RU2370534C2

RU2370534C2 - Method and bioreactor of cultivation and stimulation of three-dimensional viable cell transplants resistant to mechanical load

Info

Publication number: RU2370534C2
Application number: RU2006117360/13A
Authority: RU
Inventors: Ронни ШУЛЬЦ (DE); Ронни ШУЛЬЦ; Аугустинус БАДЕР (DE); Аугустинус БАДЕР
Original assignee: Др. АУГУСТИНУС БАДЕР
Priority date: 2003-10-21
Filing date: 2004-10-19
Publication date: 2009-10-20
Also published as: DE10349484A1; CA2543374A1; CN1898375A; RU2006117360A; JP2007508830A; WO2005040332A3; EP1675939A2; WO2005040332A2

Abstract

FIELD: medicine.

SUBSTANCE: connective or supporting tissue cells fit for transplantation are cultivated in bioreactor (1) which includes main case closed by sterile sealing cap (21) and forms at least one reactor space where transplant surface (11) and mini actuator (14) are placed. Bioreactor (1) is equipped with at least two coupling connections for hoses (19) of nutrient medium and gas feed and discharge.

EFFECT: obtaining cells with mechanical endurance to self-tissue transplantation for application as substitute tissue in treatment of connective and supporting tissues, direct injury of joints, rheumatism and degenerative diseases of joints.

22 cl, 27 dwg, 11 ex

Description

Изобретение касается способа и порядка соответствующего GMP (Good Manufactoring Practice = хорошей производственной практике) получения трехмерных, жизнеспособных и стойких к механическим нагрузкам клеточных культур, преимущественно опорной структуры клеточных конструкций, которые при этом могут культивироваться и стимулироваться новым способом в замкнутом биологическом миниреакторе одновременно, последовательно или с временным управлением. Эти выращенные таким образом трансплантаты могут использоваться в качестве тканезаменителей для лечения, например, дефектов соединительных и опорных тканей, прямой травмы суставов, ревматизма и дегенеративных заболеваний суставов и служить, например, при артрозе коленного сустава альтернативой обычным (оперативным) методам лечения как, например, микрофрактурирование или надсверливание.The invention relates to a method and procedure corresponding to GMP (Good Manufacturing Practice = Good Manufacturing Practice) for producing three-dimensional, viable and mechanical-resistant cell cultures, mainly the supporting structure of cell structures, which can be cultivated and stimulated in a new way in a closed biological mini-reactor simultaneously, sequentially or with interim management. These transplants grown in this way can be used as tissue substitutes for the treatment of, for example, defects in connective and supporting tissues, direct joint trauma, rheumatism and degenerative joint diseases and serve, for example, in case of arthrosis of the knee joint, as an alternative to conventional (surgical) treatment methods, such as microfracturing or drilling.

Tissue Engineering, занимающаяся прежде всего размножением «in-vitro» гомологичного, так называемого аутологичного клеточного материала пытается вырастить функциональные замещающие клеточные и тканевые структуры, которые могут быть использованы для трансплантации в поврежденные ткани. Tissue Engineering, primarily engaged in the propagation of in-vitro homologous, so-called autologous cellular material, is trying to grow functional replacement cell and tissue structures that can be used for transplantation into damaged tissues.

Для этого в лаборатории происходит обычное размножение клеточных культур (например, суставно-опорной клеточной структуры). Собственно размножение этих клеток (например, хондроцитов) происходит в однослойной культуре на дне сосуда или чаши согласно стандартным протоколам, предусматривающим также применение специфических для тканей факторов роста, медиаторов и индукторов. For this, the usual reproduction of cell cultures (for example, articular-supporting cell structure) takes place in the laboratory. The actual reproduction of these cells (for example, chondrocytes) occurs in a single-layer culture at the bottom of the vessel or bowl according to standard protocols, which also provide for the use of tissue-specific growth factors, mediators and inducers.

Целью этих аддитивных факторов является, например, активация особой способности хрящевых клеток синтезировать достаточное количество внеклеточных матричных компонентов (EZM), чтобы при размножении «in-vitro» получить массовое соотношение 1% хондроцитов к 99% внеклеточных матричных компонентов, присущее функциональным суставным хрящам (Stockwell RA: The cell density of human articular and costal cartilage. J Anat. 1967; 101(4):753-763; Hamerman D, Schubert M: Diarthrodial joints, an essay. Amer J Med. 1962; 33:555-590).The purpose of these additive factors is, for example, to activate the special ability of cartilage cells to synthesize a sufficient amount of extracellular matrix components (EZM) in order to obtain a mass ratio of 1% chondrocytes to 99% of extracellular matrix components inherent in functional articular cartilages during in-vitro propagation (Stockwell RA: The cell density of human articular and costal cartilage. J Anat. 1967; 101 (4): 753-763; Hamerman D, Schubert M: Diarthrodial joints, an essay. Amer J Med. 1962; 33: 555-590) .

Так как этого невозможно добиться простой добавкой дополнительной среды, предпринимается попытка различным способом возбудить/стимулировать эти хондроциты для выращивания в лабораторных условиях подходящего аутологичного (гиалинового) заменителя опорной структуры с высокой степенью дифференцировки.Since this cannot be achieved by simple addition of additional medium, an attempt is made to excite / stimulate these chondrocytes in a different way to grow in laboratory conditions a suitable autologous (hyaline) substitute for the supporting structure with a high degree of differentiation.

Описанное размножение клеточных культур и выращивание тканезамещающих структур связано с целым рядом недостатков. The described reproduction of cell cultures and the growth of tissue-replacing structures are associated with a number of disadvantages.

Это пассивное культивирование культур хрящевых клеток в двухмерной поверхностной структуре в простой чаше, покрытой питательной средой, не демонстрирует признаков активной стимуляции способных к дифференцировке хондроцитов. This passive cultivation of cartilage cell cultures in a two-dimensional surface structure in a simple bowl coated with a nutrient medium does not show signs of active stimulation of chondrocytes capable of differentiation.

Из работы Минута В.В, Клота С., Айгнера И. и Штайнера П. (Minuth, W.W., Kloth S., Aigner J., Steiner P.: MINUSHEET-Perfusionskultur: Stimulierung eines gewebetypischen Milieus. Bioscope 1995; 4:20-25) известна концепция, пытающаяся обойти этот недостаток путем внесения клеточного материала пациента в искусственную структуру-носитель, по своим биофизическим свойствам похожую на хондроциты и допускающую сетеподобное соединение между многослойно расположенными клетками, с последующим перфузионным выращиванием в соответствующем биологическом реакторе. В ходе многочисленных экспериментов была продемонстрирована повышенная дифференцирующая способность клеток благодаря синтезу внеклеточных матричных компонентов, объясняемая трехмерным культивированием хондроцитов в различных биосовместимых и биологически ресорбируемых матрицах, как, например, гидрогели, альгинаты, агарозы (Benya and Shaffer: Dedifferentiated chondrocytes reexpress the differentiated collagen phenotype when cultured in agarose gels. Cell. 1982; 30:215-224).From the work of Minut V.V., Clot S., Aigner I. and Steiner P. (Minuth, WW, Kloth S., Aigner J., Steiner P .: MINUSHEET-Perfusionskultur: Stimulierung eines gewebetypischen Milieus. Bioscope 1995; 4:20 -25) a concept is known that tries to circumvent this drawback by introducing the patient’s cellular material into an artificial carrier structure, similar in its biophysical properties to chondrocytes and allowing a network-like connection between multilayer cells, followed by perfusion growth in an appropriate biological reactor. Numerous experiments have demonstrated increased differentiating ability of cells due to the synthesis of extracellular matrix components, explained by the three-dimensional cultivation of chondrocytes in various biocompatible and biologically resorbable matrices, such as hydrogels, alginates, agaroses (Benya and Shaffer: Dedifferentiated chondrocytes reexpress the differentiated collagenoph cultured in agarose gels. Cell. 1982; 30: 215-224).

Полученное таким образом пространство имитирует оригинальные условия существования хондроцитов в живой ткани, например в коленном и бедренном суставах, и является, тем самым, выгодной адаптацией условий выращивания к условиям «in-vivo».The space thus obtained imitates the original conditions for the existence of chondrocytes in living tissue, for example, in the knee and thigh joints, and is thus a beneficial adaptation of the growing conditions to in-vivo conditions.

При контактном поверхностном выращивании клеток достаточное снабжение питательной средой обеспечивается относительно просто, так как питательные вещества находятся непосредственно над или рядом с клетками и допускают прямой диффузионный обмен веществ. И напротив, при использовании трехмерных матриц с клетками при статичной схеме культивирования возникают спады или градиенты концентрации, которые могут ограничить транспортировку материала в медиальные регионы конструкции и препятствуют, тем самым, оптимальному наличию питательных веществ для клеточных связей. In contact surface cell growth, a sufficient supply of a nutrient medium is relatively simple, since the nutrients are directly above or near the cells and allow direct diffusion metabolism. Conversely, when using three-dimensional matrices with cells in a static cultivation pattern, there are drops or concentration gradients that can limit the transport of material to the medial regions of the construct and thereby hinder the optimal availability of nutrients for cell connections.

Этому эффекту, оказывающему негативное влияние на выращивание клеточного материала в пространственных несущих матрицах, противодействуют путем перфузии/трансфузии среды сквозь конструкт. This effect, which has a negative effect on the growth of cellular material in spatial supporting matrices, is counteracted by perfusion / transfusion of the medium through the construct.

Этот активный процесс в несущей структуре обеспечивает гомогенное снабжение клеток питательными веществами и постоянное удаление метаболитов от хондроцитов. Кроме того, динамическая схема культивирования создает более высокое поступление газа и стимулирует клеточные связи в зависимости от выбранного перфузионного потока среды механически в мкПа благодаря возникающему при этом срезающему усилию (Raimondi, M.T., F. Boschetti, et al.: Mechanobiology of engineered cartilage cultured under a quantified fluid-dynamic environment. Biomechan Model Mechanobiol. 2002; 1:69-82).This active process in the supporting structure ensures a homogeneous supply of cells with nutrients and the constant removal of metabolites from chondrocytes. In addition, the dynamic cultivation pattern creates a higher gas flow and stimulates cellular connections depending on the selected perfusion flow of the medium mechanically in μPa due to the shearing force arising from this (Raimondi, MT, F. Boschetti, et al .: Mechanobiology of engineered cartilage cultured under a quantified fluid-dynamic environment. Biomechan Model Mechanobiol. 2002; 1: 69-82).

Еще одним недостатком процесса размножения клеток и создания трансплантата является отсутствие абсолютной стерильности системы "сосуд с клеточной культурой". Даже рутинные процедуры, например замена среды, высев клеток или их сбор, связаны с повышенной инфекционной опасностью для находящихся в сосуде клеточных структур, так как сосуд приходится открывать, а работа в режиме «Laminar Flow-Workbench» (ламинарная проточная система) не гарантирует 100-процентной стерильности окружающей среды в смысле „Основных правил Всемирной организации здравоохранения для изготовления лекарственных средств и обеспечения их качества“ (Good Manufacturing Practice - директива Всемирной организации здравоохранения (WHO)).Another disadvantage of the process of cell reproduction and the creation of a graft is the lack of absolute sterility of the "vessel with cell culture" system. Even routine procedures, such as replacing the medium, seeding cells or collecting them, are associated with increased infectious danger for the cell structures in the vessel, since the vessel has to be opened, and operation in the Laminar Flow-Workbench mode (laminar flow system) does not guarantee 100 -percent sterility of the environment in the sense of the "Basic rules of the World Health Organization for the manufacture of medicines and ensure their quality" (Good Manufacturing Practice - directive of the World Health Organization (WHO)).

Далее, в этой пассивной системе не обеспечивается максимальный газообмен через открытую для диффузии крышку, а также через питательную среду к находящемуся на дне слою клеток. Further, in this passive system, maximum gas exchange is not ensured through the lid open for diffusion, and also through the nutrient medium to the layer of cells located at the bottom.

