемой композиции. В конце обследования всех выживших мышей подвергали эвтаназии и выводили из исследования.
В группах мышей, которым вводили дозы 30, 100 и 300 мг/кг, были более низкие температуры тела по сравнению с контрольной группой, которым вводили наполнитель. Не выявлено связанных с обработкой клинических изменений или изменений в грубом поведении. Данные о ректальных температурах суммированы на фигуре 99; данные обследования и поведенческих тестов суммированы на фигуре 100. Не выявлено связанных с обработкой клинических изменений или изменений грубого поведения (см. фигуры 101-103). Образование аномальных социальных групп (что указано как другая реакция) происходит у мышей в группе, получавшей дозу 100 мг/кг, но не в группе, получавшей 300 мг/кг; такой результат считали случайным. Клинические/поведенческие изменения у 1 мыши в группе, получавшей 100 мг/кг, включали отсутствие активности, нарушение походки и позы, пониженную индуцированную активность, аномальную пассивность и издавание слабого/непрерывного звука; указанные изменения не приписывали действию непикастата. По одной мыши в каждой из групп обработки 30 и 100 мг/кг погибали после внесения дозы; их гибель считали случайной и мышей исключали из исследования.
Пример 21
Целью настоящего исследования было определение того, вызывают ли DBHI, SKF-102698 и непикастат изменения локомоторной активности или реакции вздрагивания на акустический сигнал. Изменения в указанных видах поведения могут отражать активность таких соединений в центральной нервной системе.
Взрослых самцов крыс Sprague Dawley (250-350 г в день исследования) получали из Charles Rivers Labs. Крыс содержали в условиях нормального цикла освещение/темнота, при этом период освещениия начинался в 09-00 часов и продолжался до 21-00 часа. Животных содержали парами в стандартных клетках из металлической проволоки и давали корм и воду без ограничения.
Камеры для определения локомоторной активности состояли из плексигласа и имели размеры 18"×18" (45,72 см×45,72 см) и высотой 12" (30,48 см). Вокруг камер из плексигласа располагали мониторы Omnitech Digiscan (модель № RXXCM 16), которые состояли из однодюймового (2,54 см) группирователя световых лучей и фотосенсоров в количестве 32 на камеру. Количество прерываний световых лучей анализировали с использованием анализатора Omnitech Digiscan (модель № DCM-8). Животных тестировали в закрытом помещении с генератором белого шума, работающим для того, чтобы замаскировать внешний шум.
Тесты реакции вздрагивания на акустический сигнал проводили, используя восемь автоматизированных испытательных установок SR-Lab (San Diego Instruments, San Diego, CA). Крыс помещали по отдельности в цилиндр из плексигласа (диаметром 10 см), который держали в вентилируемой уменьшающей звук камере. Импульсы акустического шума (широкополосный шум со временем нарастания и временем спада 1 мсек) подавали через громкоговоритель, установленный на 30 см выше животного. Пьезоэлектрический акселерометр преобразует движения субъекта в произвольное напряжение по шкале от 0 до 4095.
Перед введением лекарственного средства каждую из семидесяти двух крыс помещали в устройство для измерения вздрагиваний и после 5-минутного периода адаптации на них действовали импульсами акустического шума каждые 20 секунд в течение 15 минут (всего 45 пугающих импульсов). Среднее значение реакции вздрагивания вычисляли для каждой крысы, учитывая среднее значение реакции вздрагивания после импульсов 11-45 (первыми десятью реакциями вздрагивания можно пренебречь). Затем шестьдесят четыре крысы помещали в одну из восьми групп обработки так, чтобы каждая группа обработки имела сходное среднее значение реакции вздрагивания. Использовали следующие восемь групп обработки: SKF-102698 (100 мг/кг) и наполнитель для него (50% вода/50% полиэтиленгликоль), клонидин (40 мкг/кг), непикастат (3, 10, 30 и 100 мг/кг) и наполнитель для него дH2O. В предыдущей работе показано, что такой способ сопоставления является наиболее подходящим для оценки реакций вздрагивания, так как существует значительная вариабельность в реакции вздрагивания у крыс, но существует высокая степень соответствия между группами крыс изо дня в день.
Каждый день после такого тестирования восьми крысам (по одной крысе из каждой из восьми групп обработки) инъецировали лекарственное средство в соответствии с группой обработки и сразу же помещали поодиночке в камеру для определения моторной активности. Моторную активность крыс контролировали в течение четырех часов. Затем крыс помещали в клетку для переноса на пятнадцать минут. В начале указанного пятнадцатиминутного периода крыса, которая относилась к группе обработки клонидином, получала другую инъекцию 40 мкг/кг. Затем крыс помещали в устройство для оценки реакции вздрагивания и после пятиминутного периода акклиматизации на крыс действовали звуковым импульсом 90 дБ каждую минуту в течение четырех часов.
Чтобы оценить моторную активность, измеряли горизонтальную активность (количество пересеченных лучей), количество передвижений и время покоя. Каждый параметр анализировали отдельно. Для каждого временного интервала (или названного образца) осуществляли двухфакторный дисперсионный анализ (ANOVA), используя ранжированные данные (непараметрический способ), чтобы проверить эффект обработки при объединении данных в блоки по дням. Также осуществляли парные сравнения 4 RS-обработанных групп с контролем, обработанным наполнителем, используя t-критерий Даннета.
Чтобы оценить способность к реакции вздрагивания в течение 200 миллисекунд, непосредственно следующих после испуга, измеряли среднюю силу, проявляемую каждой испуганной крысой на протяжении всех 200 миллисекунд, и максимальную силу. Средние значения максимального и среднего напряжений (MAXMEAN и AVGMEAN) рассчитывали для каждой обработки (TREAT) в каждом испытании (TRIALN) и затем полученные значения откладывали на графике против номера испытания для каждой обработки. Графики приложены к описанию. Испытания 1-60 отнесены к временному периоду 1, испытания 61-120 к временному периоду 2, испытания 121-180 к временному периоду 3 и испытания 181-240 к временному периоду 4. Средние значения максимальной и средней реакции вздрагивания вычисляли в пределах каждого временного периода и для каждой обработки. Затем средние значения использовали в статистическом анализе. Реакции вздрагивания анализировали, используя ковариационный анализ. Для исследователей интерес представляли сравнения обработок в пределах временного периода, а не эффекты времени в пределах группы обработки. Поэтому реакции вздрагивания анализировали по времени. Модель включала члены, имеющие отношение ко дню тестирования крысы (дате), реакции вздрагивания исходного уровня и обработке. Дата была фактором объединения данных в блоки, а реакция вздрагивания исходного уровня ковариатой. Использовали три отдельные модели для каждой из указанных выше целей. Различные дозы непикастата сравнивали с контролем, используя методику Даннета для проверки множественных сравнений.
Результаты анализов 3 параметров (горизонтальной активности, количества передвижений и времени покоя) представлены на фигурах 104-115. Графики для каждого параметра, в зависимости от времени в часах по группам обработки, изображены на фигурах 116-118.
Когда четыре обработанные непикастатом группы сравнивали с обработанными наполнителем контролями, не выявили ни общих, ни попарных значимых различий ни в одном исследованном периоде времени ни по одному из 3 параметров.
По сравнению с обработанными наполнителем контролями в группе обработки клонидином имели место значимо более высокие горизонтальные активности в точках 2 и 2,5 часа, значимо большее количество передвижений в точке 2 часа и значимо меньшее время покоя в точке 2 часа (во всех случаях p<0,05, см. фигуры 104-115 соответственно). Следует отметить, что в группе обработки клонидином время покоя было значимо больше, чем в обработанных наполнителем контролях в точке 1 час (p<0,05).
По сравнению с обработанными наполнителем контролями в группе обработки SKF-102698 имели место значимо менее высокие горизонтальные активности и значимо меньшее количество передвижений в точке 2,5 часа (в обоих случаях p<0,05, см. фигуры 104-115). Следует отметить, что в группе обработки SKF-102698 было значимо больше передвижений, чем в обработанных наполнителем контролях, в точках 1,5 и 4 часа (в обоих случаях p<0,05). Не выявлено значимых различий между SKF-102698 и наполнителем ни в одной исследованной временной точке по времени покоя (см. фигуры 104-115).
В общем, горизонтальная активность и количество передвижений снижались в первые 2 часа и оставались низкими в течение последних 2 часов. Подобным образом, время покоя увеличивалось в первые 2 часа и оставалось повышенным на протяжении последних 2 часов.
Непикастат не оказывал значимого влияния на локомоторную активность у крыс. Животные, обработанные 3, 10, 30 или 100 мг/кг непикастата, значимо не отличались от обработанных наполнителем контролей в любой исследованной временной точке по горизонтальной активности, количеству передвижений и времени покоя.
Животные, обработанные агонистом альфа2-адренергических рецепторов, клонидином, имели значимо большее время покоя, чем обработанные наполнителем контроли во временной точке 1 час. Однако в точке 2 часа животные, обработанные клонидином, имели значимо более высокие горизонтальные активности, больше передвижений и значимо меньшее время покоя по сравнению с обработанными наполнителем контролями.
Животные, обработанные SKF-102698, имели значимо меньшие горизонтальные активности и количество передвижений, чем обработанные наполнителем контроли, во временной точке 2,5 часа. Крысы, обработанные SKF-102698, имели значимо меньше передвижений в точках 1,5 и 4 часа по сравнению с обработанными наполнителем контролями. Не выявлено значимых различий между SKF-102698 и контролями ни в одной из исследованных временных точек по влиянию на время покоя.
