RU2425368C1

RU2425368C1 - Method of biological material analysis for 1,1'-ethylene-2,2'-dipyridyliumdibromide

Info

Publication number: RU2425368C1
Application number: RU2010116598/15A
Authority: RU
Inventors: Владимир Камбулатович Шорманов (RU); Владимир Камбулатович Шорманов; Вадим Васильевич Чупак (RU); Вадим Васильевич Чупак; Полина Ивановна Вашко (RU); Полина Ивановна Вашко; Екатерина Анатольевна Писарева (RU); Екатерина Анатольевна Писарева
Original assignee: Владимир Камбулатович Шорманов; Вадим Васильевич Чупак; Полина Ивановна Вашко; Екатерина Анатольевна Писарева
Priority date: 2010-04-26
Filing date: 2010-04-26
Publication date: 2011-07-27

Abstract

FIELD: medicine.

SUBSTANCE: biological material is double processed by the mixed solvents of ethanol 1 n. hydrochloric acid solution (8:2 volume) in a heating to boiling environment, boiled for 10-15 minutes and kept for 35 minutes without heating; the produced extracts are separated from a solid residue, merged, filtered through a paper filter; the filtrate is steamed at 85-95°C to a solid residue; the residue is dissolved in the mixed solvents of acetonitrile 1 n. sulphuric acid solution 2:8 volume, chromatographed in a column filled with Silasorb S-18 sorbent with using a mobile phase of acetonitrile - 1 n. sulphuric acid solution 2:8 volume, eluate fractions containing an analysed substance, merged, steamed at 200°C in an air flow to produce the solid residue; the residue is water-dissolved, processed at first with the mixed solutions of sodium hydrocarbonate and glucose in a heating environment at 100°C, then with dimethylformamide in a heating environment at 100°C for 5 minutes to cool the prepared stained solution and to measure its optical density at 440 nm.

EFFECT: higher analysis accuracy.

2 ex, 3 tbl

Description

Изобретение относится к биологии, экологии, токсикологической химии, а именно к способам определения 1,1'-этилен-2,2'-дипиридилийдибромида в биологическом материале, и может быть использовано в практике санэпидстанций, химико-токсикологических, ветеринарных и экологических лабораторий. Способ относится к числу массовых.The invention relates to biology, ecology, toxicological chemistry, and in particular to methods for the determination of 1,1'-ethylene-2,2'-dipyridylidibromide in biological material, and can be used in the practice of sanitary-epidemiological, chemical-toxicological, veterinary and environmental laboratories. The method belongs to the mass.

Известен способ определения органических веществ основного характера, к которым относится 1,1'-этилен-2,2'-дипиридилийдибромид, заключающийся в том, что биологический объект измельчают, неоднократно настаивают с подкисленным этанолом (каждый раз в течение суток), отдельные извлечения объединяют, объединенное извлечение концентрируют, осаждают в нем белки и некоторые другие эндогенные вещества биоматериала абсолютным этанолом, выпавший осадок отфильтровывают, процесс концентрирования объединенного извлечения, осаждения в нем эндогенных веществ биоматериала и отделения осадка фильтрованием неоднократно повторяют до прекращения появления осадка, фильтрат сгущают до густоты сиропа, разбавляют водой и экстрагируют анализируемые соединения вначале из кислого, а затем из щелочного раствора (Швайкова М.Д. Токсикологическая химия. - М.: Медицина, 1975. - С.119-123). Способ трудоемок, длителен по выполнению, характеризуется низкой степенью извлечения 1,1'-этилен-2,2'-дипиридилийдибромида.A known method of determining organic substances of a basic nature, which includes 1,1'-ethylene-2,2'-dipyridylidibromide, which consists in the fact that the biological object is crushed, repeatedly infused with acidified ethanol (each time during the day), separate extracts are combined , the combined extraction is concentrated, proteins and some other endogenous substances of the biomaterial are precipitated with absolute ethanol, the precipitate is filtered off, the concentration of the combined extraction is concentrated, the precipitation in it is endogenous substances of the biomaterial and separating the precipitate by filtration are repeatedly repeated until the precipitate ceases, the filtrate is concentrated to a syrup, diluted with water and the analyzed compounds are extracted first from an acidic solution and then from an alkaline solution (Shvaikova M.D. Toxicological chemistry. - M.: Medicine, 1975 - S.119-123). The method is time consuming, time consuming, characterized by a low degree of extraction of 1,1'-ethylene-2,2'-dipyridylidibromide.