Для того чтобы избежать этих присущих сосудам с культурой недостатков, в последние годы форсированными темпами велись работы по разработке автоматизированных закрытых биореакторных систем для создания тканезамещающих структур. Эти системы (Freed und Vunjak-Novakovic: Microgravity tissue engineering. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 1997; 33:381-385) могут предложить преимущество стерильного контролируемого культивирования и стимуляции трехмерных трансплантатов. Путем комбинации Tissue Engineerings с возможностями биотехнологии создается возможность для контроля и управления отдельными параметрами выращивания, например обработкой CO₂ и O₂, температурой, заменой культуральной среды, отбором проб и т.п. в биореакторных системах. (Obradovic, Carrier, Vunjak-Novakovic and Freed: Gas exchange is essential for bioreactor cultivation of tissue engineered cartilage. Biotechnol Bioeng. 1999; 63:197-205).In order to avoid these inherent disadvantages of culture vessels, in recent years, efforts have been made to develop automated closed bioreactor systems to create tissue-replacing structures at an accelerated pace. These systems (Freed und Vunjak-Novakovic: Microgravity tissue engineering. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 1997; 33: 381-385) may offer the advantage of sterile controlled culture and stimulation of three-dimensional grafts. By combining Tissue Engineerings with the capabilities of biotechnology, it is possible to control and manage individual growing parameters, for example, processing CO ₂ and O ₂ , temperature, replacing the culture medium, sampling, etc. in bioreactor systems. (Obradovic, Carrier, Vunjak-Novakovic and Freed: Gas exchange is essential for bioreactor cultivation of tissue engineered cartilage. Biotechnol Bioeng. 1999; 63: 197-205).

При конструировании биореакторов всегда большое значение уделяется хорошо продуманной системе, дающей возможность искусственно регулировать процессы. Когда речь идет о выращивании определенной ткани, система биореактора должна быть в состоянии как можно точнее воспроизводить физиологические условия и процессы «in vivo». Каждая биореакторная система воздействует на выращиваемый материал по меньшей мере одним видом механического воздействия.When designing bioreactors, great attention is always paid to a well-designed system that makes it possible to artificially regulate processes. When it comes to growing a specific tissue, the bioreactor system must be able to reproduce the physiological conditions and in vivo processes as accurately as possible. Each bioreactor system acts on the cultivated material with at least one type of mechanical impact.

Соединение позитивных качеств управляемого биореакторного выращивания аутологичных тканезаменителей в биогенной матрице со стимуляцией перфузии в культуральной среде является поэтому логичным действием по обеспечению автоматизированного, стерильного и отвечающего требованиям GMP выращивания трансплантата для получения, например жизнеспособных хондроцитов с повышенной способностью к синтезу внеклеточных матричных компонентов.The combination of the positive qualities of controlled bioreactor cultivation of autologous tissue substitutes in a biogenic matrix with stimulation of perfusion in the culture medium is therefore a logical step in providing automated, sterile and GMP-compliant graft growth to obtain, for example, viable chondrocytes with increased ability to synthesize extracellular matrix components.

Из немецкого патента DE 4306661 A1 и работы Зиттингера М., Буйа Й., Минута В.В., Хаммера К. и Бурместера ГР. (Sittinger M, Bujia J, Minuth WW, Hammer C, Burmester GR: Engineering of cartilage tissue using bioresorbable polymer carriers in perfusion culture. Biomaterials. 1994; 15(6):451-456) известен перфузионный реактор, в котором клетки помещены в слой полимера и дополнительно окружены капсулой агарозы. Через этот цилиндрический стеклянный реактор со скоростью 0,016 мл/мин пропускается питательная среда. Сам реактор расположен в соответствующем инкубаторе, в котором созданы стандартные условия. Стерильные фильтры в емкости с питательной средой обеспечивают газообмен с окружающим воздухом. From the German patent DE 4306661 A1 and the work of Sittinger M., Buyer J., Minut V.V., Hammer K. and Burmester GR. (Sittinger M, Bujia J, Minuth WW, Hammer C, Burmester GR: Engineering of cartilage tissue using bioresorbable polymer carriers in perfusion culture. Biomaterials. 1994; 15 (6): 451-456) a perfusion reactor is known in which cells are placed in a layer of polymer and additionally surrounded by an agarose capsule. A nutrient medium is passed through this cylindrical glass reactor at a rate of 0.016 ml / min. The reactor itself is located in an appropriate incubator in which standard conditions are created. Sterile filters in a container with a nutrient medium provide gas exchange with the surrounding air.

В ходе дальнейших экспериментов с этими типами реакторов были применены сополимерные среды из слоев викрила и полидиоксанона, пропитанных поли-L-лизином или коллагенными волокнами типа II (Bujia J, Rotter N, Minuth W, Burmester G, Hammer C, Sittinger M: Cultivation of human cartilage tissue in a 3-dimensional perfusion culture chamber: characterization of collagen synthesis. Laryngorhinootologie. 1995; 74(9): 559-563 и Kreklau B, Sittinger M, Mensing MB, Voigt C, Berger G, Burmester GR, Rahmanzadeh R, Gross U: Tissue engineering of biphasic joint cartilage transplants. Biomaterials. 1999; 20(18):1743-1749). В эти слои были внедрены человеческие хондроциты, которые затем выращивались в течение двух недель в условиях перфузии. С применением закрепленной на карбонате кальция двухфазной модели из сополимера полигликолевой кислоты и поли-L-лактоновой кислоты (этикон) временной промежуток был увеличен до 70 дней.In further experiments with these types of reactors, copolymer media of vicryl and polydioxanone layers impregnated with poly-L-lysine or type II collagen fibers were used (Bujia J, Rotter N, Minuth W, Burmester G, Hammer C, Sittinger M: Cultivation of human cartilage tissue in a 3-dimensional perfusion culture chamber: characterization of collagen synthesis. Laryngorhinootologie. 1995; 74 (9): 559-563 and Kreklau B, Sittinger M, Mensing MB, Voigt C, Berger G, Burmester GR, Rahmanzadeh R , Gross U: Tissue engineering of biphasic joint cartilage transplants. Biomaterials. 1999; 20 (18): 1743-1749). Human chondrocytes were introduced into these layers, which were then grown for two weeks under perfusion conditions. Using a two-phase model fixed on calcium carbonate from a copolymer of polyglycolic acid and poly-L-lactonic acid (ethicon), the time interval was increased to 70 days.

Еще одна очень похожая на вышеописанный перфузионный биореактор система была сконструирована Мицуно С., Аллеманом Ф. и Гловацки Е. (Mizuno S, Allemann F, Glowacki J: Effects of medium perfusion on matrix production by bovine chondrocytes in three-dimensional collagen sponges. J Biomed Mater Res. 2001; 56(3):368-375). В противоположность уже описанному реактору, эта система имеет закрытую зону для искусственной питательной среды. Большая часть выращиваемого материала находится в стеклянной цилиндрической колонке шириной 1 см и длиной 10 см. Колонка заполнена многочисленными клеточными/полимерными ячейками размером 7Ч15 мм, не имеющими дополнительной капсулы. Искусственная питательная среда из питающей емкости со скоростью 300 мкл в минуту пропускается через колонку и всю систему. С помощью этой системы проводится испытание хондроцитов крупного рогатого скота в коллагеновых губках на их реакцию на перфузию в ходе выращивания в течение 15 дней. Another system very similar to the perfusion bioreactor described above was designed by Mitsuno S., Alleman F. and Glowacki E. (Mizuno S, Allemann F, Glowacki J: Effects of medium perfusion on matrix production by bovine chondrocytes in three-dimensional collagen sponges. J Biomed Mater Res. 2001; 56 (3): 368-375). In contrast to the reactor already described, this system has a closed zone for an artificial nutrient medium. Most of the grown material is in a glass cylindrical column 1 cm wide and 10 cm long. The column is filled with numerous 7 × 15 mm cell / polymer cells that do not have an additional capsule. Artificial nutrient medium from a supply tank with a speed of 300 μl per minute is passed through the column and the entire system. Using this system, cattle chondrocytes in collagen sponges are tested for their reaction to perfusion during growing for 15 days.

Из патента США 5928945 также известно биореакторное устройство, в котором сросшиеся хондроциты подвергаются в камере определенным потокам и срезающим усилиям для определения усиленного синтеза коллагена типа II.A bioreactor device is also known from US Pat. No. 5,928,945, in which fused chondrocytes are subjected to certain flows and shear forces in the chamber to determine enhanced synthesis of type II collagen.

Параллельно разработке перфузионных реакторов исследовательские группы занимались проектированием биореакторов, оказывающих различные нагрузки на эксплантаты, клеточные пробы или клеточные/полимерные структуры. При проектировании биореакторов со стимуляцией опорной клеточной структуры их конструкция ориентирована на реализацию механических нажимных пуансонов или аналогичных устройств, оказывающих одноосевое давление на хрящевые трансплантаты для имитации важнейших форм нагрузки на человеческую хрящевую ткань. Конструкции многих таких систем давления отличаются большим сходством.In parallel with the development of perfusion reactors, research groups have been designing bioreactors that exert various loads on explants, cell samples, or cell / polymer structures. When designing bioreactors with stimulation of the supporting cell structure, their design is focused on the implementation of mechanical pressure punches or similar devices that exert uniaxial pressure on cartilage grafts to simulate the most important forms of load on human cartilage tissue. The designs of many such pressure systems are very similar.

Камера давления одной из таких систем, разработанной Штайнмайером Й., Торцилли ПА., Бартеном-Вурстеном Н. и Лустом Г. (Steinmeyer J, Torzilli PA, Burton-Wurster N, Lust G: A new pressure chamber to study the biosynthetic response of articular cartilage to mechanical loading. Res Exp Med (Berl). 1993, 193(3):137-142), состоит из титанового корпуса, покрытого внутри слоем полиэтилена. Опытный экземпляр с максимальным диаметром 10 мм может размещаться в сосуде на дне камеры и покрываться слоем искусственной питательной среды объемом 7 мл. Так как модель не имеет перфузионной системы искусственной культуральной среды, возможно только периодическое воспроизводство давления в течение короткого времени выращивания. Воспроизводящая нагрузки система, оказывающая необходимое давление на опытный экземпляр, состоит из проходящего через запор камеры пористого тигеля и приводится в движение с помощью обычных грузов или пневматического цилиндра с создающим давление поршнем, расположенным над камерой.The pressure chamber of one of these systems developed by Steinmeier J., Torzilli PA., Barten-Wursten N. and Lust G. (Steinmeyer J, Torzilli PA, Burton-Wurster N, Lust G: A new pressure chamber to study the biosynthetic response of articular cartilage to mechanical loading. Res Exp Med (Berl. 1993, 193 (3): 137-142), consists of a titanium case coated inside with a layer of polyethylene. A prototype with a maximum diameter of 10 mm can be placed in a vessel at the bottom of the chamber and covered with a layer of artificial nutrient medium with a volume of 7 ml. Since the model does not have a perfusion system of an artificial culture medium, only periodic reproduction of pressure during a short growing time is possible. The load-reproducing system, which exerts the necessary pressure on the prototype, consists of a porous crucible passing through the chamber lock and is driven by ordinary weights or a pneumatic cylinder with a pressure-generating piston located above the chamber.