Полные эффекты обработки на реакцию вздрагивания в случае непикастата и наполнителя не были значимыми (p>0,05) ни в одной из временных точек реакции. Полый эффект обработки в отношении средней реакции вздрагивания во временном периоде 2 был мало значимым (p=0,0703), а тест Даннета показал, что непикастат в дозе 30 мг/кг вызывал значимо более высокую среднюю реакцию вздрагивания, чем в группе, обработанной наполнителем (p<0,05). Средняя реакция вздрагивания исходного уровня была статистически значимой в периоды времени 3 и 4 для ответов в обоих случаях (p<0,05) и мало значимой в периоды времени 1 и 2 для максимальной реакции вздрагивания и в период времени 2 для средней реакции вздрагивания (p<0,10).
На фигурах 123-124 показаны максимальная и средняя реакции вздрагивания в зависимости от времени для каждой из указанных пяти групп обработки.
SKF-102698 (100 мг/кг) статистически значимо не отличался от наполнителя в любом периоде времени в случае любого измерения реакции вздрагивания.
На фигурах 125 и 126 показано изменение во времени средней максимальной и средней реакции вздрагивания в случае SKF-102698 и наполнителя.
Клонидин вызывал статистически значимо более низкие максимальные и средние реакции вздрагивания, чем наполнитель, в период времени 1 (p<0,01) и в период времени 2 только в отношении средней реакции вздрагивания (p=0,0352). Максимальная реакция вздрагивания в период времени 2 и средняя реакция вздрагивания в период времени 3 в группе, обработанной клонидином, были ниже, чем в группе, получавшей воду, с небольшим уровнем значимости.
На фигурах 127-128 показано изменение во времени среднего значения максимальной и средней реакций вздрагивания в случае клонидина и воды.
Непикастат, введенный в дозе 3, 10, 30 или 100 мг/кг, по-видимому, не влиял на максимальную или среднюю реакцию вздрагивания у крыс ни в одном из периодов времени по сравнению с контролем. SKF-102698 вел себя сходным с наполнителем (ПЭГ) образом по отношению к обеим реакциям вздрагивания во всех временных периодах. Клонидин успешно снижал как максимальную, так и среднюю реакцию вздрагивания в более ранние временные периоды и вел себя сходным с наполнителем образом в более поздние временные периоды.
На фигурах 119-122 показана суммарная статистика и оценка значимости для максимальной реакции вздрагивания.
Пример 22
Исследовали влияние хронического введения доз непикастата. За три-тринадцать дней перед первым днем введения доз крыс помещали внутрь устройства для оценки реакции вздрагивания и после пятиминутного периода акклиматизации на них действовали импульсом шума 118 дБ в среднем один раз в минуту (может быть использован переменный интервал между испытаниями в диапазоне от 30 до 90 секунд) в течение 20 минут. Измеряли реакции вздрагивания и для каждой крысы вычисляли среднее значение для последних двадцати реакций вздрагивания. Крыс случайным образом распределяли на восемь групп обработки (непикастат, 5, 15 или 50 мг/кг, дважды в сутки; SKF-102698, 50 мг/кг, дважды в сутки; клонидин, 20 мкг/кг, дважды в сутки: d-амфетамин, 2 мг/кг, дважды в сутки; дH2O или циклодекстрин (наполнитель для SKF-102698)). Крысам вводили дозы, используя пероральный зонд для принудительного питания, в объеме 10 мл/кг. Крысам вводили дозы утром и вечером каждый день в течение десяти суток. Интервал времени между утренним и вечерним введением дозы может составлять от 6 до 10 часов. В предыдущей работе было показано, что такой способ сопоставления является наиболее подходящим для оценки реакций вздрагивания на акустический сигнал, так как существует значительная вариабельность в реакции вздрагивания между крысами, но существует высокая степень соответствия для крыс изо дня в день.
Так как невозможно было тестировать всех 96 крыс (8 групп обработки, n=12) в один и тот же день, то схему дозирования составляли со смещением так, чтобы исследовать только 8 крыс каждый день. Такие 12 групп по восемь крыс в каждой включали по одной крысе из каждой из восьми групп обработки так, чтобы группы обработки сбалансировать по дням. Кроме того, все группы обработки балансировали, используя восемь камер для определения моторной активности, однако группы обработки невозможно было сбалансировать на основании использования камер для определения реакции вздрагивания.
Следующие поведенческие тесты были введены во время и после хронического введения доз: внутренняя температура тела, моторная активность, способность к реакции вздрагивания на акустический сигнал и преимпульсное ингибирование реакции вздрагивания на акустический сигнал.
Животных тестировали в закрытом помещении с генератором белого шума. Тесты для определения моторной активности проводили сразу после регистрации внутренней температуры тела на десятый день введения доз (примерно через 3 часа 35 минут после утренней дозы непикастата и SKF-102698 и за 20 минут до ежедневного введения клонидина и d-амфетамина на десятый день дозирования). Тесты для определения моторной активности проводили в течение одного часа. Прогоняли диагностические программы для каждой из камер для определения моторной активности перед каждым сеансом тестирования, чтобы убедиться, что световые лучи и световые сенсоры работают правильно. Показано, что моторная активность чувствительна к изменениям центральных уровней дофамина (Dietze and Kuschinsky, 1994), что делает такой поведенческий тест возможным чувствительным анализом для определения влияния DBHI in-vivo. D-амфетамин использовали в качестве позитивного контроля в данном анализе.
Внутренние температуры тела крыс получали, помещая ректальный зонд на 2 см в ободочную кишку каждой крысы. Внутреннюю температуру тела каждой крысы измеряли три раза и вычисляли среднее из трех показаний. Показания внутренней температуры тела получали непосредственно перед десятидневной схемой хронического введения доз (чтобы получить исходный уровень), через три с половиной часа после утренней дозы непикастата и SKF-102698 и за 15 минут до ежедневного введения клонидина и d-амфетамина в первый, пятый и десятый день дозирования. Было показано, что внутренняя температура тела чувствительна к уровням дофамина и норэпинефрина, что делает такой поведенческий тест возможным чувствительным анализом для определения влияния DBHI in-vivo. Клонидин (агонист альфа2) и d-амфетамин (агент, высвобождающий дофамин) в качестве позитивных контролей в данном анализе.
Реакцию вздрагивания на акустические сигналы (серия мышечных сокращений, вызываемых интенсивным импульсом шума с быстрым началом) и преимпульсное ингибирование (сенсомоторная фильтрация, измеряемая посредством анализа снижения реакции вздрагивания, которое происходит в том случае, когда вызывающему вздрагивание стимулу непосредственно предшествует не вызывающий вздрагивание стимул) измеряли, используя восемь автоматизированных испытательных установок SR-Lab (San Diego Instruments, San Diego, CA). Крыс помещали поодиночке в цилиндр из плексигласа (диаметром 10 см), который держали в вентилируемой уменьшающей звук камере. Импульсы акустического шума (широкополосный шум со временем нарастания и временем спада 1 мсек) подавали через громкоговоритель, установленный на 30 см выше животного. Также указанные громкоговорители давали фоновый шум на уровне 68 дБ во всех сеансах тестирования. Пьезоэлектрический акселерометр, установленный ниже цилиндра из плексигласа, преобразовывал движения субъекта в напряжение, которое затем детектировали и преобразовывали в цифровую форму (по шкале от 0 до 4095) с помощью ПЭВМ с программным обеспечением SR-Lab и блоком сопряжения. Шумометр использовали для калибровки громкоговорителей в каждой из восьми испытательных установок до ±1% среднего значения. Кроме того, использовали калибровочное устройство SR-Lab для калибровки каждого из восьми устройств для детекции вздрагивания до ±2% среднего значения. Тестирование реакции вздрагивания и преимпульсного ингибирования проводили одновременно сразу после тестирования моторной активности (примерно через 4 часа 40 минут после утренней ежедневной инъекции непикастата и SKF-102698 и через 10 минут после дополнительного введения клонидина и d-амфетамина на десятый день введения дозы). Тестирование реакции вздрагивания и преимпульсного ингибирования включало помещение каждой крысы поодиночке в испытательную установку SR-Lab, и после пятиминутного периода акклиматизации на крыс воздействовали одним из трех типов шумовых импульсов (и измеряли реакцию вздрагивания) в среднем один раз в минуту (может быть использован переменный интервал между испытаниями в диапазоне от 30 до 90 секунд) в течение часа (всего 60 шумовых импульсов и реакций вздрагивания). Использовали следующие три разных типа шумовых импульсов: громкий шумовой импульс (118 дБ) и относительно тихий шумовой импульс (77 дБ), тихий импульс предшествовал громким шумовым импульсам на 100 мсек (испытание преимпульсного ингибирования). Указанные испытания проводили в псевдослучайном порядке. Показано, что преимпульсное ингибирование чувствительно к изменениям мезолимбических уровней дофамина. Кроме того, также показано, что реакция вздрагивания на акустический импульс является чувствительной к изменениям уровней дофамина и норэпинефрина, что делает такой поведенческий тест возможным чувствительным анализом для оценки влияния DBHI in vivo. Клонидин и d-амфетамин служили в качестве позитивного контроля в тестах реакции вздрагивания на акустический сигнал и преимпульсного ингибирования реакции вздрагивания на акустический сигнал.
Использовали следующую схему ежедневных поведенческих тестов. В t=0 инъецировали DBHI. В точке 3,5 часа измеряли внутреннюю температуру тела. В точке 3 часа 35 минут анализировали моторную активность. В точке 4 часа 40 минут анализировали реакцию вздрагивания и преимпульсное ингибирование.
Три результата регистрации температуры получали для каждого субъекта во время тестирования. Затем вычисляли среднее указанных трех результатов регистрации.
Спонтанные передвижения каждой крысы получали, вычисляя общее количество световых лучей, которые субъект пересекает во время сеанса тестирования.
