RU2394834C1 - Углеводсодержащие катионные амфифилы, обладающие способностью доставлять нуклеиновые кислоты в клетки млекопитающих - Google Patents
Углеводсодержащие катионные амфифилы, обладающие способностью доставлять нуклеиновые кислоты в клетки млекопитающих Download PDFInfo
- Publication number
- RU2394834C1 RU2394834C1 RU2009124773/04A RU2009124773A RU2394834C1 RU 2394834 C1 RU2394834 C1 RU 2394834C1 RU 2009124773/04 A RU2009124773/04 A RU 2009124773/04A RU 2009124773 A RU2009124773 A RU 2009124773A RU 2394834 C1 RU2394834 C1 RU 2394834C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cells
- rac
- compounds
- carbohydrate
- compound
- Prior art date
Links
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 title claims abstract description 20
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 title claims abstract description 20
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 title claims abstract description 20
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 title abstract description 12
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 title abstract 2
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 title description 15
- -1 12-amino-4,9-diazadodec-1-yl Chemical group 0.000 claims abstract description 25
- PFNFFQXMRSDOHW-UHFFFAOYSA-N spermine Chemical group NCCCNCCCCNCCCN PFNFFQXMRSDOHW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 14
- 125000004051 hexyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 claims abstract description 11
- KHBQMWCZKVMBLN-UHFFFAOYSA-N Benzenesulfonamide Chemical compound NS(=O)(=O)C1=CC=CC=C1 KHBQMWCZKVMBLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 7
- IAJHLVPJJCPWLF-UHFFFAOYSA-N 2,3-di(tetradecoxy)propan-1-ol Chemical group CCCCCCCCCCCCCCOCC(CO)OCCCCCCCCCCCCCC IAJHLVPJJCPWLF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 claims abstract description 3
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 claims abstract description 3
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims description 11
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 3
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 claims description 2
- 239000008101 lactose Substances 0.000 claims description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 abstract description 54
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 9
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 66
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 26
- KLHSDMQFUVANEB-MELZOAELSA-L hexadecyl-[(2r,3r)-4-[hexadecyl(dimethyl)azaniumyl]-2,3-dimethoxybutyl]-dimethylazanium;dibromide Chemical compound [Br-].[Br-].CCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)C[C@@H](OC)[C@H](OC)C[N+](C)(C)CCCCCCCCCCCCCCCC KLHSDMQFUVANEB-MELZOAELSA-L 0.000 description 23
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 21
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 20
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 14
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 11
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 11
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 10
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 10
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 10
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 description 7
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 7
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 7
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 7
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 6
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 6
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 6
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 5
- 229940063675 spermine Drugs 0.000 description 5
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 5
- WQDUMFSSJAZKTM-UHFFFAOYSA-N Sodium methoxide Chemical compound [Na+].[O-]C WQDUMFSSJAZKTM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 4
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 4
- 238000000034 method Methods 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 4
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 4
- 238000001644 13C nuclear magnetic resonance spectroscopy Methods 0.000 description 3
- 238000005160 1H NMR spectroscopy Methods 0.000 description 3
- MEKOFIRRDATTAG-UHFFFAOYSA-N 2,2,5,8-tetramethyl-3,4-dihydrochromen-6-ol Chemical compound C1CC(C)(C)OC2=C1C(C)=C(O)C=C2C MEKOFIRRDATTAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N Benzene Chemical compound C1=CC=CC=C1 UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000012124 Opti-MEM Substances 0.000 description 3
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010048367 enhanced green fluorescent protein Proteins 0.000 description 3
- 238000001840 matrix-assisted laser desorption--ionisation time-of-flight mass spectrometry Methods 0.000 description 3
- VMGAPWLDMVPYIA-HIDZBRGKSA-N n'-amino-n-iminomethanimidamide Chemical compound N\N=C\N=N VMGAPWLDMVPYIA-HIDZBRGKSA-N 0.000 description 3
- BOLDJAUMGUJJKM-LSDHHAIUSA-N renifolin D Natural products CC(=C)[C@@H]1Cc2c(O)c(O)ccc2[C@H]1CC(=O)c3ccc(O)cc3O BOLDJAUMGUJJKM-LSDHHAIUSA-N 0.000 description 3
- 239000004055 small Interfering RNA Substances 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WXTMDXOMEHJXQO-UHFFFAOYSA-N 2,5-dihydroxybenzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC(O)=CC=C1O WXTMDXOMEHJXQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FALRKNHUBBKYCC-UHFFFAOYSA-N 2-(chloromethyl)pyridine-3-carbonitrile Chemical compound ClCC1=NC=CC=C1C#N FALRKNHUBBKYCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M Bromide Chemical compound [Br-] CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 2
- 241000699673 Mesocricetus auratus Species 0.000 description 2
- JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N N,N-Diisopropylethylamine (DIPEA) Chemical compound CCN(C(C)C)C(C)C JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BPTWOILMGBCWJI-UHFFFAOYSA-N OCCCCCCNS(=O)(=O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 Chemical compound OCCCCCCNS(=O)(=O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 BPTWOILMGBCWJI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N Tetrahydrofuran Chemical compound C1CCOC1 WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-M Trifluoroacetate Chemical compound [O-]C(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- CYAYKKUWALRRPA-DGTMBMJNSA-N [(2r,3r,4s,5s,6r)-3,4,5-triacetyloxy-6-bromooxan-2-yl]methyl acetate Chemical compound CC(=O)OC[C@H]1O[C@H](Br)[C@@H](OC(C)=O)[C@@H](OC(C)=O)[C@@H]1OC(C)=O CYAYKKUWALRRPA-DGTMBMJNSA-N 0.000 description 2
- CYAYKKUWALRRPA-HTOAHKCRSA-N [(2r,3s,4s,5r,6r)-3,4,5-triacetyloxy-6-bromooxan-2-yl]methyl acetate Chemical compound CC(=O)OC[C@H]1O[C@H](Br)[C@H](OC(C)=O)[C@@H](OC(C)=O)[C@H]1OC(C)=O CYAYKKUWALRRPA-HTOAHKCRSA-N 0.000 description 2
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 2
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 2
- OGQYPPBGSLZBEG-UHFFFAOYSA-N dimethyl(dioctadecyl)azanium Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)CCCCCCCCCCCCCCCCCC OGQYPPBGSLZBEG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 210000002308 embryonic cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 2
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 2
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 2
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 2
- 231100000053 low toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 2
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 229940014800 succinic anhydride Drugs 0.000 description 2
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- AFSHUZFNMVJNKX-CLFAGFIQSA-N 1,2-dioleoylglycerol Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OCC(CO)OC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC AFSHUZFNMVJNKX-CLFAGFIQSA-N 0.000 description 1
- RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 1,4-Dioxane Chemical compound C1COCCO1 RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000004080 3-carboxypropanoyl group Chemical group O=C([*])C([H])([H])C([H])([H])C(O[H])=O 0.000 description 1
