RU2377014C1

RU2377014C1 - Method for production of staphylococcic anatoxin-vaccine

Info

Publication number: RU2377014C1
Application number: RU2008117242/13A
Authority: RU
Inventors: Анатолий Алексеевич Евглевский (RU); Анатолий Алексеевич Евглевский; Дмитрий Анатольевич Евглевский (RU); Дмитрий Анатольевич Евглевский; Лариса Анатольевна Майстренко (RU); Лариса Анатольевна Майстренко
Original assignee: ФГОУ ВПО Курская государственная сельскохозяйственная академия им. профессора И.И. Иванова
Priority date: 2008-04-29
Filing date: 2008-04-29
Publication date: 2009-12-27

Abstract

FIELD: biotechnologies.

SUBSTANCE: invention is related to the field of microbiology and biotechnology. Method includes growing staphylococci on synthetic medium, sterilisation, detoxication of soluble toxins complex and sorption on aluminium hydroxide. Detoxifier used is 0.8±0.2% solution of etonium for performance of complete detoxication of 1.0-3.0 mg/ml of soluble staphylococcic toxins at 42-45°C for 10-12 days. Concentration of staphylococcic anatoxin-vaccine is increased twice by decantation of 50% of supernatant after sorption on aluminium hydroxide.

EFFECT: produced anatoxin-vaccine has high efficiency, is harmless.

4 ex

Description

Изобретение относится к микробиологии, в частности к технологии изготовления биопрепаратов для специфической профилактики и лечения болезней животных стафилококковой этиологии.The invention relates to microbiology, in particular to a technology for the manufacture of biological products for the specific prophylaxis and treatment of animal diseases of staphylococcal etiology.

Известные способы получения инактивированных (обезвреженных) анатоксинов и анатоксин-вакцин, аллергоидов (толерогенов), вакцин предусматривают детоксикацию токсинов и дезаллергизацию, инактивацию аллергенов, вирусов 0,5-1,0% раствором формалина или его производными (Бурчасов П.Н. «Руководство по вакцинному и сывороточному производству». М.: «Медицина», 1978, с.72-87).Known methods for producing inactivated (neutralized) toxoids and toxoids-vaccines, allergoids (tolerogens), vaccines include detoxification of toxins and deallergization, inactivation of allergens, viruses with 0.5-1.0% formalin solution or its derivatives (PN Bourchasov “Guide for vaccine and serum production. ”M.:“ Medicine ”, 1978, pp. 72-87).

В существующих руководствах, публикациях в основе получения стафилококкового анатоксина и анатоксин-вакцины используются мясо-гидролизатные и синтетические питательные среды для выращивания стафилококков с последующим автоклавированием и детоксикацией экзо- и эндотоксинов 0,8±0,2% раствором формалина. При этом установлено, что существуют генетически обусловленные различия в чувствительности к стафилококковой инфекции у разных пород и видов животных и людей, а лечебно-профилактическое действие анатоксина не всегда эффективно. Особенно это проявляется у стафилококковых энтеротоксинов и характеризуется не только антигенной специфичностью, термоустойчивостью, но и резистентностью к действиям трипсина, пепсина, формалина в диапазоне рН от 4,5 до 10,0.Existing guidelines, publications based on the production of staphylococcal toxoid and toxoid vaccine use meat-hydrolyzed and synthetic culture media for growing staphylococci, followed by autoclaving and detoxification of exo- and endotoxins with a 0.8 ± 0.2% formalin solution. It was found that there are genetically determined differences in sensitivity to staphylococcal infection in different breeds and species of animals and people, and the therapeutic and prophylactic effect of toxoid is not always effective. This is especially evident in staphylococcal enterotoxins and is characterized not only by antigenic specificity, heat resistance, but also resistance to the effects of trypsin, pepsin, formalin in the pH range from 4.5 to 10.0.

