RU2404800C2 - Вакцина против тейлериоза - Google Patents
Вакцина против тейлериоза Download PDFInfo
- Publication number
- RU2404800C2 RU2404800C2 RU2006144451/15A RU2006144451A RU2404800C2 RU 2404800 C2 RU2404800 C2 RU 2404800C2 RU 2006144451/15 A RU2006144451/15 A RU 2006144451/15A RU 2006144451 A RU2006144451 A RU 2006144451A RU 2404800 C2 RU2404800 C2 RU 2404800C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cells
- vaccine
- culture
- per
- cultures
- Prior art date
Links
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims abstract description 61
- 208000001117 Theileriasis Diseases 0.000 title claims abstract description 37
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 76
- 244000309466 calf Species 0.000 claims abstract description 45
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 claims abstract description 32
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims abstract description 30
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 27
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims abstract description 26
- 241000223778 Theileria annulata Species 0.000 claims abstract description 25
- 241000238876 Acari Species 0.000 claims abstract description 15
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims abstract description 10
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims abstract description 9
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 9
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 claims abstract description 8
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims abstract description 8
- 239000012888 bovine serum Substances 0.000 claims abstract description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 5
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 claims abstract description 4
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 claims abstract description 4
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 claims abstract description 4
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 claims abstract description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 claims abstract description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 claims abstract description 4
- 229940049018 mycostatin Drugs 0.000 claims abstract description 4
- VQOXZBDYSJBXMA-NQTDYLQESA-N nystatin A1 Chemical compound O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1/C=C/C=C/C=C/C=C/CC/C=C/C=C/[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 VQOXZBDYSJBXMA-NQTDYLQESA-N 0.000 claims abstract description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims abstract description 4
- 238000011109 contamination Methods 0.000 claims abstract description 3
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims abstract description 3
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 claims abstract description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims abstract description 3
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 claims abstract 2
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 34
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 26
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 26
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 24
- 210000001563 schizont Anatomy 0.000 claims description 21
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 12
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 12
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 11
- 239000002577 cryoprotective agent Substances 0.000 claims description 10
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 9
- 230000012010 growth Effects 0.000 claims description 8
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 8
- 230000036039 immunity Effects 0.000 claims description 7
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 claims description 6
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 claims description 5
- 238000007710 freezing Methods 0.000 claims description 5
- 230000008014 freezing Effects 0.000 claims description 5
- 244000144972 livestock Species 0.000 claims description 5
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 claims description 4
- 230000002489 hematologic effect Effects 0.000 claims description 4
- WEEMDRWIKYCTQM-UHFFFAOYSA-N 2,6-dimethoxybenzenecarbothioamide Chemical compound COC1=CC=CC(OC)=C1C(N)=S WEEMDRWIKYCTQM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 claims description 3
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 claims description 3
- 239000007789 gas Substances 0.000 claims description 3
- 229960002385 streptomycin sulfate Drugs 0.000 claims description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 claims description 2
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 claims description 2
- 230000003071 parasitic effect Effects 0.000 claims description 2
- 229940056360 penicillin g Drugs 0.000 claims description 2
- 230000001902 propagating effect Effects 0.000 claims description 2
- 241000283725 Bos Species 0.000 claims 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 claims 1
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 claims 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 claims 1
- 238000002161 passivation Methods 0.000 claims 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 claims 1
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 claims 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims 1
- 238000011161 development Methods 0.000 abstract description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 4
- FCPVYOBCFFNJFS-LQDWTQKMSA-M benzylpenicillin sodium Chemical compound [Na+].N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C([O-])=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 FCPVYOBCFFNJFS-LQDWTQKMSA-M 0.000 abstract description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 3
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 abstract 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 abstract 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 abstract 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 abstract 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 21
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 11
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 11
- 241000282849 Ruminantia Species 0.000 description 10
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 7
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 6
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- 241001416150 Bos indicus x Bos taurus Species 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 208000009182 Parasitemia Diseases 0.000 description 3
- 208000030852 Parasitic disease Diseases 0.000 description 3
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 3
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 3
- 239000000902 placebo Substances 0.000 description 3
- 229940068196 placebo Drugs 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 3
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 3
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 2
- 208000025865 Ulcer Diseases 0.000 description 2
- 210000003165 abomasum Anatomy 0.000 description 2
- 208000007502 anemia Diseases 0.000 description 2
- 244000309464 bull Species 0.000 description 2
- 229950008349 buparvaquone Drugs 0.000 description 2
- KLLIVCPQDTYMLC-HDJSIYSDSA-N chembl292009 Chemical compound C1C[C@@H](C(C)(C)C)CC[C@@H]1CC1=C(O)C(=O)C2=CC=CC=C2C1=O KLLIVCPQDTYMLC-HDJSIYSDSA-N 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 2
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 2
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 2
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 2
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 2
- 230000001338 necrotic effect Effects 0.000 description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 2
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 2
- 231100000397 ulcer Toxicity 0.000 description 2