Известен способ определения 1,1'-этилен-2,2'-дипиридилийдибромида в биологическом материале (семенах подсолнечника), заключающийся в том, что к анализируемой пробе прибавляют порцию 1 н. раствора серной кислоты, масса которой в 5 раз превышает массу биологической пробы, кипятят образующуюся смесь с обратным холодильником в течение 3 часов, охлаждают, фильтруют через воронку Бюхнера, остаток на фильтре промывают трехкратно порциями воды, отдельные фильтраты объединяют, доводят до определенного объема водой, часть полученного раствора вначале обрабатывают 10 н. раствором гидроксида натрия, доводя pH среды до 8-9, а затем - 5% раствором динатриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты, доводя pH среды до 6-7, полученный раствор пропускают через колонку, заполненную катионитом КУ-2, находящимся в Н-форме, колонку промывают 2 н. раствором азотной кислоты, а затем дистиллированной водой до нейтральной реакции по универсальной индикаторной бумаге, элюируют анализируемое вещество 4 н. раствором хлороводородной кислоты, элюат собирают, упаривают до получения сухого остатка в условиях нагревания при 200°С в токе воздуха, остаток растворяют в 2 мл этанола, наносят на хроматографическую пластину «Силуфол» UV-254, хроматографируют, используя в качестве подвижной фазы этанол, хроматограмму высушивают и хроматографируют, используя подвижную фазу муравьиная кислота - вода (10:1), пластину высушивают, обрабатывают вначале 3% раствором бромтимолового синего в 50% этаноле, фиксируют появление пятна синего цвета на хроматограмме и определяют количество анализируемого вещества по площади окрашенного пятна (Методы определения микроколичеств пестицидов в продуктах питания, кормах и внешней среде. Т.2 / М.А.Клисенко, А.А.Калинина, К.Ф.Новикова, Г.А.Хохолькова. - М.: Колос, 1992. - С.24-26). Способ отличается недостаточно высокой точностью, длительностью и трудоемкостью процесса определения.A known method for the determination of 1,1'-ethylene-2,2'-dipyridylidibromide in biological material (sunflower seeds), which consists in the fact that a portion of 1 N. is added to the analyzed sample. sulfuric acid solution, whose mass is 5 times the mass of the biological sample, the resulting mixture is refluxed for 3 hours, cooled, filtered through a Buchner funnel, the filter residue is washed three times with portions of water, the individual filtrates are combined, adjusted to a certain volume with water, part of the resulting solution is initially treated with 10 N. a solution of sodium hydroxide, adjusting the pH of the medium to 8-9, and then a 5% solution of disodium salt of ethylenediaminetetraacetic acid, adjusting the pH of the medium to 6-7, the resulting solution is passed through a column filled with KU-2 cation exchanger, which is in the H-form, a column washed with 2 N. a solution of nitric acid, and then with distilled water until neutral, according to universal indicator paper, the analyte is eluted with 4 n. hydrochloric acid solution, the eluate is collected, evaporated to a dry residue under heating at 200 ° C in a stream of air, the residue is dissolved in 2 ml of ethanol, applied to a Silufol chromatography plate UV-254, chromatographed using ethanol as the mobile phase, the chromatogram is dried and chromatographed using the mobile phase formic acid - water (10: 1), the plate is dried, first treated with a 3% solution of bromothymol blue in 50% ethanol, a blue spot appears on the chromatogram and determined add the amount of the analyte according to the area of the stained spot (Methods for determining the microquantities of pesticides in food, feed and the environment. Vol. 2 / M.A. Klisenko, A.A. Kalinina, K.F. Novikova, G.A. Kholholkova. - M .: Kolos, 1992 .-- S.24-26). The method is not sufficiently high accuracy, duration and complexity of the determination process.

