RU2402531C2 - Биологически активные вещества, подавляющие патогенные бактерии - Google Patents

Биологически активные вещества, подавляющие патогенные бактерии Download PDF

Info

Publication number
RU2402531C2
RU2402531C2 RU2008137929/04A RU2008137929A RU2402531C2 RU 2402531 C2 RU2402531 C2 RU 2402531C2 RU 2008137929/04 A RU2008137929/04 A RU 2008137929/04A RU 2008137929 A RU2008137929 A RU 2008137929A RU 2402531 C2 RU2402531 C2 RU 2402531C2
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
arom
cells
added
solution
dmf
Prior art date
Application number
RU2008137929/04A
Other languages
English (en)
Other versions
RU2008137929A (ru
Inventor
Александр Леонидович Гинцбург (RU)
Александр Леонидович Гинцбург
Наиля Ахатовна Зигангирова (RU)
Наиля Ахатовна Зигангирова
Виктория Владимировна Зорина (RU)
Виктория Владимировна Зорина
Елизавета Александровна Токарская (RU)
Елизавета Александровна Токарская
Дина Игоревна Тартаковская (RU)
Дина Игоревна Тартаковская
Михаил Михайлович Краюшкин (RU)
Михаил Михайлович Краюшкин
Владимир Николаевич Яровенко (RU)
Владимир Николаевич Яровенко
Егор Сергеевич Заякин (RU)
Егор Сергеевич Заякин
Original Assignee
Александр Леонидович Гинцбург
Наиля Ахатовна Зигангирова
Виктория Владимировна Зорина
Елизавета Александровна Токарская
Дина Игоревна Тартаковская
Михаил Михайлович Краюшкин
Владимир Николаевич Яровенко
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Александр Леонидович Гинцбург, Наиля Ахатовна Зигангирова, Виктория Владимировна Зорина, Елизавета Александровна Токарская, Дина Игоревна Тартаковская, Михаил Михайлович Краюшкин, Владимир Николаевич Яровенко filed Critical Александр Леонидович Гинцбург
Priority to RU2008137929/04A priority Critical patent/RU2402531C2/ru
Priority to PCT/RU2009/000488 priority patent/WO2010036147A1/ru
Publication of RU2008137929A publication Critical patent/RU2008137929A/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2402531C2 publication Critical patent/RU2402531C2/ru

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D213/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D213/02—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D213/04—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom
    • C07D213/60—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D213/72—Nitrogen atoms
    • C07D213/75—Amino or imino radicals, acylated by carboxylic or carbonic acids, or by sulfur or nitrogen analogues thereof, e.g. carbamates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C327/00—Thiocarboxylic acids
    • C07C327/38—Amides of thiocarboxylic acids
    • C07C327/56—Amides of thiocarboxylic acids having nitrogen atoms of thiocarboxamide groups further bound to another hetero atom
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D333/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one sulfur atom as the only ring hetero atom
    • C07D333/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one sulfur atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings
    • C07D333/04—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one sulfur atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings not substituted on the ring sulphur atom
    • C07D333/26—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one sulfur atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings not substituted on the ring sulphur atom with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D333/38—Carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D495/00—Heterocyclic compounds containing in the condensed system at least one hetero ring having sulfur atoms as the only ring hetero atoms
    • C07D495/02—Heterocyclic compounds containing in the condensed system at least one hetero ring having sulfur atoms as the only ring hetero atoms in which the condensed system contains two hetero rings
    • C07D495/04—Ortho-condensed systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C2601/00—Systems containing only non-condensed rings
    • C07C2601/12—Systems containing only non-condensed rings with a six-membered ring
    • C07C2601/14—The ring being saturated

Abstract

Изобретение относится к новым биологически активным соединениям формулы I, где значения заместителей R, R1, R2 и R3 перечислены в формуле изобретения, и могут быть получены способом, включающим взаимодействие соответствующих хлорацетамидов с предварительно приготовленным раствором элементной серы с морфолином или пиперидином, пропускание полученного раствора монотиооксамидов через слой сорбента и последующее взаимодействие монотиооксамидов с гидразин-гидратом, реакцию полученного соединения с альдегидами в ДМФА при комнатной температуре с последующим осаждением метанолом, дающим хороший выход конечного продукта; полученные соединения обладают высокой эффективностью против патогенных бактерий, характеризуются избирательностью и могут быть использованы для ингибирования секреции III типа у патогенных бактерий. 3 н.п. ф-лы, 8 ил., 1 табл.