Реакцию субъекта измеряли во время каждого испытания на протяжении окна длительностью 40 мсек после воздействия стимулом. Каждую реакцию вздрагивания определяли, вычисляя среднее из 40 определений (одно в миллисекунду), начиная сразу после каждого шумового импульса. Реакцию вздрагивания на акустический сигнал рассчитывали, определяя среднюю реакцию вздрагивания каждого субъекта, вызываемую акустическим импульсом 118 дБ. Значения преимпульсного ингибирования вычисляли вычитанием среднего значения реакции вздрагивания, вызываемой в парном испытании импульсов 77-118 дБ (испытание преимпульсного ингибирования, описанное выше), из значения, полученного в испытании только одного импульса 118 дБ, и затем делением полученного значения на результат, полученный в испытании только одного импульса 118 дБ, для каждой крысы, т.е. ([значение в испытании 118 дБ - значение в испытании преимпульсного ингибирования]:значение в испытании 118 дБ).
Общий однофакторный ANOVA с главным эффектом обработки на изменение от исходного уровня для каждого животного осуществляли для каждого периода времени. Затем осуществляли t-тесты для каждого представляющего интерес сравнения.
Спонтанную моторную активность измеряли для каждого животного каждые 15 минут в течение 1 часа. Каждый временной блок (каждые 15 минут) анализировали отдельно. Тест Краскала-Уоллиса (непараметрический способ) осуществляли для проверки различия между группами обработки. Если не выявлено полное значимое различие, то использовали поправку Бонферрони для множественных сравнений.
Среднее значение среднего напряжения (AVGMEAN) и среднее значение преимпульсного ингибирования в процентах (RATIO) вычисляли для каждой обработки (TREAT) и типа испытаний (TRIALT) в каждом испытании (TRIALN). Значения преимпульсного ингибирования вычисляли вычитанием среднего значения реакции вздрагивания, вызванной в парном испытании импульсов 77 дБ - 118 дБ (испытание преимпульсного ингибирования, описанное выше), из значения, полученного в испытании только одного импульса 118 дБ, и затем делением полученного значения на результат, полученный в испытании только одного импульса 118 дБ, для каждой крысы, т.е. ([значение в испытании 118 дБ - значение в испытании преимпульсного ингибирования]:значение в испытании 118 дБ).
Полученные значения откладывали на графике против номера испытания для каждой обработки и типа испытания, и такие графики приложены к описанию. Обратите внимание, что ось y на графиках варьирует. Испытания 1-15 соответствуют временному периоду 1, испытания 16-30 соответствуют временному периоду 2, испытания 31-45 соответствуют временному периоду 3 и испытания 46-60 соответствуют временному периоду 4. Также прилагаются графики, показывающие средние значения преимпульсного ингибирования в процентах и средние значения средней реакции вздрагивания животных в зависимости от времени для каждой обработки.
Среднюю реакцию вздрагивания и преимпульсное ингибирование в процентах анализировали, используя дисперсионный анализ. Модель включала члены, относящиеся к обработке, животным, входящим в группу обработки, времени и взаимодействию обработки и времени. Эффекты обработки тестировали, используя случайную ошибку для животных, входящих в группу обработки. Исследовали полные эффекты обработки и эффекты обработки по времени. Способ Фишера определения наименьшей значимой разницы использовали для корректировки множественных сравнений. Если полные эффекты обработки или эффекты обработки по времени не были значимыми (p-значение>0,05), то использовали корректировку Бонферрони. Если полные эффекты обработки были незначимыми, то применяли корректировку к конкретным попарным сравнениям. Кроме того, если эффект конкретной парной обработки не был значимым (p-значение>0,05), то также применяли корректировку к эффектам обработки в определенном периоде времени. Если и полные эффекты обработки и эффекты обработки по времени не были значимыми (p-значение >0,05), то осуществляли корректировку Бонферрони для отдельных сравнений в пределах периода времени и усреднение по периодам времени.
Изменение массы тела по сравнению с массой до введения вычисляли для каждого животного в анализе. Двухфакторный ANOVA, использующий повторяющиеся критерии, применяли для тестирования полных эффектов обработки, времени и взаимодействия обработки и времени. Затем осуществляли однофакторный ANOVA для тестирования эффекта обработки в каждый день.
На фигурах 129-130 показана реакция вздрагивания на акустический сигнал до обработки и дата начала испытания для каждой крысы.
На фигуре 131 показано, что кроме позитивных контролей (d-амфетамин и клонидин), значимо увеличивающих внутреннюю температуру тела в первый день хронического введения доз, ни одно другое соединение не оказывало значимого влияния на внутреннюю температуру тела ни в одной временной точке.
На фигурах 132-133 показана средняя температура тела в каждой временной точке для каждой обработки, среднее изменение внутренней температуры тела от исходного уровня и результаты оценки значимости.
Как показано на фигуре 134, группа, обработанная d-амфетамином, имела значимо более высокую локомоторную активность, чем контрольная группа, обработанная наполнителем во всех исследованных временных точках. Однако в группах обработки клонидином значимо не отличалась от обработанных наполнителем контролей ни в одной исследованной временной точке. Группа, обработанная SKF 102698 в дозе 50 мг/кг дважды в сутки, имела значимо более низкую локомоторную активность, чем в контрольной группе, обработанной наполнителем, в первые 45 минут (т.е. образцы 1-3), но значимо не отличалась после 45 минут (см. фигуры 135-136).
На фигуре 137 также показано, что не было значимого полного эффекта обработки непикастатом ни в одной исследованной временной точке. Попарные сравнения показали, что ни одна из обработанных непикастатом групп значимо не отличалась от обработанных наполнителем контролей ни в одной исследованной временной точке. Также не было значимого различия между двумя обработанными наполнителями контролями (дH2O и наполнитель для SKF) ни в одной исследованной временной точке (см. фигуру 135 и фигуру 136).
Как показано на фигуре 138, ни в одной из групп обработки не наблюдали значимого изменения преимпульсного ингибирования. Полный эффект времени был статистически значимым для группы обработки SKF 102698 и группы обработки циклодекстрином (p=0,0001). Взаимодействие обработки и времени было статистически значимым в случае циклодекстрина по сравнению с дH2O (p=0,0283), но не в других случаях. Эффекты обработки не были значимыми ни в одном из представляющих интерес сравнений. Однако в группе SKF имело место незначительно большее преимпульсное ингибирование в процентах по сравнению с группой обработки циклодекстрином (p=0,0782) (см. фигуру 139).
В периоды времени 1 и 2 в группе обработки клонидином имело место значимо более высокое преимпульсное ингибирование в процентах, чем в обработанном наполнителем контроле, и не было значимого отличия от наполнителя в периоды 3 и 4 (см. фигуры 140-141). Ни d-амфетамин, ни SKF 102698 значимо не отличались от своего наполнителя ни в одном из периодов времени. Ни одна из групп, получавших дозы непикастата, значимо не отличалась от группы обработки дH2O ни в одном из периодов времени.
Как показано на фигуре 142, только группа обработки SKF 102698 имела значимое изменение реакции вздрагивания на акустический сигнал. Полный эффект времени был статистически значимым в случае всех представляющих интерес сравнений (все p=0,0001). Взаимодействие обработки и времени было статистически значимым в случае сравнений амфетамина и дH2O, клонидина и дH2O и циклодекстрина и дH2O (все p<0,05), но не в других случаях. Эффекты обработки были значимыми для SKF 102698 в дозе 50 мг/кг дважды в сутки по сравнению с циклодекстрином (p=0,0007) и для непикастата в дозе 50 мг/кг дважды в сутки по сравнению с SKF 102698 в дозе 50 мг/кг дважды в сутки (p=0,0047), но не в других случаях (см. фигуру 143). Группа, обработанная SKF 102698 в дозе 50 мг/кг дважды в сутки, имела значимо меньшую реакцию вздрагивания по сравнению с группой обработки циклодекстрином, а также имела значимо меньшую реакцию вздрагивания по сравнению с группой обработки непикастатом в дозе 50 мг/кг дважды в сутки.
Группа обработки SKF 102698 (50 мг/кг дважды в сутки) имела значимо меньшую реакцию вздрагивания, чем группы обработки циклодекстрином во всех периодах времени (см. таблицы 144-145). В периоды времени 1 и 3 группа обработки непикастатом (50 мг/кг дважды в сутки) имела значимо большую реакцию вздрагивания, чем группа обработки SKF 102698 (50 мг/кг дважды в сутки). Других значимых различий не выявлено.
Не было полных или попарных значимых различий по массе тела между группами на исходном уровне до введения доз.
Как показано на фигурах 146-147, группа обработки d-амфетамином имела значимо меньшее изменение массы тела по сравнению с массой до введения дозы, чем в обработанных наполнителем контролях (p<0,01). При ежедневном анализе обработанные наполнителем контроли имели значимо большее увеличение массы тела по сравнению с показателем до введения дозы, чем группа обработки амфетамином, в дни обработки 4-10. Однако группа обработки клонидином значимо не отличалась от обработанных наполнителем контролей ни в одном исследованном периоде времени. Как показано на фигуре 146, в группе обработки SKF 102698 (50 мг/кг дважды в сутки) показано значимо меньшее увеличение (p<0,01) массы тела по сравнению с показателем исходного уровня до введения дозы, чем в контроле, обработанном соответствующим наполнителем (SKF-наполнитель). При ежедневном анализе контроли, обработанные SKF-наполнителем, имели значимо большее увеличение массы тела по сравнению с показателем до введения дозы, чем группа обработки SKF 102698, в дни обработки 2-10, за исключением дней 3 и 6. Важно, что не было различий в изменениях массы тела между контрольными группами, обработанными SKF-наполнителем и наполнителем, ни в один из дней.
Как показано на фигуре 147, не было значимого полного эффекта обработки в случае любой дозы непикастата ни в одном исследованном периоде времени. Попарные сравнения показали, что ни одна из обработанных непикастатом групп значимо не отличалась от обработанных наполнителем контролей ни в одной исследованной временной точке. Интересно, что имело место значимое (p<0,05) полное различие между группой обработки SKF 102698 (50 мг/кг дважды в сутки) и группой обработки непикастатом (50 мг/кг дважды в сутки) в отношении изменений массы тела. При ежедневном анализе группа обработки SKF 102698 (50 мг/кг дважды в сутки) имела значимо меньшие массы тела, чем группа обработки непикастатом (50 мг/кг дважды в сутки), в дни 7-9.