Также и описанная Ли ДА и Бадером ДЛ (Lee DA, Bader DL: Compressive strains at physiological frequencies influence the metabolism of chondrocytes seeded in agarose. J Orthop Res. 1997; 15(2):181-188) система с приводом в состоянии оказывать давление одновременно на 24 опытных экземпляра. Привод установлен на окружающей инкубатор раме и передает усилие вниз к загрузочной панели внутри стерильного бокса. Загрузочная панель изготовлена из стали и оснащена 24 стальными болтами с насечкой из органического стекла диаметром 11 мм. Привод создает различные нагрузки в зависимости от степени деформации. Эта система применяется для двухдневного культивирования хондроцитов крупного рогатого скота/структур агарозы. Создаются статические и дополнительные циклические нагрузки (от 0,3 до 3 Гц) с максимальной амплитудой 15%.Also described by Lee DA and Bader DL (Compressive strains at physiological frequencies influence the metabolism of chondrocytes seeded in agarose. J Orthop Res. 1997; 15 (2): 181-188) a drive system is able to provide pressure at the same time on 24 prototypes. The drive is mounted on the frame surrounding the incubator and transfers the force down to the loading panel inside the sterile box. The loading panel is made of steel and equipped with 24 steel bolts with a notch of organic glass with a diameter of 11 mm. The drive creates various loads depending on the degree of deformation. This system is used for a two-day cultivation of cattle chondrocytes / agarose structures. Static and additional cyclic loads are created (from 0.3 to 3 Hz) with a maximum amplitude of 15%.

Недостатком многих создающих давление реакторов является то обстоятельство, что конструкции клеточных культур при нагрузке не могут подвергаться перфузии питательной средой, а следовательно, нет возможности для изучения эффекта множественного раздражения клеток. Далее, подобное недостаточное снабжение питательными веществами препятствует оптимальному обмену веществ, а также максимальному синтезу, например, внеклеточных матричных частиц опорной клеточной структуры.A disadvantage of many pressure-generating reactors is the fact that cell culture constructs cannot be perfused with nutrient medium when loaded, and therefore there is no way to study the effect of multiple cell irritation. Further, such an insufficient supply of nutrients prevents optimal metabolism, as well as the maximum synthesis, for example, extracellular matrix particles of the supporting cell structure.

Системы давления и перфузии, описанные, например, в патенте США 6060306 и немецком патенте 19808055, позволяют одновременную многократную стимуляцию с такими параметрами как перфузионный поток, инициированные им срезающие усилия и одноосевое давление. Недостатком реакторов со стимуляцией давления является, прежде всего, то, что это давление осуществляется с помощью исполнительных двигателей или иных приводных медиаторов давления, в большинстве случаев ползунов, поршней и т.п. в пространстве биореакторов, в котором находится преимущественно аутологичный трансплантат, с последующим определенным давлением на клеточный конструкт. Вследствие нахождения аппликатора давления в стерильной системе очень трудно обеспечить герметичную конструкцию реакторов с аппликаторами давления, поэтому подобные системы отличаются повышенной сложностью. Как следствие, сферой применения этих (потенциально нестерильных) систем являются фундаментальные исследования, в то время как использование этих устройств и способов в медицинской сфере противоречит действующему закону о лекарственных средствах.The pressure and perfusion systems described, for example, in US Pat. No. 6,060,306 and German Patent 19808055, allow simultaneous multiple stimulation with parameters such as perfusion flow, shear forces and uniaxial pressure initiated by it. The disadvantage of pressure stimulation reactors is, first of all, that this pressure is carried out by means of actuating motors or other drive pressure mediators, in most cases sliders, pistons, etc. in the space of bioreactors, in which there is a predominantly autologous transplant, followed by a certain pressure on the cell construct. Due to the location of the pressure applicator in a sterile system, it is very difficult to ensure a sealed design of reactors with pressure applicators, therefore such systems are characterized by increased complexity. As a result, the field of application of these (potentially non-sterile) systems is basic research, while the use of these devices and methods in the medical field is contrary to the current law on medicines.

Поэтому все биореакторные аппараты для культивирования и стимуляции аутологичных тканезамещающих структур подчиняются директиве Всемирной организации здравоохранения "Основные правила Всемирной организации здравоохранения для изготовления лекарственных средств и обеспечения их качества"), а также немецкому закону о лекарственных средствах (AMG), "Конвенции о фармацевтических инспекциях" и директиве GMP 91/356/EWG. Поэтому риск инфекции, а также недостаточная гарантия стерильности систем препятствуют получению разрешения на изготовление продукта в смысле § 13 AMG.Therefore, all bioreactor apparatuses for the cultivation and stimulation of autologous tissue-replacing structures are subject to the World Health Organization's directive “Basic rules of the World Health Organization for the manufacture of medicines and to ensure their quality”), as well as the German Law on Medicines (AMG), “Convention on Pharmaceutical Inspections” and GMP directive 91/356 / EWG. Therefore, the risk of infection, as well as the insufficient guarantee of the sterility of the systems, preclude obtaining permission to manufacture the product in the sense of § 13 AMG.

Задача изобретения состоит в создании способа и биореактора для изготовления трехмерных, жизнеспособных и стойких к механическим нагрузкам клеточных культур, в котором они могут культивироваться и стимулироваться в тесной временной взаимосвязи или одновременно. Биореактор должен обеспечивать выполнение требований (GMP) по выращиванию трансплантата в гарантированно стерильных условиях.The objective of the invention is to create a method and a bioreactor for the manufacture of three-dimensional, viable and resistant to mechanical stress cell cultures, in which they can be cultured and stimulated in close time relationship or at the same time. The bioreactor must ensure compliance with the requirements (GMP) for growing the transplant under guaranteed sterile conditions.

Задача изобретения решается в соответствии с описанным в пункте 1 формулы изобретения способом и описанным в пункте 13 формулы изобретения биореактором. Преимущественные варианты осуществления способа описаны в пунктах 2-12 формулы изобретения; прочие варианты биореактора описаны в пунктах 14-57 формулы изобретения.The objective of the invention is solved in accordance with the method described in paragraph 1 of the claims and the bioreactor described in paragraph 13 of the claims. Advantageous embodiments of the method are described in paragraphs 2-12 of the claims; other bioreactor options are described in paragraphs 14-57 of the claims.

Способ согласно изобретению и биореактор согласно изобретению объединяют в одном реакторе процессы культивирования и стимуляции выращенных в соответствии с требованиями GMP трехмерных, жизнеспособных и стойких к механическим нагрузкам клеточных культур, преимущественно опорных конструктов хондроцитов. При этом стимуляция и культивирование могут осуществляться одновременно, последовательно или с временным управлением. Выращенные таким образом трансплантаты предназначены в качестве тканезаменителей для лечения, например, дефектов соединительных и опорных тканей, прямых травм суставов, ревматизма и дегенеративных заболеваний суставов.The method according to the invention and the bioreactor according to the invention combine in one reactor the processes of cultivation and stimulation of three-dimensional, viable and resistant to mechanical stress cell cultures grown in accordance with GMP requirements, mainly supporting chondrocyte constructs. In this case, stimulation and cultivation can be carried out simultaneously, sequentially or with temporary control. Transplants grown in this way are intended as tissue substitutes for the treatment of, for example, defects in connective and supporting tissues, direct joint injuries, rheumatism and degenerative joint diseases.

Основным признаком способа и реактора согласно изобретению является то, что трансплантат находится в замкнутом пространстве реактора и может подвергаться воздействию стимулов, во многом соответствующих стимулам, действующим «in-vivo». Сюда относится перфузия пространственных конструкций клеточных культур кондиционированной питательной средой, вызывающая, с одной стороны, органотипичные срезающие усилия на клеточных мембранах, а кроме того, обеспечивающая повышенный обмен веществ. В этом закрытом биореакторе над трансплантатом находится магнитный поршнеобразный пуансон, служащий аппликатором нагрузки на клеточную культуру. Пуансон перемещается во внутреннем пространстве реактора бесконтактно и осуществляет при этом направленную одноосевую стимуляцию давлением на тканевый трансплантат. Бесконтактное управление миниактуатором происходит с помощью расположенных снаружи управляющих магнитов, направленное (электро)магнитное поле которых заставляет пуансон изменять свое положение в биореакторе и создавать при этом органотипичную динамическую или статическую стимуляцию давлением.The main feature of the method and reactor according to the invention is that the graft is located in the confined space of the reactor and can be exposed to stimuli, in many respects corresponding to stimuli acting in vivo. This includes the perfusion of the spatial structures of cell cultures with an air-conditioned nutrient medium, which, on the one hand, causes organotypic shearing forces on cell membranes, and also provides an increased metabolism. In this closed bioreactor above the graft is a magnetic piston-like punch serving as an applicator of the load on the cell culture. The punch moves non-contact in the interior of the reactor and, in doing so, carries out directed uniaxial stimulation by pressure on the tissue graft. The non-contact control of the mini-actuator takes place using external control magnets, the directional (electro) magnetic field of which causes the punch to change its position in the bioreactor and create organotypic dynamic or static pressure stimulation.

Способ и биореактор имеют то, уже упомянутое, преимущество, что во время культивирования может осуществляться также стимуляция клеточных культур, заключающаяся, прежде всего, в выращивании или регенерации соединительных и опорных тканевых структур и функциональных тканевых систем (хрящей, костей и т.п.). The method and bioreactor have the advantage already mentioned that during cultivation cell culture stimulation can also be carried out, which consists, first of all, in the cultivation or regeneration of connective and supporting tissue structures and functional tissue systems (cartilage, bones, etc.) .

Аппаратура позволяет осуществлять стерильное выращивание клеточных трансплантатов синхронно, с перфузией и под давлением, отличающееся повышенной производительностью по матричным компонентам (например, культур опорной клеточной структуры). Благодаря высокой степени автоматизации это устройство снижает до минимума число рабочих операций и уменьшает, таким образом, риск инфекции клеточной культуры. Далее, автоматизированное культивирование и стимуляция трансплантатов гарантирует высокую степень воспроизводства процесса. Благодаря конструкционным признакам биореактора согласно изобретению реализуется замкнутый контур биореактора и, как следствие, строго аутологичные культивирование и стимуляция тканезамещающих структур с соблюдением директив GMP.The equipment allows sterile growth of cell transplants synchronously, with perfusion and under pressure, characterized by increased productivity in matrix components (for example, cultures of the supporting cell structure). Due to the high degree of automation, this device minimizes the number of work steps and thus reduces the risk of infection of the cell culture. Further, automated cultivation and stimulation of transplants guarantees a high degree of reproduction of the process. Due to the design features of the bioreactor according to the invention, a closed bioreactor circuit is realized and, as a result, strictly autologous cultivation and stimulation of tissue-replacing structures in compliance with GMP directives.

Еще одной сферой применения биореактора является фармацевтическое исследование действующих начал для определения степени влияния пролиферационных и дифференцирующих веществ или комбинаций веществ на трансплантаты.Another area of application of the bioreactor is the pharmaceutical study of active principles to determine the degree of influence of proliferative and differentiating substances or combinations of substances on transplants.

В дальнейшем приводится описание способа и реактора согласно изобретению на конкретных примерах осуществления. На фигурах изображены:The following is a description of the method and reactor according to the invention with specific examples of implementation. The figures depict:

Фиг.1: Способ изготовления трансплантатов.Figure 1: A method of manufacturing transplants.

Фиг.2: Схема биореакторной системы согласно GMP.Figure 2: Diagram of a bioreactor system according to GMP.

Фиг.3: Схема однокамерного биореактора.Figure 3: Diagram of a single chamber bioreactor.

Фиг.4: Схема двухкамерного биореактора.Figure 4: Diagram of a two-chamber bioreactor.

Фиг.5: Конструкция и формы выполнения миниактуатора.Figure 5: Design and implementation of a mini-actuator.

Фиг.6: Схема приготовления и высева конструкции в биореакторе.6: Scheme of preparation and seeding of the structure in the bioreactor.

Фиг.7: Схема технического устройства для перфузии и перемешивания среды в однокамерном биореакторе.7: Diagram of a technical device for perfusion and mixing of the medium in a single chamber bioreactor.

Фиг.8: Схема технического устройства для перфузии и перемешивания среды в двухкамерном биореакторе.Fig: Scheme of a technical device for perfusion and mixing of the medium in a two-chamber bioreactor.