Наиболее близким является способ определения 1,1'-этилен-2,2'-дипиридилийдибромида в биологическом материале (молоке) путем неоднократной обработки биологической пробы изолирующим агентом кислотного характера (раствором трихлоруксусной кислоты), отделения полученных извлечений центрифугированием, фильтрования центрифугатов через бумажный фильтр, промывания фильтра раствором трихлоруксусной кислоты, объединения отдельных фильтратов и порций промывной жидкости, пропускания через колонку с катионитом КУ-2, находящимся в натриевой форме, промывания колонки 2,5%-ым водным раствором хлорида аммония, сбора части элюата, содержащей анализируемое вещество, прибавления к ней восстанавливающего реагента (раствора смеси гидросульфита и метабисульфита натрия) в разбавленном растворе гидроксида натрия с последующим измерением оптической плотности образующегося окрашенного раствора (Методы определения микроколичеств пестицидов в продуктах питания, кормах и внешней среде. Т.2 / М.А.Клисенко, А.А.Калинина, К.Ф.Новикова, Г.А.Хохолькова. - М.: Колос, 1992. - С.28-30). Способ отличается недостаточно высокой точностью определения.The closest is a method for determining 1,1'-ethylene-2,2'-dipyridylidibromide in a biological material (milk) by repeatedly treating the biological sample with an acid insulating agent (trichloroacetic acid solution), separating the obtained extracts by centrifugation, filtering centrifugates through a paper filter, washing the filter with a solution of trichloroacetic acid, combining individual filtrates and portions of the washing liquid, passing through a column with KU-2 cation exchanger, which is in sodium form washing the column with a 2.5% aqueous solution of ammonium chloride, collecting a portion of the eluate containing the analyte, adding a reducing reagent (a solution of a mixture of hydrosulfite and sodium metabisulfite) in a dilute solution of sodium hydroxide, followed by measuring the optical density of the resulting colored solution (Methods determination of trace amounts of pesticides in food, feed, and the environment T.2 / M.A. Klisenko, A.A. Kalinina, K.F. Novikova, G.A. Kholokhkova. - M .: Kolos, 1992 .-- S.28-30). The method is not sufficiently high definition accuracy.

Задачей настоящего изобретения является повышение точности определения.The present invention is to improve the accuracy of determination.

Поставленная цель достигается с помощью предлагаемого способа, который заключается в том, что биологическую пробу двукратно обрабатывают изолирующим агентом кислотного характера (смесью растворителей этанол - 1 н. раствор хлороводородной кислоты 8:2 по объему) в условиях нагревания до кипения, кипячения в течение 10-15 минут и выдерживания в течение 35 минут без нагревания, полученные извлечения отделяют от твердого остатка, объединяют, фильтруют через бумажный фильтр, фильтрат упаривают при 85-95°С до сухого остатка, остаток растворяют в смеси растворителей ацетонитрил - 1 н. раствор серной кислоты 2:8 по объему, хроматографируют в колонке, заполненной сорбентом «Силасорб С-18» с размером частиц 30 мкм, используя подвижную фазу ацетонитрил - 1 н. раствор серной кислоты 2:8 по объему, фракции элюата, содержащие анализируемое вещество, объединяют, упаривают при 200°С в токе воздуха до получения сухого остатка, остаток растворяют в воде, обрабатывают вначале смесью растворов гидрокарбоната натрия и восстанавливающего реагента (глюкозы) в условиях нагревания при 100°С в течение 10 минут, затем диметилформамидом в условиях нагревания при 100°С в течение 5 минут с последующим охлаждением образующегося окрашенного раствора и измерением его оптической плотности при 440 нм.This goal is achieved using the proposed method, which consists in the fact that the biological sample is treated twice with an acid insulating agent (ethanol solvent mixture - 1N solution of hydrochloric acid 8: 2 by volume) under heating to boiling, boiling for 10- 15 minutes and holding for 35 minutes without heating, the obtained extracts are separated from the solid residue, combined, filtered through a paper filter, the filtrate is evaporated at 85-95 ° C to a dry residue, the residue is dissolved in a mixture solvent acetonitrile - 1N. a solution of sulfuric acid 2: 8 by volume, chromatographic in a column filled with a Silyabsorb S-18 sorbent with a particle size of 30 μm, using a mobile phase acetonitrile - 1 N. a sulfuric acid solution of 2: 8 by volume, the eluate fractions containing the analyte are combined, evaporated at 200 ° C in an air stream until a dry residue is obtained, the residue is dissolved in water, first treated with a mixture of solutions of sodium bicarbonate and a reducing reagent (glucose) under conditions heating at 100 ° C for 10 minutes, then dimethylformamide under heating at 100 ° C for 5 minutes, followed by cooling the resulting colored solution and measuring its optical density at 440 nm.