- GATQERNJKZPJNX-LDXVYITESA-N 7-bromo-6-chloro-3-[3-[(2s,3r)-3-hydroxypiperidin-2-yl]-2-oxopropyl]quinazolin-4-one;2-hydroxypropanoic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O.O[C@@H]1CCCN[C@H]1CC(=O)CN1C(=O)C2=CC(Cl)=C(Br)C=C2N=C1 GATQERNJKZPJNX-LDXVYITESA-N 0.000 description 1
- LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M Cetrimonium bromide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)C LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 208000010201 Exanthema Diseases 0.000 description 1
- 241000190687 Gobius Species 0.000 description 1
- 241001191175 Hyalomma detritum Species 0.000 description 1
- 206010061217 Infestation Diseases 0.000 description 1
- 208000008771 Lymphadenopathy Diseases 0.000 description 1
- 206010067482 No adverse event Diseases 0.000 description 1
- 208000037273 Pathologic Processes Diseases 0.000 description 1
- 241000223777 Theileria Species 0.000 description 1
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 239000012984 antibiotic solution Substances 0.000 description 1
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 210000005252 bulbus oculi Anatomy 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 230000001055 chewing effect Effects 0.000 description 1
- 230000035606 childbirth Effects 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000003113 dilution method Methods 0.000 description 1
- 210000001840 diploid cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 201000005884 exanthem Diseases 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000003365 glass fiber Substances 0.000 description 1
- 201000001505 hemoglobinuria Diseases 0.000 description 1
- 230000002008 hemorrhagic effect Effects 0.000 description 1
- SCEVFJUWLLRELN-UHFFFAOYSA-N imidocarb Chemical compound C=1C=CC(C=2NCCN=2)=CC=1NC(=O)NC(C=1)=CC=CC=1C1=NCCN1 SCEVFJUWLLRELN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004683 imidocarb Drugs 0.000 description 1
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 230000001759 immunoprophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000006651 lactation Effects 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 231100000636 lethal dose Toxicity 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000021633 leukocyte mediated immunity Effects 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 208000018555 lymphatic system disease Diseases 0.000 description 1
- 238000009115 maintenance therapy Methods 0.000 description 1
- 229940126601 medicinal product Drugs 0.000 description 1
- 230000000394 mitotic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000004570 mortar (masonry) Substances 0.000 description 1
- 239000012452 mother liquor Substances 0.000 description 1
- 230000003108 parasitologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009054 pathological process Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 206010037844 rash Diseases 0.000 description 1
- 239000004576 sand Substances 0.000 description 1
- 230000001932 seasonal effect Effects 0.000 description 1
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 description 1
- 238000009589 serological test Methods 0.000 description 1
- 231100000046 skin rash Toxicity 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003245 working effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/002—Protozoa antigens
- A61K39/015—Hemosporidia antigens, e.g. Plasmodium antigens
- A61K39/018—Babesia antigens, e.g. Theileria antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P33/00—Antiparasitic agents
- A61P33/02—Antiprotozoals, e.g. for leishmaniasis, trichomoniasis, toxoplasmosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
- A61K2039/552—Veterinary vaccine
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Группа изобретений относится к области ветеринарной микробиологии. Способ получения вакцины включает выделение лимфоидных клеток, инфицированных шизонтами Theileria annulata, осуществляют от животного, зараженного шизонтами Theileria annulata в виде супернатанта из измельченных клещей или в виде консервированной культуры, культивирование зараженных клеток осуществляют в среде для роста, которая представляет собой RPMI 1640, дополненную сывороткой в количестве от 10 до 20%, выбранной из эмбриональной сыворотки теленка, сыворотки новорожденного теленка или нормальной бычьей сыворотки; раствором антибиотиков, содержащим бензилпенициллин натрия 100 ME на мл, сульфат стрептомицина 100 мкг на мл и микостатин 10 ME на мл, а также 200 мМ L-глутамином на мл, при этом все компоненты предварительно стерилизованы фильтрацией и очищены от любого загрязнения микроорганизмами стандартными методами. Размножение культивированных клеток in vitro осуществляют методом серийных пассажей, при этом осуществляют до 100 пассажей с периодичностью два или три раза в неделю, а плотность посева клеток поддерживают соответственно 1×105 или 2×105 клеток на мл, или методом предельных разведений их в «cupark» планшетах и выращивание клонированных культур из одной клетки пассированием культур до 200 раз в режиме два/три раза в неделю. Подращивают культуры до больших объемов для получения вакцины. Тестирование эффективности вакцины в широких полевых условиях осуществляют на коровах Bos Taurus, скрещенных с коровами Bos Indicusy, a также на новорожденных телятах, телятах возрастом до двух месяцев и беременных коровах. Вакцина безопасна для всех возрастных групп крупного рогатого скота, включая новорожденных телят и беременных коров, обладает высокой иммуногенной активностью. 3 н. и 5 з.п. ф-лы, 1 табл.
Description
ОБЛАСТЬ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
Изобретение относится к вакцине против тейлериоза и способу ее получения. Эта вакцина безопасна для всех экзотических пород, их гибридов во всех возрастных группах крупного рогатого скота, даже включая новорожденных телят и беременных коров, а также телят данной местности, и обладает способностью защищать вакцинированных животных от тропического тейлериоза жвачных животных.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Экзотические породы крупного рогатого скота, их гибриды и молодые телята данной местности в высокой степени подвержены тропическому тейлериозу жвачных животных, который представляет собой крайне опасное заболевание крупного рогатого скота, передаваемое клещами. Это заболевание неблагоприятно воздействует на рабочие свойства быков, племенные качества быков и молочную продуктивность коров, приводя к огромным экономическим потерям. Наряду с прямыми потерями, большие расходы также идут на лечение заболевших животных. Возникновение этого заболевания является сезонным, в течение лета и дождливых месяцев, т.е. с апреля по октябрь. Соответствующими признаками болезни являются лимфоаденопатия, лихорадка, анемия, слабость, лежачее положение и специфичная особенность, связанная с непрерывным потреблением пищи и жеванием, проявляющаяся у экзотических и гибридных пород крупного рогатого скота до поздних стадий заболевания. Наблюдаемыми необычными признаками являются гемоглобинурия и кожная сыпь, главным образом у взрослых особей крупного рогатого скота, а также выступающие глазные яблоки и вовлечение в патологический процесс головного мозга у гибридных телят. Диагноз подтверждается демонстрацией макрошизонтов в мазках при биопсии лимфатических узлов и пироплазм в эритроцитах.
Уровень заболеваемости приближается почти к 100 процентам, а уровень смертности - к 60-80 процентам. В основном от этого заболевания страдают молодые животные, главным образом моложе 2-месячного возраста. Впоследствии животные продолжают получать повторяющиеся природные инфекционные инокуляты через повторяющиеся клещевые инвазии и остаются иммунными к этому заболеванию и устойчивыми даже к вирулентным провокациям. Однако в результате любого стресса, такого как беременность, роды, лактация, интеркуррентное заболевание и т.д., во время последующей жизни остаточная инфекция в их организме может перерасти в заболевание с клинической симптоматикой. Это заболевание предположительно представляет угрозу для 250 миллионов особей крупного рогатого скота на Средиземноморском побережье, в Северной Африке, на Ближнем и Среднем Востоке, на Индийском субконтиненте и Центральной Азии.
