RU2398377C1 - Способ консервирования лейкозных клеток, выделенных из селезенки мышей инбредной линии akr/jy - Google Patents
Способ консервирования лейкозных клеток, выделенных из селезенки мышей инбредной линии akr/jy Download PDFInfo
- Publication number
- RU2398377C1 RU2398377C1 RU2009113931/10A RU2009113931A RU2398377C1 RU 2398377 C1 RU2398377 C1 RU 2398377C1 RU 2009113931/10 A RU2009113931/10 A RU 2009113931/10A RU 2009113931 A RU2009113931 A RU 2009113931A RU 2398377 C1 RU2398377 C1 RU 2398377C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cells
- leukemia
- cooled
- spleen
- temperature
- Prior art date
Links
Landscapes
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии. Выделенную из тушки мыши селезенку, имеющую температуру тела 38±1°С, очищают от соединительнотканной капсулы и гомогенизируют в стерильном растворе полиглюкина, охлажденном до 24,0±1,0°С. Затем суспензию клеток фильтруют в стерильном растворе полиглюкина, охлажденном до 15,0±2,0°С, и разбавляют им до концентрации от 1×106 до 1×107 кл/мл. После этого к суспензии клеток по каплям добавляют в соотношении 1:1 раствор криоконсерванта, охлажденный до 4,0±2,0°С. Разливают в ампулы для замораживания и выдерживают при температуре 4±2°С от 15 до 30 минут. После температурной выдержки охлажденные клетки замораживают и хранят в электроморозильнике с температурой от -70° до -196°С. Сохранность биологических свойств размороженных лейкозных клеток определяют по результатам перевивки лейкозных клеток. Изобретение может быть использовано для повышения сохранности биологических свойств лейкозных клеток вне организма доноров - мышей инбредной линии AKR/JY на этапах выделения и замораживания клеточной суспензии. 1 табл.
Description
Предлагаемое техническое решение относится к области медицины, в частности к способам консервирования лейкозных клеток, выделенных из селезенки мышей инбредной линии AKR/JY, которые представляют собой биологические модели лейкозов человека. Применение в экспериментальных исследованиях технологии консервирования перевиваемых лейкозных клеток, выделенных из селезенки мышей инбредной линии AKR/JY, позволит получить у здоровых животных в любое время необходимый вариант не только спонтанного сингенного лимфоидного, но и других подвидов лейкозов, что существенно расширит ограниченные возможности ученых в изучении вопросов этиологии, патогенеза и терапии тяжелых злокачественных заболеваний. Основным критерием оценки эффективности способа консервирования лейкозных клеток является определение у них сохранности биологических свойств, т.е. способности воспроизвести определенный подвид спонтанного лейкоза.
Известен способ выделения перевиваемых лейкозных клеток из селезенки мышей инбредной линии (см. Раушенбах М.О. Экспериментальные исследования лейкозов. М.: Медгиз, 1956, с.99-112). Недостатком данного способа является невозможность сохранять специфические биологические свойства перевиваемых лейкозных клеток вне организма мыши при комнатной температуре от 18 до 25°С в течение длительного времени.
Известен способ выделения клеток из селезенки мышей инбредных линий с температурой тела 38±1°С путем последовательного выполнения асептической спленэктомии, декапсуляции селезенки, измельчения ее пульпы, гомогенизации фрагментов пульпы и фильтрации лейкозных клеток гомогенизата на льду в стерильном физиологическом растворе, после чего производят смешивание фильтрата с криоконсервантом, замораживание суспензии клеток и хранение их при температуре от -70° до -196°С (Практикум по иммунологии: Учебное пособие для студ. высш. учеб. заведений / И.А.Кондратьева [и др.]. - 2-е изд., испр. и. доп. - М.: Издательский центр «Академия», 2004. - 272 с.). Этот способ является наиболее близким техническим решением к предлагаемому. Недостатком известного способа является то, что применяемые для сохранности биологических свойств перевиваемых лейкозных клеток вне организма животного искусственная охлажденная внеклеточная среда из стерильного физиологического раствора и температурные условия губительны для части перевиваемых клеток. Среда считается не оптимальной для лейкозных клеток, поскольку не обладает свойствами криоконсерванта и приводит к отрицательному результату перевивки определенного подвида лейкоза в 20-30% случаев экспериментов.
Задачей предлагаемого изобретения является обеспечение максимальной сохранности специфической функциональной полноценности перевиваемых консервированных лейкозных клеток, выделенных из селезенки мышей инбредной линии AKR/JY.
Целью предлагаемого изобретения является повышение сохранности биологических свойств лейкозных клеток вне организма доноров-мышей инбредной линии AKR/JY.