Способ осуществляется следующим образом: биологический материал, содержащий 1,1'-этилен-2,2'-дипиридилийдибромид, двукратно обрабатывают изолирующим агентом кислотного характера (смесью растворителей этанол - 1 н. раствор хлороводородной кислоты 8:2 по объему) в условиях нагревания до кипения, кипячения в течение 10-15 минут и выдерживания в течение 35 минут без нагревания, полученные извлечения отделяют от твердого остатка, объединяют, фильтруют через бумажный фильтр, фильтрат упаривают при 85-95°С до сухого остатка, остаток растворяют в смеси растворителей ацетонитрил - 1 н. раствор серной кислоты 2:8 по объему, хроматографируют в колонке, заполненной сорбентом «Силасорб С-18» с размером частиц 30 мкм, используя подвижную фазу ацетонитрил - 1 н. раствор серной кислоты 2:8 по объему, фракции элюата, содержащие анализируемое вещество, объединяют, упаривают при 200°С в токе воздуха до получения сухого остатка, остаток растворяют в воде, обрабатывают вначале смесью растворов гидрокарбоната натрия и восстанавливающего реагента (глюкозы) в условиях нагревания при 100°С в течение 10 минут, затем диметилформамидом в условиях нагревания при 100°С в течение 5 минут с последующим охлаждением образующегося окрашенного раствора и измерением его оптической плотности при 440 нм. Способ иллюстрируется следующими примерами.The method is as follows: the biological material containing 1,1'-ethylene-2,2'-dipyridylidibromide is twice treated with an acid insulating agent (ethanol solvent mixture - 1 N solution of 8: 2 hydrochloric acid by volume) under conditions of heating to boiling, boiling for 10-15 minutes and keeping for 35 minutes without heating, the obtained extracts are separated from the solid residue, combined, filtered through a paper filter, the filtrate is evaporated at 85-95 ° С to a dry residue, the residue is dissolved in a mixture of ra solvent acetonitrile - 1 N. a solution of sulfuric acid 2: 8 by volume, chromatographic in a column filled with a Silyabsorb S-18 sorbent with a particle size of 30 μm, using a mobile phase acetonitrile - 1 N. a sulfuric acid solution of 2: 8 by volume, the eluate fractions containing the analyte are combined, evaporated at 200 ° C in an air stream until a dry residue is obtained, the residue is dissolved in water, first treated with a mixture of solutions of sodium bicarbonate and a reducing reagent (glucose) under conditions heating at 100 ° C for 10 minutes, then dimethylformamide under heating at 100 ° C for 5 minutes, followed by cooling the resulting colored solution and measuring its optical density at 440 nm. The method is illustrated by the following examples.

Пример 1Example 1

Определение 1,1'-этилен-2,2'-дипиридилийдибромида в кровиDetermination of 1,1'-ethylene-2,2'-dipyridylidibromide in the blood