Различные химиотерапевтические агенты, подобные беренилу, имидокарбу, лактату галофугинона, бупарваквону, наряду с поддерживающей терапией были испробованы с различными уровнями успешного исхода. Из этих данных было обнаружено, что бупарваквон является наиболее эффективным в лечении клинических случаев тейлериоза. Однако это лекарственное средство необходимо импортировать и оно является очень дорогостоящим. Имея в виду распространенность этого заболевания и невозможность контроля за клещами-переносчиками в полевых условиях, необходимость разработки подходящих иммунопрофилактических средств ощущалась в Индии и в различных других странах, в которых проводят интенсивные программы по скрещиванию пород для увеличения продукции молока, контролируя это страшное заболевание. Время от времени с различным успехом были испробованы различные способы иммунизации. Эти способы иммунизации включают в себя лучевую обработку, неспецифическую иммунизацию, клеточную культуральную вакцину и т.д. Клеточная культуральная вакцина в настоящее время опробована в некоторых странах, тогда как другие способы были использованы в прошлом и имели их собственные преимущества и недостатки.
Существующий на рынке продукт под названием Rakshavac-T не рекомендуется ни телятам моложе 2-месячного возраста, ни беременным коровам. Несмотря на то, что эпидемиологические исследования подтвердили, что это заболевание встречается в первую очередь у этого поголовья скота.
В патенте DE2914813 описана живая вакцина против тейлериоза у крупного рогатого скота, содержащая лимфоидные клетки крупного рогатого скота, инфицированные шизонтами аттенуированного штамма Theileria annulata. Эту вакцину вводят в виде дозы, содержащей 0,1-3 миллиона живых инфицированных клеток. Эту вакцину готовили путем выращивания T. Annulata, выделенного из клещей Hyalomma detritum, в лимфоидных клетках крупного рогатого скота, используя питательную среду в течение 20-100 дней, предпочтительно осуществляя более 6-12 пассажей при 37,5-38,5°C. Затем шизонты собирали и замораживали в присутствии подходящего криопротектора, предпочтительно глицерина, при температуре ниже -60°C.
Недостатком вышеуказанной вакцины является то, что она содержит только от 0,1 до 3 миллионов клеток по сравнению с вакциной по настоящему изобретению, в которой содержится 5 миллионов клеток. Другим отличием от вышеуказанной вакцины является то, что используемым криопротектором является глицерин при -60°C, тогда как криопротектором, используемым в настоящем изобретении, является диметилсульфоксид (DMSO) и материал замораживают в жидком азоте при -179°C. Кроме того, количество пассажей, при котором получали вакцину по настоящему изобретению, составляет 200, и она представляет собой клонированную культуру, развившуюся из одной клетки, в отличие от культуры, используемой при 6-12 пассажах в вакцине, указанной в патенте DE2914813.
В патенте EP2228 A описан терапевтический препарат для лечения клинических случаев тейлериоза у крупного рогатого скота и овец, где препарат содержит 2-циклоалкил-3-гидрокси-1,4-нафтохинон. Недостаток состоит в том, что он представляет собой лекарственное средство, предназначенное для лечебных целей, а не вакцину для профилактики и контроля за заболеванием.
Ограничением вышеуказанных препаратов, следовательно, является то, что они подходят только для клинических случаев тейлериоза у крупного рогатого скота и овец и не имеют профилактического применения.
ОБЪЕКТЫ НАСТОЯЩЕГО ИЗОБРЕТЕНИЯ
Объектом настоящего изобретения является вакцина против тейлериоза и способ ее получения для иммунизации экзотического и гибридного крупного рогатого скота, а также телят данной местности против тропического тейлериоза жвачных животных, вызываемого Theileria annulata.
Другим объектом настоящего изобретения является вакцина против тейлериоза и способ ее получения для иммунизации крупного рогатого скота против тропического тейлериоза жвачных животных, которая является безопасной для всех пород и для всех возрастов и стадий развития крупного рогатого скота, в частности экзотического и гибридного крупного рогатого скота, и может защищать их от тяжелой формы заражения клещами.
Еще одним объектом настоящего изобретения является вакцина против тейлериоза и способ ее получения для иммунизации крупного рогатого скота против тропического тейлериоза жвачных животных, которая не имеет побочных реакций и может быть безопасно использована даже у телят в возрасте нескольких дней, а также у беременных животных и высокопродуктивного крупного рогатого скота без каких-либо побочных эффектов.
Дополнительным объектом настоящего изобретения является вакцина против тейлериоза и способ ее получения для иммунизации крупного рогатого скота против тропического тейлериоза жвачных животных, которая является экономически выгодной, поскольку основана на природных ингредиентах.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Способ получения вакцины против тейлериоза, включающий в себя стадии выделения лимфоидных клеток, инфицированных шизонтами Theileria annulata, присутствующими в инфицированном животном, культивирования инфицированных клеток в среде для роста, размножения указанных культивированных клеток путем серийных пассажей in vitro, выращивания клонированных культур из одной клетки методом предельных разведений и их дополнительного пассирования, кариотипирования этих клеток в среде для установления их диплоидности, и получения жизнеспособных клеток с максимальной инфицирующей способностью, определения числа ядер шизонта, замораживания некоторого количества жизнеспособных диплоидных клеток в жидком азоте в присутствии криопротектора в указанной среде для роста с получением суспензии жизнеспособных клеток, тестирования различных пассажей этих культур и различных уровней доз для установления их патогенности/антигенности в группах телят, определения уровня пассажа и дозы для безопасной и эффективной кандидатной вакцины, ее безопасного использования у новорожденных телят и беременных коров, времени, необходимого для индукции иммунитета, серологических реакций и воздействия на гематологические параметры, и тестирования ее эффективности в широких полевых условиях у восприимчивого поголовья скота.
Кроме того, в соответствии с этим изобретением также предлагается вакцина против тейлериоза, содержащая шизонт T. annulata в криопротекторе и среде для роста.