Пример 23
1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридин (МФТП) приобретали из RBI, Inc. (Natick, MA). Для введения МФТП суспендировали в воде в концентрации 2 мг/мл (свободное основание) и инъецировали подкожно в объеме (в мл), равном массе (в кг) каждого животного. Например, животное массой 950 грамм получало инъекцию 0,95 мл МФТП в концентрации 2 мг/мл, в результате 2,0 мг/кг в одну инъекцию.
Для данного исследования использовали двадцать семь (27) взрослых беличьих обезьян (Saimiri sciureus). Обезьян содержали, используя цикл освещенность/темнота 13 часов/11 часов, при этом они получали корм и воду без ограничения. Все процедуры, используемые в данном исследовании, проводили, следуя инструкциям NIH, и были одобрены институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC). Животных содержали по отдельности и давали возможность минимум в течение одного месяца, чтобы привыкнуть к колонии перед началом исследований поведения.
В указанных исследованиях использовали всего шесть беличьих обезьян, три без повреждения и три с повреждениями (3 месяца до этого получали 2 мг/кг МФТП). Чтобы определить оптимальный путь введения лекарственного средства непикастата, исследовали три разных подхода, включая (i) введение в угощение, (ii) пероральный шприц и (ii) пероральный зонд для принудительного кормления. (i) Введение раствора RS (5 мг/мл) в маршмэллоу тестировали у 3 обезьян без повреждения, и было подтверждено, что такой путь является плохим для введения лекарственного средства вследствие неспособности животных проглатывать угощение, вероятно из-за плохого вкуса, (ii) пероральная инъекция лекарственного средства шприцем (0,5, 2 и 5 мг/кг) в рот трем обезьянам без повреждения и трем обезьянам с повреждением также является неприемлемым путем, так как животные стремились выплюнуть раствор с наиболее высокой концентрацией лекарственного средства, (iii) пероральное введение с помощью зонда для принудительного кормления осуществляли у 3 обезьян с вызванными МФТП повреждениями в самой высокой дозе (5 мг/кг), и оно было приемлемым.
Полученные результаты (доставка пероральным шприцем и пероральным зондом для принудительного кормления) суммированы на фигуре 148 и фигуре 149.
В указанных исследованиях использовали всего шесть беличьих обезьян, три без повреждения и три с повреждениями (3 месяца до этого получали 2 мг/кг МФТП). Животные получали лекарственное средство в концентрации 0,5, 2,0 или 5,0 мг/кг дважды в сутки (10 часов утра и 2 часа дня) в течение 5 суток с двумя сутками для выведения из организма между приемом разных уровней доз. Лекарственное средство вводили через пероральный шприц в дозах 0,5, 2,0 и 5,0 мг/кг и с помощью перорального зонда для принудительного кормления в дозе 5,0 мг/кг. Лекарственное средство хорошо переносилось в двух более низких дозах. Одна обезьяна без повреждения, получавшая 5,0 мг/кг, имела жидкий стул светло-бежевого цвета в последние два дня введения, что проходило через день после прекращения приема лекарственного средства. Полученные результаты суммированы на фигурах 148 и 149.
Для данного исследования использовали всего 24 беличьих обезьяны (Saimiri sciureus), четырнадцать самок и десять самцов. Двадцать четыре животных случайным образом делили на четыре группы обработки по 6 животных на группу. Использовали следующие группы: (1) группа A: плацебо; (2) группа B: 1 мг/кг/сутки; (3) группа C: 4 мг/кг/сутки и (4) группа D: 10 мг/кг/сутки. В группе B одно животное скоропостижно погибло после повреждения МФТП, и его не заменяли.
Перед повреждением у животных количественно оценивали спонтанную моторную активность, используя клетку с монитором активности в инфракрасном свете (IRAM). Все сеансы регистрации продолжались 60 минут, и проводили по 10 сеансов на протяжении 2 недель. Поведение животных также подвергали клинической оценке, которую проводили от 1 до 3 исследователей, используя шкалу клинической оценки паркинсонизма (CRS), один раз в сутки (с 12-00 до 13-00) на протяжении 3-5 следующих друг за другом дней. Нормальные животные обычно не получали оценки выше 3 по шкале CRS (см. фигуру 150 в отношении шкалы клинической оценки, используемой в настоящем исследовании). Используя мониторинг активности (IRAM) и клинические оценки, устанавливали среднюю активность исходного уровня для каждого животного.
Животных подвергали повреждениям при введении МФТП в концентрации 2,0 мг/кг (свободное основание) посредством подкожной инъекции, чтобы достичь состояния паркинсонизма (см. фигуры 151-156). Оценку поведения после повреждения МФТП осуществляли через 2-4 недели после последнего повреждения МФТП. Локомоторную активность контролировали, используя IRAM, 60-минутными сеансами на протяжении 3-5 дней. Клиническое поведение (CAS) оценивали от 1 до 3 исследователей в течение периода времени от 3 до 5 дней.
В некоторых случаях животным требовались дополнительные дозы МФТП (2 мг/кг), чтобы получить достаточную степень повреждения для проявления симптомов паркинсонизма, определяемых средней суммарной клинической оценкой больше чем 3.
Всех животных подвергали конечной оценке поведения после повреждения МФТП (IRAM и CRS) в пределах трех недель до начала исследования эффективности. Такую конечную оценку после действия МФТП использовали для установления клинического состояния паркинсонизма исходного уровня и применяли в качестве значения, соответствующего состоянию до лечения, при статистическом анализе.
Животных тестировали в отношении ответа на L-ДОФА и эффективности лекарственного средства непикастата. Тестирование осуществляли через 4-12 недель после последней дозы МФТП. Двадцать четыре беличьих обезьяны случайным образом делили на 4 группы; группа A (6 животных), получавших обработку плацебо (вода); группа B (5 животных), получавших лекарственное средство непикастат в дозе 1 мг/кг/сутки (0,5 мг/кг дважды в сутки); группа C (6 животных), получавших 4 мг/кг/сутки (2 мг/кг дважды в сутки); и группа D (6 животных), получавших 10 мг/кг/сутки (5 мг/кг дважды в сутки).
L-ДОФА вводили в концентрации 2,5, 5 или 7,5 мг/кг посредством перорального зонда для принудительного кормления дважды в сутки (10-00 и 14-00) в течение 7 следующих друг за другом дней. Поведение определяли, используя IRAM и CRS. Клиническую оценку осуществляли от 60 до 90 минут после введенной в 10-00 утренней дозы в последние 4 дня обработки. Исследователи (от одного до трех человек) осуществляли клиническую оценку слепым способом в отношении разных групп обработки. Оценку IRAM осуществляли в течение 90 минут сразу после введения лекарственного средства в 2 часа дня в последние 2-5 дней обработки лекарственным средством. Между разными дозами обработки выдерживали минимум 2-дневный период для выведения лекарственного средства.
Лекарственное средство непикастат или воду (в качестве плацебо) вводили в течение 12 дней после минимум 2-дневного периода выведения после введения доз L-ДОФА. Лекарственное средство вводили дважды в сутки в 10-00 и 14-00 с помощью перорального зонда для принудительного кормления. Поведение оценивали с использованием IRAM и CRS. CRS осуществляли утром через 60-90 минут после дозы непикастата, введенной в 10-00, в последние 5 дней обработки лекарственным средством. Исследователи (от одного до трех человек) осуществляли клиническую оценку слепым способом в отношении разных групп обработки. Оценки IRAM осуществляли в течение 90 минут сразу после введения лекарственного средства в 14-00 в последние 5 дней обработки лекарственным средством.
Фармакокинетическое исследование осуществляли для определения концентрации непикастата в плазме беличьих обезьян. Такое исследование осуществляли одновременно с исследованием безопасности и переносимости. Использовали три беличьих обезьяны с МФТП-повреждениями (№ 353, 358 и 374). Для анализа брали один миллилитр крови (из бедренной вены каждого животного). Непикастат вводили в концентрациях 1, 4 и 10 мг/кг в течение 5 дней с 2-дневным периодом выведения между введением разных концентраций лекарственного средства. Кровь собирали для анализа за 1 час до введения первой дозы, чтобы установить исходный уровень, и через 6 часов после указанной первой дозы лекарственного средства в случае использования каждого из разных уровней лекарственного средства.
Второе фармакокинетическое исследование осуществляли для определения стационарного уровня непикастата в плазме. Такое исследование осуществляли вместе с исследованием эффективности, в котором животных тестировали, используя каждую из трех разных концентраций лекарственного средства, в течение 12 дней. Один миллилитр крови брали из бедренной вены через 6 часов после первой дозы в 1 день, затем через 6 часов после первой дозы на 7 день и, наконец, через 6 часов после первой дозы на 12 день. Уровни в плазме исходного уровня определяли, используя образцы, собранные за неделю до введения дозы лекарственного средства.
Среднюю локомоторную активность вычисляли до и после повреждения МФТП каждого животного. Исходный уровень до повреждения МФТП определяли посредством вычисления среднего значения из десяти 1-часовых сеансов мониторинга. Оценку поведения после МФТП (до обработки лекарственным средством) получали в течение трех недель до начала исследования эффективности. Локомоторную активность после повреждения МФТП определяли посредством вычисления среднего значения из трех-пяти 1-часовых сеансов мониторинга (IRAMS). Данные мониторинга активности выражали в виде «количества передвижений/10 минут». При более высокой оценке животное считали более быстрым. Знаково-ранговый критерий Вилкоксона использовали для сравнения активности до и после повреждения МФТП для каждой группы животных (группы A-D). (b) Клиническая рейтинговая оценка: ни одно из животных до повреждения МФТП не оценивали больше трех баллов по шкале CRS. Клиническую рейтинговую оценку после действия МФТП определяли в течение трех недель до начала исследования эффективности посредством вычисления среднего значения общих оценок CRS, которые были даны 1-3 исследователями на основании данных за 3-5 следующих друг за другом дней.