Description

Изобретение относится к новым гидразонам тиогидразидов оксаминовых кислот, которые могут быть использованы для подавления патогенных бактерий, в частности воздействовать на систему секреции 3 типа у патогенов.
Проблема антибиотикорезистентности является наиболее острой на данный момент, поскольку отмечено, что ко всем существующим классам антибактериальных препаратов у патогенных бактерий развивается устойчивость в той или иной степени (Сидоренко С.В. Механизмы антибиотикорезистентности / Антибактериальная терапия: Практическое руководство под ред. Страчунского Л.С., Белоусова Ю.Б., Козлова С.Н. - 2000. - М.: Фарммединфо. - 190 с.; Страчунский Л. С., Богданович Т.М. Состояние антибиотикорезистентности в России / Антибактериальная терапия:
Практическое руководство под ред. Страчунского Л.С., Белоусова Ю.Б., Козлова С.Н. - 2000. - М.: Фарммединфо. - 190 с.; Фурлетова Н.М., Карп В.П., Мирская М.А., Никитин А.П. Мониторинг спектра и чувствительности выделяемой микрофлоры в стационаре - МКО-10, 2002; Clatworthy A.E., Pierson E., Hung D.T. Targeting virulence: a new paradigm for antimicrobial therapy - Nature Chemical Biology - 2007. - V.3. - N9. - P.541-548).
Так, например, к группе β-лактамных антибиотиков на данный момент описано более 200 ферментов β-лактамаз, инактивирующих путем гидролиза одну из связей β-лактамного кольца. Согласно статистике такие ферменты встречаются у 60-80% штаммов стафилококков, 30-40% - Escherihia coli, 20% у возбудителей тяжелых нозокомиальных инфекций Enterobacter spp., в результате чего существенно снизилась эффективность цефалоспоринов III и, в последнее время, IV поколений.
Практически у всех грамотрицательных бактерий с течением времени развивается еще один механизм устойчивости к данной группе препаратов: снижение проницаемости внешних структур, в результате мутаций, приводящих к полной или частичной утрате поринов, белков, участвующих в осуществлении динамической связи между бактериями и окружающей средой, в том числе поддерживают структурную целостность клетки, регулируют транспорт питательных веществ и бактерицидных агентов).
Аналогичная ситуация складывается с чувствительностью патогенов к аминогликозидам. Описано более 50 ферментов, инактивирующих данную группу антибиотиков.
Кроме того, используемые в клинической практике антибиотики в большинстве своем эффективно работают против острых инфекций, но не эффективны к хронической стадии инфекционного процесса. Это объясняется тем, что острая и хроническая инфекции - две разные формы взаимодействия патогена и организма хозяина, при которых реализуются две различные стратегии, заложенные в геноме патогена.
В отличие от острой инфекции хроническая инфекция это более сложная система взаимодействия, эволюционно выработанная адаптация, направленная на длительное выживание.
В уровне техники известны соединения, воздействующие на вирулентные свойства патогенных бактерий. Эти соединения подавляют секреторные функции некоторых грамотрицательных бактерий, таких как Yersinia pseudotuberculosis, Salmonella enterica, Pseudomonas aeruginosa, патогенных штаммов E.coli, Chlamydia spp и не вызывают развитие устойчивости к препаратам на их основе. К таким соединениям можно отнести гидразоны, полученные на основе гидразидов бензойных и пиридинкарбоновых кислот (FEBS Letters, 581, (2007) 587-595; Infection and Immunity, 2005, p.3104-3114, Vol.73, No. 5; PNAS, 26, 2006 vol. 103, No.39, 14566-14571)
Однако недостатками этих соединений являются недостаточная растворимость в органических растворителях и значительная токсичность.
Задачей изобретения является создание соединений обладающих хорошей растворимостью в органических растворителях, не являющихся токсичными для нормальной микрофлоры и клеток хозяина, кроме того, к которым не будет развиваться резистентность.
Технический результат, достигаемый заявленной группы изобретений, заключается в получении биологически активных соединений с хорошим выходом, обладающих высокой эффективностью против патогенных бактерий, в том числе при лечении хронических болезней, вызванных патогенными бактериями, и характеризующихся избирательностью, т.е. воздействием только на патогенные бактерии. При этом полученные соединения нетоксичны для клеток человека и животных, они хорошо растворимы в органических растворителях, а также характеризуются специфической активностью в условиях биологических систем воздействия на патогенные бактерии и не вызывают развития резистентности патогенных бактерий.
Технический результат обеспечивается за счет того, что биологически активные соединения представляют собой замещенные производные гидразонов тиогидразидов оксаминовых кислот общей формулы (I):
Figure 00000001
где R, R1 представляю собой Н; незамещенные алкил С1-С5; пиридинил; фенил, замещенный СН3, Hal, CF3; группу
Figure 00000002
где Х представляет собой S, замещенную алкилом С1-С5, СООН, COOR4;
или группу
Figure 00000003
; R2, R3 представляют собой Н; незамещенный алкил С1-С5; 2-гидроксициклогексил; фенил, замещенный Hal, NO2, ОН, OR4, a R4 представляет собой незамещенный алкил С1-С4 за исключением соединений
Figure 00000004
, и
Figure 00000005
Способ получения заявленных соединений включает взаимодействие соответствующих хлорацетамидов с предварительно приготовленным раствором элементной серы с морфолином или пиперидином, пропускание полученного раствора монотиооксамидов через слой сорбента, последующее взаимодействие монотиооксамидов с гидразингидратом и реакцию полученного соединения с альдегидами в ДМФА при комнатной температуре с последующим осаждением метанолом.
Способ ингибирования секреции III типа у патогенных бактерий, заключающийся в воздействии на бактерии эффективным количеством соединения по п.1. (I).
Данная система секреции III типа выявлена у таксономически далеких микроорганизмов (патогенных бактерий) - возбудителей особо опасных инфекций, таких как Yersinia, Chlamydia, Brucella, Salmonella, Shigella, Hlicobacter и др. Эта система более консервативна и в гораздо меньшей степени подвержена мутациям, как одному из факторов развития антибиотикорезистентности. Следовательно, ингибиторы секреции III типа у патогенов будут оказывать направленное воздействие на механизмы, обуславливающие процесс хронизации инфекции. Кроме того, система III секреции присутствует только у патогенных бактерий, следовательно, ее ингибиторы не токсичны для нормальной микрофлоры человека и клеток хозяина, т.е. характеризуются избирательностью.
Способ получения заявленных соединений включает взаимодействие соответствующих хлорацетамидов с предварительно приготовленным раствором элементной серы с морфолином или пиперидином, пропускание полученного раствора монотиооксамидов через слой сорбента, последующее взаимодействие монотиооксамидов с гидразингидратом, и реакцию полученного соединения с с альдегидами в ДМФА при комнатной температуре с последующим осаждением метанолом по следующей схеме:
Figure 00000006
Конкретные примеры выполнения группы изобретений.
Пример 1
2-[N'-(2-Гидрокси-бензилиден)-гидразино]-N-пиридин-2-ил-2-тиоксоацетамид (4) (LHC-680).
Figure 00000007
N-хлорацетил-2-аминопиридин (1).
Figure 00000008
К раствору 9,4 г (0,1 моль) 2-аминопиридина в 100 мл ДМФА добавляют при охлаждении 8,75 мл (0,11 моль) хлорацетилхлорида, следя за тем, чтобы температура не превышала 20°С. После окончания прибавления раствор перемешивают при комнатной температуре еще 2 часа. Затем выливают реакционную смесь в 600 мл холодной воды и отфильтровывают осадок. Промывают его на фильтре водой и сушат на воздухе.
Выход: N-хлорацетил-2-аминопиридина (1) 11,9 г, (70%). Т. пл. 140-141°С. ЯМР 1H DMSOd6 (δ, м.д., J, Гц): 7,41 (м, 1Н, аром); 8,21 (м, 1Н, аром); 8,07 (м, 1Н, аром); 8,63 (м, 1Н, аром); 4,20 (с, 2Н, CH2Cl); 10,57 (с, 1Н, NH). Найдено (%): С 49.20, Н 4.03, N 16.21. Вычислено (%): С 49.28, Н 4.14, N 16.42. Масс-спектр, m/z: 170.
N(S)-морфолино-N(O)-(пиридино)-тиоксамид (2).
Figure 00000009
Готовят раствор 4,8 г (0,15 моль) элементной серы в 50 мл ДМФА и добавляют 5 мл (0,06 моль) морфолина. Полученную смесь перемешивают 20-30 минут и при охлаждении добавляют к ней раствор 8,5 г (0,05 моль) хлорацетамида (1) в минимальном количестве ДМФА, следя за тем, чтобы температура не превышала 15°С. Реакционную смесь перемешивают в течение 3-5 часов (контроль по ТСХ). После окончания реакции реакционную смесь пропускают через небольшой слой сорбента, в качестве которого может быть использован силикагель, промывают его 50 мл ДМФА, полученный раствор выливают в воду, экстрагируют этилацетатом, промывают органический слой водой и пропускают через небольшую колонку с силикагелем (элюент-этилацетат). Упаривают этилацетат на роторном испарителе.
Выход: N(S)-морфолино-N(O)-(пиридино)-тиоксамид (2) 8,5 г, (68%). Т. пл. 170-172°С. ЯМР 1H DMSOd6 (δ, м.д, J, Гц): 7,41 (м, 1Н, аром); 8,21 (м, 1Н, аром); 8,07 (м, 1Н, аром); 8,63 (м, 1Н, аром); 3,38 (м, 2Н, CH2 морф); 4,12 (м, 2Н, СН2 морф); 10,59 (с, 1Н, NH). Найдено (%): С 52.42, Н 5.10, N 16.55. Вычислено (%): С 52.57, Н 5.21, N 16.72. Масс-спектр, m/z: 251.
2-Гидразино-N-пиридин-2-ил-2-тиоксо-ацетамид (3).
Figure 00000010
Растворяют 2,5 г (0,01 моль) монотиоксамида (2) в 15 мл ДМФА. При охлаждении и перемешивании добавляют 1 мл (0,02 моль) гидразин-гидрата. Раствор перемешивают при комнатной температуре еще 2 часа. Затем выливают в воду и подкисляют разбавленной соляной кислотой до рН 7. Отфильтровывают осадок и сушат его на воздухе.
Выход: 2-гидразино-N-пиридин-2-ил-2-тиоксо-ацетамида (3) 1,2 г, (60%). Т. пл. 164-165°С. ЯМР 1H DMSOd6 (δ, м.д., J, Гц): 7,41 (м, 1Н, аром); 8,21 (м, 1Н, аром); 8,07 (м, 1Н, аром); 8,63 (м, 1Н, аром); 10,59 (с, 1Н, NH). Найдено (%): С 42.76, Н 4.01, N 28.44. Вычислено (%): С 42.85, Н 4.11, N 28.55. Масс-спектр, m/z: 196.
2-[N'-(2-Гидрокси-бензилиден)-гидразино]-N-пиридин-2-ил-2-тиоксо-ацетамид (4) (LHC-680).
Figure 00000011
К 196 мг (10 ммоль) тиогидразида оксаминовой кислоты (3) в 1-2 мл ДМФА добавляют 140 мг (11 ммоль) салицилового альдегида в 1 мл ДМФА. Реакционную смесь оставляют на сутки при комнатной температуре, затем добавляют 3 мл метанола, выпавший осадок отфильтровывают и промывают метанолом.