Фиг.9: Схема фиксации трансплантата в биореакторе.Fig.9: Scheme of fixation of the graft in the bioreactor.

Фиг.10: Магнитные системы для управления миниакутатором.Figure 10: Magnetic systems for controlling a mini-acutator.

Фиг.11: Схема стимуляции в двухкамерном реакторе.11: Scheme of stimulation in a two-chamber reactor.

Пример 1Example 1

Способ изготовления трансплантатовA method of manufacturing transplants

На фиг.1 на примере трансплантации хрящевой ткани представлено использование биореактора для синхронного культивирования и стимуляции трехмерных клеточных трансплантатов. Figure 1 shows the use of a bioreactor for simultaneous cultivation and stimulation of three-dimensional cell transplants using the example of cartilage tissue transplantation.

Для этого у пациента, прежде всего, минимально инвазивным методом отбирается (I) здоровый клеточный материал (например, артикулярная опорная структура) и кровь. Путем ферментативного расщепления производится разделение полученного материала на отдельные клетки, после чего они пересчитываются и, в зависимости от полученного результата, высеиваются стандартными методaми Tissue Engineerings в однослойных сосудах (II) и размножаются в строго аутологичных условиях, или же сразу используются для создания конструкта (III). При этом клетки помещаются в трехмерную структуру трансплантата, состоящую из биосовместимого или ресорбируемого материала-носителя (например, гидрогелей, агарозы, коллагенов, гидроксилапатитов, полимерных комплексов и т.п.). Для этого суспендированные клетки (например, хондроциты) смешиваются с биогенной опорной структурой (например, агарозой), помещаются в колбу для высева и отверждаются, например, в цилиндрической форме для трансплантата (например, матрице хрящ-агароза). Эта адаптированная к условиям «in-vivo» трехмерная структура ведет, прежде всего, у клеток соединительных и опорных тканей (например, хондроцитов) к (ре-)дифференцировке и дополнительно к синтезу типичных тканевых субстанций и матричных компонентов (например, коллагена, протеогликана). For this, the patient, first of all, using a minimally invasive method, selects (I) healthy cellular material (for example, the articular support structure) and blood. Enzymatic digestion separates the resulting material into separate cells, after which they are recounted and, depending on the result, seeded using standard Tissue Engineerings in single-layer vessels (II) and propagated under strictly autologous conditions, or immediately used to create a construct (III ) In this case, the cells are placed in a three-dimensional structure of the graft, consisting of a biocompatible or resorbable carrier material (for example, hydrogels, agarose, collagen, hydroxylapatite, polymer complexes, etc.). For this, suspended cells (e.g., chondrocytes) are mixed with a biogenic support structure (e.g., agarose), placed in a flask for plating and cured, for example, in a cylindrical shape for a graft (e.g., cartilage-agarose matrix). This three-dimensional structure adapted to in-vivo conditions leads, first of all, in cells of connective and supporting tissues (for example, chondrocytes) to (re) differentiate and in addition to the synthesis of typical tissue substances and matrix components (for example, collagen, proteoglycan) .

Эти колбы с находящимся в них пространственным клеточным трансплантатом помещаются в биореактор (IV), трансплантат выпрессовывается и помещается в биореактор. В заключение происходит отвечающее требованиям GMP одновременноe, последовательное или управляемое по времени культивирование и стимуляция этого клеточного конструкта в недавно разработанной закрытой биореакторной аппаратуре (V). На этом этапе путем многократного аналогичного условиям «in-vivo» раздражения клеточного трансплантата (стимуляции с помощью срезающего усилия, перфузии, деформации, механической нагрузки) можно добиться повышенной дифференцировки и экспрессии органотипичных маркеров. These flasks with a spatial cell transplant located in them are placed in the bioreactor (IV), the transplant is pressed out and placed in the bioreactor. In conclusion, GMP-compliant simultaneous, sequential, or time-controlled cultivation and stimulation of this cell construct in a newly developed closed bioreactor apparatus (V) takes place. At this stage, by repeated stimulation of the cell transplant similar to the in-vivo conditions (stimulation using shear force, perfusion, deformation, mechanical loading), increased differentiation and expression of organotypic markers can be achieved.

Через короткое время в биореакторе происходит регенерация очень жизненного, богатого матрицей конструкта клеточной культуры. Этот аутологичный трансплантат извлекается (VI), в случае необходимости адаптируется к геометрии тканевого дефекта и в заключение трансплантируется в поврежденные соединительные или опорные ткани.After a short time, a very vital, matrix-rich cell culture construct is regenerated in the bioreactor. This autologous graft is removed (VI), if necessary adapts to the geometry of the tissue defect and finally transplanted into damaged connective or supporting tissues.

Пример 2Example 2

Схема биореакторной системыScheme of the bioreactor system

На фиг.2 представлена форма выполнения биореакторной системы (с двухкамерным биореактором) для аутологичного культивирования и множественной стимуляции клеточных трансплантатов в закрытой реакторной системе способом, соответствующим GMP. Figure 2 presents the form of the bioreactor system (with a two-chamber bioreactor) for autologous cultivation and multiple stimulation of cell transplants in a closed reactor system in a manner consistent with GMP.

В этом примере выполнения все устройство обеспечения оптимальной температуры, влажности и состава воздуха размещено в обогреваемом и регулируемом по газу инкубаторе. Возможна также раздельная конструкция, при которой биореактор 1, среда в инкубаторе и прочие технические компоненты для контроля располагаются вне инкубатора. In this exemplary embodiment, the entire device for ensuring the optimum temperature, humidity and air composition is placed in a heated and gas-controlled incubator. A separate design is also possible in which the bioreactor 1, the medium in the incubator and other technical components for control are located outside the incubator.

Сам биореактор 1 и его компоненты являются биологически и химически инертными и могут обрабатываться в автоклаве. Кроме того, корпус и привинчиваемая крышка биореактора изготовлены из немагнитных (например, пластмассы) или слабомагнитных (например, ванадиевой стали 4) материалов. The bioreactor 1 itself and its components are biologically and chemically inert and can be autoclaved. In addition, the housing and screw cap of the bioreactor are made of non-magnetic (e.g. plastic) or weakly magnetic (e.g., vanadium steel 4) materials.

Культуральная среда поступает из резервуара 2 через систему шлангов 4 с 3-ходовым клапаном 6 и 4-ходовым клапаном 7 с помощью циркуляционного насоса 5 в биореактор 1. Эта культуральная среда может быть обогащена полученными из крови пациента аутологичными аддитивными факторами (например, факторами роста, медиаторами и т.п.) из резервуара для вспомогательных материалов (супплементов) 3. Среда подается периодически, в режиме «Fed-Batch»» или непрерывно в биореактор 1 и, тем самым, к трансплантату 11. При замкнутом контуре среда поступает затем по шланговой системе 4 в резервуар для среды 2, оборудованный измерительными датчиками для контроля физико-химических параметров, например pH, pCO₂ и pO₂. Когда среда считается отработанной, она по шланговой системе 4 может направляться во внешнюю емкость для отходов. В обоих случаях существует возможность с помощью вентильного устройства 7 осуществлять стерильный отбор проб из контура реактора. The culture medium enters from reservoir 2 through a hose system 4 with a 3-way valve 6 and a 4-way valve 7 using a circulation pump 5 to the bioreactor 1. This culture medium can be enriched with autologous additive factors (e.g., growth factors, mediators, etc.) from the reservoir for auxiliary materials (Supplements) 3. The medium is supplied periodically, in the mode of "Fed-Batch""or continuously into the bioreactor 1 and, thus, to the graft 11. With a closed circuit, the medium then flows through hose howl system 4 to the reservoir for a medium 2, equipped with measuring sensors for monitoring physical and chemical parameters such as pH, pCO ₂ and pO _2. When the medium is considered exhausted, it can be routed through the hose system 4 to an external waste container. In both cases, there is the possibility of using a valve device 7 to carry out sterile sampling from the reactor loop.

В биореакторе выращиваемый и культивируемый трансплантат 11 находится в медиальной позиции на дне реактора. Под трансплантатом 11 может находиться вторая, меньшая по размеру камера. Это проточное пространство снабжается средой через шланговую систему 4 и может быть заполнено сильнопористым, но тонким слоем агломерационного материала 16. Нижняя камера может быть отгорожена тонким прозрачным стеклом 17 и в качестве отверстия для микроскопии предназначаться для инверсного микроскопа. In the bioreactor, the grown and cultured graft 11 is in a medial position at the bottom of the reactor. Under the graft 11 there may be a second, smaller chamber. This flowing space is supplied with medium through a hose system 4 and can be filled with a highly porous but thin layer of sinter material 16. The lower chamber can be fenced off with a thin transparent glass 17 and can be used as an opening for microscopy for an inverse microscope.

Внутри верхней камеры биореактора 1 наряду с пропущенными через крышку реактора биодатчиками 9 находится миниактуатор 14. Этот выполненный как магнитный пуансон миниакутатор 14 действует как бесконтактный аппликатор давления и управляется магнитами и катушкой 15.Inside the upper chamber of the bioreactor 1, along with the biosensors 9 passed through the reactor cover 9, there is a mini-actuator 14. This mini-actuator 14, which is designed as a magnetic punch, acts as a non-contact pressure applicator and is controlled by magnets and a coil 15.

Пример 3Example 3

Схема однокамерного биореактораSingle chamber bioreactor circuit

На фиг.3 представлена возможная форма выполнения биореактора 1, состоящая из камеры для культуры, служащей для применения бесконтактно управляемого миниактуатора 14.Figure 3 presents a possible form of execution of the bioreactor 1, consisting of a chamber for culture, which serves for the use of contactlessly controlled mini-actuator 14.

Выполненный однокамерным биореактор 1 состоит из корпуса крышки 21, дополнительно герметизированной зажимным кольцом 20. Через крышку пропущены биодатчики 9 для измерения в режиме «on-line», например, концентрации глюкозы, лактата и других компонентов среды. В пространстве реактора над трансплантатом 11 расположен точно пригнанный миниактуатор 14, покоящийся на специальном днище реактора с вставленным прозрачным стеклом 17. The single chamber bioreactor 1 consists of a cover body 21, additionally sealed with a clamping ring 20. Through the cover, biosensors 9 are passed for on-line measurement, for example, the concentration of glucose, lactate and other components of the medium. In the reactor space above the graft 11, a precisely fitted mini-actuator 14 is located, resting on a special bottom of the reactor with transparent glass 17 inserted.

Для подачи среды для трансплантата 11 в биореакторе 1 предусмотрены по меньшей мере одно питающее и одно отводящее соединения 19 типа Luer. На по меньшей мере одном отводящем соединении 19 с помощью трехходового клапана 6 создан пробоотборный участок 8.To supply the medium for transplant 11, at least one Luer type supply and one discharge connection 19 is provided in the bioreactor 1. At least one outlet connection 19 using a three-way valve 6 created a sampling section 8.

Пример 4Example 4

Схема двухкамерного биореактораScheme of a two-chamber bioreactor

На фиг.4 представлена еще одна форма выполнения биореактора 1, состоящая из двух камер, при этом в верхней расположен пуансон 14, а нижняя служит для подачи питательной среды под трансплантат 11. Эта форма выполнения по функции, характеристике и требованиям к деталям 1, 6, 8, 9, 14, 19-21 не отличается от биореактора 1, описанного в примере 3. Figure 4 shows another embodiment of the bioreactor 1, consisting of two chambers, with the punch 14 located at the top, and the bottom serving for supplying a nutrient medium under the graft 11. This embodiment is performed according to the function, characteristics and requirements for parts 1, 6 , 8, 9, 14, 19-21 does not differ from the bioreactor 1 described in example 3.

В аппаратуре предусмотрены по меньшей мере одно питающее и одно отводящее соединения 19 для верхней и нижней реакторных камер, которые предназначены для регулируемого с помощью клапанов снабжения соответствующей камеры и трансплантата 11. At least one supply and one outlet connection 19 for the upper and lower reactor chambers are provided in the apparatus, which are designed for supplying the corresponding chamber and transplant 11 with valves.