Восемь признаков паркинсонизма оценивали у каждого животного и общую оценку получали на основании суммы таких восьми признаков. Для каждого животного получали одну клиническую рейтинговую оценку для каждой дозы лекарственного средства посредством вычисления среднего значения клинических рейтинговых оценок, которые были даны всеми исследователями (от одного до трех) на протяжении следующих друг за другом дней многократного введения доз (одной и той же дозы). Такую среднюю CRS использовали для статистического анализа. Более низкая оценка показывала менее выраженное поведенческое состояние паркинсонизма.
Статистический анализ включал:
(1) сравнения между средним значением CRS для плацебо со средним значением CRS для непикастата в дозе 1, 4 и 10 мг/кг/сутки с использованием теста Краскала-Уоллиса (непараметрический дисперсионный анализ). Такое сравнение повторяли, используя среднее значение CRS для каждой концентрации экспериментального лекарственного средства, скорректированное по конечным рейтинговым оценкам после МФТП. Скорректированные клинические оценки представляют собой клинические оценки экспериментального лекарственного средства в каждой концентрации в виде отношения клинических оценок после МФТП.
(2) Попарные сравнения между средней CRS после повреждения МФТП (до обработки) с обработкой 2,5, 5,0 и 7,5 мг/кг L-ДОФА и плацебо с использованием анализа Фридмана (непараметрический дисперсионный анализ, многократные измерения). Такой же анализ осуществляли для непикастата в концентрациях 1, 4 и 10 мг/кг. При необходимости осуществляли апостериорный анализ Даннета для непараметрических данных.
Локомоторную активность IRAM наблюдали каждые 10 минут в течение минимум 90 после введения лекарственного средства каждого уровня. Высокая рейтинговая оценка свидетельствовала о более быстро передвигающемся животном (меньше проявление паркинсонизма).
Статистический анализ включал описательную статистику и графическое изображение среднего значения каждого из блоков данных, получаемых в течение 10-минутного периода, для плацебо и экспериментального лекарственного средства в дозе 1, 4 и 10 мг/кг. Затем исследовали график, чтобы выявить какое-либо тренды. Дополнительный статистический анализ не проводили, так как различие не было выявлено на основании графического анализа.
Статистический анализ, сравнивающий данные, полученные после повреждения МФТП (дообработки), с данными для 2,5, 5,0 и 7,5 мг/кг L-ДОФА и непикастата (1, 4, 10 мг/кг/сутки или плацебо), не проводили из-за недостаточного сбора данных IRAM. Данные после повреждения МФТП собирали только в 60-минутных сеансах по сравнению с 90-минутными сеансами в случае непикастата.
IRAM (мониторинг активности) и CRS (шкалу клинической оценки) использовали для оценки степени повреждений у каждой беличьей обезьяны. В следующем разделе полученные результаты для групп A-D сведены в таблицы, показывающие IRAM и CRS. В общем, не было значимых различий в локомоторной активности, измеряемой посредством IRAM, между исходным уровнем (до повреждения МФТП) и после повреждения МФТП в пределах групп вследствие высокой степени вариабельности результатов IRAM для каждого животного. Результаты CBS показали различие между состояниями до повреждения МФТП и после повреждения МФТП. Животных до повреждения МФТП оценивали не больше 3 по CRS. Все животные после повреждения МФТП получали оценку больше 3. Все группы (A-D) имели среднюю оценку CRS в диапазоне от 8 до 10 из возможной общей оценки CRS 24.
На фигуре 153A показаны результаты для группы A: обработка плацебо. Не было значимого различия между группами до повреждения и после повреждения согласно IRAM вследствие высокой степени вариабельности передвижений за 10 минут для каждого животного. Знаково-ранговый критерий Вилкоксона: W=19, N=6, P<0,06; принятие нулевой гипотезы.
На фигуре 153B показана клиническая рейтинговая оценка (GRS). Средняя GRS для группы A составляла 8,9, размах от 4,8 до 15,4. У всех животных наблюдали значительное увеличение клинических рейтинговых оценок после повреждения МФТП. Нормальные животные (без повреждений) обычно имели оценки менее 3.
На фигурах 154A и B показаны результаты для группы B: обработка 1 мг/кг/сутки. Не было значимого различия в IRAM между группами до повреждения и после повреждения вследствие высокой степени вариабельности передвижений за 10 минут для каждого животного. Знаково-ранговый критерий Вилкоксона: W=9, N=5, p<0,06. Принятие нулевой гипотезы. Клиническая рейтинговая оценка (CRS). Средняя CRS для группы B составляла 10,32, размах от 4,3 до 16,1. У всех животных наблюдали значимое увеличение клинических рейтинговых оценок после повреждения МФТП. Нормальные животные (до повреждения) обычно имели оценку меньше 3.
На фигуре 155 показаны результаты для группы C: обработка 4 мг/кг/сутки. Не было значимого различия между группами до повреждения и после повреждения в отношении IRAM вследствие высокой степени вариабельности передвижений за 10 минут для каждого животного. Знаково-ранговый критерий Вилкоксона: W=17, N=6, P>0,06. Принятие нулевой гипотезы. Средняя CRS для группы C составляла 8,97, размах от 6,5 до 17,3. У всех животных наблюдали значимое увеличение клинических рейтинговых оценок после повреждения МФТП. Нормальные животные (до повреждения) обычно имели оценку меньше 3.
На фигуре 156 показаны результаты для группы D: обработка 10 мг/кг/сутки. Не было значимого различия между группами до повреждения и после повреждения в отношении IRAM вследствие высокой степени вариабельности передвижений за 10 минут для каждого животного. Знаково-ранговый критерий Вилкоксона: W=21, N=6, P>0,06. Принятие нулевой гипотезы. У всех животных наблюдали значимое увеличение клинических рейтинговых оценок после повреждения МФТП. Средняя CRS для группы C составляла 8,02, размах от 4,0 до 15,6. Нормальные животные (до повреждения) обычно имели оценку меньше 3.
Не было выявляемых различий между обработкой плацебо и тремя разными концентрациями непикастата (1, 4, 10 мг/кг/сутки) у поврежденной МФТП беличьей обезьяны. Дозы 4 и 10 мг/кг/сутки непикастата и плацебо давали значимое улучшение по сравнению с состоянием после МФТП (до обработки). Все группы животных имели значимые улучшения в случае 5 мг/кг и 7,6 мг/кг L-ДОФА по сравнению с состоянием после МФТП (до обработки), за исключением группы C при дозе 7,5 мг/кг и группы B при дозе 5 мг/кг/сутки. Ни в одной из групп животных не показано значимого улучшения в случае дозы 2,5 мг/кг L-ДОФА по сравнению с состоянием после МФТП.
На фигурах 157-170 показаны сравнения групп обработки и L-ДОФА, результаты теста Фридмана, описательная статистика и апостериорный анализ Даннета.
На фигурах 171-172 показано сравнение между результатами наблюдения активности при обработке плацебо со всеми другими концентрациями непикастата во временных точках 10-90 минут после введения дозы. Десятиминутные интервалы откладывали на графике для каждого уровня дозы лекарственного средства. Не было различия между результатами обработки лекарственным средством (непикастатом) при уровнях доз 4 и 10 мг/кг/сутки по сравнению с плацебо. В случае 1 мг/кг/сутки животные передвигались медленнее, чем при обработке плацебо. На основании непарного сравнительного анализа 4 разных групп обработки (1, 4 и 10 мг/кг непикастата и плацебо) показано, что непикастат не оказывал значимого влияния на симптомы паркинсонизма по сравнению с плацебо (обработка водой) у поврежденных МФТП в модели на отличных от человека приматах PD. На основании попарного сравнительного анализа животных (животных одной и той же группы исследовали до и после обработки) показано, что непикастат в концентрациях 4 и 10 мг/кг/сутки оказывал значимое влияние на симптомы паркинсонизма по сравнению с состоянием после повреждения МФТП (оценка до обработки). Плацебо оказывал пограничный значимый эффект. Используя такое попарное сравнение показали, что дозы 5 и 7,5 мг/кг L-ДОФА оказывали значимое влияние по сравнению с состоянием после повреждения МФТП во всех группах, за исключением животных группы B (не было эффекта в дозе 5 мг/кг L-ДОФА) и группы C (не было эффекта в дозе 7,5 мг/кг L-ДОФА). Однако 2,5 мг/кг L-ДОФА не оказывал значимого влияния.
Настоящее исследование также показало, что парный анализ, который уменьшает вариабельность между животными при сравнении одного и того же животного до и после обработки, лучше подходит для выявления значимого эффекта лекарственного средства, чем использование дизайна непарного исследования, когда используют меньшее количество животных.
Пример 24
Самцы спонтанно гипертензивных крыс (280-345 г; Charles River Labs, Kingston, NY) голодали в течение ночи, затем их анестезировали эфиром. В бедренную артерию и бедренную вену вставляли канюли с трубкой PE50 для регистрации кровяного давления и введения соединений соответственно. Затем животных помещали в устройства для ограничения движений MAYO, а их лапы нетуго привязывали к устройству для ограничения движения. Использовали физиологический раствор с гепарином (50 единиц гепарина натрия/мл) для поддержания проходимости каждой канюли на протяжении эксперимента. Непрерывно регистрировали следующие параметры, используя компьютерную программу BioRepirtTM Modular Instruments MI2, установленную на персональном компьютере IBM: среднее артериальное давление (MAP), частоту сердечных сокращений (HR), изменения по сравнению с исходным уровнем каждого параметра в указанных временных точках в эксперименте.
Все соединения растворяли в день применения. Непикастат растворяли в деионизованной воде (наполнитель) до концентрации свободного основания 1 мг/мл. Объем пероральной дозы непикастата или наполнителя составлял 10 мл/кг. SCH-23390 растворяли в физиологическом растворе (наполнитель) до концентрации свободного основания 0,2 мг/мл. Непикастат или физиологический раствор вводили внутривенно в виде болюса в объеме 1,0 мл/кг с последующим введением 0,2 мл изотонического раствора соли для промывки.
