RU2153169C1

RU2153169C1 - Method of determining complex nitrophenol preparation "nitrafen" in biological material

Info

Publication number: RU2153169C1
Application number: RU99105092A
Authority: RU
Inventors: В.К. Шорманов; Л.Е. Сипливая; М.К. Елизарова; А.В. Кукурека; М.К. Шепиев; Н.В. Костебелов; М.Ю. Маркелов; Е.П. Дурицын; В.И. Рудская
Original assignee: Шорманов Владимир Камбулатович
Priority date: 1999-03-15
Filing date: 1999-03-15
Publication date: 2000-07-20

Abstract

FIELD: toxicological chemistry. SUBSTANCE: sample is broken, treated twice with acetone for 45 min each time. Acetone extracts are combined, combined solution evaporated in air flow at 16-22 C, and residue dissolved in chloroform/hexane mixture (7:4). Solution is chromatographed in silica gel column using chloroform/hexane mixture (7:4) as mobile phase. Eluate fractions containing sum of "Nitrafen" nitrophenols are combined, eluent distilled off, residue dissolved in hexane/dioxane/2-propanol system (40:5: 1), and resulting solution analyzed by high-performance liquid chromatography technique in "Sylasorb 600" column using above-mentioned system as eluent. EFFECT: increased sensitivity and selectivity of determination. 1 dwg, 5 tbl, 4 ex

Description

Изобретение относится к биологии и токсикологической химии, а именно к способам определения нитрафена, и может быть использовано в практике санэпидстанций, химико-токсилогических и ветеринарных лабораторий. Способ относится к числу массовых. The invention relates to biology and toxicological chemistry, and in particular to methods for determining nitrafen, and can be used in the practice of sanitary and epidemiological stations, chemical-toxicological and veterinary laboratories. The method belongs to the mass.

Известен способ определения органических веществ кислого характера (к которым относятся и нитрофенольные компоненты нитрафена) в биологическом материале, заключающийся в измельчении биологического объекта, обработке водным раствором гидроксида натрия, центрифугирования, обработке центрифугата вольфраматом натрия в кислой среде при кипячении на водяной бане, отделении осадка центрифугированием в течение получаса, экстракционном выделении анализируемых соединений из центрифугата эфиром с последующим подщелачиванием центрифугата и повторной экстракцией эфиром (Крамаренко В.Ф. Химико-токсикологический анализ.- Киев: Вища школа, 1982. -С. 123-124). A known method of determining organic acids of an acidic nature (which include nitrophenol components of nitraphene) in a biological material, which consists in grinding a biological object, processing it with an aqueous solution of sodium hydroxide, centrifuging, treating the centrifugate with sodium tungstate in an acidic environment when boiling in a water bath, separating the precipitate by centrifugation within half an hour, extraction isolation of the analyzed compounds from the centrifugate with ether, followed by alkalization of the centrifugate re-extraction with ether (VF Kramarenko Chemical toxicological analiz.- Kiev: Vishcha school, 1982. 123-124 C.).

Способ малоселективен, отличается низкой степенью извлечения суммы нитрофенольных компонентов нитрафена. The method is poorly selective, characterized by a low degree of extraction of the amount of nitrophenol components of nitraphene.

Известен способ определения суммы алкилдинитрофенольных соединений (каратана) в биологических объектах путем измельчения биологической ткани, неоднократной ее обработки порциями гексана каждый раз в течение 30 минут, отделения гексановых извлечений, их объединения и упаривания до сухого остатка с последующим растворением остатка в легколетучем органическом растворителе, хроматографирования в тонком слое силикагеля в системе растворителей гексан - ацетон (4:1) (Лабораторные исследования в ветеринарии. Химико-токсикологические методы /Под ред. Б. И. Антонова. -М.: Агропромиздат, 1989. -С. 167-168). A known method for determining the amount of alkyl dinitrophenol compounds (karatana) in biological objects by grinding biological tissue, repeatedly treating it with portions of hexane every 30 minutes, separating the hexane extracts, combining them and evaporating to a dry residue, followed by dissolving the residue in a volatile organic solvent, chromatography in a thin layer of silica gel in a solvent system hexane - acetone (4: 1) (Laboratory studies in veterinary medicine. Chemical toxicological methods / od Ed. B. Antonov. -M .: Agropromizdat, 1989. C. 167-168).

Способ характеризуется недостаточно высокой чувствительностью и селективностью. The method is characterized by insufficiently high sensitivity and selectivity.