Размеры нижней камеры выбраны такими, чтобы ее диаметр был меньше диаметра трансплантата 11. В эту камеру вставляется плоский точно подогнанный диск из пористого агломерационного материала 16, что обеспечивает возможность инверсного микроскопирования через замыкающее стекло 17 и мембрану 18 в направлении трансплантата 11. Этот диск из агломерационного материала 16 в нижней камере реактора в рамках данной аппаратуры выполняет еще одну важную функцию. При механической нагрузке трансплантата 11 через пуансон 14 он предотвращает нежелательное вдавливание желеобразного клеточного конструкта 11 в камеру. В зависимости от применяемой опорной матрицы и ее вязкости предусмотрено использование проницаемой для жидкости мембраны 18 между агломерационным материалом 16 и трансплантатом 11 для предотвращения смешивания материала-носителя с агломерационным материалом 16.The dimensions of the lower chamber are chosen so that its diameter is less than the diameter of the graft 11. A flat precisely fitted disk of porous sinter material 16 is inserted into this chamber, which allows inverse microscopy through the closing glass 17 and membrane 18 in the direction of the graft 11. This disk is made of sinter material 16 in the lower chamber of the reactor in the framework of this equipment performs another important function. When the graft 11 is mechanically loaded through the punch 14, it prevents the unwanted pressing of the jelly-like cell construct 11 into the chamber. Depending on the support matrix used and its viscosity, a liquid-permeable membrane 18 is provided between the sinter material 16 and the graft 11 to prevent mixing of the carrier material with the sinter material 16.

Пример 5Example 5

Конструкция и форма выполнения миниактуатора 14The design and implementation of the mini-actuator 14

На фиг.5 представлена конструкция, геометрия и различные формы миниактуатора 14, вертикально вставленного в пространство реактора (здесь на примере двухкамерной модели) и передающего осевое давление на расположенный на дне реактора трансплантат 11. Figure 5 shows the design, geometry and various forms of the mini-actuator 14, vertically inserted into the reactor space (here as an example of a two-chamber model) and transmitting axial pressure to the graft 11 located at the bottom of the reactor.

Этот магнитный аппликатор давления 14 в соответствии с изобретением (см. фиг.5a) вертикально перемещается в биореакторе 1 с бесконтактным управлением с помощью внешне расположенных управляющих магнитов 15. Абсолютно вертикальное сжатие может быть обеспечено, с одной стороны, медиальным расположением трансплантата 11 в биореакторе 1. С другой стороны, требуется точная подгонка внешнего диаметра производящего давление пуансона D2 к внутреннему диаметру биореактора D2. Это гарантирует вертикальное движение миниактуатора 14 в биореакторе 1 без перекоса пуансона. Во всех моделях биореактора этот диаметр D2 должен быть больше диаметра D1 трансплантата 11.This magnetic pressure applicator 14 in accordance with the invention (see Fig. 5a) is vertically moved in the bioreactor 1 with non-contact control using externally located control magnets 15. Absolutely vertical compression can be achieved, on the one hand, by the medial arrangement of the graft 11 in the bioreactor 1 . On the other hand, accurate adjustment of the external diameter of the pressure-producing punch D2 to the internal diameter of the bioreactor D2 is required. This ensures the vertical movement of the mini-actuator 14 in the bioreactor 1 without skewing the punch. In all bioreactor models, this diameter D2 must be larger than the diameter D1 of graft 11.

На фиг.5b представлена характерная конструкция этого устройства давления 14. Оно оснащено очень мощным постоянным магнитом 22, преимущественно из соединения неодима, железа и бора, перемещающимся в соответствующем направлении уже при самом незначительном магнитном или электромагнитном поле. Этот постоянный магнит 22 с лакированным или лаковым покрытием заключен в капсулу из биологически инертной пластмассы - капсулу 23. Эта преимущественно цилиндрическая капсула 23 имеет точно подогнанный внешний диаметр и скользит без трения и строго вертикально в цилиндре биореактора. На нижней стороне пластмассовой капсулы 23 наряду с плоской поверхностью могут воспроизводиться также другие органотипичные негативные формы поверхности пуансона 24, точно соответствующие позитивным формам «in-vivo» (например, выпуклости, дуги и т.п.). Fig. 5b shows the characteristic construction of this pressure device 14. It is equipped with a very powerful permanent magnet 22, mainly from a combination of neodymium, iron and boron, moving in the corresponding direction even with a very small magnetic or electromagnetic field. This permanent magnet 22 with varnished or varnished coating is enclosed in a capsule of biologically inert plastic - capsule 23. This predominantly cylindrical capsule 23 has a precisely adjusted outer diameter and glides without friction and is strictly vertical in the cylinder of the bioreactor. On the lower side of the plastic capsule 23, along with the flat surface, other organotypic negative forms of the punch surface 24 can also be reproduced, exactly corresponding to positive in-vivo forms (for example, bulges, arcs, etc.).

Имеющаяся в данном случае новая геометрия актуатора без проточных каналов 33 в капсуле 23, позволяет, кроме того, реализовывать насосную функцию, обусловленную цикличным генерированием магнитного поля. Благодаря существующим условиям давления и клапанам в биореакторе 1 при движении вверх миниактуатора 14 происходит засасывание среды в пространство реактора. При движении вниз или компрессионном давлении на трансплантат 11 эта среда выжимается из биореактора 1.The new geometry of the actuator in this case without flow channels 33 in the capsule 23 allows, in addition, to realize the pump function due to the cyclical generation of the magnetic field. Due to the existing pressure conditions and valves in the bioreactor 1, when the mini-actuator 14 moves upward, the medium is sucked into the reactor space. When moving downward or compression pressure on the transplant 11, this medium is squeezed out of the bioreactor 1.

На фиг.5c представлена еще одна примерная форма выполнения миниактуатора 14, также состоящего из сильного постоянного магнита 22 и капсулы 23 с индивидуальной поверхностью пуансона 24. Эта модель для оптимизации потока имеет по краям своей капсулы 23 так называемые проточные каналы 33. Благодаря им обеспечивается обтекание средой миниактуатора 14 во внутреннем пространстве биореактора и требуется меньшее усилие для преодоления сопротивления среды. Капсула 23 должна иметь по меньшей мере 3 направляющих выступа с точно пригнанным внешним диаметром D2 для ровного позиционирования всего миниактуатора 14 на трансплантате 11.Fig. 5c shows another exemplary embodiment of the mini-actuator 14, also consisting of a strong permanent magnet 22 and a capsule 23 with an individual surface of the punch 24. This model has so-called flow channels 33 at the edges of its capsule 23. This allows flow around environment miniactuator 14 in the inner space of the bioreactor and requires less effort to overcome the resistance of the medium. The capsule 23 must have at least 3 guiding protrusions with a precisely fitted outer diameter D2 for smooth positioning of the entire mini-actuator 14 on the graft 11.

На фиг.5d представлен модифицированный пуансон 14 на основе фиг.5b, оборудованный удлинителем 34 для создания дистанции от постоянного магнита 22 и клеточного конструкта 11. Причиной подобного дистанцирования постоянного магнита 22 в верхней головке цилиндра относительно трансплантата 11 является стремление свести к минимуму возможное влияние поля на клеточные культуры 11.Fig. 5d shows a modified punch 14 based on Fig. 5b, equipped with an extension 34 to create a distance from the permanent magnet 22 and the cell construct 11. The reason for this distance of the permanent magnet 22 in the upper cylinder head relative to the graft 11 is to minimize the possible influence of the field on cell cultures 11.

На фиг.5e представлен миниактуатор 14 на основе фиг.5d, имеющий по меньшей мере 3 проточных канала 33 и 3 направляющих выступа с внешним диаметром D2.FIG. 5e shows a mini-actuator 14 based on FIG. 5d having at least 3 flow channels 33 and 3 guide protrusions with an outer diameter D2.

Пример 6Example 6

Схема изготовления и высева конструкта в биореакторе 1The scheme of manufacture and seeding of the construct in the bioreactor 1

На фиг.6 представлен способ и устройство для изготовления и высева трехмерных, преимущественно цилиндрических, конструктов клеточных матриц.Figure 6 presents a method and apparatus for the manufacture and seeding of three-dimensional, mainly cylindrical, constructs of cell matrices.

На фиг.6a (высев клеточных матриц) размноженные (см. Фиг.1, II) или свежеизолированные (см. Фиг.1, III) и препарированные клетки 12 с биогенной структурой носителя 13 размножаются, суспендируются до получения гомогенности и впрыскиваются в необходимом для получения клеточной матрицы объеме в колбу для высева 25. On figa (seeding of cell matrices) multiplied (see Figure 1, II) or freshly isolated (see Figure 1, III) and prepared cells 12 with the biogenic structure of the carrier 13 are propagated, suspended until homogeneous and injected as necessary obtain the cell matrix volume in the flask for plating 25.

Точно подогнанная колба для высева 25 по своему внутреннему диаметру D1 соответствует будущему внешнему диаметру трансплантата 11, а по своему внешнему диаметру D2 - внутреннему диаметру биореактора 1.A precisely tailored flask for seeding 25 in its inner diameter D1 corresponds to the future outer diameter of the graft 11, and in its outer diameter D2 to the inner diameter of the bioreactor 1.

На фиг.6b (применение пуансона) представлено применение пуансона 26 в колбе для высева 25. Во время отверждения или полимеризации соответствующей клеточной матрицы в цилиндре реактора 25 на пластине 27 в полый поршневой цилиндр вводится точно подогнанный пуансон 26 с внешним диаметром D1.6b (use of a punch) shows the use of a punch 26 in a flask for seeding 25. During curing or polymerization of the corresponding cell matrix in the cylinder of the reactor 25 on the plate 27, a precisely fitted punch 26 with an outer diameter D1 is inserted into the hollow piston cylinder.

Нижняя сторона этого пуансона 26 может аналогично поверхности пуансона 24 миниактуатора 14 иметь форму органотипичных структур.The lower side of this punch 26 may, similarly to the surface of the punch 24 of the mini-actuator 14, be in the form of organotypic structures.

На фиг.6c (применение пуансона) представлена насадка пуансона 26 на трансплантат 11 в колбе для высева 25. Пуансон 26 садится на клеточный конструкт с легким давлением прижима для того, чтобы противодействовать образованию мениска или выпучивания верхней стороны матрицы трансплантата 11 и получить, например, цилиндрическую форму трансплантата. Fig. 6c (application of the punch) shows the nozzle of the punch 26 on the graft 11 in the seeding flask 25. The punch 26 sits on the cell construct with a slight pressure to prevent meniscus formation or bulging of the upper side of the graft matrix 11 and obtain, for example, the cylindrical shape of the graft.

Если трансплантату 11 следует придать поверхность для адаптации к поверхности «in-vivo», то это применение пуансона 26 происходит на стадии отверждения/полимеризации.If the graft 11 should be given a surface to adapt to the surface "in-vivo", then this use of the punch 26 occurs at the stage of curing / polymerization.

На фиг.6d (удаление пластины) насаженный пуансон 26 после придания необходимой формы трансплантату 11 поднимается и происходит удаление находящейся на дне колбы для высева 25 преимущественно гидрофобной пластины 27. Для предотвращения адгезии желатинообразного клеточного конструкта 11 к пластине 27 и колбе для высева поверхность закрывается, например, инертной пленкой или инертным полимерным материалом.On fig.6d (removal of the plate), the inserted punch 26 after the desired shape of the graft 11 is lifted and the predominantly hydrophobic plate 27 located at the bottom of the seeding flask 25 is removed. To prevent adhesion of the gelatinous cell construct 11 to the plate 27 and the seeding flask, the surface is closed, for example, an inert film or an inert polymeric material.