Установлено, что стафилококковые энтеротоксины - это сильнейшие пищевые токсины, а по составу являются низкомолекулярными белками с молекулярной массой от 26 до 34 Кд со свойствами суперантигенов, устойчивые к действию формалина, и соответственно не могут быть превращены в анатоксины.It has been established that staphylococcal enterotoxins are the strongest food toxins, and in composition they are low molecular weight proteins with a molecular weight of 26 to 34 cd with superantigens that are resistant to formalin and therefore cannot be converted to toxoids.

За прототип взят «Способ получения стафилококковой анатоксин-вакцины», Евглевский Ан.А., патент РФ на изобретение №2229893, от 10 июня 2004 г., включающий выращивание стафилококков на синтетической среде, стерилизацию и детоксикацию токсинов 0,8±0,2% раствором формалина.The prototype is “A method for producing a staphylococcal toxoid vaccine”, Evgeny An.A., RF patent for the invention No. 2229893, dated June 10, 2004, including the cultivation of staphylococci on a synthetic medium, sterilization and detoxification of toxins 0.8 ± 0.2 % formalin solution.

Недостатком способа является проведение детоксикации стафилококковых экзо- и эндотоксинов с помощью 0,8% раствора формалина, который практически не обеспечивает детоксикацию стафилококковых суперэнтеротоксинов и соответственно не превращает их в анатоксины (Коротяев А.И., Бабичев С.А. «Медицинская микробиология, иммунология и вирусология». СПб.:, «Специальная литература», 1998, с.333).The disadvantage of this method is the detoxification of staphylococcal exo- and endotoxins with a 0.8% formalin solution, which practically does not detoxify staphylococcal superenterotoxins and, accordingly, does not turn them into toxoids (Korotyaev A.I., Babichev S.A. “Medical Microbiology, Immunology and virology. ”St. Petersburg:“ Special Literature ”, 1998, p.333).

До настоящего времени не обнаружены сведения о замене формалина или его производных на другие эффективные детоксикаторы при детоксикации стафилококковых экзо-, эндотоксинов и энтеротоксинов при изготовлении стафилококковых анатоксина или анатоксин-вакцины.To date, no information has been found on the replacement of formalin or its derivatives with other effective detoxifiers in the detoxification of staphylococcal exo-, endotoxins and enterotoxins in the manufacture of staphylococcal toxoid or toxoid vaccine.

Целью предлагаемого изобретения является повышение эффективности и безопасности анатоксин-вакцины посредством полной детоксикации при замене 0,8% раствора формалина на детоксикатор, обеспечивающий детоксикацию стафилококковых экзо-, эндо- и суперэнтеротоксинов при получении стафилококкового анатоксина или анатоксин-вакцины, обладающей широким спектром действия для эффективной профилактики и лечения болезней стафилококковой этиологии.The aim of the invention is to increase the efficiency and safety of the toxoid vaccine through complete detoxification when replacing a 0.8% formalin solution with a detoxifier that detoxifies staphylococcal exo-, endo- and superenterotoxins upon receipt of a staphylococcal toxoid or toxoid vaccine with a wide spectrum of action for effective prevention and treatment of diseases of staphylococcal etiology.

Поставленная цель достигается путем использования 0,8±0,2% раствора этония (1,2-этилен-бис-(N-диметилкарбдецилоксиметил) аммония дихлорид - бисчетвертичное аммониевое соединение), обеспечивающего стабильную и полную детоксикацию стафилококковых экзо-, эндотоксинов и суперэнтеротоксинов при 40-45°С в течение 10-12 суток после 12-15-суточного выращивания стафилококков на синтетической среде до 10±0,1 миллиардной взвеси микроорганизмов в 1 мл при концентрации растворимого (молекулярного) комплекса токсинов 1-3 мг/мл, содержащего протеины, липиды, РНК, ДНК и полисахариды, сорбцией на гидроксиде алюминия из расчета 1-3 мг/мл и декантацией 50% надосадочной жидкости.The goal is achieved by using a 0.8 ± 0.2% solution of ethonium (1,2-ethylene-bis- (N-dimethylcarbdecyloxymethyl) ammonium dichloride - bis-quaternary ammonium compound), which provides stable and complete detoxification of staphylococcal exo-, endotoxins and superenterotoxins during 40-45 ° C for 10-12 days after 12-15 days of growing staphylococci on a synthetic medium up to 10 ± 0.1 billion microorganisms in 1 ml suspension at a concentration of a soluble (molecular) complex of toxins 1-3 mg / ml containing proteins, lipids, RNA, D K and polysaccharides sorption on aluminum hydroxide at the rate of 1-3 mg / ml and 50% by decanting supernatant.