Наиболее близким по техническому решению и достигаемым результатам является способ определения нитрафена (комплекса моно- и динитроалкилфенолов) в биологическом материале путем измельчения биологической пробы, однократной обработки ее порцией ацетона в течение 30 минут, центрифугирования, отделения центрифугата и упаривания его в струе теплого воздуха до сухого остатка, растворения остатка в хлороформе, экстракции хлороформного раствора аммиачным раствором с pH 9,0 - 10,0, отделения водно-щелочного извлечения, подкисления его хлороводородной кислотой до pH 2,0, экстракции диэтиловым эфиром с последующим упариванием эфирного экстракта до незначительного объема и хроматографированием в тонком слое силикагеля в системе растворителей хлороформ - гексан - этилацетат (2:7:1) (Никитин П.В., Ивкин А.А., Баринов Е.Х. Случай острого перорального отравления препаратом "Нитрафен"// Судебно-медицинская экспертиза. -1996. -Т.39, N 1. -С.33-35 (прототип)). The closest technical solution and the achieved results is a method for determining nitraphene (a complex of mono- and dinitroalkylphenols) in a biological material by grinding a biological sample, processing it once with a portion of acetone for 30 minutes, centrifuging, separating the centrifugate and evaporating it in a stream of warm air to dry residue, dissolving the residue in chloroform, extracting the chloroform solution with an ammonia solution with a pH of 9.0 to 10.0, separating the aqueous-alkaline extraction, acidifying it with hydrogen chloride acid to pH 2.0, extraction with diethyl ether, followed by evaporation of the ether extract to a small volume and chromatography in a thin layer of silica gel in a solvent system of chloroform - hexane - ethyl acetate (2: 7: 1) (Nikitin P.V., Ivkin A. A., Barinov E.Kh. The case of acute oral poisoning with the drug "Nitrafen" // Forensic medical examination. -1996. -T.39, N 1. -C.33-35 (prototype)).

Задачей настоящего изобретения является повышение чувствительности и селективности определения. The objective of the present invention is to increase the sensitivity and selectivity of determination.

Поставленная задача достигается с помощью предлагаемого способа, который заключается в том, что биологическую ткань (например, ткань печени) измельчают, двукратно обрабатывают ацетоном (каждый раз в течение 45 минут), ацетоновые извлечения объединяют, экстрагент испаряют в токе воздуха при температуре 16-22^oC, остаток растворяют в смеси растворителей хлороформ-гексан (7: 4), хроматографируют в колонке с силикагелем с использованием подвижной фазы хлороформ - гексан (7:4), фракции элюата, содержащие сумму нитрофенолов нитрафена, объединяют, элюент испаряют, остаток растворяют в системе растворителей гексан - диоксан - пропанол-2 (40:5:1) и хроматографируют методом ВЭЖХ в колонке с сорбентом "Силасорб-600", используя в качестве элюента систему растворителей гексан - диоксан - пропанол-2 (40:5:1).The problem is achieved using the proposed method, which consists in the fact that the biological tissue (for example, liver tissue) is crushed, treated twice with acetone (each time for 45 minutes), the acetone extracts are combined, the extractant is evaporated in a stream of air at a temperature of 16-22 ^o C, the residue is dissolved in a solvent mixture of chloroform-hexane (7: 4) and chromatographed on a silica gel column using a mobile phase of chloroform - hexane (7: 4) eluate fractions containing the amount nitrophenols nitrafena combined, elyue t is evaporated, the residue is dissolved in a solvent system of hexane - dioxane - propanol-2 (40: 5: 1) and chromatographed by HPLC in a column with a Silabsorb-600 sorbent using an hexane-dioxane-propanol-2 solvent system ( 40: 5: 1).

Способ осуществляется следующим образом: биологическую ткань, содержащую нитрафен, измельчают, дважды настаивают с ацетоном (каждый раз в течение 45 минут), извлечения отделяют от твердых частиц биоматериала, объединяют, экстрагент испаряют в токе воздуха при температуре 16-22^oC, остаток растворяют в смеси растворителей хлороформ - гексан (7:4), хроматографируют в колонке с силикагелем с использованием подвижной фазы хлороформ - гексан (7:4), фракции элюата, содержащие сумму нитрофенолов нитрафена, объединяют, элюент испаряют, остаток растворяют в системе растворителей гексан - диоксан - пропанол-2 (40: 5: 1) и хроматографируют методом ВЭЖК в колонке с сорбентом "Силасорб-600", используя в качестве элюента систему растворителей гексан - диоксан - пропанол-2 (40:5:1). Способ иллюстрируется следующими примерами.The method is as follows: the biological tissue containing nitrafen is crushed, insisted twice with acetone (each time for 45 minutes), the extracts are separated from the solid particles of the biomaterial, combined, the extractant is evaporated in an air stream at a temperature of 16-22 ^o C, the residue is dissolved in a solvent mixture of chloroform - hexane (7: 4), chromatography on a silica gel column using a mobile phase of chloroform - hexane (7: 4), eluate fractions containing the sum of nitrophenols of nitraphene are combined, the eluent is evaporated, and the residue is dissolved in a solvent system of hexane-dioxane-propanol-2 (40: 5: 1) and chromatographed by HPLC in a column with a Silorbas-600 sorbent, using a solvent system of hexane-dioxane-propanol-2 (40: 5: 1 as an eluent) ) The method is illustrated by the following examples.