После хирургической подготовки каждому животному давали период восстановления, составляющий минимум один час. Животных случайным образом делили на четыре группы обработки: наполнитель (внутривенно)/наполнитель (перорально); наполнитель (внутривенно)/непикастат (перорально); SCH-23390 (внутривенно)/наполнитель (перорально); или SCH-23390 (внутривенно)/непикастат (перорально). После стабилизации состояния животных (минимум один час) кровяное давление и частоту сердечных сокращений исходного уровня определяли, вычисляя среднее значение каждого параметра на протяжении 15-минутного периода времени. После установления кровяного давления и частоты сердечных сокращений исходного уровня животным вводили внутривенно либо дозы SCH-23390 (200 мкг/кг), либо наполнитель (физиологический раствор, 1 мл/кг). Через пятнадцать минут животным перорально вводили либо дозы непикастата (10 мг/кг), либо наполнитель (деионизованную воду, 10 мл/кг).
Регистрируемые параметры измеряли за 15 минут до внутривенного введения доз, чтобы установить кровяное давление и частоту сердечных сокращений исходного уровня. Затем регистрируемые параметры измеряли через 5, 10 и 15 минут после внутривенного введения SCH-23390 или наполнителя. После перорального введения непикастата или наполнителя регистрируемые параметры измеряли во временных точках 15, 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210 и 240 минут.
В конце эксперимента каждое животное анестезировали галотаном и подвергали эвтаназии обезглавливанием. Кору головного мозга, левый желудочек (верхнюю часть) и брыжеечную артерию вырезали, взвешивали и фиксировали в 0,4 M перхлорной кислоте. Затем ткани замораживали в жидком азоте и хранили при -70ºC. Биохимический анализ будет осуществлен на таких тканях позднее, чтобы определить уровни катехоламинов (в частности, дофамина и норэпинефрина). Результаты анализа будут сообщены позднее. Кровяное давление и частоту сердечных сокращений анализировали отдельно. Изменение по сравнению с исходным уровнем кровяного давления и частоты сердечных сокращений анализировали дисперсионным анализом (ANOVA), оценивая эффекты обработки, времени и их взаимодействия. Такой анализ осуществляли в течение периода времени после внутривенного введения и в течение периода времени после пероральной обработки. Дополнительные анализы осуществляли в каждой временной точке, используя ANOVA с оценкой главного эффекта времени. Попарные сравнения осуществляли после каждого ANOVA, используя способ LSD Фишера с поправкой Бонферрони, когда полный эффект обработки был незначимым.
Дополнительный анализ осуществляли для сравнения средних значений исходного уровня для каждой группы обработки посредством ANOVA с главным эффектом обработки и последующих попарных сравнений. Осуществляли сравнения SCH-23390 (внутривенно)/наполнитель (перорально) по сравнению с наполнитель (внутривенно)/наполнитель (перорально), наполнитель (внутривенно)/непикастат (перорально) по сравнению с наполнитель (внутривенно)/наполнитель (перорально), и SCH-23390 (внутривенно)/непикастат(перорально) по сравнению с наполнитель (внутривенно)/непикастат (перорально).
Не было значимых различий в частоте сердечных сокращений или среднем артериальном давлении исходного уровня между группами обработки (фигура 173).
Внутривенная обработка SCH-23390 приводила к значимому снижению (p<0,05) частоты сердечных сокращений во время периода после пероральной обработки во временных точках 120 минут и 240 минут по сравнению с контролем, обработанным наполнителем (фиг. 174). Непикастат не снижал частоту сердечных сокращений так сильно, как наблюдали у обработанных наполнителем животных. Различие было статистически значимым (p<0,05) через 150 и 180 минут после введения дозы (фиг. 174). Следует отметить большую вариабельность в частоте сердечных сокращений, наблюдаемую в ходе настоящего эксперимента.
Внутривенное введение SCH-23390 приводило к небольшому (5±1 мм Hg), но тем не менее значимому снижению (p<0,05) среднего артериального давления по сравнению с животными, которые получали наполнитель в течение 15-минутного периода после внутривенного введения (фиг. 175). Пероральная обработка непикастатом вызывала значимое снижение (p<0,05) среднего артериального давления в точке 30 минут после введения дозы, которое длилось на протяжении эксперимента (фиг. 175). Предварительная обработка SCH-23390 значимо не ослабляла противогипертонические эффекты, наблюдаемые в случае введения непикастата отдельно (фиг. 175).
Пример 25
Использовали самцов крыс CrI:COBS(WI)BR 15-недельного возраста. Двадцати четырем крысам хронически имплантировали имплантаты для телеметрии (TA11PA-C40, Data Sciences, Inc., St. Paul, MN) для изменения артериального кровяного давления, частоты сердечных сокращений и моторной активности. Крысу анестезировали пентобарбиталом натрия (60 мг/кг, в/б) и брюшную сторону тела брили. В асептических условиях делали разрез по средней линии. Обнажали брюшную аорту и вставляли канюлю с катетером телеметрического передатчика. После сшивания передатчика с брюшными мышцами кожу закрывали. Каждой крысе давали возможность восстановиться, по меньшей мере, в течение 2 недель до введения лекарственного средства. За три дня до начала эксперимента крыс случайным образом делили на 4 группы обработки: наполнитель (перорально), гидралазин (10 мг/кг, перорально), непикастат (30 мг/кг, перорально), непикастат (100 мг/кг, перорально).
Контролировали систолическое кровяное давление (SBP), диастолическое кровяное давление (DBP), среднее кровяное давление (MBP), частоту сердечных сокращений (HR) и моторную активность (MA). После установления значений указанных параметров доведения дозы, соответствующие группы крыс получали в течение 7 дней ежедневную обработку наполнителем, непикастатом или гидралазином. Типичные данные MBP, HR и MA до введения доз представлены на фигурах 176-178.
Непикастат и гидралазин готовили в воде со следовыми количествами Tween 80. Все дозы вводили крысе перорально по 10 мл/кг и рассчитывали в эквивалентах свободного основания.
Использовали компьютеризованную систему сбора данных для непрерывного сбора данных SBP, DBP, MBP, HR и MA. Данные для каждой крысы собирали через каждые 5 минут в течение 10 секунд. Затем усредняли по часам и вычисляли стандартные ошибки среднего (SE). В настоящей публикации представлены только данные MBP, HR и MA. Для ясности столбики SE и указания уровней значимости на фигурах убрали (см. фигуру 186, где указаны уровни значимости для каждой временной точки MBP для крыс, обработанных руфмамидом, и фигуру 187 для крыс, обработанных гидралазином). Массы тела регистрировали ежедневно.
Все значения выражали в виде средних±SEM. Статистическую значимость определяли в виде уровня p менее 0,05.
Данные MBP, HR и MA анализировали отдельно. Каждый анализ осуществляли в 26 временных точках, измеряемых каждый день. Использовали двухфакторный ANOVA с главными эффектами обработки и времени и их взаимодействия. Если полный эффект обработки или значимое взаимодействие не выявляли, то могли осуществлять серию однофакторных ANOVA в каждой временной точке. Попарные сравнения в каждой временной точке осуществляли, используя критерий Данна. Если определяли отсутствие общего эффекта обработки, то могли находить попарное различие с контролем посредством корректировки критического значения, используя поправку Бонферрони.
В случае массы тела использовали двухфакторный ANOVA в отношении изменений по сравнению со значениями до введения доз, чтобы проанализировать полные эффекты обработки, дня и взаимодействия обработки и дня. Затем осуществляли однофакторный ANOVA для каждого дня и осуществляли попарные сравнения групп обработки лекарственным средством с обработанными наполнителем контролями, используя тест Данна и тест LSD Фишера для корректировки множественных сравнений.
При пероральном введении непикастата в дозе 30 мг/кг (все указанные далее дозы были пероральными) выявлена тенденция к медленному снижению кровяного давления, не происходило индукции стойкого гипотензивного эффекта в 1 день (фигура 179). По мере прогрессирования эффекта наблюдали максимальный гипотензивный эффект -10 мм Hg на 2 день в 13 часов (фигура 180). Сходные степени противогипертонических эффектов были индуцированы на протяжении исследования. В дозе 100 мг/кг соединение индуцировало максимальный противогипертонический ответ -11 мм Hg через 22 часа после введения дозы в 1 день (p<0,01; фигура 179). MBP продолжало снижаться и достигало своего низшего уровня примерно -17 мм Hg на 3 день (p<0,01; фигура 181). MBP оставалось низким на протяжении исследования (см. фигуру 182, 7 день).
Гидралазин в дозе мг/кг вызывал немедленный гипотензивный эффект, который убывал к 10 часам (фигура 179). Максимальное снижение -24 мм Hg (p<0,01) MBP наблюдали в течение 1 часа после введения дозы в 1 день (фигура 179). Сходные временные гипотензивные эффекты наблюдали на протяжении исследования (см. фигуры 179-182).
Непикастат в дозе 30 и 100 мг/кг соответственно не влиял на HR в 1 день. Однако во 2 день непикастат в дозе 100 мг/кг вызывал брадикардический ответ - 100 ударов/мин через 3 часа после введения дозы (фигура 183). Значимые, но менее выраженные брадикардические ответы наблюдали на 3-7 день.
В сравнении гидралазин в дозе 10 мг/кг индуцировал разные степени тахикардии на протяжении исследования (см. фигуру 183).
На протяжении исследования ни одна из обработок лекарственными средствами не оказывала соответствующего влияния на MA (например, см. фигуру 184, день 3).
По сравнению с обработкой наполнителем ни одна из обработок лекарственными средствами не влияла на массы тела (p<0,05; фигура 185). Хотя обработка непикастатом в дозе 100 мг/кг имела тенденцию снижать массу тела на 3 день, такое снижение не было статистически значимым.
Специалисту в данной области будет легко понятно, что другие подходящие модификации и адаптации способов и применений, описанных в настоящей публикации, пригодны и могут быть осуществлены не отходя от сути изобретения или любого его варианта. Хотя изобретение описано в связи с конкретными вариантами его осуществления, при этом не имеют в виду ограничение изобретения конкретными указанными формами, а напротив, подразумевается, что изобретение охватывает такие альтернативные варианты, модификации и эквиваленты, которые могут быть включены в сущность и объем изобретения, которые определены следующей формулой изобретения.