Выход: 2-[N'-(2-гидрокси-бензилиден)-гидразино]-N-пиридин-2-ил-2-тиоксо-ацетамида (4) 150 мг, (50%). Т. пл. 204-205°С. ЯМР 1H DMSOd6 (δ, м.д., J, Гц): 7,02 (м, 4Н, аром); 7,41 (м, 1Н, аром); 8,21 (м, 1Н, аром); 8,07 (м, 1Н, аром); 8,63 (м, 1Н, аром); 10,59 (с, 1Н, NH); 11,92 (с, 1Н, NH т. амид); 12,76 (с, 1Н, ОН фен.). Найдено (%): С 55.79, Н 4.12, N 18.66. Вычислено (%): С 55.99, Н 4.03, N 18.65. Масс-спектр, m/z: 300.
Пример 2.
2[N'-(3,5-Дибромо-2-гидрокси-бензилиден)-гидразино]-N-пиридин-2-ил-2-тиоксо-ацетамид (5) (LHC-679).
Figure 00000012
К 196 мг (10 ммоль) тиогидразида оксаминовой кислоты (3) (см. пример 1) в 1-2 мл ДМФА добавляют 310 мг (11 ммоль) 3,5-дибром-2-гидроксибензальдегида в 1 мл ДМФА. Реакционную смесь оставляют на сутки при комнатной температуре, затем добавляют 3 мл метанола, выпавший осадок отфильтровывают и промывают метанолом.
Выход: 2-[N'-(3,5-дибромо-2-гидрокси-бензилиден)-гидразино]-N-пиридин-2-ил-2-тиоксо-ацетамида (5) 360 мг, (80 %). Т. пл. 321-322°С (с разл.). ЯМР 1H DMSOd6 (δ, м.д., J, Гц): 7,41 (м, 1Н, аром); 8,21 (м, 1Н, аром); 8,07 (м, 1Н, аром); 8,63 (м, 1Н, аром); 7.02 (с, 1Н аром); 7,3 (с, 1Н, аром); 8,65 (с, 1Н, СН гидразон); 11,29 (с, 1Н NH амид); 11,92 (с, 1Н, NH т. амид); 12,76 (с, 1Н, ОН фен.). Найдено (%): С 36.58, Н 2.01, N 12.34. Вычислено (%): С 36.70, Н 2.20, N 12.23. Масс-спектр, m/z: 458.
Пример 3.
2-[N'-(3,5-Дихлор-2-гидрокси-бензилиден)-гидразино]-N-пиридин-2-ил-2-тиоксо-ацетамид (6).
Figure 00000013
К 196 мг (10 ммоль) тиогидразида оксаминовой кислоты (3) в 1-2 мл ДМФА добавляют 209 мг (11 ммоль) 3,5-дихлор-2-гидроксибензальдегида в 1 мл ДМФА. Реакционную смесь оставляют на сутки при комнатной температуре, затем добавляют 3 мл метанола, выпавший осадок отфильтровывают и промывают метанолом.
Выход: 2-[N'-(3,5-дихлор-2-гидрокси-бензилиден)-гидразино]-N-пиридин-2-ил-2-тиоксо-ацетамида (6) 309 мг, (84%). Т. пл. 314-315°С (с разл.). ЯМР 1H DMSOd6 (δ, м.д, J, Гц): 7,41 (м, 1Н, аром); 8,20 (м, 1Н, аром); 8,06 (м, 1Н, аром); 8,64 (м, 1Н, аром); 7.01 (с, 1Н аром); 7,3 (с, 1Н, аром); 8,65 (с, 1Н, СН гидразон); 11,29 (с, 1Н, NH амид); 11,92 (с, 1Н, NH т.амид); 12,74 (с, 1Н, ОН фен.). Найдено (%): С 45.44, Н 2.62, N 15.06. Вычислено (%): С 45.54, Н 2.73, N 15.17. Масс-спектр, m/z: 369.
Пример 4.
2-[N'-(2-Гидрокси-3-этокси-бензилиден)-гидразино]-N-пиридин-2-ил-2-тиоксо-ацетамид (7) (LHC-681).
Figure 00000014
К 196 мг (10 ммоль) тиогидразида оксаминовой кислоты (3) в 1-2 мл ДМФА добавляют 182 мг (11 ммоль) 3-этокси-2-гидроксибензальдегида в 1 мл ДМФА. Реакционную смесь оставляют на сутки при комнатной температуре, затем добавляют 3 мл метанола, выпавший осадок отфильтровывают и промывают метанолом.
Выход: 2-[N'-(2-гидрокси-3-этокси-бензилиден)-гидразино]-N-пиридин-2-ил-2-тиоксо-ацетамида (7) 240 мг, (70%). Т. пл. 194-195°С. ЯМР 1H DMSOd6 (δ, м.д., J, Гц): 1.32 (м, 3Н, СН3); 2,81 (м, 2Н, CH2); 7,41 (м, 1Н, аром); 8,21 (м, 1Н, аром); 8,07 (м, 1Н, аром); 8,63 (м, 1Н, аром); 7.01 (м, 1Н аром); 7,10 (м, 1Н, аром); 7,02 (с, СН аром); 8,6 (с, 1Н, СН гидразон); 10,88 (с, 1Н, NH амид); 11,91 (с, 1Н, NH т. амид). 12,70 (с, 1Н, ОН фен.). Найдено (%): С 55.72, Н, 4.59, N 16.15. Вычислено (%): С 55.80, Н, 4.68, N 16.27. Масс-спектр, m/z: 344.
Пример 5.
2-[N'-(2-Гидрокси-бензилиден)-гидразино]-2-тиоксо-N-о-толил-ацетамид (8).
Figure 00000015
N-хлорацетил-2-метиланилин (9).
Figure 00000016
К раствору 10,7 г (0,1 моль) 2-метиланилина в 100 мл ДМФА добавляют при охлаждении 8,75 мл (0,11 моль) хлорацетилхлорида, следя за тем, чтобы температура не превышала 20°С. После окончания прибавления раствор перемешивают при комнатной температуре еще 2 часа. Затем реакционную смесь выливают в 600 мл холодной воды и отфильтровывают осадок. Промывают его на фильтре водой и сушат на воздухе.
Выход: N-хлорацетил-2-метиланилина (9) 15,5 г, (85%). Т. пл. 124-126°С. ЯМР 1H DMSOd6 (δ, м.д, J, Гц): 1,74 (с, 3Н, СН3); 7,41 (м, 1Н, аром); 7,21 (м, 1Н, аром); 7,07 (м, 1Н, аром); 7,63 (м, 1Н, аром); 4,20 (с, 2Н, CH2Cl); 10,57 (с, 1Н, NH). Найдено (%) 58.76, Н 5.37, N 7.54. Вычислено (%): С 58.87, Н 5.49, N 7.63. Масс-спектр, m/z: 183.
2-Гидразино-2-тиоксо-N-о-толил-ацетамид (10).
Figure 00000017
Метод А. Готовят раствор 0,15 моль элементной серы в 50 мл ДМФА и добавляют 5 мл (0,06 моль) морфолина. Полученную смесь перемешивают 20-30 минут и добавляют к ней раствор 9,15 г (0,05 моль) хлорацетамида (9) в минимальном количестве ДМФА, при охлаждении, следя за тем, чтобы температура не превышала 15°С. Полученную смесь перемешивают 3-4 часа (контроль по ТСХ). После окончания реакции реакционную смесь пропускают через слой силикагеля. К полученному раствору добавляют 6 мл (0,12 моль) гидразин-гидрата и перемешивают при комнатной температуре 2 часа. Затем раствор выливают в воду и подкисляют разбавленной соляной кислотой до рН 7. Отфильтровывают осадок и сушат его на воздухе.
Выход; 2-гидразино-2-тиоксо-N-о-толил-ацетамида (10) 10,4 г (60%). Т. пл. 154-155°С. ЯМР 1H DMSOd6 (δ, м.д., J, Гц): 1,74 (с, 3Н, СН3); 7,41 (м, 1Н, аром); 7,21 (м, 1Н, аром); 7,07 (м, 1Н, аром); 7,63 (м, 1Н, аром); 10,59 (с, 1Н, NH). Найдено: С 51.54, Н 5.18, N 20.02. Вычислено: С 51.66, Н 5.30, N 20.08. Масс-спектр, m/z: 209.
Метод Б.
Готовят раствор 4,8 г (0,15 моль) элементной серы в 50 мл ДМФА и добавляют 5 мл (0,06 моль) пиперидина. Полученную смесь перемешивают 20-30 минут и, при охлаждении, добавляют к ней раствор 8,5 г (0,05 моль) хлорацетамида (9) в минимальном количестве ДМФА, следя за тем, чтобы температура не превышала 10°С. Полученную смесь перемешивают 3-5 часов (контроль по ТСХ). После окончания реакции реакционную смесь пропускают через небольшой слой силикагеля. К полученному раствору при охлаждении и перемешивании добавляют 5 мл (0,1 моль) гидразин-гидрата. Раствор перемешивают при комнатной температуре еще 2 часа. Затем выливают в воду и подкисляют разбавленной соляной кислотой до рН 6. Отфильтровывают осадок и сушат его на воздухе.
Выход: 2-гидразино-2-тиоксо-N-о-толил-ацетамида (10) 6,0 г, (62%). Т. пл. 154-155°С. ЯМР 1H DMSOd6 (δ, м.д., J, Гц): 1,74 (с, 3Н, СН3); 7,41 (м, 1Н, аром); 7,21 (м, 1Н, аром); 7,07 (м, 1Н, аром); 7,63 (м, 1Н, аром); 10,59 (с, 1Н, NH). Найдено: С 51.54, Н 5.18, N 20,19. Вычислено: С 51.66, Н 5.30, N 20.08. Масс-спектр, m/z: 209.
2-[N'-(2-Гидрокси-бензилиден)-гидразино]-2-тиоксо-N-о-толил-ацетамид (8).
Figure 00000015
К 209 мг (10 ммоль) тиогидразида оксаминовой кислоты (10) в 1-2 мл ДМФА добавляют 140 мг (11 ммоль) салицилового альдегида в 1 мл ДМФА. Реакционную смесь оставляют на сутки при комнатной температуре, затем добавляют 3 мл метанола. Выпавший осадок отфильтровывают и промывают метанолом.
Выход: 2-[N'-(2-гидрокси-бензилиден)-гидразино]-2-тиоксо-N-о-толил-ацетамида (8) 156 мг, (50%). Т. пл. 215-217°С. ЯМР 1H DMSOd6 (δ, м.д., J, Гц): 1,74 (с, 3Н, СН3); 7,02 (м, 4Н, аром); 7,41 (м, 1Н, аром); 7,21 (м, 1Н, аром); 7,07 (м, 1Н, аром); 7,63 (м, 1Н, аром); 10,59 (с, 1Н, NH); 11,92 (с, 1Н, NH т.амид); 12,76; (с, 1Н, ОН фен.). Найдено: С 61.23, Н 4.71, N 13.30. Вычислено: С 61.32, Н 4.82, N 13.41. Масс-спектр, m/z: 313.
Пример 6.
N-(4-Фтор-фенил)-2-[N'-(2-гидрокси-бензилиден)-гидразино]-2-тиоксо-ацетамид (11).
Figure 00000018
N-хлорацетил-4-фторанилин (12).
Figure 00000019
К раствору 11,1 г (0,1 моль) 4-фторанилина в 100 мл ДМФА добавляют при охлаждении 8,75 мл (0,11 моль) хлорацетилхлорида, следя за тем, чтобы температура не превышала 20°С. После окончания добавления хлорацетилхлорида раствор перемешивают при комнатной температуре еще 2 часа. Затем реакционную смесь выливают в 600 мл холодной воды и отфильтровывают осадок. Промывают его на фильтре водой и сушат на воздухе.
Выход: N-хлорацетил-4-фторанилина (12) 14,96 г (80%). Т. пл. 110-112°С. ЯМР 1Н DMSOd6 (δ, м.д., J, Гц): 7,21 (д, 2Н, аром); 7,07 (д, 2Н, аром); 4,20 (с, 2Н, CH2Cl). Найдено (%): С 51.11, Н 3.63, N 7.36. Вычислено (%): С 51.22, Н 3.76, N 7.47. Масс-спектр, m/z: 187.
N-(4-Фтор-фенил)-2-гидразино-2-тиоксо-ацетамид (13).
Figure 00000020
Метод А
Готовят раствор 0,15 моль элементной серы в 50 мл ДМФА и добавляют 0,06 моль морфолина. Полученную смесь перемешивают 20-30 минут и добавляют к ней раствор 9,37 г (0,05 моль) хлорацетамида (12) в минимальном количестве ДМФА, при охлаждении, следя за тем, чтобы температура не превышала 15°С. Полученную смесь перемешивают 3-10 часов (контроль по ТСХ). После окончания реакции реакционную смесь пропускают через слой силикагеля. К полученному раствору добавляют 6 мл (0,12 моль) гидразин-гидрата и перемешивают при комнатной температуре 2 часа. Затем выливают в воду и подкисляют разбавленной соляной кислотой до рН 7. Отфильтровывают осадок и сушат его на воздухе.
Выход: N-(4-фтор-фенил)-2-гидразино-2-тиоксо-ацетамида (13) 6,4 г (60%). Т. пл. 154-155°С. ЯМР 1H DMSOd6 (δ, м.д., J, Гц): 7,21 (д, 2Н, аром); 7,07 (д, 2Н, аром); 10,59 (с, 1Н, NH). Найдено (%): С 51.54, Н 5.18, N 20,00. Вычислено (%): С 45.06, Н 3.78, N 19,71. Масс-спектр, m/z: 213.
Метод Б
Готовят раствор 4,8 г (0,15 моль) элементной серы в 50 мл ДМФА и добавляют 5 мл (0,06 моль) пиперидина. Полученную смесь перемешивают 20-30 минут и, при охлаждении, добавляют к ней раствор 9,37 г (0,05 моль) хлорацетамида (12) в минимальном количестве ДМФА, следя за тем, чтобы температура не превышала 10°С. Полученную смесь перемешивают 3-5 часов (контроль по ТСХ). После окончания реакции реакционную смесь пропускают через небольшой слой силикагеля. К полученному раствору при охлаждении и перемешивании добавляют 5 мл (0,1 моль) гидразин-гидрата. Раствор перемешивают при комнатной температуре еще 2 часа. Затем выливают в воду и подкисляют разбавленной соляной кислотой до рН 6. Далее отфильтровывают осадок и сушат его на воздухе.
Выход: N-(4-фтор-фенил)-2-гидразино-2-тиоксо-ацетамида (13) 6,4 г, (60%). Т. пл. 154-155°С. ЯМР 1H DMSOd6 (δ, м.д., J, Гц): 7,21 (д, 2Н, аром); 7,07 (д, 2Н, аром); 10,59 (с, 1Н, NH). Найдено (%): С 51.54, Н 5.18, N 20,00. Вычислено (%): С 45.06, Н 3.78, N 19,71. Масс-спектр, m/z: 213.
N-(4-Фтор-фенил)-2-[N'-(2-гидрокси-бензилиден)-гидразино]-2-тиоксо-ацетамид (11).
Figure 00000021
К 213 мг (10 ммоль) тиогидразида оксаминовой кислоты (13) в 0,5 мл ДМФА добавляют 11 ммоль салицилового альдегида в 1 мл метанола. Реакционную смесь оставляют на сутки при комнатной температуре. Затем к реакционной смеси добавляют 2 мл метанола и охлаждают ее до -5°С. Осадок отфильтровывают и промывают небольшим количеством ледяного метанола.