Пример 1
Качественное определение нитрафена в ткани печени
К 10 г мелкоизмельченной ткани свежей трупной печени человека прибавляют 40 мг нитрафена, тщательно перемешивают биологическую ткань с веществом и оставляют на сутки при температуре 16-18^oC. По истечении указанного времени смесь заливают 20 мл ацетона и выдерживают 45 минут, периодически перемешивая. Извлечение отделяют, операцию настаивания повторяют в указанных условиях. Вытяжки объединяют, экстрагент испаряют в токе воздуха при температуре 16-22^oC, остаток растворяют в 10 мл смеси растворителей хлороформ - гексан (7: 4). 2 мл полученного раствора вносят в колонку размером 490x11 мм, заполненную 10 г силикагеля типа L 40/100μ. Хроматографирование осуществляют, используя в качестве элюента систему растворителей хлороформ - гексан (7:4). Элюат собирают отдельными фракциями по 2 мл каждая. Фракции с 2 по 75 включительно объединяют, элюент испаряют в токе воздуха при температуре 16-22^oC. Остаток растворяют в 2 мл смеси растворителей гексан - диоксан - пропанол-2 (40: 5: 1). 8 мкл полученного раствора вводят в жидкостный хроматограф типа "Милихром". Процесс хроматографирования осуществляют в колонке размером 64x2 мм, заполненной сорбентом с гидроксилированной поверхностью "Силасорб-600", используя в качестве подвижной фазы систему растворителей гексан - диоксан - пропанол-2 (40:5:1). Скорость подачи элюента составляет 50 мкл/мин, скорость диаграммной ленты - 720 мм/ч. Оптическую плотность регистрируют при длине волны 260 нм. Качественное определение отдельных нитрофенольных компонентов нитрафена осуществляют по величинам характерных объемов или времени удерживания.Example 1
Qualitative determination of nitrafen in liver tissue
40 mg of nitrafen are added to 10 g of finely ground tissue of fresh human cadaveric liver, the biological tissue is thoroughly mixed with the substance and left for a day at a temperature of 16-18 ^o C. After this time, the mixture is poured into 20 ml of acetone and incubated for 45 minutes, periodically mixing. The extraction is separated, the infusion operation is repeated under the indicated conditions. The extracts are combined, the extractant is evaporated in a stream of air at a temperature of 16-22 ^o C, the residue is dissolved in 10 ml of a solvent mixture of chloroform - hexane (7: 4). 2 ml of the resulting solution was added to a 490x11 mm column filled with 10 g of silica gel type L 40 / 100μ. Chromatography is carried out using a chloroform-hexane solvent system (7: 4) as an eluent. The eluate is collected in separate fractions of 2 ml each. Fractions 2 through 75 inclusive are combined, the eluent is evaporated in a stream of air at a temperature of 16-22 ^o C. The residue is dissolved in 2 ml of a solvent mixture of hexane - dioxane - propanol-2 (40: 5: 1). 8 μl of the resulting solution was added to a Milichrome-type liquid chromatograph. The chromatography process is carried out in a 64x2 mm column filled with a Silabsorb-600 sorbent with a hydroxylated surface, using a hexane-dioxane-propanol-2 solvent system (40: 5: 1) as the mobile phase. The flow rate of the eluent is 50 μl / min, the speed of the chart tape is 720 mm / h. The optical density is recorded at a wavelength of 260 nm. Qualitative determination of the individual nitrophenol components of nitraphene is carried out according to the values of the characteristic volumes or retention time.

