KR101313769B1 - Device for culturing soft tissue homograft - Google Patents

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Abstract

본 발명은 동종 연조직 이식체 배양 장치를 제공한다. 이에 따르면, 도입된 자가 줄기 세포가 이식된 동종 연조직 이식체에 적절한 배양 조건 및 물리적 자극을 제공하여 인체의 손상된 연조직을 대체할 수 있는 획기적인 동종 연조직 이식체를 배양 및 제조할 수 있다.The present invention provides an allogeneic soft tissue implant culture device. According to this, it is possible to culture and prepare a breakthrough allogeneic soft tissue implant that can replace the damaged soft tissues of the human body by providing appropriate culture conditions and physical stimulation to the allogeneic soft tissue implant into which the introduced autologous stem cells are transplanted.

Description

동종 연조직 이식체 배양 장치{Device for culturing soft tissue homograft}Device for culturing soft tissue homograft

본 발명은 동종 연조직 이식체를 배양하기 위한 장치에 관한 것이다.The present invention relates to an apparatus for culturing allogeneic soft tissue implants.

현재 전 세계적으로 건강에 대한 관심은 나날이 증가하고 있다. 특히, 꾸준한 운동은 건강한 삶을 유지하는 필수적인 조건으로 인정되고 있는 실정이다. 그러나, 적절한 운동은 건강 유지에 도움이 되지만, 과도한 운동은 오히려 건강에 해를 끼칠 수 있다. 대표적인 예로서, 과도한 운동에 의해 근골격계에 이상이 생길 경우 환자는 거동조차 불가능하고, 오랜 기간 동안 물리치료 등을 받지 않으면 완치되기 어려운 경우가 빈번하다. 특히 슬관절 부위 중 십자인대가 손상되는 경우 물리치료만으로는 이러한 손상을 회복시킬 수 없고, 그나마 환자 본인의 자가 조직을 이식하는 방법으로 치료하고 있는 실정이다. 그러나, 상기 자가 조직의 이식도 지속적인 재활 치료가 요구되고, 본래 고유의 인대와는 달리 이식된 자가 조직은 그 물성이 현저하게 떨어져서 실질적인 치료로 볼 수 없다. 따라서, 손상된 인대, 즉 손상된 연조직을 치료하기 위하여 본연의 물성이 유지되고, 면역 거부 반응을 현저하게 줄일 수 있으며, 환자 본인의 고유 연조직과 최대한 유사하게 대체될 수 있는 동종 연조직 이식체가 요구되고 있는 실정이며, 환자 본인의 고유 연조직과 최대한 유사하게 대체될 수 있는 동종 연조직 이식체를 제조하기 위해서는 적절한 배양 조건을 유지하되, 상기 동종 연조직 이식체에 본래 연조직에 제공된 외부 자극과 최대한 동일한 물리적 자극을 제공할 수 있는 배양 장치가 요구된다.At present, interest in health around the world is increasing day by day. In particular, steady exercise is recognized as an essential condition for maintaining a healthy life. However, while proper exercise helps maintain good health, excessive exercise can rather harm health. As a representative example, when an abnormality occurs in the musculoskeletal system due to excessive exercise, the patient may not even be able to behave, and it is often difficult to cure without receiving physical therapy for a long time. In particular, if the cruciate ligament is damaged in the knee area, physical therapy alone cannot recover the damage, but the situation is being treated by transplanting the patient's own tissue. However, the transplantation of the autologous tissue also requires continuous rehabilitation treatment, and unlike the original inherent ligaments, the transplanted autologous tissues are markedly inferior in physical properties and cannot be viewed as a practical treatment. Therefore, there is a need for allogeneic soft tissue implants that can maintain their physical properties, significantly reduce immune rejection, and replace them as closely as possible with their own soft tissues in order to treat damaged ligaments, ie, damaged soft tissues. In order to prepare allogeneic soft tissue implants that can be replaced as closely as possible with the patient's own native soft tissue, appropriate culture conditions may be maintained, but the alloplastic soft tissue implants may be provided with the same physical stimulus as the external stimulus originally provided to the soft tissue. There is a need for a culture apparatus that can.