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- XULFJDKZVHTRLG-JDVCJPALSA-N DOSPA trifluoroacetate Chemical compound [O-]C(=O)C(F)(F)F.CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCCOCC(C[N+](C)(C)CCNC(=O)C(CCCNCCCN)NCCCN)OCCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC XULFJDKZVHTRLG-JDVCJPALSA-N 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 125000002777 acetyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000001476 alcoholic effect Effects 0.000 description 1
- VZTDIZULWFCMLS-UHFFFAOYSA-N ammonium formate Chemical compound [NH4+].[O-]C=O VZTDIZULWFCMLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 description 1
- 229910000011 cadmium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- GKDXQAKPHKQZSC-UHFFFAOYSA-L cadmium(2+);carbonate Chemical compound [Cd+2].[O-]C([O-])=O GKDXQAKPHKQZSC-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- FJDQFPXHSGXQBY-UHFFFAOYSA-L caesium carbonate Chemical compound [Cs+].[Cs+].[O-]C([O-])=O FJDQFPXHSGXQBY-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000024 caesium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- MPBRYMWMMKKRGC-UHFFFAOYSA-M carbocyanin DBTC Chemical compound [Br-].C1=CC=CC2=C([N+](=C(C=C(C)C=C3N(C4=C5C=CC=CC5=CC=C4S3)CC)S3)CC)C3=CC=C21 MPBRYMWMMKKRGC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000001460 carbon-13 nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 1
- 150000007942 carboxylates Chemical class 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 229910000355 cerium(IV) sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- PBAYDYUZOSNJGU-UHFFFAOYSA-N chelidonic acid Natural products OC(=O)C1=CC(=O)C=C(C(O)=O)O1 PBAYDYUZOSNJGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001427 coherent effect Effects 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000005056 compaction Methods 0.000 description 1
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 1
- 230000012202 endocytosis Effects 0.000 description 1
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 description 1
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 208000016361 genetic disease Diseases 0.000 description 1
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N glycerol Substances OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000001698 laser desorption ionisation Methods 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 1
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- PSHKMPUSSFXUIA-UHFFFAOYSA-N n,n-dimethylpyridin-2-amine Chemical compound CN(C)C1=CC=CC=N1 PSHKMPUSSFXUIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000449 nitro group Chemical group [O-][N+](*)=O 0.000 description 1
- 108091027963 non-coding RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000042567 non-coding RNA Human genes 0.000 description 1
- 229940124276 oligodeoxyribonucleotide Drugs 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 239000003208 petroleum Substances 0.000 description 1
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 1
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 1
- 239000012286 potassium permanganate Substances 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 125000001436 propyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 230000004224 protection Effects 0.000 description 1
- 238000000425 proton nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 1
- 210000003660 reticulum Anatomy 0.000 description 1
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- DPKBAXPHAYBPRL-UHFFFAOYSA-M tetrabutylazanium;iodide Chemical compound [I-].CCCC[N+](CCCC)(CCCC)CCCC DPKBAXPHAYBPRL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N tetrahydrofuran Natural products C=1C=COC=1 YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CZDYPVPMEAXLPK-UHFFFAOYSA-N tetramethylsilane Chemical compound C[Si](C)(C)C CZDYPVPMEAXLPK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000003536 tetrazoles Chemical class 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
- 239000012224 working solution Substances 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Saccharide Compounds (AREA)
Abstract
Изобретение относится к углеводсодержащим поликатионным амфифилам (1-3), представляющим собой тригидрохлориды rac-N-[6-(β-D-гликопиранозилокси)гексил]-N-[2,3-ди(тетрадецилокси)проп-1-ил]-4-[(12-амино-4,9-диазадодец-1-ил)амино-сукциниламино]бензолсульфонамида приведенной общей формулы, где А - остаток 1,2-ди-О-тетрадецил-rac-глицерина, В - остаток галактозы (для (1)), лактозы (для (2)) и маннозы (для (3)), С - остаток спермина, n=6, m=2. Указанные соединения обладают способностью доставлять нуклеиновые кислоты в клетки млекопитающих. 4 табл., 2 ил.
Description
Изобретение относится к области химии и медицины, а именно к новым соединениям, способным доставлять нуклеиновые кислоты в клетки млекопитающих.
За последние несколько лет в связи с увеличением количества генетических заболеваний возрос интерес к такой области медицины, как генная терапия. Среди методов доставки генетического материала в эукариотические клетки заметное место занимает липофекция - перенос ДНК с помощью катионных амфифилов или липосом [1]. Катионные амфифилы и липосомы на их основе образуют с молекулами нуклеиновых кислот электростатические комплексы, которые защищают нуклеиновые кислоты от деградации под действием клеточных ферментов, а их проникновение в клетку происходит по механизму эндоцитоза. Доставка нуклеиновых кислот с помощью катионных амфифилов in vitro является обыденной рутинной процедурой, однако применение этого метода in vivo ограничено низкой эффективностью переноса, что связано с наличием различных типов биологических барьеров (например, взаимодействием ДНК-липидных частиц с белками плазмы крови и их захватом ретикуло-эндотелиальной системой, а также низкой специфичностью попадания в целевые органы и ткани) [2]. Для увеличения эффективности доставки нуклеиновых кислот в молекулы катионных амфифилов вводят специальные структурные элементы, которые помогают им преодолевать биологические барьеры [3]. Например, для нацеливания на определенные типы клеток молекулу катионного амфифила модифицируют адресными лигандами пептидной или углеводной природы [4].
К катионным амфифилам относят обширный круг химических веществ, имеющих общие структурные черты: наличие положительно заряженного и гидрофобного доменов, связанных спейсером различной длины [5-7]. Гидрофильный положительно заряженный домен необходим для связывания с молекулой нуклеиновой кислоты, а гидрофобный - для ее инкапсулирования. В последнее время в структуру катионных амфифилов все чаще включают остатки углеводов, которые выступают в качестве адресных маркеров для доставки нуклеиновых кислот в специальные клетки и ядро [8-14]. Кроме того, остаток углевода может служить базисом для размещения одной или нескольких катионных групп [15-17]. Амфифилы, содержащие углеводные остатки, способны вызывать рН-зависимый переход агрегатов амфифилов из ламеллярной фазы в мицеллярную, увеличивая и тем самым эффективность доставки генетического материала [18]. Кроме того, наличие углеводных фрагментов повышает коллоидную стабильность ДНК-липидных частиц в сыворотке крови [19, 20] и уменьшает токсичность [21].
Наиболее близким по структуре к заявляемым соединениям - прототипом является катионный амфифил N-[1-(2,3-диолеилокси)пропил]-N-[2-(6-спермилкарбамоил)этил]-N,N-диметиламмоний трифторацетат (DOSPA) [22]. В структуру данного липида входит остаток 1,2-ди-О-олеоил-rac-глицерина, который формирует гидрофобный домен, остаток природного поликатиона - спермина - формирует катионный домен, который связывается с фосфатными группами нуклеиновых кислот. Недостатком известного соединения является низкая трансфицирующая активность при использовании в виде индивидуального соединения.
Технической задачей изобретения является получение новых эффективных синтетических соединений, обладающих высокой трансфицирующей активностью, низкой токсичностью и способных доставлять нуклеиновые кислоты в клетки млекопитающих.