Общий вид хроматограммы суммы нитрофенолов препарата "Нитрафен" при определении методом ВЭЖХ представлен на чертеже. Первый пик (с наименьшим временем удерживания) на хроматограмме соответствует выходу растворителя, остальные пики соответствуют нитрофенольным компонентам нитрафена. A general view of the chromatogram of the amount of nitrophenols of the Nitraphen preparation as determined by HPLC is shown in the drawing. The first peak (with the shortest retention time) in the chromatogram corresponds to the yield of solvent, the remaining peaks correspond to the nitrophenol components of nitraphene.

Значения объемов и времени удерживания нитрофенольных компонентов препарата "Нитрафен" указаны в таблице 1. The values of volumes and retention times of nitrophenol components of the drug "Nitrafen" are shown in table 1.

Пример 2
Количественное определение 2-нитро-4-метилфенола (компонента нитрафена) в ткани печени
К 10 г мелкоизмельченной ткани свежей трупной печени человека прибавляют 40 мг нитрафена, тщательно перемешивают биологическую ткань с веществом и оставляют на сутки при температуре 16-18^oC. По истечении указанного времени смесь заливают 20 мл ацетона и выдерживают 45 минут, периодически перемешивая. Извлечение отделяют, операцию настаивания повторяют в указанных условиях. Вытяжки объединяют, экстрагент испаряют в токе воздуха при температуре 16-22^oC, остаток растворяют в 10 мл смеси растворителей хлороформ - гексан (7: 4). 2 мл полученного раствора вносят в колонку размером 490x11 мм, заполненную 10 г силикагеля типа L 40/100μ. Хроматографирование осуществляют, используя в качестве элюента систему растворителей хлороформ - гексан (7:4). Элюат собирают отдельными фракциями по 2 мл каждая. Фракции с 2 по 5 включительно объединяют, элюент испаряют в токе воздуха при температуре 16-22^oC. Остаток растворяют в 26 мл смеси растворителей гексан - диоксан - пропанол-2 (40: 5: 1). 8 мкл полученного раствора вводят в жидкостный хроматограф типа "Милихром". Процесс хроматографирования осуществляют в колонке размером 64x2 мм, заполненной сорбентом с гидроксилированной поверхностью "Силасорб-600", используя в качестве подвижной фазы систему растворителей гексан - диоксан - пропанол-2 (40:5:1). Скорость подачи элюента составляет 50 мкл/мин, скорость диаграммной ленты - 720 мм/ч. Оптическую плотность регистрируют при длине волны 266 нм. Пик на хроматограмме с временем удерживания 4,76 мин (объемом удерживания 238 мкл) соответствует 2-нитро-4-метилфенолу.Example 2
Quantification of 2-nitro-4-methylphenol (a component of nitraphene) in liver tissue
40 mg of nitrafen are added to 10 g of finely ground tissue of fresh human cadaveric liver, the biological tissue is thoroughly mixed with the substance and left for a day at a temperature of 16-18 ^o C. After this time, the mixture is poured into 20 ml of acetone and incubated for 45 minutes, periodically mixing. The extraction is separated, the infusion operation is repeated under the indicated conditions. The extracts are combined, the extractant is evaporated in a stream of air at a temperature of 16-22 ^o C, the residue is dissolved in 10 ml of a solvent mixture of chloroform - hexane (7: 4). 2 ml of the resulting solution was added to a 490x11 mm column filled with 10 g of silica gel type L 40 / 100μ. Chromatography is carried out using a chloroform-hexane solvent system (7: 4) as an eluent. The eluate is collected in separate fractions of 2 ml each. Fractions 2 to 5 inclusive are combined, the eluent is evaporated in a stream of air at a temperature of 16-22 ^o C. The residue is dissolved in 26 ml of a mixture of solvents hexane - dioxane - propanol-2 (40: 5: 1). 8 μl of the resulting solution was added to a Milichrome-type liquid chromatograph. The chromatography process is carried out in a 64x2 mm column filled with a Silyabsar-600 sorbent with a hydroxylated surface, using a hexane-dioxane-propanol-2 solvent system (40: 5: 1) as the mobile phase. The flow rate of the eluent is 50 μl / min, the speed of the chart tape is 720 mm / h. The optical density is recorded at a wavelength of 266 nm. The peak in the chromatogram with a retention time of 4.76 min (retention volume 238 μl) corresponds to 2-nitro-4-methylphenol.

Количественное содержание 2-нитро-4-метилфенола определяют, исходя из площади хроматографического пика, по уравнению калибровочного графика и пересчитывают на навеску нитрафена, внесенную в биологический материал. The quantitative content of 2-nitro-4-methylphenol is determined based on the area of the chromatographic peak according to the equation of the calibration graph and is counted on a sample of nitrafen introduced into the biological material.