В патентной и научно-технической литературе не выявлены технические решения, аналогичные заявленному с использованием этония.In the patent and scientific and technical literature, no technical solutions similar to those declared using ethony have been identified.

Только применение 0,8±0,2% раствора этония в предложенном режиме позволяет достичь технического эффекта, т.е. полной детоксикации стафилококковых токсинов и получения эффективной анатоксин-вакцины широкого спектра действия.Only the use of a 0.8 ± 0.2% ethonium solution in the proposed mode allows to achieve a technical effect, i.e. complete detoxification of staphylococcal toxins and obtaining an effective broad-spectrum toxoid vaccine.

Нами установлена не только возможность полной детоксикации всего комплекса стафилококковых токсинов с помощью этония, но и определена его концентрация, температурный, временной режим и схема технологического процесса для получения анатоксин-вакцины в промышленных условиях.We have established not only the possibility of complete detoxification of the entire complex of staphylococcal toxins with the help of etonium, but also determined its concentration, temperature, time regime and process scheme for the production of toxoid vaccines in industrial conditions.

Предлагаемое изобретение иллюстрируется следующими примерами.The invention is illustrated by the following examples.

Пример 1. Получение стафилококковой анатоксин-вакцины и изучение лечебно-профилактической эффективности CAB при стафилококкозе птиц.Example 1. Obtaining a staphylococcal toxoid vaccine and the study of the therapeutic and prophylactic efficacy of CAB in staphylococcosis of birds.

Выращенные на жидкой синтетической среде золотистые стафилококки в 2-литровых биобутылях с объемом среды, равным 1 литру, до концентрации микроорганизмов 10-12 млрд/мл, подвергнуты стерилизации при 1,0 атм в течение 30 минут, а затем детоксикации 0,8% раствором этония при 42-45С° в течение 12 суток. Перед аэрозольным распылением к общему объему стафилококковой анатоксин-вакцины добавлялся гидроксид алюминия из расчета 3 мг на 1 мл препарата. Для профилактики стафилококкоза птиц провели 2-кратное аэрозольное распыление стафилококковой анатоксин-вакцины с интервалом 7 дней по 1 литру на один птичник с объемом 5000 м³ с 40 тысячами цыплят 15-дневного возраста. Сохранность вакцинированной птицы составила 97%, а увеличение привесов - 10-12%.Golden staphylococci grown on a liquid synthetic medium in 2-liter bio-bottles with a volume of medium equal to 1 liter, to a concentration of microorganisms of 10-12 billion / ml, were sterilized at 1.0 atm for 30 minutes, and then detoxified with a 0.8% solution ethonia at 42-45 ° C for 12 days. Before aerosol spraying, aluminum hydroxide was added to the total volume of the staphylococcal toxoid vaccine at the rate of 3 mg per 1 ml of the drug. For the prevention of bird staphylococcosis, a 2-fold aerosol spray of staphylococcal toxoid vaccine was carried out with an interval of 7 days, 1 liter per chicken house with a volume of 5000 m ³ with 40 thousand chickens of 15 days of age. The safety of the vaccinated bird was 97%, and the increase in weight gain was 10-12%.