Поставленная цель достигается тем, что в известном способе выделения лейкозных клеток из селезенки мышей с температурой тела 38±1°С, включающем асептическую спленэктомию, декапсуляцию селезенки, измельчение ее пульпы, гомогенизацию фрагментов пульпы и фильтрацию лейкозных клеток гомогенизата в искусственной охлажденной внеклеточной среде, последующее смешивание фильтрата с криоконсервантом, замораживание и хранение суспензии клеток при температуре от -70° до -196°С, декапсуляцию, измельчение пульпы и гомогенизацию фрагментов пульпы селезенки производят в стерильном растворе полиглюкина, охлажденном до 24,0±1,0°С, фильтрацию лейкозных клеток выполняют в стерильном растворе полиглюкина, охлажденном до 15,0±2,0°С, которым суспензию клеток разбавляют до концентрации от 1×106 до 1×107 кл/мл, к суспензии клеток по каплям добавляют в соотношении 1:1 раствор криоконсерванта, охлажденном до 4,0±2,0°С, разливают в ампулы для замораживания и выдерживают при температуре 4±2°С от 15 до 30 минут, после температурной выдержки клетки замораживают и хранят в электроморозильнике. Сохранность размороженных лейкозных клеток определяют по результатам перевивки лейкозных клеток.
Предлагаемое изобретение отвечает критериям «новизна» и «изобретательский уровень», так как в процессе проведения патентно-информационных исследований не выявлено источников информации, порочащих новизну предлагаемого способа.
Предлагаемый способ заключается в асептическом выделении лейкозных клеток из селезенки мышей инбредной линии AKR/JY, поэтапном охлаждении температуры клеток, замораживании и хранении их при температуре от -70° до -196°С. Поэтапное снижение температуры клеток от температуры тела животного 38±1°С до 24,0±1,0°С, затем 15,0±2,0°С и 4,0±2,0°С вне организма проводится в искусственной внеклеточной среде - лечебном препарате для инфузий «Полиглюкин», который представляет собой 6% раствор декстрана с молекулярной массой от 50000 до 70000 и обладает свойствами клеточного криоконсерванта (Криоконсерванты / Белоус A.M., Шраго М.И., Пушкарь Н.С. - К.: Наук. думка, 1974. - 200 с., стр.73-77). Последующее замораживание, хранение клеток при -70° или -196°С и размораживание повышают сохранность биологических свойств лейкозных клеток и способность к перевиванию определенного подвида спонтанного лейкоза.
Экспериментальные исследования выполнены на базе ФГУ «Кировский НИИ гематологии и переливания крови Росмедтехнологий».
Эффективность способа проверена в ряде опытов на мышах инбредной линии AKR/JY на высоте заболевания. Сравнительные с прототипом результаты представлены в таблице.
Выводы.
Предлагаемый способ консервирования обеспечивает сохранность биологических свойств лейкозных клеток и позволяет использовать их для моделирования сингенных лейкозов мышей инбредной линии AKR/JY.
Пример.
Способ осуществляют в асептических условиях в стерильной маске, стерильных перчатках, стерильными глазными хирургическими инструментами (ножницы, пинцеты, скальпели), на стерильном препаровальном столике с иглами, с использованием стерильного гомогенизатора тканей, 4-слойного капронового фильтра, стерильной конической пробирки объемом 10 мл, электрических морозильников на 4,0±2,0°С, -70±2,0°С (или сухая углекислота) и -196±2,0°С, флакона объемом 400 мл с лечебным препаратом для инфузий «Полиглюкин» с системой для переливания крови, кровезаменителей и инфузионных растворов, к которому подведена вода с изменяемой температурой от 24,0±1,0°C до 15,0±2,0°С, флакона объемом 50 мл стерильного раствора криоконсерванта, охлажденного до 4,0±2,0°С и ампул объемом 5-10 мл для замораживания клеток селезенки.