Построение калибровочного графика
В ряд мерных колб вместимостью 50 мл вносят 0,625, 1,25, 2,50, 3,75 и 5,00 мл 0,02% раствора 2-нитро-4-метилфенола в смеси растворителей гексан - диоксан - пропанол-2 (40:5:1) и доводят объем раствора в каждой колбе до метки смесью растворителей гексан - диоксан - пропанол-2 (40:5:1). 8 мкл каждого из полученных растворов вводят в хроматограф. Хроматографирование осуществляют в колонке размером 64x2 мм с сорбентом "Силасорб-600", используя в качестве элюента систему растворителей гексан - диоксан - пропанол-2 (40:5: 1). Скорость подачи элюента составляет 50 мкл/мин, скорость диаграммной ленты - 720 мм/ч. Оптическую плотность регистрируют при длине волны 266 нм. По результатам измерений на хроматографе строят график зависимости площади пика от концентрации определяемого вещества. График линеен в интервале концентраций 0,02 - 0,16 мкг. Методом наименьших квадратов рассчитывают уравнение калибровочного графика, которое в данном случае имеет вид:
S = 36,7622•C - 0,1602,
где S - площадь хроматографического пика, см²;
C - концентрация определяемого вещества в анализируемой пробе, мкг.Calibration plotting
In a series of volumetric flasks with a capacity of 50 ml, 0.625, 1.25, 2.50, 3.75 and 5.00 ml of a 0.02% solution of 2-nitro-4-methylphenol in a mixture of solvents hexane - dioxane - propanol-2 (40 : 5: 1) and the volume of the solution in each flask was adjusted to the mark with a solvent mixture of hexane - dioxane - propanol-2 (40: 5: 1). 8 μl of each of the resulting solutions was introduced into the chromatograph. Chromatography is carried out in a column with a size of 64x2 mm with a Silorbass-600 sorbent, using a hexane-dioxane-propanol-2 solvent system (40: 5: 1) as an eluent. The flow rate of the eluent is 50 μl / min, the speed of the chart tape is 720 mm / h. The optical density is recorded at a wavelength of 266 nm. According to the results of measurements on a chromatograph, a graph of the dependence of the peak area on the concentration of the analyte is built. The graph is linear in the concentration range of 0.02 - 0.16 μg. The least squares method calculates the equation of the calibration graph, which in this case has the form:
S = 36.7622 • C - 0.1602,
where S is the area of the chromatographic peak, cm ² ;
C is the concentration of the analyte in the analyzed sample, mcg.

Результаты количественного определения 2-нитро-4-метилфенола в ткани печени представлены в таблице 2. The results of the quantitative determination of 2-nitro-4-methylphenol in liver tissue are presented in table 2.

Пример 3
Количественное определение 2-метил-4,6-динитрофенола (компонента нитрафена) в ткани печени
К 10 г мелкоизмельченной ткани свежей трупной печени человека прибавляют 40 мг нитрафена, тщательно перемешивают биологическую ткань с веществом и оставляют на сутки при температуре 16-18^oC. По истечении указанного времени смесь заливают 20 мл ацетона и выдерживают 45 минут, периодически перемешивая. Извлечение отделяют, операцию настаивания повторяют в указанных условиях. Вытяжки объединяют, экстрагент испаряют в токе воздуха при температуре 16-22^oC, остаток растворяют в 10 мл смеси растворителей хлороформ - гексан (7: 4). 2 мл полученного раствора вносят в колонку размером 490x11 мм, заполненную 10 г силикагеля типа L 40/100μ. Хроматографирование осуществляют, используя в качестве элюента систему растворителей хлороформ - гексан (7:4). Элюат собирают отдельными фракциями по 2 мл каждая. Фракции с 8 по 18 включительно объединяют, элюент испаряют в токе воздуха при температуре 16-22^oC. Остаток растворяют в 25 мл смеси растворителей гексан - диоксан - пропанол-2 (40: 5: 1). 4 мкл полученного раствора вводят в жидкостный хроматограф типа "Милихром". Процесс хроматографирования осуществляют в колонке размером 64x2 мм, заполненной сорбентом с гидроксилированной поверхностью "Силасорб-600", используя в качестве подвижной фазы систему растворителей гексан - диоксан - пропанол-2 (40:5:1). Скорость подачи элюента составляет 50 мкл/мин, скорость диаграммной ленты - 720 мм/ч. Оптическую плотность регистрируют при длине волны 264 нм. Пик на хроматограмме с временем удерживания 7,40 мин (объемом удерживания 370 мкл) соответствует 2-метил-4,6-динитрофенолу.Example 3
Quantification of 2-methyl-4,6-dinitrophenol (a component of nitraphene) in liver tissue
40 mg of nitrafen are added to 10 g of finely ground tissue of fresh human cadaveric liver, the biological tissue is thoroughly mixed with the substance and left for a day at a temperature of 16-18 ^o C. After this time, the mixture is poured into 20 ml of acetone and incubated for 45 minutes, periodically mixing. The extraction is separated, the infusion operation is repeated under the indicated conditions. The extracts are combined, the extractant is evaporated in a stream of air at a temperature of 16-22 ^o C, the residue is dissolved in 10 ml of a solvent mixture of chloroform - hexane (7: 4). 2 ml of the resulting solution was added to a 490x11 mm column filled with 10 g of silica gel type L 40 / 100μ. Chromatography is carried out using a chloroform-hexane solvent system (7: 4) as an eluent. The eluate is collected in separate fractions of 2 ml each. Fractions 8 through 18 inclusive are combined, the eluent is evaporated in a stream of air at a temperature of 16-22 ^o C. The residue is dissolved in 25 ml of a mixture of solvents hexane - dioxane - propanol-2 (40: 5: 1). 4 μl of the resulting solution was added to a Milichrome-type liquid chromatograph. The chromatography process is carried out in a 64x2 mm column filled with a Silabsorb-600 sorbent with a hydroxylated surface, using a hexane-dioxane-propanol-2 solvent system (40: 5: 1) as the mobile phase. The flow rate of the eluent is 50 μl / min, the speed of the chart tape is 720 mm / h. The optical density is recorded at a wavelength of 264 nm. The peak in the chromatogram with a retention time of 7.40 min (retention volume 370 μl) corresponds to 2-methyl-4,6-dinitrophenol.