Выход: N-(4-фтор-фенил)-2-[N'-(2-гидрокси-бензилиден)-гидразино]-2-тиоксо-ацетамида (11) 158 мг, (50%). Т. пл. 215-217°С. ЯМР 1H DMSOd6 (δ, м.д., J, Гц): 1.32 (м, 3Н, СН3); 2,81 (м, 2Н, CH2); 7,21 (д, 2Н, аром); 7,07 (д, 2Н, аром); 7,21 (м, 1Н, аром); 7,07 (м, 1Н, аром); 7,63 (м, 1Н, аром); 10,59 (с, 1Н, NH); 11,92 (с, 1Н, NH т.амид). 12,76 (с, 1Н, ОН фен.). Найдено (%): С 56.05, Н 3.70, N 13.32. Вычислено (%): С 56.77, Н 3.81, N 13.24. Масс-спектр, m/z: 317.
Пример 7.
2-[N'-(2-Гидрокси-бензилиден)-гидразино]-2-тиоксо-N-(4-трифторметил-фенил)-ацетамид (12) (LHC-710).
Figure 00000022
N-хлорацетил-2-трифторметиланилин(13).
Figure 00000023
К раствору 16,1 г (0,1 моль) 2-трифторметиланилина в 100 мл ДМФА добавляют, при охлаждении, 8,75 мл (0,11 моль) хлорацетилхлорида, следя за тем, чтобы температура не превышала 20°С. После окончания прибавления раствор перемешивают при комнатной температуре еще 2 часа. Затем выливают реакционную смесь в 600 мл холодной воды и отфильтровывают осадок. Далее промывают его на фильтре водой и сушат на воздухе.
Выход: N-хлорацетил-2-трифторметиланилина (13) 20,1 г, (85%). Т. пл. 134-136°С. ЯМР 1H DMSOd6 (δ, м.д., J, Гц): 7,62 (м, 1Н, аром); 7,57 (м, 1Н, аром); 7,35 (м, 1Н, аром); 7,62 (м, 1Н, аром); 4,22 (с, 2Н, CH2Cl); 10,55 (с, 1Н, NH). Найдено (%): С 45.40, Н 2.86, N 5.78. Вычислено (%): С 45.49, Н 2.97, N 5.89. Масс-спектр, m/z: 237.
2-Гидразино-2-тиоксо-N-(4-трифторметил-фенил)-ацетамид (14).
Figure 00000024
Готовят раствор 0,15 моль элементной серы в 50 мл ДМФА и добавляют 5 мл (0,06 моль) морфолина. Полученную смесь перемешивают 20-30 минут и добавляют к ней раствор 11,85 г (0,05 моль) хлорацетамида (13) в минимальном количестве ДМФА, при охлаждении, следя за тем, чтобы температура не превышала 15°С. Полученную смесь перемешивают 3-4 часа (контроль по ТСХ). После окончания реакции, реакционную смесь пропускают через слой силикагеля. К полученному раствору добавляют 6 мл (0,12 моль) гидразин-гидрата и перемешивают при комнатной температуре 2 часа. Затем раствор выливают в воду и подкисляют разбавленной соляной кислотой до рН 7. Отфильтровывают осадок и сушат его на воздухе.
Выход: 2-гидразино-2-тиоксо-N-(4-трифторметил-фенил)-ацетамида (14) 7,89 г, (60%). Т. пл. 163-164°С. ЯМР 1H DMSOd6 (δ, м.д., J, Гц): 7,63 (м, 1Н, аром); 7,58 (м, 1Н, аром); 7,34 (м, 1Н, аром); 7,61 (м, 1Н, аром); 10,59 (с, 1Н, NH). Найдено: С 40.90, Н 3.15, N 15.83. Вычислено: С 41.06, Н 3.06, N 15.96. Масс-спектр, m/z: 263.
2-[N'-(2-Гидрокси-бензилиден)-гидразино]-2-тиоксо-N-(4-трифторметил-фенил)-ацетамид (12).
Figure 00000022
К 263 мг (10 ммоль) тиогидразида оксаминовой кислоты (14) в 1-2 мл ДМФА добавляют 140 мг (11 ммоль) салицилового альдегида в 1 мл ДМФА. Реакционную смесь оставляют на сутки при комнатной температуре, затем добавляют 3 мл метанола. Выпавший осадок отфильтровывают и промывают метанолом.
Выход: 2-[N'-(2-гидрокси-бензилиден)-гидразино]-2-тиоксо-N-(4-трифторметил-фенил)-ацетамида (12) 183 мг, (50%). Т. пл. 215-217°С. ЯМР 1H DMSOd6 (δ, м.д., J, Гц): 7,63 (м, 1Н, аром); 7,58 (м, 1Н, аром); 7,34 (м, 1Н, аром); 7,61 (м, 1Н, аром); 7,21 (м, 1Н, аром); 7,07 (м, 1Н, аром); 7,63 (м, 1Н, аром); 10,59 (с, 1Н, NH); 11,93 (с, 1Н, NH т. амид); 12,76 (с, 1Н, ОН фен.). Найдено: С 61.23, Н 4.71, N 13.50. Вычислено: С 52.31, Н 3.29, N 11.44. Масс-спектр, m/z: 367.
Пример 8.
5-Этил-2-[(2-гидрокси-бензилиден-гидразинооксотиоацетил)-амино]-тиофен-3-карбоновой кислоты этиловый эфир (15) (LHC-536).
Figure 00000025
N-хлорацетил-3-карбэтокси-3-этил-тиофен (16).
Figure 00000026
К раствору 19,9 г (0,1 моль) 2-амино-3-карбэтокси-5-этилтиофена (J. Heterocycl. Chem. Vol.36, (1999), p.333-345) в 100 мл ДМФА добавляют при охлаждении 8,75 мл (0,11 моль) хлорацетилхлорида, следя за тем, чтобы температура не превышала 20°С. После окончания прибавления раствор перемешивают при комнатной температуре еще 2 часа. Затем реакционную смесь выливают в 600 мл холодной воды и отфильтровывают осадок. Промывают его на фильтре водой и сушат на воздухе.
Выход: N-хлорацетил-3-карбэтокси-5-этил-тиофена (16) 23,4 г, (85%). Т. пл. 123-125°С (EtOH). Спектр ЯМР 1H (δ, м.д., J, Гц): 1,27 (м, 3Н, СН3); 1,30 (м, 3Н, СН3); 2,45 (м, 2Н, CH2); 4,43 (м, 2Н, CH2); 4,3 (с, 2Н, CH2Cl); 7,53 (с, 1Н, тиофен); 10,65 (с, 1Н, NH). Найдено (%): С 47.92, Н 5.11, N 5.07. Вычислено (%): С 47.81, Н 5.22, N 5.00. Масс-спектр, m/z: 275.
5-Этил-2-(гидразинооксотиоацетил-амино)-тиофен-3-карбоновой кислоты этиловый эфир (17).
Figure 00000027
Готовят раствор 4,8 г (0,15 моль) элементной серы в 50 мл ДМФА и добавляют 5,1 мл (0,06 моль) морфолина. Полученную смесь перемешивают 20-30 минут и добавляют к ней, при охлаждении, раствор 13,75 г (0,05 моль) хлорацетамида (16) в минимальном количестве ДМФА, следя за тем, чтобы температура не превышала 15°С. Полученную смесь перемешивают 3-10 часов (контроль по ТСХ). После окончания реакции реакционную смесь пропускают через слой силикагеля. К полученному раствору добавляют 6 мл (0,12 моль) гидразин-гидрата и перемешивают его при комнатной температуре 2 часа. Затем раствор выливают в воду и подкисляют разбавленной соляной кислотой до рН 7. Отфильтровывают осадок и сушат его на воздухе.
Выход: 5-этил-2-(гидразинооксотиоацетил-амино)-тиофен-3-карбоновой кислоты этилового эфира (17) 8,6 г, (57%). Т. пл. 152-154°С. Спектр ЯМР 1H (δ, м.д., J, Гц): Спектр ЯМР 1H (δ, м.д., J, Гц): 1.2 (т, 3Н, СН3); 1.4 (т, 3Н, СН3); 2.8 (м, 3Н, СН3); 4.3 (м, 3Н, СН3); 7.10 (с, 1Н, Н аром.); 12.40 (с, 1Н, NH). Найдено (%): С 43.80, Н 5.87, N 14.11. Вычислено (%): С 43.84, Н 5.02, N 13.94. Масс-спектр, m/z: 301.
5-Этил-2-[(2-гидрокси-бензилиден-гидразинооксотиоацетил)-амино]-тиофен-3-карбоновой кислоты этиловый эфир (15) (LHC-536).
Figure 00000025
К 300 мг (10 ммоль) тиогидразида оксаминовой кислоты (16) в 1-2 мл ДМФА добавляют 140 мг (11 ммоль) салицилового альдегида в 1 мл ДМФА. Реакционную смесь оставляют на сутки при комнатной температуре, затем добавляют 3 мл метанола. Выпавший осадок отфильтровывают и промывают метанолом.
Выход: 5-этил-2-[(2-гидрокси-бензилиден-гидразинооксотиоацетил)-амино]-тиофен-3-карбоновой кислоты этилового эфира (15) 364 мг, (90%). Т. пл. 189-190°С. Спектр ЯМР 1H DMSOd6 (δ, м.д., J, Гц): 1.2 (т, 3Н, СН3); 1.4 (т, 3Н, СН3); 2.8 (м, 3Н, СН3); 4.3 (м, 3Н, СН3); 7.05 (м, 4Н, Н аром); 7.10 (с, 1Н, Н аром.); 7.35 (с, 1Н); 12.40 (с, 1Н, NH). Найдено (%): С 53.23, Н 4.81, N 10.25. Вычислено (%): С 53.32, Н 4.72, N 10.36.
Пример 9
5-Этил-2-[(2-гидрокси-бензилиден-гидразиноксотиоацетил)-амино]-тиофен-3-карбоновая кислота (18) (LHC-587).
Figure 00000028
2-N-хлорацетил-3-карбокси-5-этилтиофен (19).
Figure 00000029
К раствору 17,1 г (0,1 моль) 2-амино-3-карбокси-5-этилтиофена (полученного щелочным гидролизом 2-амино-3-карбэтокси-5-этилтиофена аналогично методике, приведенной в патенте US 4159377, опубл. 26.06.1979, патентообладатель MEAD JOHNSON & СО в 100 мл ДМФА добавляют при охлаждении 8,75 мл (0,11 моль) хлорацетилхлорида, следя за тем, чтобы температура не превышала 20°С. После окончания добавления хлорацетилхлорида полученный раствор перемешивают при комнатной температуре еще 2 часа. Затем выливают реакционную смесь в 600 мл холодной воды и отфильтровывают осадок. Промывают его на фильтре водой и сушат на воздухе.
Выход: 2-N-хлорацетпил-3-карбокси-5-этилтиофена (19) 19,7 г, (80%). Т. пл. 133-134°С (EtOH). Спектр ЯМР 1H DMSOd6 (δ, м.д., J, Гц): 1,27 (м, 3Н, СН3); 2,45 (м, 2Н, СН2); 4,3 (с, 2Н, CH2Cl); 7,53 (с, 1Н, тиофен); 10,65 (с, 1Н, NH), 14.10 (с, 1Hкарб.). Найдено (%): С 43.55, Н 4.16, N 5.54. Вычислено (%): С 43.64, Н 4.07, N 5.65. Масс-спектр, m/z: 247.
5-Этил-2-(гидразиноксотиоацетил-амино)-тиофен-3-карбоновая кислота (20).
Figure 00000030
Готовят раствор 4,8 г (0,15 моль) элементной серы в 50 мл ДМФА и добавляют 5,1 мл (0,06 моль) морфолина. Полученную смесь перемешивают 20-30 минут и добавляют к ней раствор 12,35 г (0,05 моль) хлорацетамида (19) в минимальном количестве ДМФА, при охлаждении, следя за тем, чтобы температура не превышала 15°С. Полученную смесь перемешивают 3-10 часов (контроль по ТСХ). После окончания реакции реакционную смесь пропускают через слой силикагеля. К полученному раствору добавляют 6 мл (0,12 моль) гидразин-гидрата и перемешивают раствор при комнатной температуре 2 часа. Затем раствор выливают в воду и подкисляют разбавленной соляной кислотой до рН 7. Отфильтровывают осадок и сушат его на воздухе.
Выход: 5-этил-2-(гидразиноксотиоацетил-амино)-тиофен-3-карбоновой кислоты (20) 8,2 г, (60%). Т. пл. 180-182°С. Спектр ЯМР 1H DMSOd6 (δ, м.д, J, Гц): 1.2 (т, 3Н, СН3); 2.8 (м, 2Н, CH2); 7.10 (с, 1Н, Н аром.); 12.40 (с, 1Н, NH); 14.05 (с, 1Hкарб.). Найдено (%): С 39.46, Н 4.12, N 15.66. Вычислено (%): С 39.55, Н 4.06, N 15.37. Масс-спектр, m/z: 273.
5-Этил-2-[(2-гидрокси-бензилиден-гидразиноксотиоацетил)-амино]-тиофен-3-карбоновая кислота (18) (LHC-587).
Figure 00000028
К 273 мг (10 ммоль) тиогидразида оксаминовой кислоты (20) в 1-2 мл ДМФА добавляют 140 мг (11 ммоль) салицилового альдегида в 1 мл ДМФА. Реакционную смесь оставляют на сутки при комнатной температуре. Затем добавляют 3 мл метанола. Выпавший осадок отфильтровывают и промывают метанолом.
Выход: 5-этил-2-[(2-гидрокси-бензилиден-гидразиноксотиоацетил)-амино]-тиофен-3-карбоновой кислоты (18) 263 мг, (70%). Т. пл. 205-206°С. Спектр ЯМР 1H DMSOd6 (δ, м.д., J, Гц): 7.05 (м, 4Н, Н аром); 7.10 (с, 1Н, Н аром.); 7.35 (с, 1Н); 12.40 (с, 1Н, NH); 14.07 (с, 1Hкарб. уширен.). Найдено (%): С 50.83, Н 4.16, N 11.21. Вычислено (%): С 50.92, H 4.01, N 11.13.
Пример 10
N,N-Диэтил-2-[N'-(2-гидрокси-бензилиден)-гидразино]-2-тиоксо-ацетамид (21)
Figure 00000031
2-Хлор-N,N-диэтилацетамид (22)
Figure 00000032
К 7,3 г (0,1 моль) диэтиламина в 50 мл хлористого метилена добавляют 10 г (0,1 моль) триэтиламина. Затем при охлаждении добавляют 12 г (0,11 моль) хлорацетилхлорида. После окончания реакции (контроль по ТСХ) полученную смесь выливают в 300 мл холодной воды. Органический слой отделяют, водный слой экстрагируют хлористым метиленом 2×50 мл. Объединенные органические слои промывают разбавленной соляной кислотой, затем водой, сушат над сульфатом натрия и упаривают на роторном испарителе.