На фиг.6e (высев конструкта в биореакторе) представлен высев цилиндрического конструкта на примере двухкамерного биореактора. При этом точно подогнанная колба для высева 25 помещается в биореактор 1, после чего с помощью прижимного пуансона 26 клеточный конструкт 11 вводится медиально в препарированный реактор и высевное устройство удаляется из биореактора 1. Этот подготовленный биореактор 1 содержит пористый агломерационный материал 16 и, возможно, проницаемую для диффузии мембрану 18.On fig.6e (seeded construct in the bioreactor) shows the sowing of a cylindrical construct on the example of a two-chamber bioreactor. In this case, a precisely fitted flask for seeding 25 is placed in the bioreactor 1, after which, using the pressure punch 26, the cell construct 11 is inserted medially into the prepared reactor and the seeding device is removed from the bioreactor 1. This prepared bioreactor 1 contains porous agglomeration material 16 and, possibly, permeable for diffusion membrane 18.

Пример 7Example 7

Схема технического устройства для перфузии конструкта и перемешивания среды в однокамерном биореактореScheme of a technical device for perfusion of the construct and mixing of the medium in a single chamber bioreactor

На фиг.7 представлена конструкция корпуса однокамерного реактора и ее влияние на диффузию и перфузию в трансплантате 11.Figure 7 shows the design of a single-chamber reactor vessel and its effect on diffusion and perfusion in transplant 11.

При представленной на фиг.7a форме исполнения биореактор 1 имеет четыре входящих и выходящих трубопровода с интегрированной муфтой Luer 19. Для оптимизации потока они могут различаться по размеру и расположению, в том числе, например, входить в корпус биореактора 1 по касательной. Количество подсоединенных к биореактору 1 входящих и отходящих трубопроводов 19 должно составлять не менее двух. На каждом отходящем соединении Luer 19 с помощью, например, 3-ходового клапана 6 может быть создан пробоотборный участок 8.In the embodiment shown in FIG. 7a, the bioreactor 1 has four inlet and outlet pipelines with an integrated Luer 19 coupling. To optimize the flow, they can vary in size and location, including, for example, tangentially entering the bioreactor 1 body. The number of incoming and outgoing pipelines 19 connected to the bioreactor 1 should be at least two. A sample section 8 can be created on each outgoing Luer 19 connection using, for example, a 3-way valve 6.

При статическом выращивании в биореакторе среда диффундирует, прежде всего, в верхние и краевые области, например, цилиндрического тканевого трансплантата 11 и снабжает клеточную культуру, среди прочего, нутриентами, одновременно вынося продукты обмена из матрицы.During static growth in a bioreactor, the medium diffuses, first of all, in the upper and marginal regions, for example, of a cylindrical tissue transplant 11 and supplies the cell culture, among other things, with nutrients, while removing metabolic products from the matrix.

На фиг.7b представлена непрерывная подача питательной среды из резервуара 2 с расположенным сзади факультативным резервуаром для супплементов 3 (не изображен) с помощью дозирующего циркуляционного насоса 5 по шланговой системе 4 в по меньшей мере один вход 19 биореактора 1.Fig. 7b shows a continuous supply of nutrient medium from a reservoir 2 with an optional additional suppressor reservoir 3 (not shown) located at the rear of the at least one inlet 19 of the bioreactor 1 via a metering circulating pump 5 through a hose system 4.

Отток среды происходит через по меньшей мере один выход 19 в шланговую систему 4, в которую по меньшей мере в одном месте с помощью 3-ходового клапана 6 может быть интегрирован автономный пробоотборный участок 8. Израсходованная среда может, как здесь представлено, оставаться в контуре, поступая при этом в резервуар для среды 2, откуда она забирается затем для повторной непрерывной перфузии трансплантата 11. В ином случае она полностью выводится из контура. Культивирование трансплантата 11 происходит затем периодически или в режиме «Fed-Batch».The outflow of the medium occurs through at least one outlet 19 into the hose system 4, into which an autonomous sampling section 8 can be integrated using the 3-way valve 6 at least in one place. The expended medium can, as shown here, remain in the loop, when this enters the reservoir for medium 2, from where it is then taken for repeated continuous perfusion of the graft 11. Otherwise, it is completely removed from the circuit. The graft 11 is then cultured periodically or in Fed-Batch mode.

Целевая непрерывная подача среды культуры в пространство реактора может значительно улучшить поточную обработку трансплантата 11 по сравнению со статичной схемой на фиг.7a. Благодаря индуцированной перфузии обеспечивается промывание средой более глубоких участков конструкта. В результате оптимизируется обмен веществ, что ведет к повышению дифференцировки клеток. Далее, благодаря такому осуществлению поточной обработки конструктa стимулируется срезающее усилие на клетки.Targeted continuous flow of culture medium into the reactor space can significantly improve the in-line processing of the graft 11 compared to the static circuit in Fig. 7a. Due to induced perfusion, the medium is flushed with deeper sections of the construct. As a result, metabolism is optimized, which leads to increased differentiation of cells. Further, due to such an implementation of the in-line processing of the construct, the shearing force on the cells is stimulated.

Пример 8Example 8

Схема технического устройства для перфузии конструкта и перемешивания среды в двухкамерном биореактореScheme of a technical device for perfusion of the construct and mixing of the medium in a two-chamber bioreactor

На фиг.8 представлен двухкамерный биореактор, обеспечивающий оптимизацию потока, диффузии и перфузии трансплантата и повышающий, тем самым, качество трансплантата.On Fig presents a two-chamber bioreactor, providing optimization of flow, diffusion and perfusion of the graft and thereby improving the quality of the graft.

На фиг.8a представлен вариант со статическим выращиванием и диффузией. Число подсоединенных к биореактору 1 подводящих и отводящих трубопроводов 19 должно составлять по меньшей мере два, при этом по меньшей мере по одному из них должны быть подсоединены к нижней и верхней камерам реактора. Изображенные на фигуре два трубопровода 19 (входящий и выходящий) на камеру в целях оптимизации потока могут иметь различное положение, позицию и диаметр.On figa presents a variant with static growth and diffusion. The number of inlet and outlet pipelines 19 connected to the bioreactor 1 must be at least two, with at least one of them must be connected to the lower and upper chambers of the reactor. The two pipelines 19 shown in the figure (inlet and outlet) to the chamber can have a different position, position and diameter in order to optimize the flow.

Пробоотборный участок 8 может быть создан на любом отходящем соединении Luer 19 обеих камер, например, с помощью 3-ходового клапана 6 или т.п. A sampling section 8 can be created on any Luer 19 outgoing connection of both chambers, for example, using a 3-way valve 6 or the like.

Наряду с диффузией среды в верхние и боковые области трансплантата эта новая конструкция камеры под трансплантатом 11 на статической фазе культивирования ведет к диффузии среды культуры из пористого агломерационного материала в придонные зоны структуры носителя, что улучшает обмен веществ во всем трансплантате 1.Along with diffusion of the medium into the upper and lateral regions of the graft, this new design of the chamber under the graft 11 during the static cultivation phase leads to diffusion of the culture medium from the porous agglomeration material into the bottom zones of the carrier structure, which improves metabolism throughout the transplant 1.

На фиг.8b представлена непрерывная подача питательной среды из резервуара для среды 2 с расположенным сзади факультативным резервуаром для супплементов 3 (не изображен) с помощью дозирующего циркуляционного насоса 5 по шланговой системе 4 в по меньшей мере один вход нижней и верхней камеры 19 биореактора 1. On fig.8b presents a continuous supply of nutrient medium from the reservoir for the medium 2 with the optional optional suppository reservoir 3 (not shown) using a metering circulating pump 5 through the hose system 4 into at least one input of the lower and upper chambers 19 of the bioreactor 1.

Отток среды происходит через по меньшей мере один выход 19 в шланговую систему 4, в которую по меньшей мере в одном месте с помощью 3-ходового клапана 6 может быть интегрирован автономный пробоотборный участок 8. Израсходованная среда может, как здесь представлено, оставаться в контуре, поступая при этом в резервуар для среды 2, откуда она забирается затем для повторной непрерывной перфузии трансплантата 11. В ином случае она полностью выводится из контура. Выращивание трансплантата 11 происходит затем периодически или в режиме «Fed-Batch». The outflow of the medium occurs through at least one outlet 19 into the hose system 4, into which an autonomous sampling section 8 can be integrated using the 3-way valve 6 at least in one place. The expended medium can, as shown here, remain in the loop, when this enters the reservoir for medium 2, from where it is then taken for repeated continuous perfusion of the graft 11. Otherwise, it is completely removed from the circuit. The graft 11 is then grown periodically or in Fed-Batch mode.

Интеграция согласно изобретению второй камеры, в данном случае под трансплантатом 11, демонстрирует свои положительные качества, прежде всего, при целевой поточной обработке биологического конструкта. Если соответственно с помощью 3-ходового клапана 6 включается поток среды из резервуара 2 в нижнюю камеру, то происходит индуцированная направленная вверх перфузия трансплантата 11 при закрытом нижнем сливе, так как среда может покинуть пространство реактора только через верхний слив. The integration according to the invention of the second chamber, in this case under the graft 11, demonstrates its positive qualities, especially with the targeted in-line processing of the biological construct. If, respectively, using a 3-way valve 6, the flow of medium from the reservoir 2 into the lower chamber is switched on, then the induced upward perfusion of the graft 11 occurs when the lower drain is closed, since the medium can leave the reactor space only through the upper drain.

Аналогично этой схеме с помощью 3-ходового клапана 6 обеспечивается поточная обработка трансплантата 11 по направлению из верхней в нижнюю камеру. Результатом такой конструкции устройства наряду с полной перфузией является дальнейшая стимуляция клеток с помощью индуцированного срезающего усилия, влияющего на клетки и регулируемого путем изменения производительности циркуляционного насоса 5. Возможно также частичное или полное открытие 3-ходового клапана 6 для более быстрого обмена среды в биореакторе 1.Similarly to this scheme, a 3-way valve 6 provides in-line processing of the graft 11 in the direction from the upper to the lower chamber. The result of this design of the device, along with complete perfusion, is further stimulation of the cells by means of an induced shear force, which affects the cells and is controlled by changing the performance of the circulation pump 5. It is also possible to partially or completely open the 3-way valve 6 for faster exchange of the medium in bioreactor 1.

Пример 9Example 9

Схема фиксации трансплантата 11 в биореакторе 1The graft fixation scheme 11 in the bioreactor 1

На фиг.9 представлена схема фиксации трансплантата 11 в однокамерном или двухкамерном биореакторе 1.In Fig.9 presents a diagram of the fixation of the graft 11 in a single or double chamber bioreactor 1.

На фиг.9a представлен стимулируемый трансплантат 11, зафиксированный медиально поверх прозрачного стекла 17 в однокамерном биореакторе 1. С помощью по меньшей мере 3 фиксирующих стенок 28 должно предупреждаться вызываемое потоком среды горизонтальное движение трансплантата 11 по дну реактора в целях достижения оптимальной перфузии и стимуляции давлением. Эти опущенные в реактор 1 биосовместимые фиксирующие стенки 28 по своей высоте должны быть ниже амплитуды давления, прикладываемого к трансплантату 11.Fig. 9a shows a stimulated graft 11 fixed medially over a clear glass 17 in a single-chamber bioreactor 1. Using at least 3 fixing walls 28, horizontal movement of the graft 11 along the bottom of the reactor caused by the flow of the medium should be prevented in order to achieve optimal perfusion and pressure stimulation. These biocompatible fixing walls 28 lowered into the reactor 1 should be lower in height than the amplitude of the pressure applied to the graft 11.

На фиг.9b представлена схема использования по меньшей мере 3 фиксирующих стенок 28 в двухкамерном биореакторе для горизонтальной фиксации трансплантата 11 при различных условиях потока, идеальной вертикальной перфузии, а также механического воздействия давлением.Fig. 9b shows a diagram of the use of at least 3 fixing walls 28 in a two-chamber bioreactor for horizontal fixation of the graft 11 under various flow conditions, ideal vertical perfusion, and mechanical pressure.