Количественное содержание 2-метил-4,6-динитрофенола определяют, исходя из площади хроматографического пика, по уравнению калибровочного графика и пересчитывают на навеску нитрафена, внесенную в биологический материал. The quantitative content of 2-methyl-4,6-dinitrophenol is determined based on the area of the chromatographic peak according to the equation of the calibration graph and is converted to a weighed portion of nitraphene introduced into the biological material.

Построение калибровочного графика
В ряд мерных колб вместимостью 50 мл вносят 0,625, 1,25, 2,50, 3,75, 5,00 и 7,50 мл 0,02% раствора 2-метил-4,6-динитрофенола в смеси растворителей гексан - диоксан - пропанол-2 (40:5:1) и доводят объем раствора в каждой колбе до метки смесью растворителей гексан - диоксан - пропанол-2 (40:5:1). 8 мкл каждого из полученных растворов вводят в хроматограф. Хроматографирование осуществляют в колонке размером 64x2 мм с сорбентом "Силасорб-600", используя в качестве элюента систему растворителей гексан - диоксан - пропанол-2 (40:5:1). Скорость подачи элюента составляет 50 мкл/мин, скорость диаграммной ленты - 720 мм/ч. Оптическую плотность регистрируют при длине волны 264 нм. По результатам измерений на хроматографе строят график зависимости площади пика от концентрации определяемого вещества. График линеен в интервале концентраций 0,02 - 0,24 мкг. Методом наименьших квадратов рассчитывают уравнение калибровочного графика, которое в данном случае имеет вид:
S = 56,6001•C - 0,1096,
где S - площадь хроматографического пика, см²;
C - концентрация определяемого вещества в анализируемой пробе, мкг.Calibration plotting
In a series of 50-ml volumetric flasks, 0.625, 1.25, 2.50, 3.75, 5.00 and 7.50 ml of a 0.02% solution of 2-methyl-4,6-dinitrophenol in a mixture of hexane-dioxane solvents are added - propanol-2 (40: 5: 1) and the volume of the solution in each flask was adjusted to the mark with a mixture of solvents hexane-dioxane-propanol-2 (40: 5: 1). 8 μl of each of the resulting solutions was introduced into the chromatograph. Chromatography is carried out in a column with a size of 64x2 mm with a Silorbass-600 sorbent, using a hexane-dioxane-propanol-2 solvent system (40: 5: 1) as an eluent. The flow rate of the eluent is 50 μl / min, the speed of the chart tape is 720 mm / h. The optical density is recorded at a wavelength of 264 nm. According to the results of measurements on a chromatograph, a graph of the dependence of the peak area on the concentration of the analyte is plotted. The graph is linear in the concentration range of 0.02 - 0.24 μg. The least squares method calculates the equation of the calibration graph, which in this case has the form:
S = 56.6001 • C - 0.1096,
where S is the area of the chromatographic peak, cm ² ;
C is the concentration of the analyte in the analyzed sample, mcg.