본 발명은 인체의 손상된 연조직을 효율적으로 대체할 수 있는 자가 줄기 세포가 이식된 동종 연조직 이식체를 제조하기 위하여 적절한 배양 조건 및 물리적 자극을 가할 수 있도록 구현된 동종 연조직 이식체 배양 장치를 제공하기 위함이다.The present invention is to provide an allogeneic soft tissue implant culture device that is implemented to apply appropriate culture conditions and physical stimulation in order to produce allogeneic soft tissue implants in which autologous stem cells are transplanted to efficiently replace damaged soft tissues of the human body. to be.

본 발명은 자가 줄기 세포가 이식된 동종 연조직 이식체 및 상기 자가 줄기 세포를 배양하기 위한 세포 배양액을 포함하는 세포 배양 챔버; 상기 세포 배양 챔버 내에 배치된 상기 동종 연조직 이식체의 상 말단 및 하 말단에 각각 연결 부착되어 상기 동종 연조직 이식체를 수직 배치시키는 상부 그립 및 하부 그립; 상기 상부 그립 및 상기 하부 그립을 각각 고정하되, 상기 고정된 상태로 상하 방향 이동하거나, 및/또는 시계 또는 반시계 방향으로 회전 가능하도록 배치되어 상기 상부 그립 및 상기 하부 그립에 의해 수직 배치된 상기 동종 연조직 이식체에 인장 자극 및/또는 비틀림 자극을 제공하도록 구현된 상부 고정 자극부 및 하부 고정 자극부; 및 상기 상부 고정 자극부 및 상기 하부 고정 자극부에 구동축을 통해 각각 연결되고, 상기 구동축을 통해 상기 상부 고정 자극부 및 상기 하부 고정 자극부에 상하 방향 이동 및 회전 운동의 구동력을 전달하는 상부 구동 모터 및 하부 구동 모터를 포함하는 동종 연조직 이식체 배양 장치를 제공한다.The present invention provides a cell culture chamber including an allogeneic soft tissue implant into which autologous stem cells are transplanted and a cell culture solution for culturing the autologous stem cells; An upper grip and a lower grip connected to the upper and lower ends of the allogeneic soft tissue implant disposed in the cell culture chamber to vertically position the allogeneic soft tissue implant; The upper grip and the lower grip are fixed to each other, and are arranged to be movable up and down in the fixed state, and / or rotatable in a clockwise or counterclockwise direction so as to be vertically disposed by the upper grip and the lower grip. An upper fixed stimulus and a lower fixed stimulus configured to provide tensile and / or torsional stimuli to the soft tissue implant; And an upper driving motor connected to the upper fixed magnetic pole part and the lower fixed magnetic pole part through a driving shaft, and transmitting a driving force of vertical movement and rotational movement to the upper fixed magnetic pole part and the lower fixed magnetic pole part through the driving shaft. And it provides a homologous soft tissue implant culture device comprising a lower drive motor.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 세포 배양 챔버는 그 외부 표면에 배치되되, 상기 세포 배양 챔버 내에 배치된 세포 배양액의 온도를 유지 제어하고 이산화탄소를 공급하도록 구현된 수로 채널을 더 포함할 수 있다.According to one embodiment of the present invention, the cell culture chamber may be disposed on an outer surface thereof, and may further include a channel channel configured to maintain and control the temperature of the cell culture solution disposed in the cell culture chamber and supply carbon dioxide. .