Поставленная техническая задача решается предлагаемыми соединениями, представляющими собой углеводсодержащие катионные амфифилы общей формулы:
где А - остаток 1,2-ди-О-тетрадецил-rac-глицерина, B - остаток галактозы (для (1)), лактозы (для (2)) и маннозы (для (3)), C - остаток спермина, n=6, m=2.
На фигуре 1 представлены структурные формулы соединений (1), (2) и (3). В структуру амфифилов (1), (2) и (3) входят остаток спермина для связывания и компактизации молекулы нуклеиновой кислоты, остаток 1,2-ди-О-тетрадецил-rac-глицерина для формирования гидрофобного окружения. Для связывания гидрофобной и сперминовой частей используют биодеградируемый линкер сукцинильного типа. Для придания углеводным остаткам пространственной подвижности моносахариды присоединены к липидным составляющим через гексаметиленовые мостики.
Новые соединения (1), (2) и (3) были получены по общей схеме, представленной на фигуре 2. Исходным соединением в синтезе являлся 1-бром-1-дезокси-2,3-ди-О-тетрадецил-rac-глицерин (4), который вводили во взаимодействие с N-(6-гидроксигексил)-4-нитробензолсульфонамидом (5), получая бифункциональное соединение (6). Ключевым этапом синтеза соединений (7a-b) явилось гликозилирование соединения (6) 2,3,4,6-тетра-О-ацетил-α-D-галактопиранозилбромидом, 2,2',3,3',4',6,6'-гепта-O-ацетил-β-лактопиранозилбромидом или 2,3,4,6-тетра-O-ацетил-α-D-маннопиранозилбромидом [23]. Для получения удобного узла связывания нитрогруппу ароматического ядра восстанавливали до аминогруппы, используя в качестве катализатора Pd/C. Далее в молекулы амфифилов (8a-b) вводили сукцинильный спейсер обработкой янтарным ангидридом, получая карбоксилаты (9а-с). Связывание соединений (9а-с) с N4,N9,N12-три-трет-бутоксикарбонил-1,12-диамино-4,9-диазадодеканом проводили в присутствии O-(1Н-бензотриазол-1-ил)-N,N,N',N'-тетраметилуроний гексафторфосфата при 4°С. На завершающем этапе синтеза в соединениях (10а-с) проводили деблокирование аминогрупп действием трифторуксусной кислоты, а удаление ацетильных защит - 0.04 н. раствором метилата натрия в метаноле.
В синтезе использовались очищенные растворители, реагенты отечественного (Химмед, Реахим) и зарубежного производства (Merck, Fluka, Aldrich, Acros). Контроль за ходом реакций осуществляли с помощью ТСХ. Тонкослойную хроматографию проводили на пластинках Kieselgel 60 F254 (Merck), RP -18 F254S (Merck), Сорбфил (Россия). Обнаружение пятен на хроматограммах проводили раствором фосформолибденовая кислота - церий (IV) сульфат с последующим прогреванием, реактивом Драгендорфа, раствором перманганата калия и с помощью УФ-лампы (254 нм). Колоночную хроматографию проводили на силикагеле Kieselgel 60 (0.040-0.063 mm); Kieselgel 60 (0.063-0.200 mm), LiChroprep® RP-18 (0.040-0.063 mm, Merck). Спектры 1H- и 13С-ЯМР регистрировали на импульсном фурье-спектрометре «Bruker DPX-300» и «Bruker АМХ-400» в CDCl3, смеси CDCl3-CD3OD и Py-d5 (внутренний стандарт тетраметилсилан). Значения химических сдвигов (δ) приведены в миллионных долях (м.д.), константы спин-спинового взаимодействия (J) в герцах (Гц). Масс-спектры получали на время-пролетном масс-спектрометре «Bruker Ultraflex» (Германия) методом матриксной лазерно-десорбционной ионизации на матрице с использованием в качестве матрицы 2,5-дигидроксибензойной кислоты. Углы оптического вращения измеряли на фотоэлектрическом спектрополяриметре «Digytor Yasco DIP 360» (Япония).
Для изучения способности предлагаемых соединений доставлять нуклеиновые кислоты в клетки млекопитающих использовали 25-звенный олигодезоксирибонуклеотид 5'-dTACAGTGGAATTGTATGCCTATTA-3', модифицированный флуоресцеинизотиоционатом (FITC) по 3'-концу, плазмидную ДНК (pEGFP-C2, «Clontech» (Германия)) и 21-звенную двуцепочечную РНК (siPHK, ИХБФМ СО РАН) (последовательность смысловой цепи 5'-GCGCCGAGGUGAAGUUCGATT-3', антисмысловой цепи - 5'-UCGAACUUCACCUCGGCGCGG-3'). FITC-ON был синтезирован фосфитамидным методом [24] и очищен ионообменной и обращенно-фазовой хроматографией. Чистоту олигонуклеотида проверяли с помощью электрофореза в 15% ПААГ в денатурирующих условиях, визуализацию олигонуклеотида в геле проводили с помощью окраски Stains-Аll.
Эффективность проникновения нуклеиновых кислот с использованием катионных амфифилов в клетки млекопитающих in vitro была исследована в экспериментах по трансфекции клеток FITC-меченным олигонуклеотидом, плазмидной ДНК, кодирующей зеленый флуоресцирующий белок (EGFP) и короткой интерферирующей РНК, направленной против матричной РНК гена, кодирующего EGFP.
Сопоставительный анализ заявляемых соединений с известными и широко используемыми соединениями, такими как Lipofectamine®2000 и Oligofectamine показал, что предлагаемые соединения обладают следующими преимуществами.
1) Благодаря наличию природных структурных модулей, в том числе углеводных остатков, заявляемые соединения обладают низким токсическим воздействием на клетки млекопитающих.
2) Заявляемые соединения обладают способностью доставлять в клетки млекопитающих нуклеиновые кислоты как короткие, так и протяженные, что позволяет рассматривать их как перспективные агенты для трансфекции клеток млекопитающих.
3) Заявляемые соединения доставляют нуклеиновые кислоты в клетки в индивидуальном состоянии в виде водных растворов и не требуют использования дополнительных вспомогательных липидов.
Заявляемые соединения не требуют сложной процедуры приготовления, свойственной липосомальным композициям, для них характерна легкость приготовления рабочего раствора, для получения которого достаточно растворить заявляемое соединение в воде или спирте. Кроме того, заявляемые соединения стабильны при хранении как в сухом виде, так и в виде концентрированного водного или спиртового растворов.
Поиск по источникам научно-технической и патентной литературы показал, что заявляемые соединения (1), (2), (3), способные доставлять нуклеиновые кислоты в клетки млекопитающих, в известных источниках не описаны.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1. Получение rac-N-(6-гидроксигексил)-N-[2,3-ди(тетрадецил-окси)проп-1-ил]-4-нитробензолсульфонамида (промежуточное соединение 6).