Пример 10Example 10

Магнитные системы для управления миниактуатором 14Magnetic systems for controlling the mini-actuator 14

На фиг.10 представлены (на примере однокамерного биореактора) характерные устройства и расположения аппаратуры для бесконтактно управляемого способа стимуляции путем воздействия миниактуатором 14 на трансплантат 11.Figure 10 presents (by the example of a single-chamber bioreactor) characteristic devices and equipment locations for a contactlessly controlled method of stimulation by exposure to a mini-actuator 14 on the graft 11.

На фиг.10a (магнитный эффект управления - притягивание магнита) представлены характерное устройство и принцип бесконтактного управления магнитным актуатором 14 в биореакторе 1 для деформации давлением трансплантата 11. Постоянный магнит в миниактуаторе 14 ориентирован по преобладающему направлению магнитного поля, генерируемого расположенным снаружи управляющим магнитом 15. С помощью этого магнита 15, представляющего собой, например, по меньшей мере один постоянный магнит или по меньшей мере одну катушку, генерируется определенное (электро-)магнитное поле, силовые линии которого проникают во все внутреннее пространство биореактора 1 и вызывают зависимое от направления силовых линий движение пуансона миниактуатора 14. В рамках иллюстрированного фиг.10a способа представлен принцип притягивания магнитом управления 15, в данном случае, для примера, расположенного вверху.Fig. 10a (magnetic control effect - magnet attraction) shows a characteristic device and the principle of non-contact control of the magnetic actuator 14 in the bioreactor 1 for deformation by transplant pressure 11. The permanent magnet in the mini-actuator 14 is oriented in the prevailing direction of the magnetic field generated by the external control magnet 15. Using this magnet 15, which is, for example, at least one permanent magnet or at least one coil, a certain (electrical ) a magnetic field whose lines of force penetrate the entire inner space of the bioreactor 1 and cause the punch of the mini-actuator 14 to depend on the direction of the lines of force. The principle of attracting the control magnet 15, in this case, for example, located at the top, is presented within the illustrated FIG.

На фиг.10b (магнитный пример управления - отталкивание магнита) представлен пример исполнения со вторым магнитным принципом управления, реализованным магнитной системой управления 15 и миниактуатором 14, а именно магнитным отталкиванием. Путем изменения направления силового поля управляющего магнита 15 изменяется направление движения миниактуатора 14, который теперь опускается вниз на трансплантат 11. При увеличении мощности/плотности магнитного потока, исходящего от управляющего магнита 15, усиливается также и нагрузка давления на трансплантат 11 до получения целевого значения для стимуляции в условиях, близких к условиям «in-vivo».10b (a magnetic control example — magnet repulsion) is an embodiment with a second magnetic control principle implemented by the magnetic control system 15 and the mini-actuator 14, namely, magnetic repulsion. By changing the direction of the force field of the control magnet 15, the direction of movement of the mini-actuator 14, which now drops down to the graft 11, changes. With increasing power / density of the magnetic flux coming from the control magnet 15, the pressure load on the graft 11 also increases to obtain the target value for stimulation in conditions close to in-vivo conditions.

На фиг.10c-10e представлено расположение элементов управления, позволяющее циклически и с высокой частотой управлять миниактуатором 14 в закрытом биореакторе 1.On figs-10e presents the location of the controls, allowing cyclically and with high frequency to control the mini-actuator 14 in a closed bioreactor 1.

На фиг.10c (управление миниактуатором 14 с помощью направляющей пластины управляющего магнита) представлена форма выполнения системы управления на базе постоянного магнита. В данном варианте управления на расположенной, например, поверх прототипа реактора линейно управляемой направляющей пластине 31 применяются несколько постоянных магнитов 32 различных размеров, разной полярности и, тем самым, разной силы и направленности силового поля. On figs (control mini-actuator 14 using the guide plate of the control magnet) presents a form of execution of the control system based on a permanent magnet. In this control variant, several permanent magnets 32 of various sizes, different polarity and, therefore, different strength and directivity of the force field are used on, for example, a linearly controlled guide plate 31 located on top of the reactor prototype.

При этом с помощью линейного двигателя 29 осуществляется привод направляющей пластины 30 с зажатым в креплении 31 постоянным магнитом 32. Эта мобильная фаза магнитной системы делает излишним движение биореактора 1.In this case, with the help of the linear motor 29, the guide plate 30 is driven with the permanent magnet 32 clamped in the mount 31. This mobile phase of the magnetic system makes the bioreactor 1 unnecessary to move.

Система управления на фиг.10d (управление миниактуатором 14 посредством вращающегося постоянного магнита) также основана на управлении магнитным пуансоном 14 с помощью системы постоянного магнита на вращающемся диске. The control system of FIG. 10d (controlling the mini-actuator 14 by means of a rotating permanent magnet) is also based on controlling the magnetic punch 14 by means of a permanent magnet system on a rotating disk.

При этом серводвигатель 29 вращает крепление 31 с закрепленным в нем постоянным разнополюсным магнитом 32. В это вращающееся крепление магнита могут быть установлены, например, четыре разнополюсных магнита 32, при этом при его полном вращении на трансплантат 11 дважды оказывается комплексное давление. Эти вращающиеся магниты в комбинации с частотой вращения серводвигателя 29 дают возможность изменять магнитное поле с высокой частотой и создавать, тем самым, высокодинамичную схему стимуляции трансплантата 11. Вид спереди поясняет магнитные эффекты ротационной системы на примере двух биореакторов 1. Форма выполнения этого устройства может применяться с большим числом биореакторов 1, если они расположены точно над или под центром управляющего магнита.In this case, the servomotor 29 rotates the mount 31 with the permanent multi-pole magnet 32 fixed therein. For example, four different-pole magnets 32 can be installed in this rotating magnet mount, and when it is fully rotated, the transplant 11 is subjected to complex pressure twice. These rotating magnets in combination with the rotation speed of the servomotor 29 make it possible to change the magnetic field with a high frequency and thereby create a highly dynamic transplant stimulation scheme 11. The front view illustrates the magnetic effects of the rotation system using two bioreactors as an example 1. The embodiment of this device can be used with a large number of bioreactors 1, if they are located exactly above or below the center of the control magnet.

На фиг.10e (управление миниактуатором 14 с помощью катушки с железным сердечником 35) представлено магнитное устройство на базе магнитной катушки. 10e (control of a mini-actuator 14 using an iron core coil 35), a magnetic device based on a magnetic coil is shown.

Эта система с магнитной катушкой работает с индукционной катушкой 35, в данном случае расположенной над биореактором 1, с генерированием определенного электромагнитного поля, плавно регулируемого через подводимую электрическую мощность и допускающего любую позицию миниактуатора 14 в корпусе биореактора. За счет изменения полярности направления тока происходит перемена направления силового тока и электромагнитного эффекта. Используемая катушка с железным сердечником 35 создает направленное перпендикулярно обмотке катушки электрическое поле и воздействует на статический постоянный магнит миниактуатора 14, притягивая или отталкивая его.This system with a magnetic coil works with an induction coil 35, in this case located above the bioreactor 1, with the generation of a certain electromagnetic field, smoothly regulated through the supplied electric power and allowing any position of the mini-actuator 14 in the bioreactor body. By changing the polarity of the current direction, the direction of the power current and the electromagnetic effect change. The used coil with an iron core 35 creates an electric field directed perpendicular to the coil of the coil and acts on the static permanent magnet of the mini-actuator 14, attracting or repelling it.

Автоматизированная станция этой системы состоит из мощной катушки 35 с незначительным выделением тепла и закрытого регулируемого трансформатора, мощность которого контролируется универсальным измерительным прибором. Кроме того, применяется микроконтроллер для управления реле, включающим ток в нужном направлении, что позволяет создавать эффект периодического воздействия давлением на клеточный конструкт.The automated station of this system consists of a powerful coil 35 with little heat and a closed adjustable transformer, the power of which is controlled by a universal measuring device. In addition, a microcontroller is used to control the relay, including the current in the desired direction, which allows you to create the effect of periodic exposure to pressure on the cell construct.

Пример 11Example 11

Схема стимуляции в двухкамерном реактореStimulation scheme in a two-chamber reactor

На фиг.11 представлена общая схема стимуляции нового отвечающего требованиям GMP биореактора 1. При этом механическая стимуляция давлением, перфузия и индуцированное потоком срезающее усилие в трехмерном трансплантате 11 реализуются одновременно.Figure 11 presents the General scheme of stimulation of a new GMP-compliant bioreactor 1. In this case, mechanical pressure stimulation, perfusion and flow-induced shear force in the three-dimensional graft 11 are realized simultaneously.

На фиг.11a (стимуляция перфузии без механической нагрузки) происходит стимуляция клеточного конструкта 11 только с помощью направленного потока среды, приводящего к перфузии конструкта с воздействием срезающего усилия на клеточную мембрану в диапазоне мкПа. В представленном примере этого способа идет непрерывная подача питательной среды в два входа 19 так, чтобы обеспечивалось снабжение каждой реакторной камеры, сначала происходило выравнивание концентрации в пределах трансплантата 11, а затем, в зависимости от выбранного расхода потока, в конструкте образовывалась верхняя и нижняя перфузионные зоны. Израсходованная среда покидает реактор через два следующих выхода 19. При такой поточной стимуляции подачи на трансплантат давления не происходит, так как пуансон 14 удерживается управляющей магнитной системой 15 в крайнем верхнем положении в биореакторе 1.On figa (stimulation of perfusion without mechanical load) is the stimulation of the cell construct 11 only using a directed flow of medium, leading to perfusion of the construct with the action of shearing forces on the cell membrane in the range of μPa. In the presented example of this method, there is a continuous supply of nutrient medium to two inlets 19 so that each reactor chamber is supplied, concentration was equalized within the graft 11 first, and then, depending on the selected flow rate, the upper and lower perfusion zones formed in the design . The consumed medium leaves the reactor through the following two exits 19. With such flow stimulation, the pressure on the transplant is not pressured, since the punch 14 is held by the control magnetic system 15 in its highest position in the bioreactor 1.

На фиг.11b (стимуляция перфузии и применение пуансона) представлен второй шаг множественной стимуляции трансплантата 11 в биореакторе 1. Сначала, как в данном примере, модифицируются условия потока. С помощью 3-ходового клапана 6 поток питательной среды направляется в нижнюю реакторную камеру, откуда он, проходя с перфузией через трансплантат 11, обеспечивает обмен веществ и покидает затем верхнее пространство реактора через отводящий трубопровод. Путем изменения полярности системы управляющего магнита, в данном случае катушки с железным сердечником 35, при ограниченной силовой индукции приводится в действие магнитный миниактуатор 14, воздействующий, например, на цилиндрический трансплантат 11. Подобное применение пуансона с 0%-процентной деформацией конструкта является поворотной точкой миниактуатора 14 при динамической высокочастотной деформации клеточной матрицы 11.On fig.11b (stimulation of perfusion and the use of the punch) presents the second step of multiple stimulation of the graft 11 in the bioreactor 1. First, as in this example, the flow conditions are modified. Using a 3-way valve 6, the flow of the nutrient medium is directed to the lower reactor chamber, from where it, passing through perfusion through the transplant 11, provides metabolism and then leaves the upper space of the reactor through the discharge pipe. By changing the polarity of the control magnet system, in this case the coil with an iron core 35, with limited power induction, a magnetic mini-actuator 14 is activated, for example, acting on a cylindrical transplant 11. A similar use of a punch with a 0% deformation of the structure is the turning point of the mini-actuator 14 during dynamic high-frequency deformation of the cell matrix 11.