Выход: 2-хлор-N,N-диэтилацетамида (22) 10,4 г, (70%). (маслообразный продукт) ЯМР 1H DMSOd6 (δ, м.д., J, Гц); 2,41 (м, 4Н, СН2); 1,44 (т, 6Н, СН3); 4,20 (с, 2Н, CH2Cl). Найдено (%): С 48.08, Н 8.15, N 9,24. Вычислено (%): С 48.17, Н 8.08, N 9,36. Масс-спектр, m/z: 149.
N,N-Диэтил-2-гидразино-2-тиоксоацетамид (23).
Figure 00000033
Готовят раствор 0,15 моль элементной серы в 50 мл ДМФА и добавляют 0,06 моль морфолина. Полученную смесь перемешивают 20-30 минут и добавляют к ней при охлаждении раствор 7,45 г (0,05 моль) хлорацетамида (22) в минимальном количестве ДМФА, следя за тем, чтобы температура не превышала 15°С. Полученную смесь перемешивают 3-5 часов (контроль по ТСХ). После окончания реакции реакционную смесь пропускают через слой силикагеля. К полученному раствору добавляют 6 мл (0,12 моль) гидразин-гидрата и перемешивают при комнатной температуре 2 часа. Затем раствор выливают в воду и подкисляют разбавленной соляной кислотой до рН 7. Отфильтровывают осадок и сушат его на воздухе.
Выход: N,N-диэтил-2-гидразино-2-тиоксоацетамида (23) 5,7 г, (50%). Т. пл. 45-46°С ЯМР 1H DMSOd6 (δ, м.д, J, Гц); 2,42 (м, 4Н, СН2); 1,47 (т, 6Н, СН3); 11,20 (с, 1Н, NH). Найдено (%): С 41.01, Н 7.39, N 24,02. Вычислено (%): С 41.12, Н 7.48, N 23,98. Масс-спектр, m/z: 175.
N,N-Диэтил-2-[N'-(2-гидрокси-бензилиден)-гидразино}-2-тиоксо-ацетамид (21).
Figure 00000034
К 175 мг (10 ммоль) тиогидразида оксаминовой кислоты (23) в 1-2 мл ДМФА добавляют 130 мг (11 ммоль) салицилового альдегида в 1 мл ДМФА. Реакционную смесь оставляют на сутки при комнатной температуре, затем добавляют 3 мл метанола. Выпавший осадок отфильтровывают и промывают метанолом.
Выход: N,N-диэтил-2-[N'-(2-гидрокси-бензилиден)-гидразино]-2-тиоксо-ацетамида (21) 139 мг, (50%). Т. пл. 154-155°С. ЯМР 1H DMSOd6 (δ, м.д., J, Гц); 7,02 (м, 4Н, аром); 2,42 (м, 4Н, СН2); 1,47 (т, 6Н, СН3); 11,92 (с, 1H, NH т. амид); 12,76 (с, 1Н, ОН фен.). Найдено: С 55.77, Н 6.04, N 15.13. Вычислено: С 55.89, Н 6.13, N 15.04. Масс-спектр, m/z: 279.
Пример 11
2-[N'-(2-Гидрокси-циклогексилметилен)-гидразино]-2-тиоксо-N-о-толил-ацетамид (24).
Figure 00000035
К 209 мг (10 ммоль) тиогидразида оксаминовой кислоты (10) в 1-2 мл ДМФА добавляют 132 мг (11 ммоль) 2-гидроксициклогексанкарбальдегида (Journal of Organic Chemistry; 51; 13; 1986; 2596-2599) в 1 мл ДМФА. Реакционную смесь оставляют на сутки при комнатной температуре, затем добавляют 3 мл метанола. Выпавший осадок отфильтровывают и промывают метанолом.
Выход: 2-[N'-(2-гидрокси-циклогексилметилен)-гидразино]-2-тиоксо-N-о-толил-ацетамида (24) 159 мг, (50%). Т. пл. 111-113 ЯМР 1H DMSOd6 (δ, м.д., J, Гц); 1,74 (с, 3Н, СН3); 1,42 (м, 4Н, цг); 1,63 (м, 2Н, цг); 2,24 (м, 2Н, цг); 7,41 (м, 1Н, аром); 7,21 (м, 1Н, аром); 7,07 (м, 1Н, аром); 7,63 (м, 1Н, аром); 10,59 (с, 1Н, NH); 11,92 (с, 1Н, NH т. амид); 12,76 (с, 1Н, ОН фен.). Найдено: С 60.07, Н 6.50, N 13.24. Вычислено: С 60.16, Н 6.63, N 13.15. Масс-спектр, m/z: 319.
Пример 12
2-{N'-(2-Гидрокси-5-нитро-фенил)-этилиден]-гидразино}-2-тиоксо-]-N-о-толил-ацетамид (25)
Figure 00000036
К 209 мг (10 ммоль) тиогидразида оксаминовой кислоты (10) в 1 мл ДМФА и 1 мл этанола добавляют 199 мг (11 ммоль) 1-(2-гидрокси-5-нитрофенил)этанона (Journal of the University of Bombay, Science: Physical Sciences, Mathematics, Biological Sciences and Medicine; 25/A; 1957; 8, 11). Реакционную смесь кипятят в течение 3-х часов. После охлаждения осадок отфильтровывают и промывают его холодным метанолом 2х5 мл. Затем высушивают его на воздухе.
Выход: 2-{N'-[1-(2-гидрокси-5-нитро-фенил)-этилиден]-гидразино}-2-тиксо-N-o-толил-ацетамида (25) 149 мг, (40%). Т. пл. 214-215 ЯМР 1H DMSOd6 (δ, м.д., J, Гц); 2,75 (с, 3Н, СН3) 1,74 (с, 3Н, СН3); 7,02 (м, 3Н, аром); 7,41 (м, 1Н, аром); 7,21 (м, 1Н, аром); 7,07 (м, 1Н, аром); 7,63 (м, 1Н, аром); 10,59 (с, 1Н, NH); 11,92 (с, 1Н, NH т. амид); 12,76 (с, 1Н, ОН фен.). Найдено: 54.70, Н 4.24, N 15.20. Вычислено: С 54.83, Н 4.33, N 15.04. Масс-спектр, m/z: 372.
Пример 13
N-(3-Циано-2-фенил-5,6,7,8-тетрагидро-бензо[4,5]тиено[2,3-b]пиридин-4-ил)-2-[N'-(3,5-дибром-2-гидрокси-бензилиден)-гидразино]-2-тиоксо-ацетамид (26)
Figure 00000037
4-Амино-2-фенил-5,6,7,8-тетрагидро[1]бензотиено[2,3-b]пиридин-3-карбонитрил (27)
Figure 00000038
Синтез соединения (27) проводят по методике, описанной в J. Heterocyclic. Chem. 44, 561, (2007). Смесь, состоящую из 1,78 г (10 ммоль) 2-амино-4,5,6,7-тетрагидро-1-бензотиофен-3-кабонитрила и 1,45 г (10 ммоль) 3-оксо-3-фенилпропанонитрила в 20 мл ДМФА и 1 мл пиперидина, кипятят в течение 3-х часов. После охлаждения до комнатной температуры реакционную смесь выливают в холодную воду, фильтруют образовавшийся продукт и перекристаллизовывают из этанола.
Выход: 4-амино-2-фенил-5,6,7,8-тетрагидро[1]бензотиено[2,3-b]пиридин-3-карбонитрила (27) 2,22 г, (73%). Т.пл. 113-115°С; ЯМР 1H DMSOd6 (δ, м.д, J, Гц); 1,41-1,56 (м, 8Н, СН2); 7,54-7,68 (м, 5Н, СН). Найдено (%): С 70.67, Н 4.80, N 13.64. Вычислено (%): С 70.79, Н 4.95, N 13.76. Масс-спектр, m/z: 305.
2-Хлор-N-(3-циан-2-фенил-5,6,7,8-тетрагидро-бензо[4,5]тиено[2,3-b]пиридин-4-ил)-ацетамид (28).
Figure 00000039
К 30,5 г (0,1 моль) амина (27) в 50 мл хлористого метилена добавляют 10 г (0,1 моль) триэтиламина. Затем, при охлаждении, добавляют 12 г (0,11 моль) хлорацетилхлорида. После окончания реакции (контроль по ТСХ) полученный раствор выливают в 300 мл холодной воды. Органический слой отделяют, водный слой экстрагируют хлористым метиленом 2×50 мл. Объединенные органические слои промывают разбавленной соляной кислотой, затем водой, сушат над сульфатом натрия и упаривают на роторном испарителе.
Выход: 2-хлор-N-(3-циан-2-фенил-5,6,7,8-тетрагидро-бензо[4,5]тиено[2,3-b]пиридин-4-ил)-ацетамида (28) 31,6 г, (83%). Т.пл. 146-148°С; ЯМР 1H DMSOd6 (δ, м.д., J, Гц); 1,41-1,58 (м, 8Н, СН2); 4,20 (с, 2Н, CH2Cl); 7,56-7,70 (м, 5Н, СН). Найдено (%): С 62.78, Н 4.10, N 11.12. Вычислено (%): С 62.90, Н 4.22, N 11.00. Масс-спектр, m/z: 381.
N-(3-Циано-2-фенил-5,6,7,8-тетрагидро-бензо[4,5]тиено[2,3-b]пиридин-4-ил)-2-гидразино-2-тиоксо-ацетамид (29).
Figure 00000040
Готовят раствор 0,15 моль серы в 50 мл ДМФА и добавляют 0,06 моль морфолина. Полученную смесь перемешивают 20-30 минут и добавляют к ней раствор 19,1 г (0,05 моль) хлорацетамида (28) в минимальном количестве ДМФА при охлаждении, следя за тем, чтобы температура не превышала 15°С. Полученную смесь перемешивают 3-5 часов (контроль по ТСХ). Затем реакционную смесь пропускают через небольшой слой силикагеля и при охлаждении и перемешивании добавляют 0,1 моль гидразин-гидрата. Полученный раствор при комнатной температуре перемешивают 2 часа. Затем выливают в воду и подкисляют до рН 7. Отфильтровывают осадок и сушат его на воздухе.
Выход: N-(3-циано-2-фенил-5,6,7,8-тетрагидро-бензо[4,5]тиено[2,3-b]пиридин-4-ил)-2-гидразино-2-тиоксо-ацетамида (29) 14,3 г, (70%).
Т.пл. 140-142°С; ЯМР 1H DMSOd6 (δ, м.д, J, Гц); 1,40-1,56 (м, 8Н, СН2); 7,56-7,70 (м, 5Н, СН); 11,20 (с, 1Н, NH). Найдено (%): С 58.83, Н 4.13, N 17.27. Вычислено (%): С 58.95, Н 4.20, N 17.19. Масс-спектр, m/z: 407.
N-(3-Циано-2-фенил-5,6,7,8-тетрагидро-бензо[4,5]тиено[2,3-b]пиридин-4-ил)-2-[N'-(3,5-дибром-2-гидрокси-бензилиден)-гидразино]-2-тиоксо-ацетамид (26)
Figure 00000041
К раствору 407,5 мг (10 ммоль) тиогидразида оксаминовой кислоты (30) в 1-2 мл ДМФА добавляют 308 мг (11 ммоль) 3,5-дибром-2-гидроксибензальдегида в 1 мл ДМФА. Реакционную смесь оставляют на сутки при комнатной температуре, затем добавляют 30 мл метанола. Выпавший осадок отфильтровывают и промывают метанолом.
Выход: N-(3-циано-2-фенил-5,6,7,8-тетрагидро-бензо[4,5]тиено[2,3-b]пиридин-4-ил)-2-[N'-(3,5-дибром-2-гидрокси-бензилиден)-гидразино]-2-тиоксо-ацетамида (26) 501 мг, (75%). Т пл. 178-180°С; ЯМР 1H DMSOd6 (δ, м.д., J, Гц); 1,40-1,56 (м, 8Н, СН2); 6,68 (с, 1Н, СН); 7,56-7,84 (м, 7Н, СН); 11,02 (с, 1Н, NH); 12,76 (с, 1Н, ОН фен.). Найдено (%): С 48.33, Н 2.78, N 10.54. Вычислено (%): С 48.45, Н 2.86, N 10.46. Масс-спектр, m/z: 669.
Биологические примеры.
Для определения биологической активности и токсичности производных гидразонов тиогидразидов оксаминовых кислот были использованы следующие методы:
1. Методы определения цитотоксического эффекта производных гидразонов тиогидразидов оксаминовых кислот.
А) Для эукариотической клетки использовали метод окрашивания клеток метиленовым синим (стандартная методика) с последующим спектрометрическим учетом результатов. Работу проводили в формате 96-луночных планшетов.
В суточном монослое клеток МсСоу В (гибридная линия синовиальных клеток человека и мышиных фибробластов) и HL (эпителиальные клетки легкого человека) заменяли среду культивирования на полную СК с циклогексимидом и вносили разные дозы исследуемых химических соединений. Клетки инкубировали в течение 24 и 48 часов в CO2 инкубаторе при 37°С. Спустя 24/48 ч из лунок отбирали надосадок и отмывали клетки 0,1 моль/л раствором фосфатно-солевого буфера (ФСБ). Клетки фиксировали охлажденным метанолом (20 мкл) в течение 15 мин при 4°С.К фиксированным клеткам добавляли 40 мкл 0,5% метиленового синего и инкубировали 20 мин при комнатной температуре. После инкубации метиленовую синь отбирали из лунок и отмывали клетки ФСБ 4 раза. В лунки добавляли 100 мкл додецилсульфата натрия (SDS) в ФСБ и инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре до полного лизиса клеток. Количество живых клеток определяли спектрометрически при длине волны 540 нм на флуориметре MuktiscanEX.
Б) Метод, направленный на определение метаболической активности клетки - МТТ-тест (Niks M., Otto M. Toward sanoptimized МТТ assay. // Immunol. - 1900. - V. 130, №1. - р.149-151), основанный на восстановлении бесцветной соли тетразолия (3-[4,5-диметилтиазол-2-ил]-2,5-дифенилтетразолия бромид, МТТ) митохондриальными и цитоплазматическими дегидрогеназами живых метаболически активных клеток с образованием голубых кристаллов формазана, количество которого измеряется спектрометрически.