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 동종 연조직 이식체는 인대, 또는 뼈 단편과 연결된 인대일 수 있다.According to one embodiment of the invention, the allogeneic soft tissue implant may be ligaments or ligaments linked to bone fragments.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 동종 연조직 이식체는 상기 자가 줄기 세포를 포함하는 하나 이상의 포어를 포함할 수 있다.According to one embodiment of the invention, the allogeneic soft tissue implant may comprise one or more pores comprising the autologous stem cells.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 동종 연조직 이식체에 인장 자극을 제공하기 위하여 상기 상부 고정 자극부는 상기 동종 연조직 이식체의 전체 길이 대비 10% 이하 범위 내에서 상향 이동함과 동시에 상기 하부 고정 자극부는 상기 동종 연조직 이식체의 전체 길이 대비 10% 이하 범위 내에서 하향 이동하도록 구현될 수 있다.According to an embodiment of the present invention, the upper fixed stimulus portion moves upwards within a range of 10% or less of the total length of the allogeneic soft tissue graft and provides the lower fixed stimulus to provide tensile stimulation to the allogeneic soft tissue implant. The portion may be implemented to move downwards within 10% or less of the total length of the allogeneic soft tissue implant.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 동종 연조직 이식체에 비틀림 자극을 제공하기 위하여 상기 상부 고정 자극부는 45 도 이하 범위 내에서 시계 방향으로 회전함과 동시에 상기 하부 고정 자극부는 45 도 이하 범위 내에서 반시계 방향으로 회전하도록 구현되거나, 또는 상기 상부 고정 자극부는 45 도 이하 범위 내에서 반시계 방향으로 회전함과 동시에 상기 하부 고정 자극부는 45 도 이하 범위 내에서 시계 방향으로 회전하도록 구현될 수 있다.According to one embodiment of the present invention, the upper fixed stimulator rotates clockwise within a range of 45 degrees or less and the lower fixed stimulus within a range of 45 degrees or less to provide a torsional stimulus to the allogeneic soft tissue implant. The upper fixed magnetic pole portion may be implemented to rotate in a counterclockwise direction, or the upper fixed magnetic pole portion may be implemented to rotate in a clockwise direction within a range of 45 degrees or less while the upper fixed magnetic pole portion rotates in a counter clockwise direction.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 동종 연조직 이식체에 인장 자극 및/또는 비틀림 자극을 제공하기 위하여 상기 상부 고정 자극부 및 상기 하부 고정 자극부는 초당 1회 이하의 빈도로 상하 방향 이동 및/또는 시계 또는 반시계 방향으로 회전하도록 구현될 수 있다.According to one embodiment of the present invention, the upper fixed magnetic pole portion and the lower fixed magnetic pole portion in order to provide a tensile stimulation and / or torsional stimulation to the allogeneic soft tissue implants and the vertical movement and / or downward direction at a frequency of less than once per second It may be implemented to rotate clockwise or counterclockwise.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 동종 연조직 이식체 배양 장치는 배양 조건이 프로그램화된 세포 배양 시스템 장치에 구동 가능하게 연결되고, 상기 세포 배양 시스템 장치에 의해 제어될 수 있다.According to one embodiment of the invention, the allogeneic soft tissue implant culture device is operably connected to a cell culture system device in which culture conditions are programmed, and can be controlled by the cell culture system device.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 세포 배양 챔버는 멸균 상태로 유지되도록 구현될 수 있다.According to one embodiment of the invention, the cell culture chamber may be implemented to be maintained in a sterile state.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 세포 배양 챔버는 그 내부에 세포 배양액을 유입 또는 유출할 수 있고 이산화탄소 기체를 유입 또는 유출할 수 있도록 배치된 유입출부를 더 포함할 수 있다.According to one embodiment of the present invention, the cell culture chamber may further include an inlet / outlet arranged to allow inflow or outflow of cell culture fluid therein and to inflow or outflow of carbon dioxide gas.