Claims (18)

1. Способ лечения посттравматического стрессового расстройства у пациента, включающий введение пациенту терапевтически эффективного количества ((S)-5-аминометил-1-(5,7-дифтор-1,2,3,4-тетрагидронафт-2-ил)-2,3-дигидро-2-тиоксо-1Н-имидазола), ((R)-5-аминометил-1-(5,7-дифтор-1,2,3,4-тетрагидронафт-2-ил)-2,3-дигидро-2-тиоксо-1Н-имидазола), их фармацевтически приемлемой соли или их смеси.
2. Способ по п.1,
где пациент имеет аномальные уровни, по меньшей мере, одного катехоламина в головном мозге;
или где введение ((S)-5-аминометил-1-(5,7-дифтор-1,2,3,4-тетрагидронафт-2-ил)-2,3-дигидро-2-тиоксо-1Н-имидазола), ((R)-5-аминометил-1-(5,7-дифтор-1,2,3,4-тетрагидронафт-2-ил)-2,3-дигидро-2-тиоксо-1Н-имидазола), их фармацевтически приемлемой соли или их смеси уменьшает активность дофамин-β-гидроксилазы в головном мозге пациента; или
где введение ((S)-5-аминометил-1-(5,7-дифтор-1,2,3,4-тетрагидронафт-2-ил)-2,3-дигидро-2-тиоксо-1Н-имидазола), ((R)-5-аминометил-1-(5,7-дифтор-1,2,3,4-тетрагидронафт-2-ил)-2,3-дигидро-2-тиоксо-1Н-имидазола),
их фармацевтически приемлемой соли или их смеси модулирует уровни, по меньшей мере, одного катехоламина в головном мозге пациента; или
где введение ((S)-5-аминометил-1-(5,7-дифтор-1,2,3,4-тетрагидронафт-2-ил)-2,3-дигидро-2-тиоксо-1Н-имидазола), ((R)-5-аминометил-1-(5,7-дифтор-1,2,3,4-тетрагидронафт-2-ил)-2,3-дигидро-2-тиоксо-1Н-имидазола), их фармацевтически приемлемой соли или их смеси уменьшает стресс, ассоциированный с воспоминанием у пациента.
3. Способ по п.1, где введение ((S)-5-аминометил-1-(5,7-дифтор-1,2,3,4-тетрагидронафт-2-ил)-2,3-дигидро-2-тиоксо-1Н-имидазола), ((R)-5-аминометил-1-(5,7-дифтор-1,2,3,4-тетрагидронафт-2-ил)-2,3-дигидро-2-тиоксо-1Н-имидазола), их фармацевтически приемлемой соли или их смеси уменьшает частоту возникновения, по меньшей мере, одного расстройства, встречающегося у пациента в сочетании с посттравматическим стрессовым расстройством, выбранного из злоупотребления лекарственными веществами, злоупотребления алкоголем и депрессии.
4. Способ по п.1, включающий:
диагностику пациента, имеющего посттравматическое стрессовое расстройство;
введение пациенту ((S)-5-аминометил-1-(5,7-дифтор-1,2,3,4-тетрагидронафт-2-ил)-2,3-дигидро-2-тиоксо-1H-имидазола), ((R)-5-аминометил-1-(5,7-дифтор-1,2,3,4-тетрагидронафт-2-ил)-2,3-дигидро-2-тиоксо-1Н-имидазола), их фармацевтически приемлемой соли или их смеси;
оценку, по меньшей мере, одного признака, симптома и кластера симптомов посттравматического стрессового расстройства; и
определение того, что состояние при синдроме посттравматического стресса улучшается, если введение ((S)-5-аминометил-1-(5,7-дифтор-1,2,3,4-тетрагидронафт-2-ил)-2,3-дигидро-2-тиоксо-1Н-имидазола), ((R)-5-аминометил-1-(5,7-дифтор-1,2,3,4-тетрагидронафт-2-ил)-2,3-дигидро-2-тиоксо-1Н-имидазола), их фармацевтически приемлемой соли или их смеси уменьшает, по меньшей мере, один признак, симптом и кластер симптомов посттравматического стрессового расстройства.
5. Способ по п.4,
где введение ((S)-5-аминометил-1-(5,7-дифтор-1,2,3,4-тетрагидронафт-2-ил)-2,3-дигидро-2-тиоксо-1Н-имидазола), ((R)-5-аминометил-1-(5,7-дифтор-1,2,3,4-тетрагидронафт-2-ил)-2,3-дигидро-2-тиоксо-1Н-имидазола), их фармацевтически приемлемой соли или их смеси уменьшает, по меньшей мере, один из показателей: частоту и интенсивность, по меньшей мере, одного симптома посттравматического стрессового расстройства у пациента, или
где введение ((S)-5-аминометил-1-(5,7-дифтор-1,2,3,4-тетрагидронафт-2-ил)-2,3-дигидро-2-тиоксо-1Н-имидазола), ((R)-5-аминометтл-1-(5,7-дифтор-1,2,3,4-тетрагидронафт-2-ил)-2,3-дигидро-2-тиоксо-1Н-имидазола), их фармацевтически приемлемой соли или их смеси уменьшает, по меньшей мере, один из показателей: частоту и интенсивность, по меньшей мере, одного кластера симптомов посттравматического стрессового расстройства у пациента, при этом кластер симптомов выбран из повторного переживания/вторжения, избегания/блокировки и гипервозбуждения.
6. Способ по п.1 или 4, где способ дополнительно включает совместное введение, по меньшей мере, одного другого средства, выбранного из бензодиазепина, селективного ингибитора обратного захвата серотонина (SSRI), ингибитора обратного захвата серотонина-норэпинефрина (SNRI), ингибитора обратного захвата норэпинефрина (NRI), антагониста серотонин-5-гидрокситриптамина 1А (5НТ1А), ингибитора дофамин-β-гидроксилазы, антагониста рецептора аденозина А2А, ингибитора моноаминоксидазы (MAOI), блокатора натриевых (Na) каналов, блокатора кальциевых каналов, антагониста центральных и периферических альфа-адренергических рецепторов, агониста центральных альфа-адренергических рецепторов, антагониста центральных или периферических бета-адренергических рецепторов, антагониста рецептора NK-I, антагониста кортикотропин-рилизинг фактора (CRF), атипичного антидепрессанта/антипсихотического средства, трициклического средства, противосудорожного средства, антагониста глутамата, агониста гамма-аминомасляной кислоты (GABА) и частичного агониста D2.
7. Способ по п.1 или 4, где введение ((S)-5-аминометил-1-(5,7-дифтор-1,2,3,4-тетрагидронафт-2-ил)-2,3-дигидро-2-тиоксо-1Н-имидазола), ((R)-5-аминометил-1-(5,7-дифтор-1,2,3,4-тетрагидронафт-2-ил)-2,3-дигидро-2-тиоксо-1Н-имидазола), их фармацевтически приемлемой соли или их смеси уменьшает, по меньшей мере, один из показателей: частоту и интенсивность, по меньшей мере, одного признака посттравматического стрессового расстройства у пациента.
8. Способ по п.1, где пациент является ребенком, подростком или взрослым человеком.
9. Способ повышения способности пациента переживать травматическое событие, при этом не страдая от посттравматического стрессового расстройства, или с развитием такого расстройства, но с меньшей симптоматикой после травматического события или меньшим нарушением нормальной активности в повседневной жизни, включающий введение пациенту терапевтически эффективного количества ((S)-5-аминометил-1-(5,7-дифтор-1,2,3,4-тетрагидронафт-2-ил)-2,3-дигидро-2-тиоксо-1Н-имидазола), ((R)-5-аминометил-1-(5,7-дифтор-1,2,3,4-тетрагидронафт-2-ил)-2,3-дигидро-2-тиоксо-1Н-имидазола), их фармацевтически приемлемой соли или их смеси.
10. Способ по п.9, где способ дополнительно включает совместное введение, по меньшей мере, одного другого средства, выбранного из бензодиазепина, селективного ингибитора обратного захвата серотонина (SSRI), ингибитора обратного захвата серотонина-норэпинефрина (SNRI), ингибитора обратного захвата норэпинефрина (NRI), антагониста серотонин-5-гидрокситриптамина 1А (5НТ1А), ингибитора дофамин-β-гидроксилазы, антагониста рецептора аденозина А2А, ингибитора моноаминоксидазы (MAOI), блокатора натриевых (Na) каналов, блокатора кальциевых каналов, антагониста центральных и периферических альфа-адренергических рецепторов, агониста центральных альфа-адренергических рецепторов, антагониста центральных или периферических бета-адренергических рецепторов, антагониста рецептора NK-I, антагониста кортикотропин-рилизинг фактора (CRF), атипичного антидепрессанта/антипсихотического средства, трициклического средства, противосудорожного средства, антагониста глутамата, агониста гамма-аминомасляной кислоты (GABA) и частичного агониста D2.
11. Способ по п.10, где, по меньшей мере, одно другое средство представляет собой SSRI, выбранный их пароксетина, сертралина, циталопрама, эсциталопрама и флуоксетина.
12. Способ по п.10, где, по меньшей мере, одно другое средство представляет собой SNRI, выбранный из дулоксетина, миртазапина и венлафаксина.
13. Способ по п.10, где, по меньшей мере, одно другое средство представляет собой NRI, выбранный из бупропиона и атомоксетина.
14. Способ по п.10, где, по меньшей мере, одно другое средство представляет собой ингибитор дофамин-β-гидроксилазы: дисульфирам.
15. Способ по п.9, где введение ((S)-5-аминометил-1-(5,7-дифтор-1,2,3,4-тетрагидронафт-2-ил)-2,3-дигидро-2-тиоксо-1Н-имидазола), ((R)-5-аминометил-1-(5,7-дифтор-1,2,3,4-тетрагидронафт-2-ил)-2,3-дигидро-2-тиоксо-1Н-имидазола), их фармацевтически приемлемой соли или их смеси уменьшает, по меньшей мере, один из показателей: частоту и интенсивность, по меньшей мере, одного признака посттравматического стрессового расстройства у пациента.
16. Способ диагностики посттравматического стрессового расстройства у пациента, у которого предполагается наличие посттравматического стрессового расстройства, включающий:
введение пациенту терапевтически эффективного количества ((S)-5-аминометил-1-(5,7-дифтор-1,2,3,4-тетрагидронафт-2-ил)-2,3-дигидро-2-тиоксо-1 Н-имидазола), ((R)-5-аминометил-1-(5,7-дифтор-1,2,3,4-тетрагидронафт-2-ил)-2,3-дигидро-2-тиоксо-1Н-имидазола), их фармацевтически приемлемой соли или их смеси; и оценку, по меньшей мере, одного признака, симптома или кластера симптомов посттравматического стрессового расстройства; и
диагностику посттравматического стрессового расстройства у пациента, если введение ((S)-5-аминометил-1-(5,7-дифтор-1,2,3,4-тетрагидронафт-2-ил)-2,3-дигидро-2-тиоксо-1Н-имидазола), ((R)-5-аминометил-1-(5,7-дифтор-1,2,3,4-тетрагидронафт-2-ил)-2,3-дигидро-2-тиоксо-1Н-имидазола), их фармацевтически приемлемой соли или их смеси уменьшает, по меньшей мере, один признак, симптом и кластер симптомов постгравматического стрессового расстройства.
17. Способ по п.16, где пациент является ребенком, подростком или взрослым человеком.
18. Способ по п.17, где ((S)-5-аминометил-1-(5,7-дифтор-1,2,3,4-тетрагидронафт-2-ил)-2,3-дигидро-2-тиоксо-1Н-имидазола), ((R)-5-аминометил-1-(5,7-дифтор-1,2,3,4-тетрагидронафт-2-ил)-2,3-дигидро-2-тиоксо-1Н-имидазола), их фармацевтически приемлемой соли или их смеси уменьшает, по меньшей мере, один из показателей: частоту и интенсивность, по меньшей мере, одного признака или симптома посттравматического стрессового расстройства у пациента, при этом признак или симптом выбран из дезорганизованного или возбужденного поведения, периодически повторяющихся игр, которые отображают аспекты травмы, ночных кошмаров, в которых отсутствует распознаваемое содержание, и специфичного для травмы повторяющегося поведения.
RU2010106014/15A 2007-07-23 2008-07-23 Лечение посттравматического стрессового расстройства RU2458691C2 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US93503607P 2007-07-23 2007-07-23
US60/935,036 2007-07-23