Способ получения вакцины против тейлериоза включает в себя выделение лимфоидных клеток, инфицированных шизонтами Theileria annulata, из инфицированного животного, выращивание в среде для роста in vitro, замораживание и получение вакцины против тейлериоза, где указанное выращивание in vitro проводят два/три раза в неделю серийными пассажами до потери культурой патогенности, но сохранения ее антигенности, где указанная среда для роста содержит RPMI-1640, дополненную 10-20% по объему бычьей сывороткой, выбранной из эмбриональной бычьей сыворотки, сыворотки новорожденного теленка и нормальной бычьей сыворотки; раствор антибиотика, содержащий бензилпенициллин натрия 100 МЕ на мл, стрептомицина сульфат 100 мкг на мл, микостатин 10 МЕ на мл, и 200 мM/мл L-глутамина, а указанное замораживание осуществляют с использованием криопротектора, выбранного из диметилсульфоксида (DMSO) или глицерина, и указанную вакцину против тейлериоза готовят путем доведения концентрации клеток до 5·106 жизнеспособных клеток на мл в указанной среде для роста, содержащей 10% DMSO, помещая аликвоты клеточной суспензии в предварительно помеченные стерильные криопробирки объемом один мл, и переноса этих пробирок в газовую фазу жидкого азота.
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В настоящем изобретении вакцина против тейлериоза была получена способом, включающим следующие стадии:
(a) Приготовление супернатанта, полученного из измельченных клещей (GUTS), зараженных Theileria annulata
Инфицированные взрослые особи клещей Hyelomma предварительно выкармливались на теленке в течение 72 часов и их собирали в стерильные стеклянные пробирки. Клещей тщательно промывали водой и 1% раствором цетавлона, а затем физиологическим раствором и RPMI-1640, и клещей замораживали в течение 5-10 минут. Известное количество клещей тонко измельчают пестиком в пастообразную массу в стерильной ступке путем добавления морского песка или стеклянного волокна. Достаточное количество среды RPMI-1640 дополняют 3,6% бычьим сывороточным альбумином в виде порошка и добавляют антибиотики. Пастообразную массу собирают в стерильную культуральную пробирку. Хорошо перемешивают и центрифугируют при 4°C при 250g. Надосадочную жидкость, в дальнейшем называемую супернатантом, полученным из измельченных клещей (GUTS), содержащую спорозоиды T. annulata берут в аликвотном количестве в зависимости от количества инфицированных клещей, взятых в качестве инфицирующей дозы. GUTS используют для инициализации инфекционного процесса или для проверки иммунности вакцинированных животных либо в свежем виде, либо сохраненными в жидком азоте, добавляя глицерин/диметилсульфоксид (DMSO) в качестве криопротектора до использования в качестве консервированной культуры.
(b) Получение инфицирующих культур Theileria annulata
Восприимчивых животных подвергали инфицированию тропическим тейлериозом жвачных животных с использованием инфицирующих GUTS/консервированных культур. Кровь и материал биопсии лимфатических узлов собирали в тот момент, когда у телят появлялись клинические признаки заболевания. В асептических условиях лейкоциты отделяли от крови и культивировали в среде для роста, описанной ниже. Клетки, полученные из лимфатического узла, дважды промывали средой RPMI-1640 и культивировали в среде для роста. Как только клетки, инфицированные Т. annulata, начали расти во флаконах для тканевых культур, их инфицирующую способность оценивали, как описано ниже. Как только клетки, инфицированные Т. annulata, становятся конфлюэнтными, их пересаживают в другой флакон для тканевых культур, как описано ниже.
(c) Размножение in vitro
Длительное культивирование T. annulata in vitro осуществляют с помощью серийных пассажей с различными интервалами до достижения стадии, на которой культура теряет свою патогенность и сохраняет свою иммуногенность на желаемом уровне. Культуры пересаживают либо два, либо три раза в неделю и как стабильные культуры, где среду меняют в том же флаконе два раза в неделю. В культурах, пересаживаемых два раза в неделю, и в стабильных культурах 9 мл свежей среды для роста добавляют к 1 мл старой культуры, таким образом, поддерживая плотность посева 1·105 клеток на мл. В культурах, пересаживаемых три раза в неделю, 8 мл свежей среды для роста добавляют к 2 мл старой культуры с плотностью посева 2·105 клеток на мл. Культуры, пересаживаемые два и три раза в неделю, размножают вплоть до 100 пассажей и их замораживают в различных пассажах, таким образом, чтобы заморозить маточный раствор на всех уровнях. В дальнейшем клонированные культуры выращивали и пересаживали до 200 раз и замораживали в различных пассажах. Стабильные культуры поддерживали до одного года и культуры замораживали в различные промежутки времени 3 месяца, 6 месяцев, 9 месяцев и один год. Криопротектор, используемый для этих культур, представляет собой диметилсульфоксид (DMSO).
(d) Клонирование клеток
Проверяли эффективность культивирования этих культур и клонировали популяции клеток, инфицированных шизонтами T. annulata в виде суспензионных культур, развившихся из одной клетки, используя метод предельных разведений, в котором культуру в определенном пассаже разводят таким образом, что получается клеточная популяция 1·103 клеток на мл. Для этой цели использовали культуры, уже перенесшие до 90-100 пассажей в режиме либо два раза в неделю, либо три раза в неделю. Разведенные таким образом культуры затем помещают в «cupark» планшеты, а затем наблюдают под микроскопом. Те лунки, которые содержали единичные клетки, метили, а другие оставляли, как есть. Лунки, содержащие единичные клетки, ежедневно подвергали мониторингу и выращивали клонированную клеточную популяцию. Эти единичные клетки, таким образом, оставляли для размножения и дальнейшего роста. Когда через несколько дней образовывалась масса клеток, клетки вместе со средой переносили в большую по размеру лунку планшета costar, добавляли среду и клетки оставляли для дальнейшего роста. При увеличении их количества затем клетки переносили во флакон объемом 25 см3 и подвергали дальнейшему мониторингу с ежедневным добавлением свежей среды. Когда такие культуры вырастают до полной популяции, их затем пересаживают в новый флакон. В случае трансформации, их пересаживали во флаконы большего объема и подращивали, как описано здесь, и замораживали в жидком азоте при различных уровнях пассажей.