На следующем этапе способа стимуляции, как это представлено на фиг.11c (стимуляция перфузии и механическая нагрузка), происходит увеличение силы магнитного поля, генерируемого катушкой 35. Результатом такого повышения плотности магнитного потока является усиление компрессии трансплантата 11 до желаемой деформации, преимущественно имитирующей процессы, аналогичные процессам «in-vivo». После этой стимуляции давлением могут в периодическом режиме попеременно осуществляться раздражение клеток и применение пуансона. In the next step of the stimulation method, as shown in Fig. 11c (perfusion stimulation and mechanical loading), the magnetic field generated by the coil 35 increases. The result of this increase in magnetic flux density is to increase the compression of the graft 11 to the desired deformation, mainly simulating processes, similar to in-vivo processes. After this stimulation by pressure, cell irritation and the use of a punch may be alternately carried out periodically.

С помощью указанной аппаратуры и описанного способа может также осуществляться статическая компрессия имплантата. Using the specified equipment and the described method can also be carried out static compression of the implant.

В принципе, в ходе этой механической нагрузки может осуществляться направленная перфузия конструкта с помощью матрицы носителя, поставляющая клеткам нутриенты и отводящая метаболиты, прежде всего, во время фазы активного обмена веществ, например, при пролиферации и дифференцировке (внеклеточном синтезе матрицы). In principle, during this mechanical loading, directed perfusion of the construct using a carrier matrix can be carried out, supplying the cells with nutrients and diverting metabolites, primarily during the active metabolism phase, for example, during proliferation and differentiation (extracellular matrix synthesis).

После отработки протокола нагрузки давлением пуансон возвращается в свое исходное положение, продолжается перфузия клеточной культуры, например, в непрерывном режиме и извлекается, например, трансплантант 11 при достаточно синтезированной внеклеточной матрице.After working out the pressure loading protocol, the punch returns to its original position, perfusion of the cell culture continues, for example, in continuous mode, and, for example, graft 11 is removed with a sufficiently synthesized extracellular matrix.

Список позицийList of items

1. Биореактор1. Bioreactor

2. Резервуар для среды2. Medium tank

3. Резервуар для вспомогательной среды3. Tank for auxiliary medium

4. Шланговая система4. Hose system

5. Циркуляционный насос5. Circulation pump

6. 3-ходовой клапан6. 3-way valve

7. 4-ходовой клапан7.4-way valve

8. Пробоотборный участок8. Sampling site

9. Биодатчики Glu/Lac9. Glu / Lac biosensors

10. Измерительный щупы pH, pCO₂, pO₂ 10. Measuring probes pH, pCO ₂ , pO ₂

11. Трансплантат11. Transplant

12. Клетки/ткань12. Cells / Tissue

13. Опорная матрица13. Support matrix

14. Миниактуатор14. Miniactuator

15. Управляющий магнит15. Control magnet

16. Пористый агломерационный материал16. Porous sinter material

17. Прозрачное стекло17. clear glass

18. Проницаемая мембрана18. Permeable membrane

19. Шланговая муфта/соединение Luer19. Hose coupling / Luer connection

20. Зажимное кольцо20. Clamp ring

21. Запор реактора21. Reactor constipation

22. Постоянный магнит22. Permanent magnet

23. Капсула23. Capsule

24. Поверхность пуансона24. The surface of the punch

25. Колба для высева25. Flask for seeding

26. Пуансон26. Punch

27. Подвижная пластина27. Movable plate

28. Фиксирующая стенка28. Locking wall

29. Серводвигатель29. Servo motor

30. Направляющая30. Guide

31. Крепление магнита31. Magnet mount

32. Постоянный магнит32. Permanent magnet

33. Проточные каналы33. Flow channels

34. Удлинитель34. Extension cord

35. Катушка35. Coil

Claims

1. A method of culturing mechanically resistant to autologous transplantation of suitable cells of connective or supporting tissue in a bioreactor, comprising the following stages:
a) preparing autologous cells of connective or supporting tissue (12) in a known manner for culturing explant cells in a bioreactor,
b) mixing these cells (12) with a biocompatible or bioresorbable curable carrier matrix (13);
c) placing the autologous cell matrix suspension thus obtained in a flask (25) for seeding with any cross-section corresponding to the resulting transplant and curing the mixture from step (b) to obtain an in-vivo adaptive three-dimensional structure of the graft (11),
d) insertion of a flask for seeding with the graft (11) thus obtained into the space of the bioreactor chamber (1), medial application of the graft to the bottom of the bioreactor and removal of the flask for seeding,
e) culturing the transplant under the influence of perfusion flow and recovering, after completion of the cultivation, the obtained tissue substitute material for further use,
characterized in that the graft (11) at the stage of cultivation on the opposite bottom of the bioreactor surface is loaded due to acting as a mini-actuator, similar to the flask of the punch (14), which in the bioreactor (1) is placed above the graft (11) and through one or of several external control / control magnets (15) that moves along the bioreactor (1) longitudinally to the surface of the graft and this determines the pressure on the graft, while the control magnet (15)
(a) consists of at least two permanent magnets (32) with different vertical directions of the magnetic poles, which are inserted into a rectangle-shaped magnetic holder (31) and are cycled along the bioreactor using a servomotor (29) and a guiding element (30) ( 1) in the horizontal direction or which are inserted into the disk-shaped magnetic holder (31) and with the help of a rotary actuator of the servomotor (29) are cyclically moved along the bioreactor (1), or
(b) is made as an electric magnet with at least one induction coil (35), the field of which is controlled using a changing high frequency to ensure high dynamics of the magnetic field and the impact of the mini-actuator (14) on the graft (11), moreover, as the mixing process in the bioreactor space under the influence of perfusion flow, as well as the pressure on the graft are regulated in time, quantity or strength depending on the cultivation conditions and thus cause repeated irritation of cells current, like irritation "in-vivo".

2. The method according to claim 1, characterized in that the conditioned medium is periodically passed through the transplant (11) and cyclically loaded with a pressure transmitting magnetic punch (14).

3. The method according to claim 1 or 2, characterized in that the pressure on the graft (11) is exerted during perfusion.

4. The method according to claim 1 or 2, characterized in that the graft (11), depending on its application, is irritated by static compressive loads, predominantly similar to “in-vivo” compressive loads, or by structural deformations, or continuously subjected to periodic or dynamic forces compression.

5. The method according to claim 1 or 2, characterized in that the magnetic field of the mini-actuator (14) is created by at least one permanent magnet.

6. The method according to claim 1 or 2, characterized in that the external control / control magnet (15) contains at least two permanent magnets with alternating polarity on a movable holder on top of the bioreactor, which periodically change their position using a servomotor, as a result whereby the magnetic pressure plug (14) periodically exerts pressure on the graft (11).

7. The method according to claim 1 or 2, characterized in that the control / control magnet (15) located outside is an electromagnet, the coil of which changes the current direction and voltage with a high frequency, and with it the field direction and magnetic flux density over bioreactor, as a result of which the magnetic mini-actuator (14) periodically exerts pressure on the graft.

8. A bioreactor for culturing suitable connective or supporting tissue cells mechanically resistant to autologous transplantation in a bioreactor, comprising a main body, which is hermetically and sterilely connected to the constipation (21) of the reactor and forms at least one reactor space in which a surface is provided for placement " in-vivo "adaptive three-dimensional graft (11) made from a cured mixture of suspended cells (12) with a biocompatible or resorbable carrier matrix (13) and equipped with m at least two inlets or outlets (19) for continuous transfusion of the transplant with a nutrient medium, characterized in that it contains a punch (14) similar to the bulb in the reactor space above the transplant (11), and also a control located outside / control magnet (15), which is located in relation to the pressure punch (14) vertically and medially and depending on the polarity has the ability to move the magnetic pressure punch (14) in the bioreactor (1) in a non-contact way up and down, resulting in a change in pressure on the graft (11), while the control magnet (15)
(a) consists of at least two permanent magnets (32) with different vertical directions of the magnetic poles, which are inserted into a rectangle-shaped magnetic holder (31) and, using a servomotor (29) and a guide element (30), are cyclically moved around the bioreactor ( 1) in the horizontal direction or which are inserted into the disk-shaped magnetic holder (31) and with the help of a rotary actuator of the servomotor (29) are cyclically moved along the bioreactor (1), or
(b) is made in the form of an electric magnet with at least one induction coil (35), the field of which is controlled using a changing high frequency to ensure high dynamics of the magnetic field and the impact of the mini-actuator (14) on the transplant (11).

9. The bioreactor according to claim 8, characterized in that the bioreactor (1) is designed as a single chamber bioreactor and the graft (11) can be directly or indirectly cultivated and stimulated at the bottom of the bioreactor (1).

10. The bioreactor according to claim 8, characterized in that the bioreactor (1) is designed as a two-chamber bioreactor and the graft (11) directly or indirectly at least partially lies on the bottom surface of the upper reaction chamber for cultivation and stimulation, while under the graft (11) is the second space of the reactor.

11. Bioreactor according to claim 10, characterized in that the upper chamber of the bioreactor (1) on its main surface corresponds to the main surface of the graft, while the sizes of the lower chamber are smaller than the sizes of the graft, as a result of which, for the medial arrangement of the cell culture, this construct is mostly located above the lower chamber and partially on the bottom of the upper chamber of the reactor.

12. The bioreactor according to claim 10 or 11, characterized in that the space of the lower chamber of the reactor is filled with a flat disk (16) of a biologically inert light-transmitting large-porous material, mainly a porous agglomeration material, so that an even bottom closure of the reactor from this disk is formed (16) and the bottom of the upper chamber of the reactor.

13. Bioreactor according to claim 8, characterized in that the closure (21) made in the form of a cover is equipped with biosensors (8), and / or measuring probes (10), and / or a sampling section (1).

14. Bioreactor according to claim 8, characterized in that the inlet and outlet connections (19) connected to the bioreactor chambers are equipped with a 3-way valve (6) or a 4-way valve (7) with a non-return valve function.

15. The bioreactor according to claim 8, characterized in that for monitoring the transplant manufacturing process, the bioreactor (1) in the area of the bottom of the bioreactor (1) completely or partially consists of a transparent material, mainly transparent glass (17).

16. The bioreactor according to claim 8, characterized in that a film, tissue or membrane (18) of an antistatic or inert material is located above the bottom of the bioreactor (1) to place the graft on it (11), and this material mainly has large cells and passes light, liquid and gas.

17. The bioreactor according to claim 8, characterized in that the mini-actuator (14) in the single-chamber bioreactor (1) is located above the membrane (18) and the graft (11) in the space of the bioreactor (1).

18. The bioreactor according to claim 8, characterized in that the mini-actuator (14) in the two-chamber bioreactor (1) is located above the porous material (16), the membrane (18) and the graft (11) in the upper space of the reactor.

19. A bioreactor according to claim 8, characterized in that the magnetic mini-actuator (14) used consists of a magnetic rod body (22) in the form of a permanent magnet, which is enclosed in a biologically inert capsule (23).

20. The bioreactor according to claim 19, characterized in that the piston-shaped mini-actuator (14) consists of more than one cylinder of the capsule (23), so that one cylinder of the capsule contains a permanent magnet, and the other cylinder has a recess (24) for the punch, moreover, spatially separated cylinders are connected to each other by a jumper (34) or a functionally equivalent connection.

21. The bioreactor according to claim 19 or 20, characterized in that the capsule (24) of the mini-actuator (14) is provided with holes and / or flow channels (33) in such a way that it is provided exactly at least in three places of the outer diameter adjusted vertical direction of movement of the mini-actuator (14).

22. The bioreactor according to claim 8, characterized in that it contains a cylindrical flask for seeding (25) with an inner diameter corresponding to the outer diameter of the graft, designed to inject a mixture of cells (12) and the carrier matrix (13) onto the movable plate (27), moreover, the aforementioned flask for sowing after the placement of the cured graft in the flask for sowing the graft (11) in the space of the reactor is removed from the device.