Метод проводили в формате 96-луночного культурального планшета. В суточном монослое клеток МсСоу В и HL заменяли среду культивирования на полную СК без циклогексемида и вносили разные дозы исследуемых химических соединений. Клетки инкубировали в течение 48 часов в СО2 инкубаторе при 37°С. За 4 часа до окончания эксперимента вносили 1:10 от объема культуральной среды 10х раствора МТТ (5 мг/мл). Инкубировали 4 часа при 37°С 5% CO2. Отбирали среду, отмывали однократно ФСБ. Добавляли в каждую лунку 100 мкл изопропанола (пропанола-2). Инкубировали при комнатной температуре 30 минут. Оценивали оптическую плотность при длине волны 540 нм на флуориметре Muktiscan EX. Субстратное поглощение оценивали при 405 нм.
В) Для оценки токсического эффекта производных гидразонов тиогидразидов оксаминовых кислот в условиях in vitro был использован кальцеиновый тест, который основывается на двойной окраске живых метаболически активных клеток и мертвых клеток с поврежденной цитоплазматической мембраной. В качестве первого красителя используется нефлюоресцирующий ацетоксиметилированный эфир кальцеина, который под действием внутриклеточный эстераз живой клетки переходит в флюоресцирующие анионы кальцеина, что обусловливает зеленое свечение живых клеток при флюоресцентной микроскопии. Вторым красителем является этидиум гомодимер, который проникает внутрь клетки только в условиях нарушения целостности ее мембраны и, связываясь с нуклеиновыми кислотами, окрашивает ядро клетки в оранжевый цвет.При просмотре препаратов с помощью люминесцентного микроскопа дифференцируют и определяют количество живых и мертвых клеток в исследуемых условиях.
Метод проводили в формате 24-луночного культурального планшета со стеклами. Анализ осуществлялся согласно протоколу, прилагаемому к коммерческому набору LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit for mammalian cells (Invitrogen, США). Для этого в суточном монослое клеток HL заменяли среду культивирования на полную СК без циклогексимидм и вносили разные дозы исследуемых химических соединений. Клетки инкубировали в течение 48 часов в СО2 инкубаторе при 37°С. Затем отбирали СК, отмывали однократно ФСБ и, не высушивая стекла, вносили смесь реагентов: 20 мкл 2 mM этидиум гомодимера и 5 мкл 2 mM Calcein AM, растворенных в 10 мл стерильного ФСБ, в объеме 150 мкл/лунка. Инкубировали в течение 20 мин при 37°С. Затем стекла монтировали на предметное стекло при нанесении на него нескольких 15-20 мкл того же раствора. Учет результатов (определение соотношения живых и мертвых клеток) осуществляли методом флюоресцентной микроскопии.
2. Метод суспензионного заражения эукариотических клеток.
Для получения суспензии использовали суточный монослой клеток МсСоу В и HL, который обрабатывали 2,5 мл раствора трипсина и версена (соотношение 1:3, соответственно) для открепления клеток от поверхности флакона. Флакон помещали в термостат на 5 мин. Затем отбирали раствор трипсина и версена и добавляли 2,5 мл полной среды культивирования (СК). Открепившиеся клетки отмывали в указанном объеме СК путем центрифугирования при 1000 об/мин 10 мин. Убирали надосадок и ресуспендировали клетки в 2 мл СК.
Для получения монослоя из приготовленной клеточной суспензии производили подсчет клеток в камере Горяева из расчета 1,5×105 кл/мл. Заражение клеток штаммом Bu-434 Chlamydia trachomatis серовар L2 производили в соотношении бактерия: клетка 1:1 в необходимом объеме транспортной среды, что обеспечивает 80-90% инфицированных клеток. Готовую суспензию вносили в лунки 96- или 24-луночных планшетов в объеме 100 мкл или 1000 мкл, соответственно. Для осаждения клеток и стимуляции взаимодействия с ними хламидий планшеты центрифугировали при 3000 об/мин 1 час при температуре 25°С. После этого планшет помещали в СО2 инкубатор на 48 ч при 37°С.
3. Определение влияния производных гидразонов тиогидразидов оксаминовых кислот на жизнеспособность хламидий.
Исследуемые химические соединения в разных концентрациях вносили в культуру клеток одновременно с патогеном для оценки возможного их влияния на взаимодействие хламидий с эукариотической клеткой: сразу после центрифугирования зараженной суспензии (ранняя стадия внутриклеточного цикла хламидий 0-2 ч), через 6-8 часов после начала эксперимента (средняя фаза), через 16 часов (поздняя стадия). Эффект оценивали методом прямой иммунофлюоресценции и путем высева материала, полученного из лизата клеток, инфицированных в присутствии ингибитора клеток.
Для данного метода были использованы клеточные линии МсСоу В и HL. Работу проводили в формате 96-луночных планшетов. В суточном монослое клеток заменяли СК на транспортную среду (ТС) и заражали С.trachomatis L2 для получения 80-90% инфицированных клеток (множественность инфекции 1:1). После центрифугирования при 3000 об/мин 30 мин при 25°С клетки инкубировали в течение 48 ч в CO2 инкубаторе при 37°С. Разные дозы исследуемого соединения добавляли в рабочую суспензию с учетом особенностей жизненного цикла хламидий, как было описано ранее. Спустя 48 ч из лунок отбирали надосадок и планшет помещали на 30 мин при -70°С, для того чтобы лизировать инфицированные клетки. В получившийся лизат добавляли 100 мкл транспортной среды и готовили разведения материала 1:10-1:1000. Заражали суточный монослой клеток с последующим центрифугированием при 3000 об/мин 30 мин при 25°С. После 48 ч инкубирования в ранее указанных условиях клетки фиксировали и окрашивали меченными ФИТЦ (флюоресце-инизотиоцианит) моноклональными антителами для последующего учета результатов методом иммунофлюоресцентной микроскопии.
4. Методы прямой иммунофлюоресценции.
Методы иммунофлюоресценции направлены на выявление объектов, содержащих некоторый антиген, и основаны на обработке препаратов соответствующими антителами, меченными флюорохромом, с последующей микроскопией в ультрафиолетовом луче.
В данной работе использован метод прямой иммунофлюоресценции (стандартная методика), позволяющий проводить полуколичественный учет развития хламидийной инфекции. Для этого использованы коммерческие наборы ЗАО "НИАРМЕДИК плюс" при НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи РАМН (ФС 42-359598 и регистрационное удостоверение Минздрава России 93/ 270/ 9) "Хламоноскрин" для определения моноклональных антител к родоспецифическому липополисахаридному антигену Chlamydia и "Хламоноскрин-2" для определения моноклональных антител к видоспецифическому белковому антигену C.trachomatis.
Работу проводили на клеточных линиях МсСоу В и HL, инфицированных С.trachomatis серовар L2 в формате 96-луночных планшетов или 24-луночных со стеклами. Для этого суточный монослой заражали для получения 80-90% инфицированных клеток и одновременно с внесением инфекции добавляли разные дозы исследуемых химических соединений. Планшет центрифугировали при 3000 об/мин 30 мин при 25°С и инкубировали клетки в течение 48 ч в СО2 инкубаторе при 37°С. Через 48 ч из лунок отбирали надосадок и фиксировали клетки. При работе с 96-луночными планшетами фиксацию осуществляли ледяным 72° этанолом с последующим помещением планшета на 30-40 мин на -20°С. При работе с 24-луночными планшетами стекла промывали в 0,1 моль/л растворе ФСБ и высушивали. После этого клетки фиксировали ацетоном в течение 15 мин при комнатной температуре. На фиксированные клетки наносили 30-50 мкл моноклональные, меченные ФИТЦ антитела к белковым антигенам всех серотипов C.trachomatis (ХлаМоноСкрин-2, ООО «НИАРМЕДИК ПЛЮС») и инкубировали в течение 30 мин во влажной камере при 37°С. После инкубации клетки промывались 2 раза раствором ФСБ. Препарат полностью высушивали. В формате 24-луночных планшетов, подготовленные таким образом стекла монтировали на предметное стекло при помощи монтирующей жидкости (забуференный глицерин). Готовые препараты исследовали в люминесцентном микроскопе.
5. Метод непрямой иммунофлюоресценции.
Метод непрямой иммунофлюоресценции (стандартная методика) с использованием коммерческих антител к эффекторному белку ТТС IncA C.trachomatis (поликлональная кроличья сыворотка, специфическая к IncA, «Innovagen», Швеция).
Пример 1
2-[(2-(3-Этокси-2-гидроксибензилиден)гидразино]-М-(4-фторфенил)-2-тиоксоацетамид (LHC 709)
Figure 00000042
Соединение характеризуется высокой степенью растворимости в ДМФ, не образует осадка в процессе хранения и при переведении в транспортную среду.
Анализ токсичности LHC 709 в условиях in vitro (при добавлении 50 мМ раствора в среду культивирования эукариотических клеток в дозах 12.5, 25, 50 и 75 мкМ и последующем инкубировании в течение 48 часов при 37°С), проведенный методами 1. А-В, выявил отсутствие токсического эффекта.
Способность данного соединения подавлять внутриклеточный жизненный цикл хламидии в условиях in vitro оценивалась при помощи методов 2-4. Наилучший эффект соединение LHC 709 проявляет в дозе 50 мкМ при добавлении в СК клеток HL одновременно с инфекционным материалом (штамм C.trachomatis L2) и последующем культивировании в течение 48 часов. Показано, что в данных условиях инфицированные клетки отсутствуют (см. Фиг.1, на которой показано влияние LHC 709 на внутриклеточное развитие хламидийной инфекции в условиях in vitro (48 ч)). Анализ активности данного соединения в дозе 25 мкМ в аналогичных условиях проведения эксперимента выявил выраженное сокращение размеров включений.
Пример 2
2-[2-(3-Этокси-2-гидроксибензилиден)гидразино]-2-тиоксо-N-[2-(трифторметил)фенил]ацетамид (LHC 711).
Figure 00000043
Соединение характеризуется высокой степенью растворимости в ДМФ, не образует осадка в процессе хранения и при переведении в транспортную среду.
Токсичность LHC 711 для эукариотических клеток оценивалась методами 1. А-В при добавлении 50 мМ раствора данного соединения в СК клеток в дозах 12.5, 25, 50 и 75 мкМ и последующем инкубировании в течение 48 часов при 37°С. Установлено отсутствие токсичности соединения во всех указанных дозах.
Способность данного соединения подавлять внутриклеточный жизненный цикл хламидии в условиях in vitro оценивалась при помощи методов 2-4. Наибольший эффект выявлен в дозе 50 мкМ при добавлении в СК клеток HL одновременно с инфекционным материалом (штамм C.trachomatis L2) и последующем культивировании в течение 48 часов. В данных условиях эксперимента включения мелкие и единичные по сравнению с таковыми показателями в контроле (100%) (см. Фиг.2, на которой показано влияние LHC 711 на внутриклеточное развитие хламидийной инфекции в условиях in vitro (48 ч)). Анализ активности данного соединения в дозе 25 мкМ в аналогичных условиях выявил снижение размеров включений (средние и мелкие).
Пример 3