К раствору 0.995 г (1.816 ммоль) rac-1-бром-1-дезокси-2,3-ди-О-тетрадецилглицерина (4) в 10 мл диметилформамида добавили 0.571 г (1.888 ммоль) N-(6-гидроксигексил)-4-нитробензолсульфонамида (5), карбоната цезия (0.355 г, 1.090 ммоль) и тетрабутиламмоний йодида (0.067 г, 0.181 ммоль). Реакционную смесь перемешивали 2 дня при нагревании, экстрагировали петролейным эфиром. Органический экстракт упаривали и хроматографировали на колонке с силикагелем. Выход соединения (6) составил 1.397 г (60%).
Пример 2. Получение rac-N-[6-(2,3,4,6-тетра-О-ацетил-β-D-галактопиранозилокси)гексил]-N-[2,3-ди(тетрадецилокси)проп-1-ил]-4-нитробензолсульфонамида (промежуточное соединение 7а).
К раствору 1.028 г (1.336 ммоль) rac-N-(6-гидроксигексил)-N-[2,3-ди(тетрадецилокси)проп-1-ил]-4-нитробензолсульфонамида (6) в 40 мл безводного бензола добавили 0.691 г (4.009 ммоль) прокаленного карбоната кадмия и кипятили в аппарате Сокслета. В реакционную смесь вносили раствор 1.648 г (4.009 ммоль) 2,3,4,6-тетра-O-ацетил-α-D-галактопиранозилбромида. Через 2.5 ч реакционную массу фильтровали, растворитель удаляли в вакууме. Остаток хроматографировали на колонке с силикагелем. Выход соединения (7а) составил 1.152 г (78%).
Промежуточные соединения (7b) и (7с) были получены, как описано для получения соединения (7а), исходя из rac-N-(6-гидроксигексил)-N-[2,3-ди(тетрадецилокси)проп-1-ил]-4-нитробензолсульфонамида (6), 2,2',3,3',4',6,6'-гепта-O-ацетил-β-лактопиранозилбромида и 2,3,4,6-тетра-О-ацетил-α-D-маннопиранозилбромида, соответственно. Физико-химические характеристики соединений (7b) и (7с) соответствуют их химической структуре.
Пример 3. Получение rac-N-[6-(2,3,4,6-тетра-O-ацетил-β-D-галактопиранозилокси)гексил]-N-[2,3-ди(тетрадецилокси)проп-1-ил]-4-аминобензолсульфонамида (промежуточное соединение 8а).
К раствору 1.126 г (1.024 ммоль) rac-N-[6-(2,3,4,6-тетра-O-ацетил-[β-D-галактопиранозилокси)гексил]-N-[2,3-ди(тетрадецилокси)проп-1-ил]-4-нитробензолсульфонамида (7а) в 14 мл смеси метанол:тетрагидрофуран (2.5:2) добавили 0.258 г (4.096 ммоль) формиата аммония и нагревали до 60°С, вносили каталитическое количество Pd/C. Через 30 мин реакционную смесь фильтровали, растворители удаляли в вакууме. Остаток хроматографировали на колонке с силикагелем. Выход соединения (8а) составил 0.933 г (85%).
Промежуточные соединения (8b) и (8с) были получены, как описано для получения соединения (8а), исходя из rac-N-[6-(2,2',3,3',4',6,6'-гепта-O-ацетил-β-лактопиранозилокси)гексил]-N-[2,3-ди(тетрадецилокси)проп-1-ил]-4-нитробензолсульфонамида (7b) и rac-N-[6-(2,3,4,6-тетра-O-ацетил-β-D-маннопиранозилокси)гексил]-N-[2,3-ди(тетрадецилокси)-проп-1-ил]-4-нитробензолсульфонамида (7с), соответственно. Физико-химические характеристики соединений (8b) и (8с) соответствуют их химической структуре.
Пример 4. Получение rac-N-[6-(2,3,4,6-тетра-O-ацетил-β-D-галактопиранозилокси)гексил]-N-[2,3-ди(тетрадецилокси)проп-1-ил]-4-(3-карбоксипропаноиламино)бензолсульфонамида (промежуточное соединение 9а).
К раствору 0.932 г (0.872 ммоль) rac-N-[6-(2,3,4,6-тетра-O-ацетил-β-D-галактопиранозилокси)гексил]-N-[2,3-ди(тетрадецилокси)проп-1-ил]-4-аминобензолсульфонамида (8а) в дихлорметане добавили 1.025 г (10.23 ммоль) янтарного ангидрида, 0.024 г (0.201 ммоль) диметиламинопиридина и 287 мкл (2.046 ммоль) триэтиламина. Через 36 ч реакционную смесь промывали водным раствором HCl. Органическую фазу сушили, фильтровали, растворители удаляли в вакууме. Остаток хроматографировали на колонке с силикагелем. Выход соединения (9а) составил 0.747 г (73%).
Промежуточные соединения (9b) и (9с) были получены, как описано для получения соединения (9а), исходя из rac-N-[6-(2,2',3,3',4',6,6'-гепта-O-ацетил-β-лактопиранозилокси)гексил]-N-[2,3-ди(тетрадецилокси)проп-1-ил]-4-аминобензолсульфонамида (8b) и rас-N-[6-(2,3,4,6-тетра-O-ацетил-β-D-маннопиранозилокси)гексил]-N-[2,3-ди(тетрадецилокси)проп-1-ил]-4-аминобензолсульфонамида (8с), соответственно. Физико-химические характеристики соединений (9b) и (9с) соответствуют их химической структуре.
Пример 5. Получение rac-N-[6-(2,3,4,6-тетра-O-ацетил-β-D-галактопиранозилокси)гексил]-N-[2,3-ди(тетрадецилокси)проп-1-ил]-4-[(N4,N9,N12-три-трет-бутоксикарбонил-12-амино-4,9-диазадодец-1-ил)аминосукциниламино]бензолсульфонамида (промежуточное соединение 10а).
К раствору 0.642 г (0.549 ммоль) соединения (9а) и 0.552 г (1.098 ммоль) N4,N9,N12-три-трет-бутоксикарбонил-1,12-диамино-4,9-диазадодекана в диметилформамида внесли 191 мкл (1.098 ммоль) N,N-диизопропилэтиламина и по каплям раствор 0.416 г (1.098 ммоль) О-(1Н-бензотриазол-1-ил)-N,N,N',N'-тетраметилуроний гексафторфосфата в ДМФА. Через 5.5 ч к реакционной массе добавили хлороформ и экстрагировали водным раствором HCl. Органическую фазу сушили, фильтровали, остаток хроматографировали на колонке с силикагелем. Выход соединения (10а) составил 0.563 г (62%).
Промежуточные соединения (10b) и (10с) были получены, как описано для получения соединения (10а), исходя из соединений (9b) и (9 с), соответственно. Физико-химические характеристики соединений (10b) и (10с) соответствуют химической структуре.
Пример 6. Получение трис(трифторацетата) rac-N-[6-(2,3,4,6-тетра-O-ацетил-β-D-галактопиранозилокси)гексил]-N-[2,3-ди(тетрадецилокси)проп-1-ил]-4-[(12-амино-4,9-диазадодец-1-ил)аминосукциниламино]бензолсульфонамида (промежуточное соединение 11а).