В птичниках, где не проводилась аэрозольная вакцинация, падеж птицы составлял 50±10%.In poultry houses where aerosol vaccination was not carried out, the mortality rate was 50 ± 10%.

Присутствующий персонал и ветспециалисты не ощущали вредного воздействия.The present staff and veterinarians did not feel any harmful effects.

Пример 2. Испытание профилактической эффективности анатоксин-вакцины на собаках.Example 2. Testing the prophylactic efficacy of toxoid vaccine in dogs.

В исследованиях использовано 18 беспородных щенков 1,5-2,5-месячного возраста путем двукратной подкожной вакцинации препарата в дозе 1,5-2,0 мл с интервалом 15 суток. Через 20 дней после 2-й вакцинации все щенки, в т.ч. 6 контрольных невакцинированных, были заражены смесью 2-х вирулентных штаммов стафилококков в дозе 5-6 млрд микробных клеток. Наблюдение за животными проводили в течение 15 суток. После заражения все вакцинированные животные не заболели, а у контрольных отмечались поражения, характерные для стафилококкоза.The studies used 18 outbred puppies of 1.5-2.5 months of age by double subcutaneous vaccination of the drug in a dose of 1.5-2.0 ml with an interval of 15 days. 20 days after the 2nd vaccination, all puppies, incl. 6 control unvaccinated, were infected with a mixture of 2 virulent strains of staphylococci at a dose of 5-6 billion microbial cells. Observation of animals was carried out for 15 days. After infection, all vaccinated animals did not get sick, and the control showed lesions characteristic of staphylococcosis.

Пример 3. Определение профилактической эффективности стафилококковой анатоксин-вакцины по истечении 2-х и 3-х лет хранения.Example 3. Determination of the prophylactic efficacy of staphylococcal toxoid vaccine after 2 and 3 years of storage.

Исследования проводили с использованием 4-х щенков 3-5 месячного возраста, которые подвергались двукратной иммунизации, а затем заражению живыми стафилококками аналогично действиям, указанным в примере №2.The studies were carried out using 4 puppies of 3-5 months of age, which were subjected to double immunization, and then infected with live staphylococci similar to the actions specified in example No. 2.

Испытания стафилококковой анатоксин-вакцины после 2-х и 3-х годичного хранения не выявили снижения профилактической эффективности.Tests of staphylococcal toxoid vaccine after 2 and 3 year storage did not reveal a decrease in prophylactic efficacy.

Пример 4. Испытание на остаточную токсичность и безвредность.Example 4. Test for residual toxicity and harmlessness.

Испытание проводили на 6 телятах, 8 поросятах и 10 курах путем одновременного подкожного и внутримышечного введения по 15-20 мл стафилококковой анатоксин-вакцины. Все животные в течение 10 дней остались живыми и не имели клинически выраженных проявлений.The test was carried out on 6 calves, 8 pigs and 10 chickens by simultaneous subcutaneous and intramuscular administration of 15-20 ml of staphylococcal toxoid vaccine. All animals remained alive for 10 days and did not have clinically pronounced manifestations.

Представленные примеры подтверждают высокое качество и безвредность стафилококковой анатоксин-вакцины, полученной заявленным способом.The presented examples confirm the high quality and safety of the staphylococcal toxoid vaccine obtained by the claimed method.

Claims

A method of producing a staphylococcal toxoid vaccine, comprising growing staphylococci on a synthetic medium, sterilizing and detoxifying a complex of soluble toxins (exo, endo, and superenterotoxins) in suspension with autoclaved staphylococci, sorption on aluminum hydroxide, characterized in that 0 is used as a detoxifier An 8 ± 0.2% etonia solution for complete detoxification of 1.0-3.0 mg / ml of soluble staphylococcal toxins at 42-45 ° C for 10-12 days, and the concentration of staphylococcal toxoid vaccine is increased ichivayut decantation twice the 50% supernatant after adsorption to aluminum hydroxide.