2-[2-(3,5-Дибром-2-гидроксибензилиден)гидразино]-2-тиоксо-N-[2-(трифторметил)фенил]ацетамид (LHC 712).
Figure 00000044
Соединение характеризуется высокой степенью растворимости в ДМФ, не образует осадка в процессе хранения и при переведении в транспортную среду.
Анализ токсичности LHC 712 оценивался методами 1. А-В при добавлении 50 мМ раствора данного соединения в СК клеток в дозах 12.5, 25, 50 и 75 мкМ и последующем инкубировании с клетками линии HL в течение 48 часов при 37°С. Установлено отсутствие токсичности соединения в дозах 12.5-50 мкМ.
Способность данного соединения подавлять внутриклеточный жизненный цикл хламидии в условиях in vitro оценивалась при помощи методов 2-4. Наибольшая активность данного соединения выявлена в дозе 50 мкМ при добавлении в СК клеток HL одновременно с инфекционным материалом (штамм C.trachomatis L2) и последующем культивировании в течение 48 часов. Показано, что в данных условиях эксперимента включения мелкие и единичные по сравнению с таковыми показателями в контроле (100%) (см. Фиг.3, на которой показано влияние LHC 712 на внутриклеточное развитие хламидийной инфекции в условиях in vitro (48 ч)).
Пример 4
N-(4-Фтор-фенил)-2-[N'-(2-гидрокси-бензилиден)-гидразино]-2-тиоксо-ацетамид (LHC 725).
Figure 00000045
Данное соединение характеризуется высокой степенью растворимости в ДМФ, не образует осадка в процессе хранения и при переведении в транспортную среду.
Анализ токсичности LHC 725 в условиях in vitro (при добавлении 50 мМ раствора в среду культивирования эукариотических клеток в дозах 12.5, 25, 50 и 75 мкМ и последующем инкубировании в течение 48 часов при 37°С), проведенный методами 1. А-В, выявил отсутствие токсического эффекта.
Способность данного соединения подавлять внутриклеточный жизненный цикл хламидии в условиях in vitro оценивалась при помощи методов 2-4. Показано, что наибольшее подавление внутриклеточной инфекции соединение LHC 725 проявляет в дозе 75 мкМ при добавлении в СК клеток HL одновременно с инфекционным материалом (штамм C.trachomatis L2) и последующем культивировании в течение 48 часов. Выявлено, что в данных условиях количество инфицированных клеток сокращается до 10% по сравнению с контролем, кроме того, LHC 725 влияет на размер включений (средние и мелкие) (см. Фиг.4, на которой показано влияние LHC 725 на внутриклеточное развитие хламидийной инфекции в условиях in vitro (48 ч)).
Пример 5
2-[2-(3,5-Дибром-2-гидроксибензилиден)гидразино]-N-(4-фторфенил)-2-тиоксоацетамид (LHC 726).
Figure 00000046
Соединение характеризуется высокой степенью растворимости в ДМФ, не образует осадка в процессе хранения и при переведении в транспортную среду.
Анализ токсичности LHC 726 в условиях in vitro (при добавлении 50 мМ раствора в среду культивирования эукариотических клеток в дозах 12.5, 25, 50 и 75 мкМ и последующем инкубировании в течение 48 часов при 37°С), проведенный методами 1. А-В, выявил отсутствие токсического эффекта.
Способность данного соединения подавлять внутриклеточный жизненный цикл хламидии в условиях in vitro оценивалась при помощи методов 2-4. Наилучший эффект соединение LHC 726 проявляет в дозе 75 мкМ при добавлении в СК клеток HL одновременно с инфекционным материалом (штамм C.trachomatis L2) и последующем культивировании в течение 48 часов. Показано, что в данных условиях процент инфицированных клеток сокращается по сравнению с таковыми показателями в контроле в 5 раз (20% и 100%, соответственно) (см. Фиг.5, на которой показано влияние LHC 726 на внутриклеточное развитие хламидийной инфекции в условиях in vitro (48 ч)). Кроме того, в опытной группе уменьшаются размеры включений (средние).
Пример 6
2-[(2-(3-Этокси-2-гидроксибензилиден)гидразино]-2-тиоксо-N-[3-(трифторметил)фенил]ацетамид (LHC 771).
Figure 00000047
Соединение характеризуется высокой степенью растворимости в ДМФ, не образует осадка в процессе хранения и при переведении в транспортную среду.
Анализ токсичности LHC 771 оценивался методами 1. А-В при добавлении 50 мМ раствора данного соединения в СК клеток в дозах 12.5, 25, 50 и 75 мкМ и последующем инкубировании с клетками линии HL в течение 48 часов при 37°С. Установлено отсутствие токсичности соединения во всех указанных дозах.
Ингибирующий эффект LHC 771 на развитие хламидийной инфекции в условиях in vitro оценивался при помощи методов 2-4. Наибольшая активность данного соединения выявлена в дозе 50 мкМ при добавлении в СК клеток HL одновременно с инфекционным материалом (штамм C.trachomatis L2) и последующем культивировании в течение 48 часов. Показано, что в данных условиях эксперимента включения мелкие, а количество инфицированных клеток составляет 10% по сравнению с таковыми показателями в контроле (100%) (см. Фиг.6, на которой показано влияние LHC 771 на внутриклеточное развитие хламидийной инфекции в условиях in vitro (48 ч)).
Пример 7
2-[(2-(3,5-Дибром-2-гидроксибензилиден)гидразино]-2-тиоксо-N-[3-(трифторметил)фенил]ацетамид (LHC 772).
Figure 00000048
Соединение характеризуется высокой степенью растворимости в ДМФ, не образует осадка в процессе хранения и при переведении в транспортную среду.
Токсичность LHC 772 для эукариотических клеток оценивалась методами 1. А-В при добавлении 50 мМ раствора данного соединения в СК клеток в дозах 12.5, 25, 50 и 75 мкМ и последующем инкубировании в течение 48 часов при 37°С. Установлено отсутствие токсичности соединения во всех указанных дозах.
Ингибирующая активность LHC 772 в условиях in vitro оценивалась при помощи методов 2-4. Наибольший эффект выявлен в дозе 50 мкМ при добавлении в СК клеток HL одновременно с инфекционным материалом (штамм C.trachomatis L2) и последующем культивировании в течение 48 часов. В данных условиях эксперимента отмечено наличие единичных инфицированных клеток с мелкими включениями (Фиг.7, на которой показано влияние LHC 772 на внутриклеточное развитие хламидийной инфекции в условиях in vitro (48 ч)).
В таблице 1 представлены результаты проведенных тестов, которые свидетельствуют о биологической активности замещенных производных гидразонов тиогидразидов оксаминовых кислот, а также о том, что эти соединения не токсичны для эукариотических клеток.
Пример 8
Исследование на специфическую активность некоторых замещенных производных гидразонов тиогидразидов оксаминовых кислот (LHC 709 и 711) ингибировать функции третьей транспортной системы (ТТС) проводилось по методу 5.
Для этого суточный монослой заражали для получения 80-90% инфицированных клеток, центрифугировали при 3000 об/мин 30 мин при 25°С и инкубировали клетки в течение 48 ч в СО2 инкубаторе при 37°С. Через 8 ч после заражения (время транслокации эффекторного белка в мембрану включения) добавляли разные дозы исследуемых химических соединений. Через 24 ч из лунок отбирали надосадок, стекла промывали в 0,1 моль/л растворе ФСБ и высушивали. После этого клетки фиксировали ацетоном в течение 15 мин при комнатной температуре. На фиксированные клетки наносили 50 мкл сыворотки и инкубировали в течение 30 мин в CO2 инкубаторе при 37°С. Затем стекла промывали указанным раствором ФСБ и наносили антитела, меченные ФИТЦ. Инкубировали в течение 30 мин во влажной камере при 37°С. После инкубации стекла с клетками промывались 2 раза раствором ФСБ. Препарат полностью высушивали. Подготовленные таким образом стекла монтировали на предметное стекло при помощи монтирующей жидкости. Готовые препараты исследовали в люминесцентном микроскопе. Одновременно проводилась окраска моноклональными антителами к белку МОМР наружной мембраны клеточной стенки, что позволяло оценивать развитие хламидийной инфекции. В случае действия препарата на ТТС при данной окраске выявляются включения, соответствующие по своим размерам сроку инфекции. На Фиг.8. показано подавление транслокации эффекторного белка IncA ТТС C.trachomatis L2 специфическими ингибиторами.
Другой тест на специфичность соединений в отношении ТТС связан с тем, что транслоцируемый с помощью ТТС хламидийный белок IncA участвует в процессе слияния отдельных, развивающихся внутри клетки включений. При окраске инфицированных клеток антителами к белку МОМР в формате эксперимента: заражение - через 8 часов внесение химсоединения - инкубация до 24 часов с момента заражения, в контрольных клетках наблюдали крупные включения, по одному в каждой клетке, а в случае действия соединения на ТТС - несколько мелких, не слившихся включений в цитоплазме клетки.
Проведенные тесты свидетельствуют о том, что ряд биологически активных соединений, представляющих собой замещенные производные гидразонов тиогидразидов оксаминовых кислот общей формулы (I) может проявлять специфическую активность в отношении ТТС, подавляя процесс транслокации эффекторного белка IncA и препятствуя, тем самым, процессу гомотипичного слияния первичных включений, т.е. ингибировать систему секреции III типа у патогенных бактерий, не вызывая развития устойчивости к препаратам в результате селекции резистентных мутантов, а также оказывая направленное воздействие на механизмы, обуславливающие процесс хронизации инфекции.
Сказанное выше позволяет сделать вывод, что поставленная техническая задача решена.
Таблица 1
Результаты тестирования химических соединений
Название Концентрация, мкМ Токсичность (тест Calcein AM, кол-во живых клеток), в % Влияние на внутриклеточный цикл развития С.trachomatis
Множественность инфекции (48 ч), в % Размер включений
LHC 709 12,5 98 5 средние
  25 98 5 мелкие
  50 98 0 -
  75   0 -
LHC 711 12,5 98   крупные
  25 98 80 средние
  50 98 единичные мелкие
  75   0  
LHC 712 12,5 98 50 средние/мелкие
  25 98 10 мелкие
  50 70 единичные мелкие
  75 - 0 -
LHC 725 12,5 - -K+ -K+
  25 95 =K+ =K+
  50 80-85 40 средние
  75 80 10 средние
LHC 726 12,5 - -K+ -K+
  25 95 =K+ =K+
  50 95 20-30 средние
  75 75 20 средние
К+ - положительный контроль (инфицированные клетки в отсутствие ингибитора)
Продолжение Таблицы 1
Название Концентрация, мкМ Токсичность (тест Calcein AM, кол-во живых клеток), в % Влияние на внутриклеточный цикл развития С.trachomatis
Множественность инфекции (48 ч), в % Размер включений
LHC 771 12,5 - 70 -K+
  25 95 60 =K+
  50 95 10 мелкие
  75 95 10 мелкие
LHC 772 12,5 - -K+ -K+
  25 95 =K+ =K+
  50 95 единичные мелкие
  75 95 единичные мелкие
К+ - положительный контроль (инфицированные клетки в отсутствие ингибитора)