(e) Среда для роста
Используемая среда для роста представляет собой RPMI-1640, дополненную исходно эмбриональной сывороткой теленка, а затем ее заменяли сывороткой новорожденного теленка или нормальной бычьей сывороткой, взятой в количестве 10-20% по объему. К этой среде добавляли антибиотики в форме бензилпенициллина натрия 100 МЕ на мл, сульфата стрептомицина 100 мкг на мл и микостатина 10 МЕ на мл. Помимо этого также добавляют 200 мM L-глутамина. Все компоненты предварительно стерилизуют фильтрацией и освобождают от любого загрязнения микроорганизмами стандартным способом.
(f) Подращивание культур
Замороженную посевную культуру размораживают непосредственно до 37°C из жидкого азота, промывают путем ресуспендирования в 10 мл среды для роста и центрифугируют при 400g в течение 10 минут. Супернатант отбрасывают. Осадок, содержащий клетки, ресуспендируют в 10 мл среды для роста, засеянной в 25 см2 флаконах для тканевых культур, и инкубируют в термостате при 37°C. Культура достигает фазы экспоненциального роста через 24 часа. После подсчета количества клеток культуру высевают во флаконы для тканевых культур объемом 80 или 250 см2 с плотностью 2·105 клеток на мл в 25 или 100 мл среды для роста соответственно, и инкубируют при 37°C. Через 48 часов в каждый флакон добавляют равное количество среды для роста. На следующий день флаконы проверяют на рост шизонтов T. annulatа. Две аликвоты по 100 мкл из каждого флакона берут для подсчета жизнеспособных и нежизнеспособных клеток и инфицирующей способности. Инфицирующая способность в культурах составила более 99 процентов. Регистрировали митотические индексы и подсчитывали число ядер макрошизонтов. Кариотипирование показало, что клетки в культурах сохраняют свой диплоидный характер.
Оценка инфицирующей способности
Инфицирование мононуклеарных клеток шизонтами T. annulatа во флаконах оценивали, получая клеточный мазок с помощью центрифугирования, из 100 мкл культуры. Клеточный мазок сразу же сушили на воздухе, фиксировали метанолом, окрашивали по Гимза и изучали под иммерсионным микроскопом. Более 99% клеток в своей цитоплазме имели шизонты T. annulatа.
Оценка жизнеспособности
Количество жизнеспособных клеток в каждом флаконе оценивали стандартным методом исключения с помощью 0,1-процентного трипанового синего, и подсчитывали в гемоцитометре. При доступности могут быть использованы другие современные автоматические и полуавтоматические методы, такие как с использованием счетчика Coulter Counter и т.п. Оценка жизнеспособности показала более высокую жизнеспособность на 2-3 день.
(g) Получение вакцинных доз
Клетки из всех флаконов объединяют и их клеточную концентрацию доводят до 10·106 жизнеспособных клеток на мл. Общий объем измеряют и смешивают с равным количеством среды для роста, содержащей 20% диметилсульфоксида (DMSO) до получения конечной концентрации клеток 5·106 жизнеспособных клеток на мл в среде для роста, содержащей 10% DMSO. Клеточную суспензию разливают аликвотами в предварительно меченые стерильные криопробирки, объемом один мл, и сразу же переносят в контейнер, содержащий газовую фазу жидкого азота. Флаконы можно переносить в контейнер с жидкой фазой жидкого азота на следующее утро для длительного хранения до использования.
ИССЛЕДОВАНИЕ КУЛЬТУР ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ВАКЦИНЫ
(a) Тестирование культур на патогенность/антигенность
Различные клеточные линии, инфицированные шизонтами T. annulata, полученными различными путями размножения, тестировали в различных пассажах, т.е. 10, 20, 60, 100, 160 и 200 с различными уровнями доз, вводимыми подкожно в виде единичной инъекции для установления их патогенности и/или защитной эффективности в группах восприимчивых телят, которых содержали в контролируемых условиях без клещей в экспериментальных помещениях для животных. Телят инфицировали клеточными культурами после быстрого оттаивания при 37°C из жидкого азота, а контрольным телятам вводили плацебо. Затем всех телят заражали инфицирующими супернатантами, полученными из измельченных клещей (GUTS) или консервированными культурами, чтобы получить кандидатную линию клеточной культуры в соответствующем пассаже и при соответствующем уровне дозы, неспособную вызвать заболевание, но способную вызвать иммунитет у скота, подверженного этому заболеванию. Используя несколько испытаний на животных, включающих в себя группы телят, надлежащий уровень пассажа культур, титрование дозы клеток для иммунизации, путь заражения и время, необходимое для развития иммунитета и т.п., устанавливали в тех случаях, когда вакцина давала желаемый уровень защиты от заражения летальными дозами клещевого материала. Таким образом, была разработана кандитатная клеточная культуральная вакцина из клонированной культуры в 200 пассаже, которая не вызывала какого-либо заболевания у животных, которым вводили вакцину, но защищала их от тропического тейлериоза при заражении GUTS или консервированной культурой. Эту группу сравнивали с животными, которым вводили плацебо, у которых было показано тяжелое клиническое заболевание при заражении GUTS или консервированной культурой. Таким образом, было установлено, что клонированная культура в 200 пассаже, содержащая 5·106 клеток в качестве дозы, взятой в виде единичной инъекции, введенной подкожно, была безопасной и иммуногенной в качестве вакцины.
(b) Кандидатная вакцина
Клонированную культуру в 200 пассаже использовали в объеме 1,0 мл, содержащем 5·106 клеток в качестве кандидатной вакцины, вводимой подкожно в виде единичной дозы.
(c) Опыты по иммунизации
Все вакцинированные животные оставались клинически здоровыми после инъекции вакцины. Не было клинических симптомов у животных, вакцинированных клеточными культурами шизонтов при уровне дозы 5·106 клеток на мл, при подкожном введении в 200 пассаже. Гематологические показатели были в пределах нормы у всех вакцинированных животных. В сыворотке этих животных была показана выработка антител против этого организма. Даже после очень мощного заражения GUTS или консервированной культурой, вызывающими клиническое заболевание у животных, которым вводили плацебо, у животных, которым вводили клеточные культуры шизонтов в 200 пассаже, не вызывало симптома заболевания или какого-либо изменения в гематологических показателях. Немногочисленные шизонты и пироплазмы можно увидеть у небольшого процента животных после вакцинации. Эта чрезвычайно низкая паразитемия может указывать на установление клеточно-опосредованного иммунного ответа у вакцинированных животных. Титры антител определяли серологически уже на первой неделе после вакцинации и пик титров антител наблюдали через четыре недели после вакцинации. Защитный иммунитет индуцировался в течение 15 дней после вакцинации. Вакцина успешно применялась даже у новорожденных телят и беременных коров, которые наиболее подвержены этому заболеванию, и оказалась безопасной и обладающей защитными свойствами.