После усыпления (эфир, хлороформ) половозрелой мыши (массой 18-22 г, температурой тела 38±1°С) с развитым лейкозом (от 4 до 10 мес. от начала опыта) тушку кладут на препаровальный столик на правый бок, фиксируют к столику стерильными иглами, затем обрабатывают левый бок спиртом. В районе «талии» животного ножницами делают поперечный разрез кожи длиной 2-2,5 см слева от середины туловища, затем разрез мышц, пинцетом извлекают из брюшной полости селезенку темно-бордового цвета массой 700±300 мг, отрезают ее соединительные тяжи и помещают в стерильную чашку Петри, в которую по полимерной магистрали поступает препарат «Полиглюкин» из стеклянного флакона, охлажденный проточной водой до 24,0±1,0°С. В этих условиях селезенку освобождают от остатков соединительной ткани (декапсулируют), после чего пульпу селезенки ножницами фрагментируют на мелкие кусочки и гомогенизируют. Гомогенизат фильтруют через один или два стерильных капроновых 4-слойных фильтра в пробирку, в которые по полимерной магистрали поступает препарат «Полиглюкин» из стеклянного флакона, охлажденный проточной водой до 15,0±2,0°С, и разбавляют им до концентрации от 1×106 до 1×107 кл/мл. После этого к суспензии клеток по каплям добавляют в соотношении 1:1 раствор криоконсерванта, охлажденный в электроморозильнике до 4,0±2,0°С, разливают в ампулы для замораживания, герметизируют и выдерживают в электроморозильнике при температуре 4±2°С от 15 до 30 минут. После температурной выдержки охлажденные клетки переносят в электроморозильник, замораживают и хранят при температуре -70°С в течение года, при -196°С в течение несколько лет. Размораживание клеток производят путем погружения ампул в водяную баню и их интенсивного покачивания в ручном режиме при температуре 39-41°С до согревания суспензии лейкозных клеток до 37°С. Сохранность размороженных лейкозных клеток определяют по результатам перевивки заданного подвида спонтанного лейкоза.
| Таблица | |||
| Сравнительные результаты сохранности биологических свойств перевиваемых лейкозных клеток селезенки мышей инбредной линии AKR/JY | |||
| №№ пп. | Вид лейкоза | Результат перевивки выделенных лейкозных клеток селезенки | |
| Способ-прототип | Заявленный способ | ||
| 1. | Т-клеточный лимфобластный лейкоз | Т-клеточный лимфобластный лейкоз | Т-клеточный лимфобластный лейкоз |
| 2. | Т-клеточный лимфобластный лейкоз | Т-клеточный лимфобластный лейкоз | Т-клеточный лимфобластный лейкоз |
| 3. | Т-клеточный лимфобластный лейкоз | отрицательный | Т-клеточный лимфобластный лейкоз |
| 4. | Т-клеточный лимфобластный лейкоз | отрицательный | Т-клеточный лимфобластный лейкоз |
| 5. | В-клеточный лимфобластный лейкоз | В-клеточный лимфобластный лейкоз | В-клеточный лимфобластный лейкоз |
| 6. | Т-клеточный лимфобластный лейкоз | отрицательный | Т-клеточный лимфобластный лейкоз |
| 7. | Т-клеточный лимфобластный лейкоз | отрицательный | Т-клеточный лимфобластный лейкоз |
| 8. | Т-клеточный лимфобластный лейкоз | Т-клеточный лимфобластный лейкоз | Т-клеточный лимфобластный лейкоз |
| 9. | миелобластный лейкоз | отрицательный | отрицательный |
| 10. | Т-клеточный лимфобластный лейкоз | Т-клеточный лимфобластный лейкоз | Т-клеточный лимфобластный лейкоз |
| 11. | Т-клеточный лимфобластный лейкоз | Т-клеточный лимфобластный лейкоз | Т-клеточный лимфобластный лейкоз |
| 12. | Т-клеточный лимфобластный лейкоз | отрицательный | отрицательный |
| 13. | миелобластный лейкоз | миелобластный лейкоз | миелобластный лейкоз |
| 14. | Т-клеточный лимфобластный лейкоз | Т-клеточный лимфобластный лейкоз | Т-клеточный лимфобластный лейкоз |
| 15. | пролимфоцитарный лейкоз | отрицательный | пролимфоцитарный лейкоз |
Проведенные исследования показывают, что из 15 случаев параллельной перевивки сингенного лейкоза положительные результаты при использовании прототипа получены в 8 случаях, тогда как применение предложенного способа дало положительные результаты в 13 случаях.
Предлагаемая технология консервирования лейкозных перевиваемых клеток инбредных мышей в установленных стандартах технологии проста в реализации, дает стабильный положительный результат и может быть использована в учреждениях медицинского и биологического профиля в экспериментальных исследованиях лейкозов для сохранности биологических свойств перевивных лейкозных клеток.