Claims (3)

1. Замещенные производные гидразонов тиогидразидов оксаминовых кислот общей формулы:
Figure 00000049

где R-R1 представляют собой Н, незамещенные алкил С1-С5; пиридинил; фенил, замещенный СН3, Hal, CF3; группу
Figure 00000050
где Х представляет собой S, замещенную алкилом С1-С5, СООН, COOR4;
или группу
Figure 00000051

R2, R3 представляют собой Н, незамещенный алкил С1-С5, 2-гидроксициклогексил; фенил, замещенный Hal, NO2, ОН, OR4, a R4 представляет собой незамещенный алкил С1-С4 за исключением соединений
Figure 00000052
, и
Figure 00000053
2. Способ получения соединений по п.1, включающий взаимодействие соответствующих хлорацетамидов с предварительно приготовленным раствором элементной серы с морфолином или пиперидином, пропускание полученного раствора монотиооксамидов через слой сорбента, последующее взаимодействие монотиооксамидов с гидразингидратом, и реакцию полученного соединения с альдегидами в ДМФА при комнатной температуре с последующим осаждением метанолом.
3. Способ ингибирования секреции III типа у патогенных бактерий, заключающийся в воздействии на бактерии эффективным количеством соединения по п.1.
RU2008137929/04A 2008-09-24 2008-09-24 Биологически активные вещества, подавляющие патогенные бактерии RU2402531C2 (ru)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2008137929/04A RU2402531C2 (ru) 2008-09-24 2008-09-24 Биологически активные вещества, подавляющие патогенные бактерии
PCT/RU2009/000488 WO2010036147A1 (ru) 2008-09-24 2009-09-23 Биологически активные вещества, подавляющие патогенные бактерии и способ их получения

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2008137929/04A RU2402531C2 (ru) 2008-09-24 2008-09-24 Биологически активные вещества, подавляющие патогенные бактерии

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RU2008137929A RU2008137929A (ru) 2010-03-27
RU2402531C2 true RU2402531C2 (ru) 2010-10-27

Family

ID=42059931

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2008137929/04A RU2402531C2 (ru) 2008-09-24 2008-09-24 Биологически активные вещества, подавляющие патогенные бактерии

Country Status (2)

Country Link
RU (1) RU2402531C2 (ru)
WO (1) WO2010036147A1 (ru)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2493259C1 (ru) * 2012-07-23 2013-09-20 Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи" Минздрава России) Применение индол-3-ил-глиоксиламидов для подавления хламидийной инфекции

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BR112013011991A2 (pt) * 2010-11-15 2016-08-30 Viiv Healthcare Uk Ltd composto, composição farmacêutica, uso de um composto, método de tratamento, produto, e kit.

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Krayushkin et al. "N-anilino-2-[(2-oxidophenyl)methylenehydrazono]-2-sulfidoacetamide"]pyridinenickel (II), Acta Crystallographica, Section E: Structure reports Online, E61(5), 2005, p.964-966. Yarovenko, V. N. et al. "Synthesis of oxamic acid thiohydrazides and carbamoyl-l,3,4-thiadiazole", RUSSIAN JOURNAL OF ORGANIC CHEMISTRY, 2003, vol.39, no. 8, p.l133-1139. Kraushkin M. M. et al. "Synthesis and reactivity of monothiooxoamides and thiohydrazides of oxamic acids", RUSSIAN CHEMICAL BULLETIN, INTERNATIONAL EDITION, 2004, vol. 53, no.3, p.517-527. Yarovenko V. N. et al. "Synthesis of 4,5-dihydro-1,3,4-thiadiazole-2-carboxamide and 2-carbamoyl-4,5-dihydro-1,3,4-thiadiazole 1-oxide derivatives based on hydrazones of oxamic acid thiohydrazides ", Chemistry of Heterocyclic Compounds (Translation of Khimiya Geterotsiklicheskikh Soedinenii), 39(12), p.1633-1638 (English) 2003. Сальникова Е.В. и др. Методы концентрирования разделения микроэлементов: учебное пособие. - Оренбург: ГОУ ОГУ, 2005. *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2493259C1 (ru) * 2012-07-23 2013-09-20 Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи" Минздрава России) Применение индол-3-ил-глиоксиламидов для подавления хламидийной инфекции

Also Published As

Publication number Publication date
RU2008137929A (ru) 2010-03-27
WO2010036147A1 (ru) 2010-04-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Singh et al. Design, synthesis and mode of action of some benzothiazole derivatives bearing an amide moiety as antibacterial agents
CN101594866A (zh) 局部用的制剂
RU2447066C2 (ru) Биологически активные вещества, подавляющие патогенные бактерии, и способ ингибирования секреции iii типа у патогенных бактерий
KR20100096101A (ko) 박테리아 독성을 억제하는 방법 및 이에 대한 화합물
Haroun et al. Thiazole-based thiazolidinones as potent antimicrobial agents. Design, synthesis and biological evaluation
Kühler et al. Novel Structures Derived from 2-[[(2-Pyridyl) methyl] thio]-1 H-benzimidazole as Anti-Helicobacter p ylori Agents, Part 1
US20140323483A1 (en) Type iii secretion inhibitors, analogs and uses thereof
CN107151250A (zh) 嘧啶类七元环化合物、其制备方法、药用组合物及其应用
US20210324198A1 (en) Silicon-substituted rhodamine dyes and dye conjugates
US11519893B2 (en) Therapeutic drug for lipid-peroxidation-induced diseases and screening method for therapeutic drugs for lipid-peroxidation-induced diseases
RU2402531C2 (ru) Биологически активные вещества, подавляющие патогенные бактерии
Suryavanshi Synthesis and biological activities of piperazine derivatives as antimicrobial and antifungal agents
CN105001193A (zh) 阳离子水溶性寡聚噻吩乙炔化合物及其制备方法和应用
Verma et al. Discovery of inhibitors of the lipopolysaccharide transporter MsbA: from a screening hit to potent wild-type gram-negative activity
CN105121446A (zh) 亚锡荧光探头
CN111943868B (zh) 一种含二乙胺的吖嗪联肼类化合物及其制备方法与应用
RU2400471C1 (ru) N-замещенные производные тиогидразидов оксаминовых кислот, способ их получения и их использование
CN114181165B (zh) 杂环亚砜类化合物及其制备方法与在制备铜绿假单菌群体感应抑制剂中的应用
RU2495036C1 (ru) Биологически активные вещества, подавляющие патогенные бактерии, и способ ингибирования секреции iii типа у патогенных бактерий
US11162951B2 (en) Membrane-impermeant fluorogenic chromophores
RU2622747C2 (ru) Способ и средство для лечения реактивного артрита хламидийной этиологии
CN111909107B (zh) Ido/hdac双重抑制剂及其药物组合物和应用
CN113372296A (zh) 用于抑制多重耐药的金黄色葡萄球菌的硒啉类化合物及用途
IJEOMAH et al. SYNTHESIS, CHARACTERISATION AND ANTIBACTERIAL ACTIVITY OF 2-(PHENYL SULFONYL) AMINO PYRIDINE.
Kaur et al. Synthesis and antibacterial activity of various substituted oxadiazole derivatives

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A The patent is invalid due to non-payment of fees

Effective date: 20110925

NF4A Reinstatement of patent

Effective date: 20120710

MM4A The patent is invalid due to non-payment of fees

Effective date: 20150925