К раствору 0.669 г (0.404 ммоль) соединения (10а) в дихлорметане добавили 4.416 мл (19.8 ммоль) трифторуксусной кислоты. Через 3.5 ч растворители удаляли в вакууме. Остаток хроматографировали на колонке с силикагелем. Выход соединения (11а) составил 0.472 г (76%).
Промежуточные соединения (11b) и (11с) были получены, как описано для получения соединения (11а), исходя из (10b) и (10с), соответственно. Физико-химические характеристики соединений (11b) и (11c) соответствуют их химической структуре.
Пример 7. Получение тригидрохлорида rac-N-[6-(β-D-галактопиранозилокси)гексил]-N-[2,3-ди(тетрадецилокси)проп-1-ил]-4-[(12-амино-4,9-диазадодец-1-ил)-аминосукциниламино]бензолсульфонамида (1).
К 0.472 г (0.278 ммоль) соединения (11а) добавили 0.04 н. раствор метилата натрия в метаноле. Через 1 ч к реакционной массе добавляли раствор 4 н. HCl в диоксане, пока pH не станет равным 5. Растворитель удаляли в вакууме, остаток хроматографировали на колонке. Полученный продукт растворяли в 7 мл дистиллированной воды и проводили диализ против воды в мембране. После лиофилизации выход соединения (1) составил 0.199 г (55%). 1Н-ЯМР (δ, м.д.): 0.65 (т, 6Н, J=6.5, 2СН2СН
3), 1.05 (уш.с, 44Н, 2(СН2)11), 1.13-1.26 (м, 4Н, СН2СН2), 1.31-1.49 (м, 8Н, 3CH
2CH2O, CH
2CH2N), 1.68-1.95 (м, 6Н, протоны спермина), 2.28-2.40 (м, 2Н) и 2.58-2.69 (м, 2Н, NCOCH2CH2COO), 2.81-3.55 (м, 24Н, CHHaO, OCH2CH, 2CH2N, 2CH2O, протоны спермина), 3.74-3.95 m, 4Н, H5-Gal, Hab6-Gal, CHHbO), 4.11-4.20 (м, 2Н, H2-Gal, H3-Gal), 4.35-4.31 (м, 1Н, H4-Gal), 4.31-4.49 (д, 1Н, J=7.6, H1-Gal), 7.78-7.86 (м, 2Н) и 8.01-8.09 (м, 2Н, Ar), 8.95-9.02 (уш.с, 1Н, NH). 13С-ЯМР (δ, м.д.): 14.21, 22.87, 23.94, 24.21, 25.56, 25.97, 26.49, 26.81, 27.18, 28.34, 29.55, 29.76, 29.92, 30.11, 30.61, 30.96, 32.06, 32.60, 36.24, 37.78, 39.00, 45.19, 45.54, 47.26, 50.11, 62.19, 69.52, 70.13, 70.55, 71.39, 71.69, 72.46, 75.13, 76.67, 78.75, 105.08, 128.78, 172.23, 174.08. Масс-спектр (MALDI-TOF), m/z: 1185.864 [M-3HCl+H]+, 1207.847 [M-3HCl+Na]+, 1223.825 [M-3HCl+K]+ вычислено для C63H120N6O12S: 1184.8685.
Соединения (2) и (3) были получены, как описано для получения соединения (1), исходя из (11b) и (11с), соответственно. Физико-химические характеристики соединений (2) и (3) соответствуют их химической структуре.
Тригидрохлорид rac-N-[6-(β-лактопиранозилокси)гексил]-N-[2,3-ди(тетрадецилокси)проп-1-ил]-4-[(12-амино-4,9-диазадодец-1-ил)аминосукциниламино]бензолсульфонамид (2).
Выход соединения (2) составил 64%. [α]D 33 -3.07 (с0.8, CHCl3-СН3ОН, 1:5). 1Н-ЯМР (δ, м.д.): 0.81 (т, 6Н, J=6.8, 2CH2CH
3), 1.16-1.28 (м, 48Н, 2(CH2)11, (CH2)2); 1.36-1.66 (м, 20Н, 3CH
2CH2O, 5CH
2CH2N, CH2CH2), 3.18-3.57 (м, 12Н, 2NCH
2, 2OCH2CH
2, CH2O, CHHaO, CH2CHCH2), 3.65-3.75 (м, 2Н, CHHbO, H5-Lac), 3.78-3.86 (м, 1Н, H5'-Lac), 3.91-4.12 (м, 4Н, Hab6-Lac, Hab6'-Lac), 4.37 (д, 1Н, J=7.8, Н-1' Lac), 4.41 (м, 1Н, Н-4 Lac), 4.43 (д, 1Н, J=7.8, Н-1 Lac), 4.79 (дд, 1Н, J=7.8, 9.4, Н-2 Lac), 4.89 (дд, 1Н, J=3.4, 10.3, Н-3' Lac), 5.03 (дд, 1Н, J=7.8, 10.3, Н-2' Lac), 5.12 (т, 1Н, J=9.4, Н-3 Lac), 5.29 (м, 1Н, Н-4' Lac), 7.75-7.92 (м, 4Н, Ar). 13С-ЯМР (δ, м.д.): 14.84, 23.48, 24.28, 25.50, 26.40, 27.29, 28.54, 30.16, 30.55, 30.72, 30.72, 31.23, 33.63, 38.47, 46.04, 46.47, 48.05, 50.46, 62.32, 62.49, 70.27, 70.40, 71.24, 72.28, 72.88, 75.25, 76.79, 77.49, 78.72, 79.52, 82.04, 104.51, 105.80, 120.28, 129.27, 134.58, 144.82, 172.96, 174.35. Масс-спектр (MALDI-TOF), m/z: 1347.700 [M-3HCl+H], вычислено для C69H1130N6O17S: 1346.9213.
Тригидрохлорид rac-N-[6-(β-D-маннопиранозилокси)гексил]-N-[2,3-ди(тетрадецилокси)проп-1-ил]-4-[(12-амино-4,9-диазадодец-1-ил)аминосукциниламино]бензолсульфонамид (3).