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RU2010106014A RU2010106014A (ru) 2011-08-27
RU2458691C2 true RU2458691C2 (ru) 2012-08-20

Family

ID=40281815

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2010106014/15A RU2458691C2 (ru) 2007-07-23 2008-07-23 Лечение посттравматического стрессового расстройства

Country Status (12)

Country Link
US (1) US20090054403A1 (ru)
EP (1) EP2182952A4 (ru)
JP (1) JP2010534676A (ru)
CN (1) CN101951912A (ru)
AU (1) AU2008279091A1 (ru)
CA (1) CA2707858A1 (ru)
CO (1) CO6260078A2 (ru)
MX (1) MX2010000937A (ru)
NZ (1) NZ583193A (ru)
RU (1) RU2458691C2 (ru)
SG (1) SG183069A1 (ru)
WO (1) WO2009015248A1 (ru)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2614697C1 (ru) * 2016-04-12 2017-03-28 Общество с ограниченной ответственностью "Нормофарм" Нейропротекторное средство

Families Citing this family (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2010534674A (ja) * 2007-07-23 2010-11-11 シノシア・セラピューティクス 心的外傷後ストレス障害の治療用４−ヒドロキシ−４−メチル−ピペリジン−１−カルボン酸（４−メトキシ−７−モルホリン−４−イル−ベンゾチアゾール−２−イル）−アミド
WO2009021055A1 (en) * 2007-08-06 2009-02-12 Synosia Therapeutics, Inc. Methods for treating dependence
AU2016208412A1 (en) * 2007-08-06 2016-08-18 Biotie Therapies, Inc. Methods for treating dependence
RS56634B1 (sr) * 2009-11-20 2018-03-30 Tonix Pharma Holdings Ltd Postupci i kompozicije za lečenje simptoma povezanih sa posttraumatskim stresnim poremećajem korišćenjem ciklobenzaprina
US20110319389A1 (en) 2010-06-24 2011-12-29 Tonix Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for treating fatigue associated with disordered sleep using very low dose cyclobenzaprine
US11998516B2 (en) 2011-03-07 2024-06-04 Tonix Pharma Holdings Limited Methods and compositions for treating depression using cyclobenzaprine
ES2769879T3 (es) 2013-03-15 2020-06-29 Tonix Pharma Holdings Ltd Formulaciones eutécticas de clorhidrato de ciclobenzaprina y manitol
WO2015081166A1 (en) * 2013-11-26 2015-06-04 University Of North Texas Health Science Center At Fort Worth Personalized medicine approach for treating cognitive loss
CA2961822A1 (en) 2014-09-18 2016-03-24 Tonix Pharma Holdings Limited Eutectic formulations of cyclobenzaprine hydrochloride
JOP20190049A1 (ar) 2016-09-23 2019-03-20 Bial Portela & C? S A مثبطات دوبامين-b-هيدروكسيلاز
KR20200015534A (ko) * 2017-05-30 2020-02-12 폴 지. 에머슨 스트레스 장애에서 호르몬 연쇄반응(hormonal cascade)을 조절하는 조성물 및 방법
US11116564B2 (en) * 2017-07-05 2021-09-14 Medtronic Ardian Luxembourg S.A.R.L. Methods for treating anxiety disorders in patients via renal neuromodulation
CA3082337A1 (en) 2017-12-04 2019-06-13 Bial - Portela & Ca, S.A. Dopamine-b-hydroxylase inhibitors
BR112020011345A2 (pt) 2017-12-11 2020-11-17 Tonix Pharma Holdings Limited tratamento com ciclobenzaprina para agitação, psicose e declínio cognitivo na demência e condições neurodegenerativas
CN109966281B (zh) * 2019-04-11 2021-04-27 北京大学 PAO作为Pi4KIIα抑制剂在制备治疗创伤后应激障碍药物中的应用
CN114555071A (zh) * 2019-07-25 2022-05-27 学校法人东京理科大学 治疗、预防或改善精神/神经系统的疾病或症状的药剂
WO2024118912A1 (en) * 2022-11-30 2024-06-06 Blinklab Ltd Psychopharmacological system and method using eyelid tracking

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6391922B1 (en) * 1998-01-13 2002-05-21 Synchroneuron, Llc Treatment of posttraumatic stress disorder, obsessive-compulsive disorder and related neuropsychiatric disorders
MXPA04002389A (es) * 2001-09-13 2004-05-31 Schering Corp Combinacion de un antagonista del receptor de adenosian a2a y un antidepresivo o ansiolitico.
EP1336406A1 (en) * 2002-02-14 2003-08-20 Solvay Pharmaceuticals B.V. Partial dopamine-D2 receptor agonist plus serotonin and/or noradrenaline inhibitory activity
EP1499309A4 (en) * 2002-04-24 2008-05-28 Cypress Bioscience Inc PREVENTION AND TREATMENT OF FUNCTIONAL SOMATIC DISEASES, INCLUDING STRESS-BASED DISEASES
EP1734920A2 (en) * 2004-02-13 2006-12-27 Neuromolecular Inc. Combination of a nmda receptor antagonist and an mao-inhibitor or a gadph-inhibitor for the treatment of psychiatric conditions
JP2008531714A (ja) * 2005-03-04 2008-08-14 ベーリンガー インゲルハイム インターナショナル ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング 不安障害の治療用及び／又は予防用の医薬組成物
JP2009500421A (ja) * 2005-07-06 2009-01-08 セプラコア インコーポレーテッド エスゾピクロン及び抗うつ薬の組み合わせ
WO2008115706A1 (en) * 2007-03-16 2008-09-25 Emory University Methods and compositions for treatment of drug addiction
US20090054414A1 (en) * 2007-07-23 2009-02-26 Synosia Therapeutics Rufinamide for the Treatment of Post-Traumatic Stress Disorder

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
КОСОВА Е.Г. Психическая ригидность как фактор развития посттравматического стрессового расстройства у сотрудников оперативных подразделений, перенесших боевой стресс. Диссертация. - Томск, 2005. PETRAKIS I.L. et al. Naltrexone and disulfiram in patients with alcohol dependence and comorbid post-traumatic stress disorder. Biol Psychiatry. 2006 Oct 1; 60(7):777-783. STANLEY W.C. et al. Catecholamine modulatory effects of nepicastat (RS-25560-197), a novel, potent and selective inhibitor of dopamine-beta-hydroxylase. Br J Pharmacol. 1997 Aug; 121(8): 1803-1809. HAMNER M.B. Plasma dopamine beta-hydroxylase activity in psychotic and non-psychotic post-traumatic stress disorder. Psychiatry Res. 1998 Feb 27; 77(3): 175-181. *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2614697C1 (ru) * 2016-04-12 2017-03-28 Общество с ограниченной ответственностью "Нормофарм" Нейропротекторное средство

Also Published As

Publication number Publication date
JP2010534676A (ja) 2010-11-11
EP2182952A1 (en) 2010-05-12
SG183069A1 (en) 2012-08-30
AU2008279091A1 (en) 2009-01-29
US20090054403A1 (en) 2009-02-26
CA2707858A1 (en) 2009-01-29
CO6260078A2 (es) 2011-03-22
NZ583193A (en) 2012-05-25
RU2010106014A (ru) 2011-08-27
MX2010000937A (es) 2010-06-25
EP2182952A4 (en) 2010-09-08
WO2009015248A1 (en) 2009-01-29
CN101951912A (zh) 2011-01-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2458691C2 (ru) Лечение посттравматического стрессового расстройства
US20200383951A1 (en) Methods for treating dependence
US10632124B2 (en) Adrenoceptors antagonists for the prevention and treatment of neurodegenerative conditions
WO2010124089A2 (en) Methods for treating dependence
AU2018203524B2 (en) Methods for treating dependence
WO2021139874A1 (en) Cognitive disorder prevention and therapy
US20200129528A1 (en) Methods for treating blood pressure conditions using aminosterol compositions
EP4009942B1 (en) Compound for combination treatment
AU2014202047A1 (en) Methods for treating dependence
Siever et al. Extreme elevations in plasma norepinephrine associated with decreased α-adrenergic responsivity in major depressive disorder: Two case reports
US20210315907A1 (en) Compositions and methods for treating brain-gut disorders
US20200038415A1 (en) Aminosterol compositions and methods of using the same for treating erectile dysfunction
US20200038416A1 (en) Methods of treating cardiac conduction defects using aminosterol compositions
STEINHEYER et al. Basic and Clinical Aspects of Depression
Rapole et al. Comparative Study of Atenolol And Nebivolol on Hypertension And Heart Rate in Hypertensive Patients

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A The patent is invalid due to non-payment of fees

Effective date: 20130724