(d) Тестирование вакцины Индийским советом по научным исследованиям в области сельского хозяйства
Полученная таким образом клеточная культуральная вакцина также была протестирована в слепом испытании, проводимом Координационной группой Индийского совета по научным исследованиям в области сельского хозяйства (ICAR) Всеиндийского координированного научно-исследовательского проекта (AICRP) по одноклеточным организмам, паразитирующим в крови. Это независимое агентство также сообщило о том, что эта вакцина была безопасной для восприимчивых животных и индуцировала защитный иммунитет против тропического тейлериоза жвачных животных.
ПРИМЕР
В этот эксперимент были включены двенадцать молодых гибридных бычков в возрасте примерно от 2 до 4 месяцев, выращенных в защищенных от клещей условиях. В слепом испытании 6 из них инъекционно вводили клеточную культуральную вакцину шизонтов Theileria, разработанную HAU центром. Один мл этой вакцины вводили подкожно на левой стороне шеи 30.10.90, а остальные 6 особей оставляли в качестве контроля. Все 10 выживших телят (другие два теленка из контрольной группы умерли от других причин) подвергали заражению 17.12.90 путем введения на правой стороне шеи T. annulata в виде суспензии инфицированных измельченных клещей. Вакцинирование и заражение проводили сотрудники H.A.U. Центра. Ответ организма-хозяина на вакцинацию и заражение контролировали с помощью Координатора проекта и его сотрудников в соответствии с протоколом, разработанным данным научно-исследовательским проектом.
НАБЛЮДЕНИЯ
Все 6 вакцинированных телят выжили. Вакцина не вызывала развития какой-либо клинической и паразитологической реакции, за исключением лихорадки в течение суток у 2 телят.
Ответы организма-хозяина на заражение
а) Иммунизированная группа: у одного теленка наблюдалась лихорадка в течение суток, и он умер на 12 день без видимой паразитемии. После смерти не было обнаружено типичных для тейлериоза повреждений. Следовательно, смерть этого теленка объясняется любой другой причиной, кроме тейлериоза. Оставшиеся 5 телят выжили.
b) Контрольная группа: для всех практических целей только 2 теленка приняли участие в этом эксперименте. Из них один теленок страдал тяжелым тейлериозом и умер от него на 15 день. Несколько перфорированных некротических язв, типичных для тейлериоза, было видно на слизистой оболочке сычуга после смерти. Второй теленок страдал тейлериозом в легкой степени, но умер на 33 день от анемии. Геморрагические перфорированные некротические язвы на слизистой оболочке сычуга отсутствовали.
Оставшиеся 4 теленка контрольной группы умерли - 2 из них до заражения и 2 теленка на 2 и 9 день после заражения.
Подробности представлены в следующей таблице.
Таблица демонстрирует ответы организма-хозяина на заражение.
Категория | Число телят | Продолжительность лихорадки (дни) | Максималь-ная парази-темия (%) | Максимальное содержание лимфоидных клеток, инфицированных шизонтами в биопсийном материале (%) | Снижение Hb (%) | Снижение PCV (%) | Примечания |
Иммунизированная группа | 6 | 1-2 | L1-2 | L1 | 20-25 | 16-30 | *Один умер на 12 день |
Контрольная группа | 2 | 5 и 6 | 5 и 80 | 2 и 30 | 45 и 22 | 46 и 30 | Один умер на 15 день. Один умер на 33 день |
* Смерть не обусловлена тейлериозом. Отсутствие паразитемии |
Заключение
Эта вакцина считается безопасной для иммунизации гибридных телят в возрасте от 2 до 4 месяцев, поскольку не вызывала клинического заболевания. Эта вакцина давала достаточную защиту для устойчивости к тяжелому заражению GUTS, эквивалентному 10 клещам.
(e) Объем исследований иммунизации
Полученную таким образом клеточную культуральную вакцину против тропического тейлериоза жвачных животных использовали в полевых условиях на организованных животноводческих фермах, а также в фермерских хозяйствах в различных частях Харияны, Пенджаба, Мадхья Прадеш и Махараштры. Крупный рогатый скот всех экзотических пород и их гибриды всех возрастных групп были включены в эти испытания. Вакцина оказалась безопасной и эффективной в полевых условиях, поскольку вакцинированные животные были защищены от тропического тейлериоза жвачных животных, тогда как в этих областях у невакцинированных животных наблюдались клинические случаи заболевания. Было отмечено, что телята, родившиеся от племенных коров, вакцинированных на поздней стадии беременности, были подвержены этому заболеванию.