К 10 г крови прибавляют 5 мг 1,1'-этилен-2,2'-дипиридилийдибромида, тщательно перемешивают биологический материал с веществом и оставляют на 1,5 часа при температуре 18-20°С. По истечении указанного времени биологический объект, содержащий анализируемое вещество, заливают 20 г изолирующего агента кислотного характера (смеси растворителей этанол - 1 н. раствор хлороводородной кислоты 8:2 по объему) и нагревают образующуюся смесь с обратным холодильником до состояния кипения, кипятят 10-15 минут, после чего прекращают нагревание и выдерживают колбу с содержимым в течение 35 минут при комнатной температуре. Жидкое извлечение отделяют от твердых частиц биоматериала, а процесс изолирования повторяют по вышеописанной схеме. Полученные извлечения объединяют, объединенное извлечение фильтруют через бумажный фильтр, фильтр промывают 10 мл смеси этанол - 1 н. раствор хлороводородной кислоты, а фильтрат и промывную жидкость объединяют. Объединенный фильтрат упаривают при 85-95°С до сухого остатка. Остаток растворяют в 2 мл системы растворителей ацетонитрил - 1 н. раствор серной кислоты 2:8 по объему. Полученный раствор вносят в колонку размером 490×11 мм, заполненную 7,5 г сорбента «Силасорб С-18» с размером частиц 30 мкм, предварительно промытого последовательно 20 мл ацетонитрила и 12 мл системы растворителей ацетонитрил - 1 н. раствор серной кислоты 2:8 по объему. После полного вхождения раствора сухого остатка в слой сорбента осуществляют хроматографирование с использованием подвижной фазы ацетонитрил - 1 н. раствор серной кислоты 2:8 по объему. Высоту столба подвижной фазы над поверхностью сорбента поддерживают на уровне 26-28 см. Элюат собирают фракциями по 1 мл каждая. Фракции элюата, содержащие анализируемое вещество (с пятой по седьмую включительно), объединяют в выпарительной чашке и упаривают до сухого остатка в условиях нагревания при 200°С.5 mg of 1,1'-ethylene-2,2'-dipyridylidibromide are added to 10 g of blood, the biological material is thoroughly mixed with the substance and left for 1.5 hours at a temperature of 18-20 ° C. After the specified time, the biological object containing the analyte is poured into 20 g of an acid insulating agent (ethanol solvent mixture - 1 N solution of hydrochloric acid 8: 2 by volume) and the resulting mixture is heated under reflux to a boiling state, boiled for 10-15 minutes, then stop heating and stand the flask with the contents for 35 minutes at room temperature. The liquid extraction is separated from the solid particles of the biomaterial, and the isolation process is repeated according to the above scheme. The obtained extracts are combined, the combined extract is filtered through a paper filter, the filter is washed with 10 ml of a mixture of ethanol - 1 N. a solution of hydrochloric acid, and the filtrate and washings are combined. The combined filtrate was evaporated at 85-95 ° C to a dry residue. The residue is dissolved in 2 ml of a solvent system acetonitrile - 1 N. sulfuric acid solution 2: 8 by volume. The resulting solution was introduced into a column 490 × 11 mm in size, filled with 7.5 g of a Silabsorb S-18 sorbent with a particle size of 30 μm, previously washed successively with 20 ml of acetonitrile and 12 ml of a solvent system of acetonitrile - 1 N. sulfuric acid solution 2: 8 by volume. After complete incorporation of the solution of the dry residue into the sorbent layer, chromatography is carried out using the mobile phase acetonitrile - 1 N. sulfuric acid solution 2: 8 by volume. The height of the column of the mobile phase above the surface of the sorbent is maintained at 26-28 cm. The eluate is collected in fractions of 1 ml each. Fractions of the eluate containing the analyte (fifth through seventh inclusive) are combined in an evaporation cup and evaporated to dryness under heating at 200 ° C.

Остаток растворяют в 2 мл воды, к раствору добавляют 1,0 мл 10% раствора гидрокарбоната натрия, 2 мл восстанавливающего реагента (5% раствора глюкозы), полученную реакционную смесь переносят в пробирку, градуированную на 10 мл, и нагревают в течение 10 минут на водяной бане при 100°С. Затем к реакционному раствору прибавляют 5,0 мл диметилформамида и повторяют нагревание на водяной бане при 100°С. Образующийся окрашенный раствор охлаждают до комнатной температуры, доводят его объем водой до 10 мл, перемешивают и измеряют оптическую плотность на фотоэлектроколориметре КФК-2 в кювете с толщиной рабочего слоя 20 мл при длине волны 440 нм. Измерения проводят на фоне раствора, полученного в контрольном опыте. По величине оптической плотности определяют количественное содержание 1,1'-этилен-2,2'-дипиридилийдибромида, используя предварительно рассчитанное уравнение градуировочного графика, и пересчитывают на навеску вещества, внесенную в биологический объект.The residue is dissolved in 2 ml of water, 1.0 ml of a 10% sodium hydrogen carbonate solution, 2 ml of a reducing reagent (5% glucose solution) are added to the solution, the resulting reaction mixture is transferred to a 10 ml graduated test tube and heated for 10 minutes water bath at 100 ° C. Then, 5.0 ml of dimethylformamide was added to the reaction solution, and heating was repeated in a water bath at 100 ° C. The resulting colored solution is cooled to room temperature, its volume is brought up to 10 ml with water, mixed and the absorbance is measured on a KFK-2 photoelectrocolorimeter in a cuvette with a working layer thickness of 20 ml at a wavelength of 440 nm. The measurements are carried out against the background of the solution obtained in the control experiment. By the value of optical density, the quantitative content of 1,1'-ethylene-2,2'-dipyridylidibromide is determined using the pre-calculated equation of the calibration graph, and recounted for a sample of the substance introduced into the biological object.