Claims (1)
- Способ консервирования лейкозных клеток, выделенных из селезенки мышей инбредной линии AKR/JY с температурой тела 38±1°С, включающем асептическую спленэктомию, декапсуляцию селезенки, измельчение ее пульпы, гомогенизацию фрагментов пульпы и фильтрацию лейкозных клеток гомогенизата в искусственной охлажденной внеклеточной среде, последующее смешивание фильтрата с криоконсервантом, замораживание суспензии клеток и хранение их при температуре от -70 до -196°С, декапсуляцию, измельчение пульпы и гомогенизацию фрагментов пульпы селезенки производят в стерильном растворе полиглюкина, охлажденном до 24,0±1,0°С, фильтрацию лейкозных клеток выполняют в стерильном растворе полиглюкина, охлажденном до 15,0±2,0°С, которым суспензию клеток разбавляют до концентрации от 1·106 до 1·107 кл/мл, к суспензии клеток по каплям добавляют в соотношении 1:1 раствор криоконсерванта, охлажденный до 4,0±2,0°С, разливают в ампулы для замораживания и выдерживают при температуре 4±2°С от 15 до 30 мин, после температурной выдержки клетки замораживают и хранят в электроморозильнике, сохранность размороженных лейкозных клеток определяют по результатам перевивки лейкозных клеток.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2009113931/10A RU2398377C1 (ru) | 2009-04-13 | 2009-04-13 | Способ консервирования лейкозных клеток, выделенных из селезенки мышей инбредной линии akr/jy |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2009113931/10A RU2398377C1 (ru) | 2009-04-13 | 2009-04-13 | Способ консервирования лейкозных клеток, выделенных из селезенки мышей инбредной линии akr/jy |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2398377C1 true RU2398377C1 (ru) | 2010-09-10 |
Family
ID=42800201
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2009113931/10A RU2398377C1 (ru) | 2009-04-13 | 2009-04-13 | Способ консервирования лейкозных клеток, выделенных из селезенки мышей инбредной линии akr/jy |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2398377C1 (ru) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2490637C1 (ru) * | 2012-04-12 | 2013-08-20 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки "Кировский научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови Федерального медико-биологического агентства" | Способ оценки развития сингенного перевивного миелобластного лейкоза у мышей линии akr/jy |
-
2009
- 2009-04-13 RU RU2009113931/10A patent/RU2398377C1/ru not_active IP Right Cessation
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2490637C1 (ru) * | 2012-04-12 | 2013-08-20 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки "Кировский научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови Федерального медико-биологического агентства" | Способ оценки развития сингенного перевивного миелобластного лейкоза у мышей линии akr/jy |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2435080T3 (es) | Procedimiento de expansión de células madre adultas de sangre, en particular sangre periférica, y aplicación relativa en el campo médico | |
| EP2641623B1 (en) | Apparatus and methods for providing cryopreserved ecp-treated mononuclear cells | |
| CN106665559A (zh) | 一种免疫细胞冻存液及其应用 | |
| CN109662091B (zh) | 一种脂肪颗粒组织冻存液及其配制方法和冻存方法 | |
| CN111838130A (zh) | 一种保护液及其制备方法和应用 | |
| RU2398377C1 (ru) | Способ консервирования лейкозных клеток, выделенных из селезенки мышей инбредной линии akr/jy | |
| Ekim et al. | A modified S10B silicone plastination method for preparation and preservation of scaled reptile specimens | |
| ES2690253T3 (es) | Método para expandir células madre adultas a partir de sangre entera | |
| CN101336932B (zh) | 一种低传代猪毛乳头细胞培养上清液冻干粉 | |
| KR20080011307A (ko) | 고압 저온 챔버 | |
| RU2440065C2 (ru) | Биологический контейнер и его трансплантация животным | |
| RU2400241C1 (ru) | Способ получения плацентарного лечебного препарата | |
| Luk et al. | The use of stem cells for treatment of diseases | |
| RU2481115C1 (ru) | Средство для заживления ран "целльгель", способ его получения и способ лечения ран различной этиологии полученным средством | |
| MELENEY et al. | ACTION OF ACRIFLAVINE ON THE BLOOD AND CERTAIN TISSUES OF RABBITS: WITH PARTICULAR REFERENCE TO HEMOLYTIC STREPTOCOCCUS SEPTICEMIA | |
| Jofra et al. | Murine pancreatic islets transplantation under the kidney capsule | |
| Ruer-Laventie et al. | Skin transplantation and lymphoid organ analysis in mice | |
| Aksamitiene et al. | Standardized Pre-clinical Surgical Animal Model Protocol to Investigate the Cellular and Molecular Mechanisms of Ischemic Flap Healing | |
| RU2402337C1 (ru) | Способ выделения и приготовления суспензии лейкозных клеток из селезенок мышей инбредной линии akr/jy | |
| RU2547697C1 (ru) | Способ моделирования острого деструктивного инфицированного панкреонекроза | |
| Mohammad et al. | Spleen Autotransplantation in Rat | |
| Wei et al. | Generation of Human Liver Chimeric Mice and Harvesting of Human Hepatocytes from Mouse Livers | |
| RU2698041C1 (ru) | Способ получения ксенотрансплантата с модулируемыми параметрами жесткости для офтальмохирургии | |
| CN103006695A (zh) | 眼内灌注液及其制备方法 | |
| RU2265050C1 (ru) | Способ стимуляции фагоцитарной активности макрофагов |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20120414 |