Claims (8)
1. Способ получения вакцины против тейлериоза, включающий стадии выделения лимфоидных клеток, инфицированных шизонтами Theileria annulata, присутствующими у инфицированного животного, культивирование зараженных клеток в среде для роста, размножения культивированных клеток in vitro методом серийных пассажей, замораживание диплоидных жизнеспособных клеток в жидком азоте в присутствии диметилсульфоксида в качестве криопротектора в указанной среде для роста для получения суспензии жизнеспособных клеток, тестирование исходных культур, а также культур с различными уровнями пассажей и в различных дозах в группах телят для определения их патогенности/антигенности, определение уровня пассажа и дозы для безопасной и эффективной кандидатной вакцины, ее безопасного использования у новорожденных телят и беременных коров, времени, необходимого для индукции иммунитета, серологических реакций и воздействия на гематологические параметры, и тестирование ее эффективности в широких полевых условиях у поголовья скота, подверженного этому заболеванию, отличающийся тем, что
выделение лимфоидных клеток, инфицированных шизонтами Theileria annulata, осуществляют от животного, зараженного шизонтами Theileria annulata в виде супернатанта из измельченных клещей или в виде консервированной культуры,
культивирование зараженных клеток осуществляют в среде для роста, которая представляет собой RPMI 1640, дополненную сывороткой в количестве от 10 до 20%, выбранной из эмбриональной сыворотки теленка, сыворотки новорожденного теленка или нормальной бычьей сыворотки; раствором антибиотиков, содержащим бензилпенициллин натрия 100 ME на мл, сульфат стрептомицина 100 мкг на мл и микостатин 10 ME на мл; а также 200 мМ L-глутамином на мл, при этом все компоненты предварительно стерилизованы фильтрацией и очищены от любого загрязнения микроорганизмами стандартными методами;
размножение культивированных клеток in vitro осуществляют методом серийных пассажей, при этом осуществляют до 100 пассажей с периодичностью два или три раза в неделю, а плотность посева клеток поддерживают соответственно 1·105 или 2·105 клеток на мл, или методом предельных разведений их в «cupark» планшетах и выращивание клонированных культур из одной клетки пассированием культур до 200 раз в режиме два/три раза в неделю;
подращивание культуры до больших объемов для получения вакцины;
тестирование эффективности вакцины в широких полевых условиях осуществляют на коровах Bos Taurus, скрещенных с коровами Bos Indicusy, a также на новорожденных телятах, телятах возрастом до двух месяцев и беременных коровах.
выделение лимфоидных клеток, инфицированных шизонтами Theileria annulata, осуществляют от животного, зараженного шизонтами Theileria annulata в виде супернатанта из измельченных клещей или в виде консервированной культуры,
культивирование зараженных клеток осуществляют в среде для роста, которая представляет собой RPMI 1640, дополненную сывороткой в количестве от 10 до 20%, выбранной из эмбриональной сыворотки теленка, сыворотки новорожденного теленка или нормальной бычьей сыворотки; раствором антибиотиков, содержащим бензилпенициллин натрия 100 ME на мл, сульфат стрептомицина 100 мкг на мл и микостатин 10 ME на мл; а также 200 мМ L-глутамином на мл, при этом все компоненты предварительно стерилизованы фильтрацией и очищены от любого загрязнения микроорганизмами стандартными методами;
размножение культивированных клеток in vitro осуществляют методом серийных пассажей, при этом осуществляют до 100 пассажей с периодичностью два или три раза в неделю, а плотность посева клеток поддерживают соответственно 1·105 или 2·105 клеток на мл, или методом предельных разведений их в «cupark» планшетах и выращивание клонированных культур из одной клетки пассированием культур до 200 раз в режиме два/три раза в неделю;
подращивание культуры до больших объемов для получения вакцины;
тестирование эффективности вакцины в широких полевых условиях осуществляют на коровах Bos Taurus, скрещенных с коровами Bos Indicusy, a также на новорожденных телятах, телятах возрастом до двух месяцев и беременных коровах.
2. Способ получения вакцины против тейлериоза по п.1, отличающийся тем, что пассирование культуры два раза в неделю состоит в добавлении 8-9 мл среды для роста к 1-2 мл старой культуры в новый флакон для получения общего объема приблизительно 10 мл, и пассирование культуры три раза в неделю состоит в добавлении 7-8 мл свежей среды для роста к 2-3 мл старой культуры в новом флаконе, а в случае стационарной культуры - добавлением 8-9 мл свежей среды к 1-2 мл старой культуры дважды в неделю в том же флаконе для сохранения общего объема приблизительно 10 мл в течение периода времени до одного года, с последующим пассированием в больший по объему флакон, подращиванием и криоконсервацией культур, пассируемых два/три раза в неделю, в различных пассажах и в различные интервалы времени в случае стационарных культур.
3. Способ получения вакцины против тейлериоза по п.1, отличающийся тем, что в качестве сыворотки, которой дополняют среду для роста RPMI 1640, исходно используют эмбриональную сыворотку теленка, которую впоследствии заменяют нормальной бычьей сывороткой или сывороткой новорожденного теленка.
4. Способ получения вакцины против тейлериоза по п.1, отличающийся тем, что концентрацию клеток в клеточной суспензии доводят до 9-11·106 жизнеспособных клеток на мл, определяют суммарный объем и смешивают с равным количеством среды для роста, содержащей 20% DMSO, чтобы получить конечную концентрацию клеток 4,5-5,5·106 жизнеспособных клеток на мл в среде для роста, содержащей 10% DMSO.
5. Способ получения вакцины против тейлериоза по п.1, отличающийся тем, что подращивание культуры осуществляют путем быстрого нагревания посевной культуры до 37°C из газовой фазы жидкого азота, промывания путем ресуспендирования в 9-10 мл среды для роста, центрифугирования при 400g в течение 10 мин, отбрасывания супернатанта, посева во флаконы для клеточных культур в приблизительно 10 мл среды для роста и инкубирования при 37°C, последовательно высевая во флаконы для клеточных культур объемом 80 или 250 см2 при 1,5-2·105 кл/мл в 25 или 100 мл среды для роста соответственно, и инкубирования при 37°C, и добавления через 48 ч равного количества среды для роста в каждый флакон.
6. Способ получения вакцины против тейлериоза по п.1, отличающийся тем, что на стадии размножения in vitro различные клеточные линии паразитирующих организмов, выращенные пассированием в режиме два или три раза в неделю, тестируют для различных уровней пассажей, т.е. 10-15, 20-25, 50-55 для исходных культур и 100-105, 150-155 и 200-205 для клонированных культур, с различными уровнями доз, и определяют, что клонированная культура в пассаже 200-205 с 4,5-5·106 клетками на мл в виде единичной дозы является безопасной и иммуногенной в качестве вакцины.