Построение градуировочного графикаBuilding a calibration graph

В ряд пробирок, градуированных на 10 мл, вносят 0,01, 0,02, 0,04, 0,10, 0,20, 0,40, 1,00 мл 0,025% раствора 1,1'-этилен-2,2'-дипиридилийдибромида в воде, соответственно 1,99, 1,98, 1,96, 1,90, 1,80, 1,00 мл воды, по 1 мл 10% раствора гидрокарбоната натрия, по 2 мл восстанавливающего реагента (5% раствора глюкозы) и нагревают полученные смеси при 100°С на кипящей водяной бане в течение 10 минут.0.01, 0.02, 0.04, 0.10, 0.20, 0.40, 1.00 ml of a 0.025% solution of 1,1'-ethylene-2 are added to a series of tubes graduated per 10 ml. 2'-dipyridylidibromide in water, respectively 1.99, 1.98, 1.96, 1.90, 1.80, 1.00 ml of water, 1 ml of 10% sodium hydrogen carbonate solution, 2 ml of reducing agent (5 % glucose solution) and heat the resulting mixture at 100 ° C in a boiling water bath for 10 minutes.

По истечении указанного времени реакционные смеси вынимают из горячей воды, к каждой из них прибавляют по 5 мл диметилформамида и нагревают полученные растворы при 100°С на кипящей водяной бане в течение 5 минут. По истечении указанного времени нагревание прекращают, пробирки с растворами охлаждают до комнатной температуры, доводят объем содержимого каждой пробирки до 10 мл водой, перемешивают и измеряют оптическую плотность образующихся окрашенных растворов на фотоэлектроколориметре КФК-2 при 440 нм в кювете с толщиной рабочего слоя 20 мм. Измерения проводят на фоне раствора, полученного в контрольном опыте.After this time, the reaction mixtures are removed from hot water, 5 ml of dimethylformamide are added to each of them, and the resulting solutions are heated at 100 ° C in a boiling water bath for 5 minutes. After the specified time, the heating is stopped, the test tubes with solutions are cooled to room temperature, the volume of each test tube is brought to 10 ml with water, mixed and the optical density of the resulting colored solutions is measured on a KFK-2 photoelectric colorimeter at 440 nm in a cell with a working layer thickness of 20 mm. The measurements are carried out against the background of the solution obtained in the control experiment.

По результатам измерения оптической плотности серии растворов с известными концентрациями 1,1'-этилен-2,2'-дипиридилийдибромида строят график зависимости оптической плотности от концентрации определяемого вещества. График линеен в интервале концентраций 0,5-50,0 мкг/мл. Методом наименьших квадратов рассчитывают уравнение градуировочного графика, которое в данном случае имеет вид:According to the results of measuring the optical density of a series of solutions with known concentrations of 1,1'-ethylene-2,2'-dipyridylidibromide, a graph of the dependence of optical density on the concentration of the analyte is constructed. The graph is linear in the concentration range 0.5-50.0 μg / ml. The least squares method calculates the equation of the calibration graph, which in this case has the form:

А=0,01647·С+0,04988,A = 0.01647 · C + 0.04988,

где А - оптическая плотность; С - концентрация анализируемого вещества (мкг в 1 мл фотометрируемого раствора).where A is the optical density; C is the concentration of the analyte (μg in 1 ml of photometric solution).

Результаты количественного определения 1,1'-этилен-2,2'-дипиридилийдибромида в крови представлены в таблице 1.The results of the quantitative determination of 1,1'-ethylene-2,2'-dipyridylidibromide in the blood are presented in table 1.

Пример 2Example 2

Определение 1,1'-этилен-2,2'-дипиридилийдибромида в ткани печениDetermination of 1,1'-ethylene-2,2'-dipyridylidibromide in liver tissue