Выход соединения (3) составил 55%. [α]D 23 6.48 (c1, CH3OH). 1Н-ЯМР (δ, м.д.): 0.67 (т, 6Н, J=6.7, 2 СН2СН
3), 1.10 (уш.с, 44Н, 2(СН2)11), 1.15-1.25 (м, 4Н, CH2CH2), 1.34-1.45 (м, 8Н, 3CH
2CH2O, CH
2CH2N, 1.68-1.95 (м, 6Н, протоны спермина), 2.28-2.40 (м, 2Н) и 2.58-2.69 (м, 2Н, NCOCH2CH2COO), 2.81-3.55 (м, 24Н, CHHaO, OCH2CH, 2CH2N, 2CH2O, протоны спермина), 3.61 (дт, J=9.6, 6.4, 1Н, CHHbO), 3.81-3.85 (м, 2Н, Н5-Man), 4.04 (дд, 1Н, J=2.4, 12.2, Ha6-Man), 4.23 (дд, 1Н, J=5.2, 12.2, Hb6-Man), 4.73 (д, 1Н, J=1.6, H1-Man), 5.16 (дд, 1Н, J=1.6, 3.1, Н2-Man), 5.19 (дд, 1Н, J=9.2, 9.8, H4-Man), 5.28 (дд, 1Н, J=3.1, 9.8, H3-Man), 7.75-7.91 (м, 2Н) и 8.05-8.15 (м, 2Н, Ar), 8.95-9.02 (м, 1Н, NH), 11.05-11.45 (м, 1Н, NH). 13С-ЯМР (δ, м.д.): 24.67, 25.75, 26.33, 27.65, 29.39, 29.62, 29.71, 29.77, 30.46, 31.24, 31.89, 45.32, 46.75, 47.19, 61.93, 66.91, 67.11, 67.99, 70.46, 71.50, 71.78, 72.32, 78.81, 100.77, 119.43, 122.56, 123.92, 128.50, 134.00, 135.98, 143.97, 148.84, 172.21, 173.78. Масс-спектр (MALDI-TOF), m/z: 1185.499 [M-3HCl+H]+, 1207.483 [M-3HCl+Na], 1223.451 [M-3HCl+K]+ вычислено для C63H120N6O12S: 1184.8685.
Пример 8. Влияние углеводсодержащего катионного амфифила (1) на жизнеспособность клеток линии ВНK, ВНK IR-780, HeLa, НЕK 293.
Клетки линий ВНK (эмбриональные клетки почки сирийского хомячка), ВНK IR-780 (модифицированные эмбриональные клетки почки сирийского хомячка), НЕK 293 (эмбриональные клетки почки человека) культивировали в среде DMEM, содержащей 10%-ную эмбриональную телячью сыворотку, в атмосфере 5%-ного CO2 при 37°С.
Жизнеспособность клеток после инкубации с катионным амфифилом (1) определяли с помощью МТТ теста, который основан на способности живых клеток превращать соединения на основе тетразола (МТТ) в ярко окрашенные кристаллы формазана, что позволяет спектрофотометрически оценивать количество живых клеток в препарате. Для этого клетки высаживали в 96-луночные планшеты (0.1×105 клеток на лунку для клеток НЕK 293 и 0.03×105 клеток на лунку для клеток ВНK, ВНK IR-780). Через 24 ч в лунках меняли среду и к клеткам добавляли раствор катионного амфифила (1) в среде DMEM до конечной концентрации в лунке от 1 до 80 мкМ. Клетки инкубировали в присутствии амфифила в течение 24 часов в тех же условиях. По окончании инкубации к клеткам без смены среды добавляли раствор МТТ (5 мг/мл) в фосфатно-солевом буфере до концентрации 0.5 мг/мл и инкубировали в течение 3 ч в тех же условиях. Среду удаляли, к клеткам добавляли по 100 мкл диметилсульфоксида, в котором происходит растворение образовавшихся в клетках кристаллов формазана, и измеряли оптическую плотность на многоканальном спектрофотометре на длинах волн 570 и 630 нм, где А570 - поглощение формазана, а А630 - фон клеток.
Из экспериментальных данных вычисляли значение IC50, концентрацию соединения, при которой наблюдается гибель 50% клеток. Значения IC50 катионного амфифила (1) для клеток приведены в таблице 1.
| Таблица 1 | ||
| Клетки | Наличие 10% сыворотки в ростовой среде | IC50, мкМ |
| НЕK 293 | + | >40 |
| - | 25 | |
| ВНK IR-780 | + | >40 |
| - | 18 | |
| ВНK | + | >40 |
| - | 17 | |
Из приведенных данных видно, что обработка клеток катионным амфифилом (1) вызывает их эффективную гибель только при концентрациях соединений выше 17 мкМ в отсутствии сыворотки в ростовой среде, а при наличии сыворотки - выше 40 мкМ, что свидетельствует о низкой токсичности заявляемого соединения.
Пример 9. Проникновение в клетки FITC-меченного олигонуклеотида с использованием катионного амфифила (1).
Исследование проникновения FITC-меченного олигонуклеотида в клетки НЕK 293 проводили с помощью проточной цитофлуориметрии. Эффективность доставки оценивали по количеству трансфицированных клеток от общего количества клеток в образце. Клетки высаживали в 24-луночные планшеты (2×105 клеток на лунку) и культивировали в течение суток при 37°С в атмосфере, содержащей 5% CO2. Перед проведением трансфекции для экспериментов в присутствии или в отсутствие сыворотки среду в лунках заменяли на 200 мкл среды DMEM, содержащей 10% FBS, или DMEM, не содержащей сыворотку, соответственно. Раствор катионного амфифила (1) (10 мкМ) в среде OptiMEM смешивали с раствором FITC-меченного олигонуклеотида (5 мкМ) в этой же среде, полученные комплексы добавляли к клеткам и инкубировали в течение 4 ч. По окончании инкубации клетки промывали PBS (300 мкл), добавляли 50 мкл раствора трипсина и инкубировали 1-2 мин (37°С, 5% CO2). По окончании инкубации в лунки добавляли 200 мкл DMEM с 10% сыворотки, клетки суспендировали и переносили в пробирки. Полученную клеточную суспензию центрифугировали при 1000-1200 об/мин, 4°С, отбирали среду и промывали 1 мл PBS. Затем клетки фиксировали 500 мкл 2% раствора формальдегида в PBS. Анализ уровня трансфекции клеток проводили на флоуцитометре BD FACSAria (Becton Dickinson). В этих экспериментах определяли число клеток, трасфицированных FITC-меченным олигонуклеотидом, и средний уровень флуоресценции клеток, определяемый при длине волны возбуждения 488 нм (в приборе используется когерентный сапфировый лазер (20 мВ)).
Результаты доставки в клетки ВНK FITC-меченного олигонуклеотида (5 мкМ) с катионным амфифилом (1) (5, 10 мкМ) в присутствии или отсутствие сыворотки в ростовой среде приведены в таблице 2.
| Таблица 2 | ||
| Концентрация липида, мкМ | Наличие 10% сыворотки в ростовой среде | Количество трансфицированных клеток, % |
| 5 | - | 61,4 |
| + | 94,6 | |
| 10 | - | 63,3 |
| + | 94,6 | |
Из приведенных данных видно, что в присутствии амфифила (1) FITC-меченный олигонуклеотид эффективно (количество трансфицированных клеток превышает 60%) проникает в клетки в отсутствие сыворотки в ростовой среде. Наличие в ростовой среде 10% сыворотки значительно увеличивает эффективность трансфекции: количество трансфицированных клеток при этом приближается к максимально возможному.
Пример 10. Трансфекция клеток НЕK 293 плазмидной ДНК с использованием катионного амфифила (1).