7. Способ выращивания клонированных культур из единичной клетки, инфицированной шизонтами Theileria annulata, включающий
отбор культур лимфоидных клеток, инфицированных шизонтами Theileria annulata, которые перенесли 90-100 пассажей;
получение клеточной популяции из 1·103 клеток на мл методом конечных разведений;
помещение полученной разведенной культуры в «cupark» планшеты;
мечение лунок «cupark» планшета, содержащих единичную клетку и выращивание клонированной клеточной популяции;
перенос растущей клонированной клеточной популяции вместе со средой для дальнейшего роста в большую по объему лунку «costar» планшета и добавление среды;
при увеличении клонированной клеточной популяции добавляют свежую среду и переносят во все большие и большие флаконы;
замораживание клонированной клеточной популяции при различных уровнях пассажей в контейнере с жидким азотом и использованием в качестве криопротектора 10%-ного раствора диметилсульфоксида.
отбор культур лимфоидных клеток, инфицированных шизонтами Theileria annulata, которые перенесли 90-100 пассажей;
получение клеточной популяции из 1·103 клеток на мл методом конечных разведений;
помещение полученной разведенной культуры в «cupark» планшеты;
мечение лунок «cupark» планшета, содержащих единичную клетку и выращивание клонированной клеточной популяции;
перенос растущей клонированной клеточной популяции вместе со средой для дальнейшего роста в большую по объему лунку «costar» планшета и добавление среды;
при увеличении клонированной клеточной популяции добавляют свежую среду и переносят во все большие и большие флаконы;
замораживание клонированной клеточной популяции при различных уровнях пассажей в контейнере с жидким азотом и использованием в качестве криопротектора 10%-ного раствора диметилсульфоксида.
8. Вакцина против тейлериоза, полученная способом по любому из пп.1-6, с концентрацией 4,5-5,5·106 жизнеспособных клеток на мл среды для роста.
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
IN880DE2004 | 2004-05-14 | ||
IN880/DEL/2004 | 2004-05-14 | ||
IN2103/DEL/2004 | 2004-10-26 | ||
IN2103DE2004 | 2004-10-26 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2006144451A RU2006144451A (ru) | 2008-06-20 |
RU2404800C2 true RU2404800C2 (ru) | 2010-11-27 |
Family
ID=35394566
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2006144451/15A RU2404800C2 (ru) | 2004-05-14 | 2005-05-12 | Вакцина против тейлериоза |
Country Status (5)
Country | Link |
---|---|
AP (1) | AP2709A (ru) |
IL (1) | IL179254A (ru) |
MA (1) | MA28656B1 (ru) |
RU (1) | RU2404800C2 (ru) |
WO (1) | WO2005109991A2 (ru) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2023072178A1 (en) * | 2021-10-27 | 2023-05-04 | Porton Advanced Solutions Ltd. | Methods for developing a cell line for producing virus in suspension cell culture |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE2914813C2 (de) * | 1979-04-11 | 1984-04-19 | Vsesojuznyj institut eksperimental'noj veterinarii, Moskva | Lebend-Impfstoff gegen Theieriosis beim Rindvieh und Verfahren zu dessen Herstellung |
-
2005
- 2005-05-12 WO PCT/IN2005/000154 patent/WO2005109991A2/en active Application Filing
- 2005-05-12 RU RU2006144451/15A patent/RU2404800C2/ru not_active IP Right Cessation
- 2005-05-12 AP AP2006003856A patent/AP2709A/xx active
-
2006
- 2006-11-14 IL IL179254A patent/IL179254A/en active IP Right Grant
- 2006-12-08 MA MA29521A patent/MA28656B1/fr unknown
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
MA28656B1 (fr) | 2007-06-01 |
IL179254A0 (en) | 2007-03-08 |
WO2005109991A3 (en) | 2006-03-30 |
IL179254A (en) | 2011-12-29 |
RU2006144451A (ru) | 2008-06-20 |
WO2005109991A2 (en) | 2005-11-24 |
AP2709A (en) | 2013-07-30 |
AP2006003856A0 (en) | 2006-12-31 |
WO2005109991A8 (en) | 2006-08-24 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Spink | The nature of brucellosis | |
CN105462936B (zh) | 一种猪流行性腹泻病毒my01株及其应用 | |
Oberem et al. | The production of heartwater vaccine | |
NO159782B (no) | Anordning ved fjaersystem, foerst og fremst paa kjoeretoeyer. | |
RU2403063C1 (ru) | Вакцина инактивированная комбинированная против вирусной диареи, рота-, коронавирусной болезней и эшерихиоза крупного рогатого скота | |
CN104758928B (zh) | 一种山羊痘、羊口疮二联细胞弱毒疫苗及其制备方法和用途 | |
CN104056265B (zh) | 猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征二联疫苗及其制备方法 | |
Salmakov et al. | Comparative study of the immunobiological properties of live brucellosis vaccines | |
US20020146436A1 (en) | Neospora vaccines | |
RU2404800C2 (ru) | Вакцина против тейлериоза | |
US4472378A (en) | Live vaccine for the prevention of salmonellosis in water fowl, a process for making and applying the same | |
Palya | Manual for the production of Marek's disease, Gumboro disease and inactivated Newcastle disease vaccines | |
US3519710A (en) | Direct active modified live virus vaccine immunization against transmissible gastroenteritis in swine piglets at birth | |
CN101380470B (zh) | 一种猪细小病毒活疫苗 | |
US4386065A (en) | Vaccine against EAE | |
Heintz | Transmission of a new mycoplasma‐like organism (MLO) from Cuscuta odorata (Ruiz et Pav.) to herbaceous plants and attempts to its elimination in the vector | |
US3098011A (en) | Process of producing a vaccine against distemper | |
US4312947A (en) | Process for the preparation of a vaccine against panleucopenia of the cat | |
KR101210082B1 (ko) | 돼지 다발성 장막염 예방용 백신 조성물 및 그 제조방법 | |
MacNeal | Contagious abortion of cows | |
Rickard et al. | Field trial to evaluate the use of antigens from Taenia hydatigena oncospheres to prevent infection with Taenia saginata in cattle grazing on sewage-irrigated pasture | |
Pipano | Vaccination of cattle against Theileria annulata using culture-derived schizonts | |
CN105749273A (zh) | 猪圆环病毒2型与猪细小病毒二联灭活疫苗及其制备方法 | |
Handman et al. | Standardization and quality control of Leishmania tropica vaccine | |
CN116478280B (zh) | 牛结节性皮肤病病毒阳性血清及其制备方法和应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20130513 |