К 10 г мелкоизмельченной ткани печени прибавляют 5 мг 1,1'-этилен-2,2'-дипиридилийдибромида, тщательно перемешивают биологический материал с веществом и оставляют на 1,5 часа при температуре 18-20°С. По истечении указанного времени биологический объект, содержащий анализируемое вещество, заливают 20 г изолирующего агента кислотного характера (смеси растворителей этанол - 1 н. раствор хлороводородной кислоты 8:2 по объему) и нагревают образующуюся смесь с обратным холодильником до состояния кипения, кипятят 10-15 минут, после чего прекращают нагревание и выдерживают колбу с содержимым в течение 35 минут при комнатной температуре. Жидкое извлечение отделяют от твердых частиц биоматериала, а процесс изолирования повторяют по вышеописанной схеме. Полученные извлечения объединяют, объединенное извлечение фильтруют через бумажный фильтр, фильтр промывают 10 мл смеси этанол - 1 н. раствор хлороводородной кислоты, а фильтрат и промывную жидкость объединяют. Объединенный фильтрат упаривают при 85-95°С до сухого остатка. Остаток растворяют в 2 мл системы растворителей ацетонитрил - 1 н. раствор серной кислоты 2:8 по объему. Полученный раствор вносят в колонку размером 490×11 мм, заполненную 7,5 г сорбента «Силасорб С-18» с размером частиц 30 мкм, предварительно промытого последовательно 20 мл ацетонитрила и 12 мл системы растворителей ацетонитрил - 1 н. раствор серной кислоты 2:8 по объему. После полного вхождения раствора сухого остатка в слой сорбента осуществляют хроматографирование с использованием подвижной фазы ацетонитрил - 1 н. серной кислоты 2:8 по объему. Высоту столба подвижной фазы над поверхностью сорбента поддерживают на уровне 26-28 см. Элюат собирают фракциями по 1 мл каждая. Фракции элюата, содержащие анализируемое вещество (с пятой по седьмую включительно), объединяют в выпарительной чашке и упаривают до сухого остатка в условиях нагревания при 200°С.5 mg of 1,1'-ethylene-2,2'-dipyridylidibromide are added to 10 g of finely divided liver tissue, the biological material is thoroughly mixed with the substance and left for 1.5 hours at a temperature of 18-20 ° C. After the specified time, the biological object containing the analyte is poured into 20 g of an acid insulating agent (ethanol solvent mixture - 1 N solution of hydrochloric acid 8: 2 by volume) and the resulting mixture is heated under reflux to a boiling state, boiled for 10-15 minutes, then stop heating and stand the flask with the contents for 35 minutes at room temperature. The liquid extraction is separated from the solid particles of the biomaterial, and the isolation process is repeated according to the above scheme. The obtained extracts are combined, the combined extract is filtered through a paper filter, the filter is washed with 10 ml of a mixture of ethanol - 1 N. a solution of hydrochloric acid, and the filtrate and washings are combined. The combined filtrate was evaporated at 85-95 ° C to a dry residue. The residue is dissolved in 2 ml of a solvent system acetonitrile - 1 N. sulfuric acid solution 2: 8 by volume. The resulting solution was introduced into a column 490 × 11 mm in size, filled with 7.5 g of a Silabsorb S-18 sorbent with a particle size of 30 μm, previously washed successively with 20 ml of acetonitrile and 12 ml of a solvent system of acetonitrile - 1 N. sulfuric acid solution 2: 8 by volume. After complete incorporation of the solution of the dry residue into the sorbent layer, chromatography is carried out using the mobile phase acetonitrile - 1 N. sulfuric acid 2: 8 by volume. The height of the column of the mobile phase above the surface of the sorbent is maintained at 26-28 cm. The eluate is collected in fractions of 1 ml each. Fractions of the eluate containing the analyte (fifth through seventh inclusive) are combined in an evaporation cup and evaporated to a dry residue under heating at 200 ° C.

Схема построения градуировочного графика для определения 1,1'-этилен-2,2'-дипиридилийдибромида и уравнение этого графика представлены выше в примере 1.The scheme for constructing a calibration graph for determining 1,1'-ethylene-2,2'-dipyridylidibromide and the equation of this graph are presented above in Example 1.

Результаты количественного определения 1,1'-этилен-2,2'-дипиридилийдибромида в ткани печени представлены в таблице 2.The results of the quantitative determination of 1,1'-ethylene-2,2'-dipyridylidibromide in the liver tissue are presented in table 2.

Предлагаемый способ по сравнению с прототипом в 2,5 раза повышает точность определения (полуширина доверительного интервала уменьшается при определении в крови с 8,72% до 3,48%, при определении в ткани печени - с 10,21% до 3,94%).The proposed method in comparison with the prototype 2.5 times increases the accuracy of determination (the half-width of the confidence interval decreases when determined in blood from 8.72% to 3.48%, when determined in liver tissue - from 10.21% to 3.94% )

Сравнительная характеристика предлагаемого и известного способов представлена в таблице 3.Comparative characteristics of the proposed and known methods are presented in table 3.