Доставку плазмидной ДНК в клетки НЕK 293 проводили с помощью проточной цитофлуориметрии. Эффективность трансфекции оценивали по количеству клеток, содержащих зеленый флуоресцентный белок (EGFP) от общего количества клеток в образце. Клетки высаживали в 24-луночные планшеты (2×105 клеток на лунку для клеток НЕK 293) и культивировали в течение суток при 37°С в атмосфере, содержащей 5% CO2. Перед проведением трансфекции для экспериментов в присутствии или в отсутствие сыворотки среду в лунках заменяли на 200 мкл среды DMEM, содержащей 10% FBS, или DMEM, не содержащей сыворотку, соответственно. Раствор соединения (1) (10 мкМ) в среде OptiMEM смешивали с раствором pEGFP-C2 (0.3 мкг/мкл) в этой же среде, полученную смесь добавляли к клеткам и инкубировали в течение 24 ч. Через 4 часа в лунках со средой без сыворотки заменяли среду на DMEM с 10% сывороткой. По окончании инкубации клетки обрабатывали и анализировали, как описано в примере 9. В таблице 3 представлены результаты трансфекции клеток плазмидной ДНК pEGFP-C2 с катионным амфифилом (1).
| Таблица 3 | ||
| Клетки | Наличие 10% сыворотки в ростовой среде | Количество трансфицированных клеток, % |
| НЕK 293 | - | 30,3 |
| + | 2,2 | |
Из приведенных данных видно, что с использованием катионного амфифила (1) плазмидная ДНК проникает в клетки в заметном количестве в отсутствие сыворотки в ростовой среде.
Пример 11. Трансфекция клеток ВНK IR-780 короткой интерферирующей РНК с использованием катионного амфифила (1).
Исследование проникновения siPHK, направленной на подавление синтеза зеленого флуоресцирующего белка EGFP, проводили на клетках линии ВНK IR-780, стабильно экспрессирующих этот белок. В качестве мишени была выбрана мРНК, кодирующая белок EGFP, таким образом по уменьшению флуоресценции клеток, определяемой этим белком, можно судить об эффективности доставки siPHK в цитоплазму.
Клетки высаживали в 24-луночные планшеты (0.2×105 клеток на лунку для клеток ВНK IR-780) и культивировали в течение суток при 37°С в атмосфере, содержащей 5% CO2. Перед проведением трансфекции для экспериментов в присутствии или в отсутствие сыворотки среду в лунках заменяли на 200 мкл среды DMEM, содержащей 10% FBS, или DMEM, не содержащей сыворотку, соответственно. Раствор катионного амфифила (1) (10 мкМ) в среде OptiMEM смешивали с раствором siPHK (50 нМ) в этой же среде, полученные комплексы добавляли к клеткам и инкубировали в течение 72 ч. Через 4 часа среду в лунках со средой без сыворотки заменяли на DMEM с 10% сывороткой. По окончании инкубации клетки обрабатывали, как описано в примере 9. В таблице 4 представлены результаты по трансфекции клеток короткой интерферирующей РНК с катионным амфифилом (1), определенные по уровню снижения экспрессии белка EGFP.
| Таблица 4 | ||
| Концентрация липида, мкМ | Наличие 10% сыворотки в ростовой среде | Подавление экспрессии EGFP, % |
| 10 | - | 81.1 |
| + | 14,2 | |
Из приведенных данных видно, что катионный амфифил (1) в количестве, малотоксичном для клеток, способствует высокоэффективному проникновению siRNA в клетки, о чем свидетельствует подавление экспрессии заданного белка в отсутствие сыворотки в ростовой среде на 80%.
Таким образом, приведенные примеры однозначно указывают на способность предлагаемых углеводсодержащих катионных амфифилов эффективно способствовать проникновению нуклеиновых кислот в клетки млекопитающих, что позволяет использовать их в качестве агентов для доставки нуклеиновых кислот в клетки млекопитающих.
Источники информации
1. Non-viral Vectors for Gene Therapy, Part 1, Eds L.Huang, M.-C.Hung, E.Wagner, Elsevier, Amsterdam, 2005.
2. I.S.Zuhorn, J.B.F.N.Engberts, and D.Hoekstra, Eur. Biophys. J., 2007, 36, 349.
3. M.Morille, C.Passirani, A.Vonarbourg, A.Clavreul, and J.-P.Benoit, Biomaterials, 2008, 29, 3477.
4. M.Molas, A.G.Gómez-Valadés, A.Vidal-Alabró, M.Miguel-Turu, J.Bermudez, R.Bartrons, and J.C.Perales, Curr. Gene Ther., 2003, 3, 468.
5. B.Martin, M.Sainlos, A.Aissaoui, N.Oudrhiri, M.Hauchecorne, J.-P.Vigneron, J.-M.Lehn, and P.Lehn, Curr. Pharm. Design, 2005, 11, 375.
6. M.A.Mintzer and E.E.Simanek, Chem. Rev., 2009, 109, 259.
7. K.Kostarelos and A.D.Miller, Chem. Soc. Rev., 2005, 34, 970.
8. A.Murao, M.Nishikawa, C.Managit, J.Wong, S.Kawakami, F.Yamashita, and M.Hashida, Pharm. Res., 2002, 19, 1808.
9. K.Fabio, J.Gaucheron, C.Di Giorgio, and P.Vierling, Bioconjugate Chem., 2003, 14, 358.
10. M.Hashimoto, M.Morimoto, H.Saimoto, Y.Shigemasa, and T.Sato, Bioconjugate Chem., 2006, 17, 309.
11. R.Mukthavaram, S.Marepally, M.Y.Venkata, G.N.Vegi, R.Sistla, and A.Chaudhuri, Biomaterials, 2009, 30, 2369.
12. A.Düffels, L.G.Green, S.V.Ley, and A.D.Miller, Chem. Eur. J., 2000, 6, 1416.
13. Y.Higuchi, S.Kawakami, F.Yamashita, and M.Hashida, Biomaterials, 2007, 28, 532.
14. T.Masuda, H.Akita, T.Nishio, K.Niikura, K.Kogure, K.Ijiro, and H.Harashima, Biomaterials, 2008, 29, 709.
15.3. Я.Аль Шоэйби, Т.В.Андрюшина, Н.Г.Морозова, Г.А.Серебренникова, Биоорган. химия, 2003, 29, 323.
16. J.Herscovici, M.J.Egron, A.Quenot, F.Leclercq, N.Leforestier, N.Mignet, B.Wetzer, and D.Scherman, Org. Lett., 2001, 3, 1893.