Результаты количественного определения 2-метил-4,6-динитрофенола в ткани печени представлены в таблице 3. The results of the quantitative determination of 2-methyl-4,6-dinitrophenol in liver tissue are presented in table 3.

Пример 4
Количественное определение 4-метил-2,6-динитрофенола (компонента нитрафена) в ткани печени
К 10 г мелкоизмельченной ткани свежей трупной печени человека прибавляют 40 мг нитрафена, тщательно перемешивают биологическую ткань с веществом и оставляют на сутки при температуре 16-18^oC. По истечении указанного времени смесь заливают 20 мл ацетона и выдерживают 45 минут, периодически перемешивая. Извлечение отделяют, операцию настаивания повторяют в указанных условиях. Вытяжки объединяют, экстрагент испаряют в токе воздуха при температуре 16-22^oC, остаток растворяют в 10 мл смеси растворителей хлороформ - гексан (7: 4). 2 мл полученного раствора вносят в колонку размером 490x11 мм, заполненную 10 г силикагеля типа L 40/100μ. Хроматографирование осуществляют, используя в качестве элюента систему растворителей хлороформ - гексан (7:4). Элюат собирают отдельными фракциями по 2 мл каждая. Фракции с 18 по 38 включительно объединяют, элюент испаряют в токе воздуха при температуре 16-22^oC. Остаток растворяют в 25 мл смеси растворителей гексан - диоксан - пропанол-2 (40: 5: 1). 8 мкл полученного раствора вводят в жидкостный хроматограф типа "Милихром". Процесс хроматографирования осуществляют в колонке размером 64x2 мм, заполненной сорбентом с гидроксилированной поверхностью "Силасорб-600", используя в качестве подвижной фазы систему растворителей гексан - диоксан - пропанол-2 (40:5:1). Скорость подачи элюента составляет 50 мкл/мин, скорость диаграммной ленты - 720 мм/ч. Оптическую плотность регистрируют при длине волны 266 нм. Пик на хроматограмме с временем удерживания 9,92 мин (объемом удерживания 496 мкл) соответствует 4-метил-2,6-динитрофенолу.Example 4
Quantification of 4-methyl-2,6-dinitrophenol (a component of nitraphene) in liver tissue
40 mg of nitrafen are added to 10 g of finely ground tissue of fresh human cadaveric liver, the biological tissue is thoroughly mixed with the substance and left for a day at a temperature of 16-18 ^o C. After this time, the mixture is poured into 20 ml of acetone and incubated for 45 minutes, periodically mixing. The extraction is separated, the infusion operation is repeated under the indicated conditions. The extracts are combined, the extractant is evaporated in a stream of air at a temperature of 16-22 ^o C, the residue is dissolved in 10 ml of a solvent mixture of chloroform - hexane (7: 4). 2 ml of the resulting solution was added to a 490x11 mm column filled with 10 g of silica gel type L 40 / 100μ. Chromatography is carried out using a chloroform-hexane solvent system (7: 4) as an eluent. The eluate is collected in separate fractions of 2 ml each. Fractions 18 to 38 inclusive are combined, the eluent is evaporated in a stream of air at a temperature of 16-22 ^o C. The residue is dissolved in 25 ml of a mixture of solvents hexane - dioxane - propanol-2 (40: 5: 1). 8 μl of the resulting solution was added to a Milichrome-type liquid chromatograph. The chromatography process is carried out in a 64x2 mm column filled with a Silabsorb-600 sorbent with a hydroxylated surface, using a hexane-dioxane-propanol-2 solvent system (40: 5: 1) as the mobile phase. The flow rate of the eluent is 50 μl / min, the speed of the chart tape is 720 mm / h. The optical density is recorded at a wavelength of 266 nm. The peak in the chromatogram with a retention time of 9.92 min (retention volume 496 μl) corresponds to 4-methyl-2,6-dinitrophenol.

Количественное содержание 4-метил-2,6-динитрофенола определяют, исходя из площади хроматографического пика, по уравнению калибровочного графика и пересчитывают на навеску нитрафена, внесенную в биологический материал. The quantitative content of 4-methyl-2,6-dinitrophenol is determined based on the area of the chromatographic peak according to the equation of the calibration graph and is converted to a weighed portion of nitraphene introduced into the biological material.