Таблица 1Table 1 Результаты определения 1,1'-этилен-2,2'-дипиридилийдибромида в кровиThe results of the determination of 1,1'-ethylene-2,2'-dipyridylidibromide in the blood №No. Внесено 1,1'-этилен-2,2'-дипиридилийдибромида, мг в 10 г кровиIntroduced 1,1'-ethylene-2,2'-dipyridylidibromide, mg in 10 g of blood Найдено 1,1'-этилен-2,2'-дипиридилийдибромидаFound 1,1'-ethylene-2,2'-dipyridylidibromide Метрологические характеристики, %Metrological characteristics,% мгmg %% 1.one. 0,005550,00555 0,004960,00496 89,3789.37 х=88,01x = 88.01 2.2. 0,006050,00605 0,005540,00554 91,5791.57 S=2,79S = 2.79 3.3. 0,004450.00445 0,003850,00385 86,5286.52 S_x=1,25S _x = 1.25 4.four. 0,005250.00525 0,004420,00442 84,1984.19 Δх=3,48Δx = 3.48 5.5. 0,005700.00570 0,005040,00504 88,4288,42 ε=3,95ε = 3.95

Таблица 2table 2 Результаты определения 1,1'-этилен-2,2'- дипиридилийдибромида в ткани печениThe results of the determination of 1,1'-ethylene-2,2'-dipyridylidibromide in the liver tissue №No. Внесено 1,1'-этилен-2,2'-дипиридилийдибромида, мг в 10 г мочиIntroduced 1,1'-ethylene-2,2'-dipyridylidibromide, mg in 10 g of urine Найдено 1,1'-этилен-2,2'-дипиридилийдибромидаFound 1,1'-ethylene-2,2'-dipyridylidibromide Метрологические характеристики, %Metrological characteristics,% мгmg %% 1.one. 0,004700.00470 0,004050,00405 86,1786.17 х=86,21x = 86.21 2.2. 0,005350.00535 0,004410,00441 82,1382.13 S=3,17S = 3.17 3.3. 0,006200,00620 0,005240.00524 84,3284.32 S_x=1,42S _x = 1.42 4.four. 0,004950,00495 0,004450.00445 90,2090,20 Δх=3,94Δx = 3.94 5.5. 0,005600.00560 0,004930,00493 88,2488.24 ε=4,58ε = 4.58

Таблица 3Table 3 Сравнительная характеристика предлагаемого и известного способовComparative characteristics of the proposed and known methods ПоказательIndicator Предлагаемый способThe proposed method Известный способKnown method 1. Полуширина доверительного интервала (характеристика точности)1. Half-width of the confidence interval (accuracy characteristic) а) при определении в кровиa) when determined in blood 3,48%3.48% 8,72%8.72% б) при определении в ткани печениb) when determined in liver tissue 3,94%3.94% 10,21%10.21% 2. Продолжительность хранения2. Duration of storage восстанавливающего реагентаreducing reagent Не менее 4 днейNot less than 4 days 1 час1 hour 3. Время, в течение которого сохраняется стабильность3. The time during which stability is maintained оптической плотности фотометрируемых растворовthe optical density of photometric solutions Не менее 2 часовAt least 2 hours 3-5 минут3-5 minutes

Claims

The method for determination of 1,1′-ethylene-2,2′-dipyridylidibromide in biological material, namely, that the biological sample is treated with an acid insulating agent, the obtained extract is separated from the particles of the biomatrial, subjected to chromatographic purification in a column with a stationary phase, a portion of the eluate leaving the column and containing the analyte are collected, the eluent is evaporated, the residue is treated with a reducing reagent in an alkaline medium, followed by measurement of the optical density of the formed environment Mortar solution, characterized in that as an insulating agent of an acidic nature using a mixture of ethanol-1 N. a solution of hydrochloric acid 8: 2 by volume, treatment with an insulating agent is carried out under conditions of heating to boiling, subsequent boiling and maintaining without heating, chromatographic purification is carried out in a column filled with a stationary Silabsorb S-18 phase using an acetonitrile solvent system as an eluent 1 n a sulfuric acid solution of 2: 8 by volume, a glucose solution is used as a reducing reagent, an alkaline reaction is created with sodium bicarbonate, treatment with a reducing reagent in an alkaline medium is carried out under heating at 100 ° C, and before measuring the optical density, the reaction solution is treated with dimethylformamide under heating at 100 ° C.