17. M.А.Маслов, З.Я.Аль Шоэйби, Т.В.Андрюшина, Н.Г.Морозова, Г. А. Серебренникова, Биоорган. химия, 2007, 33, 538.
18. L.Wasungu, М.С.A.Stuart, М.Scarzello, J.В.F.N.Engberts, and D.Hoekstra, Biochim. Biophys. Acta, 2006, 1758, 1677.
19. C.Jacopin, H.Hofland, D.Scherman, and J.Herscovici, Bioorg. Med. Chem. Left, 2001, 11, 419.
20. E.Perouzel, M.R.Jorgensen, M.Keller, and A.D.Miller, Bioconjugate Chem., 2003, 14, 884
21. S.Horiuchi, and Y.Aoyama, J.Controlled Release, 2006, 116, 107.
22. P.Hawley-Nelson, V.Ciccarone, G.Geleyehu, J.Jesse, and P. L.Feigner, Focus, 15, 73.
23. A.c. 1428755 СССР. Способ получения н-алкил-β-D-гликозидов/ Толкач A.M., Полоник С.Г., Уварова Н.И.; 1988, Бюл. №37.
24. D.Proudnikov, A.Mirzabekov, Nucleic Acids Res. 1996, 24, 4535-4542.
Claims (1)
- Углеводсодержащие поликатионные амфифилы, представляющие собой тригидрохлориды rac-N-[6-(β-D-гликопиранозилокси)гексил]-N-[2,3-ди(тетрадецилокси)проп-1-ил]-4-[(12-амино-4,9-диазадодец-1-ил)амино-сукциниламино]бензолсульфонамида общей формулы:
где А - остаток 1,2-ди-О-тетрадецил-rac-глицерина, В - остаток галактозы (для (1)), лактозы (для (2)) и маннозы (для (3)), С - остаток спермина, n=6, m=2,
обладающие способностью доставлять нуклеиновые кислоты в клетки млекопитающих.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2009124773/04A RU2394834C1 (ru) | 2009-06-29 | 2009-06-29 | Углеводсодержащие катионные амфифилы, обладающие способностью доставлять нуклеиновые кислоты в клетки млекопитающих |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2009124773/04A RU2394834C1 (ru) | 2009-06-29 | 2009-06-29 | Углеводсодержащие катионные амфифилы, обладающие способностью доставлять нуклеиновые кислоты в клетки млекопитающих |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2394834C1 true RU2394834C1 (ru) | 2010-07-20 |
Family
ID=42685939
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2009124773/04A RU2394834C1 (ru) | 2009-06-29 | 2009-06-29 | Углеводсодержащие катионные амфифилы, обладающие способностью доставлять нуклеиновые кислоты в клетки млекопитающих |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2394834C1 (ru) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2618393C1 (ru) * | 2016-05-23 | 2017-05-03 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Московский технологический университет" | Липофильные полиамины с противоопухолевой активностью |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5783565A (en) * | 1994-12-09 | 1998-07-21 | Genzyme Corporation | Cationic amphiphiles containing spermine or spermidine cationic group for intracellular delivery of therapeutic molecules |
| RU2294738C2 (ru) * | 2001-07-30 | 2007-03-10 | Митсубиси Кемикэл Корпорейшн | Фармацевтическая композиция, содержащая липиды, которые несут полярный и неполярный фрагмент |
-
2009
- 2009-06-29 RU RU2009124773/04A patent/RU2394834C1/ru not_active IP Right Cessation
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5783565A (en) * | 1994-12-09 | 1998-07-21 | Genzyme Corporation | Cationic amphiphiles containing spermine or spermidine cationic group for intracellular delivery of therapeutic molecules |
| RU2294738C2 (ru) * | 2001-07-30 | 2007-03-10 | Митсубиси Кемикэл Корпорейшн | Фармацевтическая композиция, содержащая липиды, которые несут полярный и неполярный фрагмент |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Гришаева А.О., Маслов М.А., Морозова Н.Г. М.: Издательство МГУ; СП МЫСЛЬ, 2008. Секция "Химия", Подсекция "Цикл науки о живом", с.269 (см. http:www.lomonosov-msu.ru/archive/Lomonosov_2008/26_5.pdf. Seddon J.M. et al. Structure and phase behavior of synthetic glycolipids. 2nd Anglo-Japanese Seminar on Liquid Crystals, 2003, Pages: 313-320. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2618393C1 (ru) * | 2016-05-23 | 2017-05-03 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Московский технологический университет" | Липофильные полиамины с противоопухолевой активностью |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN110799492B (zh) | 用于递送核酸的新型羰基脂质和脂质纳米颗粒制剂 | |
| US6333433B1 (en) | Process for synthesis of novel cationic amphiphiles containing N-hydroxyalkl group for intracellular delivery of biologically active molecules | |
| EP2427472B1 (en) | Lipophilic polynucleotide conjugates | |
| JP6339884B2 (ja) | イミダゾール化合物およびそれを含有するリポソーム | |
| CN114929282B (zh) | 脱唾液酸糖蛋白受体介导的治疗活性缀合物的递送 | |
| US8987226B2 (en) | Modified single-stranded polynucleotides | |
| JP2012521358A (ja) | ポリアミン誘導体 | |
| CN119836414A (zh) | 用于脂质纳米颗粒制剂的脂质 | |
| US20070260055A1 (en) | Methods and compositions for the efficient delivery of therapeutic agents to cells and animals | |
| JP2007516233A (ja) | 核酸のトランスフェクションのための新規脂質 | |
| WO2018085962A1 (zh) | 一种碱基乙酰胺甘油醚分子，其化学合成方法及其在基因治疗领域的应用 | |
| Yue et al. | Synthesis of bifunctional molecules containing [12] aneN 3 and coumarin moieties as effective DNA condensation agents and new non-viral gene vectors | |
| RU2394834C1 (ru) | Углеводсодержащие катионные амфифилы, обладающие способностью доставлять нуклеиновые кислоты в клетки млекопитающих | |
| WO2011019942A2 (en) | Synthetic cholesterylamine-linker derivatives for agent delivery into cells | |
| Yang et al. | Synthesis and anti-HIV-1 activity of the conjugates of gossypol with oligopeptides and D-glucosamine | |
| CN105085292B (zh) | 3‑((2‑(二甲氨基)乙烷基)(甲基)氨基)丙酸的两亲性衍生物及其用途 | |
| Paul et al. | Synthesis and cell transfection properties of cationic uracil-morpholino tetramer | |
| KR20260005960A (ko) | 전신, 중추 신경계, 말초 신경계, 및 안구 전달을 위한 지질 기반 접합체 | |
| Mbatha et al. | Spacer length: A determining factor in the design of galactosyl ligands for hepatoma cell-specific liposomal gene delivery | |
| Zhang et al. | Development of 4, 4′-dibromobinaphthalene analogues with potent photo-inducible DNA cross-linking capability and cytotoxicity towards breast MDA-MB 468 cancer cells | |
| Gosangi et al. | Novel 1, 2, 3-triazolium-based dicationic amphiphiles synthesized using click-chemistry approach for efficient plasmid delivery | |
| CN105085437A (zh) | 3-(1-叔丁氧羰酰哌嗪-4-yl)丙酸的两亲性衍生物及其用途 | |
| FR2921668A1 (fr) | Nouvelles compositions lipophiles et leurs utilisations. | |
| He et al. | Design, synthesis and in vitro evaluation of d-glucose-based cationic glycolipids for gene delivery | |
| RU2610271C1 (ru) | Дисульфидный поликатионный амфифил, композиция на его основе с нейтральным фосфолипидом и способ ее получения |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD4A | Correction of name of patent owner | ||
| PC41 | Official registration of the transfer of exclusive right |
Effective date: 20120829 |
|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20190630 |