Построение калибровочного графика
В ряд мерных колб вместимостью 50 мл вносят 0,625, 1,25, 2,50, 3,75 и 5,00 мл 0,02% раствора 4-метил-2,6-динитрофенола в смеси растворителей гексан - диоксан - пропанол-2 (40:5:1) и доводят объем раствора в каждой колбе до метки смесью растворителей гексан - диоксан - пропанол-2 (40:5:1). 8 мкл каждого из полученных растворов вводят в хроматограф. Хроматографирование осуществляют в колонке размером 64x2 мм с сорбентом "Силасорб-600", используя в качестве элюента систему растворителей гексан - диоксан - пропанол-2 (40: 5:1). Скорость подачи элюента составляет 50 мкл/мин, скорость диаграммной ленты - 720 мм/ч. Оптическую плотность регистрируют при длине волны 266 нм. По результатам измерений на хроматографе строят график зависимости площади пика от концентрации определяемого вещества. График линеен в интервале концентраций 0,02 - 0,16 мкг. Методом наименьших квадратов рассчитывают уравнение калибровочного графика, которое в данном случае имеет вид:
S = 49,0294•C - 0,0804,
где S - площадь хроматографического пика, см²;
C - концентрация определяемого вещества в анализируемой пробе, мкг.Calibration plotting
In a series of 50-ml volumetric flasks, 0.625, 1.25, 2.50, 3.75 and 5.00 ml of a 0.02% solution of 4-methyl-2,6-dinitrophenol in a mixture of solvents hexane - dioxane - propanol-2 are added (40: 5: 1) and the volume of the solution in each flask was adjusted to the mark with a mixture of solvents hexane - dioxane - propanol-2 (40: 5: 1). 8 μl of each of the resulting solutions was introduced into the chromatograph. Chromatography is carried out in a column with a size of 64x2 mm with a Silorbass-600 sorbent, using a hexane-dioxane-propanol-2 solvent system (40: 5: 1) as an eluent. The flow rate of the eluent is 50 μl / min, the speed of the chart tape is 720 mm / h. The optical density is recorded at a wavelength of 266 nm. According to the results of measurements on a chromatograph, a graph of the dependence of the peak area on the concentration of the analyte is built. The graph is linear in the concentration range of 0.02 - 0.16 μg. The least squares method calculates the equation of the calibration graph, which in this case has the form:
S = 49.0294 • C - 0.0804,
where S is the area of the chromatographic peak, cm ² ;
C is the concentration of the analyte in the analyzed sample, mcg.

Результаты количественного определения 4-метил-2,6-динитрофенола в ткани печени представлены в таблице 4. The results of the quantitative determination of 4-methyl-2,6-dinitrophenol in liver tissue are presented in table 4.

Предлагаемый способ по сравнению с прототипом в 5 раз повышает чувствительность определения в хроматографируемой пробе и в 2 - 10 раз - в ткани печени, в два раза увеличивает степень извлечения отдельных нитрофенольных компонентов нитрафена из ткани печени (для 2-метил-4,6-динитрофенола степень извлечения возрастает с 3,75 до 7,65%), характеризуется более высокой селективностью (позволяет выделить 18 компонентов нитрафена, прототип - только 9). The proposed method, compared with the prototype, increases the detection sensitivity by a factor of 5 in a chromatographic sample and 2–10 times in liver tissue, doubles the degree of extraction of individual nitrophenol components of nitraphene from liver tissue (for 2-methyl-4,6-dinitrophenol the degree of extraction increases from 3.75 to 7.65%), is characterized by higher selectivity (allows you to select 18 components of nitrafen, the prototype is only 9).

Сравнительная характеристика предлагаемого и известного способов представлена в таблице 5. Comparative characteristics of the proposed and known methods are presented in table 5.

Claims

The method for determining the complex nitrophenol preparation "Nitraphene" in biological material by grinding the sample, processing with acetone, separating the extraction, evaporation of the extractant, obtaining the residue, dissolving it in an organic solvent and chromatography in a sorbent based on silica gel with a hydroxylated surface, characterized in that the biological tissue is processed acetone is carried out twice (each time for 45 minutes), acetone evaporation is performed at 16 - 22 ^o C, the residue is dissolved in a solvent mixture of chloroform hexane (7: 4), chromatographed on a silica gel column using chloroform-hexane (7: 4) as an eluent, the eluate fractions containing the sum of nitrophenol nitrophenols are combined, the eluent is evaporated, the residue is dissolved in hexane-solvent system dioxanpropanol-2 (40: 5: 1) and chromatographed by HPLC in a column with a Silabsorb-600 sorbent using a hexane-dioxane-propanol-2 (40: 5: 1) solvent system.