본 발명에 따른 동종 연조직 이식체 배양 장치를 제공함으로써 도입된 자가 줄기 세포가 이식된 동종 연조직 이식체에 적절한 배양 조건 및 물리적 자극을 제공하여 인체의 손상된 연조직을 대체할 수 있는 획기적인 동종 연조직 이식체를 배양 및 제조할 수 있다.By providing an allogeneic soft tissue implant culture apparatus according to the present invention, a novel allogeneic soft tissue implant that can replace damaged soft tissues of the human body by providing appropriate culture conditions and physical stimulation to allogeneic soft tissue implants into which autologous stem cells are introduced is implanted. Can be cultured and prepared.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 동종 연조직 이식체 배양 장치를 도시한다.
도 2는 수로 채널을 포함된 본 발명의 일 실시예에 따른 동종 연조직 이식체 배양 장치를 도시한다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 동종 연조직 이식체 배양 장치에서 배양되는 자가 줄기 세포가 이식된 동종 연조직 이식체를 도시한다.
도 4는 동종 연조직 이식체에 인장 자극을 제공하는 본 발명의 일 실시예에 따른 동종 연조직 이식체 배양 장치를 도시한다.
도 5는 동종 연조직 이식체에 비틀림 자극을 제공하는 본 발명의 일 실시예에 따른 동종 연조직 이식체 배양 장치를 도시한다.
도 6은 배양 조건이 프로그램화된 세포 배양 시스템 장치와 구동 가능하게 연결된 본 발명의 일 실시예에 따른 동종 연조직 이식체 배양 장치를 도시한다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 생체배양기에서 물리적 자극 전 후 줄기세포 담지겔 이식 경골건의 Real time PCR 분석 결과를 도시한다.
도 8는 본 발명의 일 실시예에 따른 생체배양기내에서 물리적 자극을 준 줄기세포 담지겔 이식군의 GAG 함량 분석 결과를 도시한다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 생체배양기내에서 물리적 자극을 준 줄기세포 담지겔 이식군의 콜라겐 함량 분석 결과를 도시한다.1 shows an allogeneic soft tissue implant culture device according to one embodiment of the invention.
Figure 2 shows an allogeneic soft tissue implant culture device according to one embodiment of the present invention comprising a channel.
Figure 3 shows an allogeneic soft tissue implant with autologous stem cells cultured in an allogeneic soft tissue implant culture device according to one embodiment of the invention.
Figure 4 illustrates an allogeneic soft tissue implant culture device according to one embodiment of the present invention for providing tensile stimulation to allogeneic soft tissue implants.
FIG. 5 illustrates an allogeneic soft tissue implant culture device according to one embodiment of the present invention for providing torsional stimulation to allogeneic soft tissue implants.
FIG. 6 illustrates an allogeneic soft tissue implant culture device in accordance with one embodiment of the present invention in which the culture conditions are operably linked to a programmed cell culture system device.
Figure 7 shows the results of Real time PCR analysis of stem cell-supported gel graft tibial tendon before and after physical stimulation in a bioculture according to an embodiment of the present invention.
Figure 8 shows the results of GAG content analysis of the stem cell-supported gel transplant group subjected to physical stimulation in the incubator according to an embodiment of the present invention.
Figure 9 shows the results of the collagen content analysis of the stem cell-supported gel transplant group subjected to physical stimulation in the incubator according to an embodiment of the present invention.

이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 일 실시예를 상세하게 설명한다. 이하 설명은 본 발명의 일 실시예들을 용이하게 이해하기 위한 수단일 뿐이며, 본 발명의 보호범위를 제한하기 위한 것은 아니다.Hereinafter, an embodiment of the present invention will be described in detail with reference to the accompanying drawings. The following description is merely a means for easily understanding the embodiments of the present invention, and is not intended to limit the protection scope of the present invention.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 동종 연조직 이식체 배양 장치를 도시한다.1 shows an allogeneic soft tissue implant culture device according to one embodiment of the invention.

도 1에 따르면, 본 발명의 일 실시예에 따른 동종 연조직 이식체 배양 장치는 자가 줄기 세포가 이식된 동종 연조직 이식체(100) 및 상기 자가 줄기 세포를 배양하기 위한 세포 배양액(200)을 포함하는 세포 배양 챔버(300); 상기 세포 배양 챔버 내에 배치된 상기 동종 연조직 이식체의 상 말단 및 하 말단에 각각 연결 부착되어 상기 동종 연조직 이식체를 수직 배치시키는 상부 그립 및 하부 그립(400); 상기 상부 그립 및 상기 하부 그립을 각각 고정하되, 상기 고정된 상태로 상하 방향 이동하거나, 및/또는 시계 또는 반시계 방향으로 회전 가능하도록 배치되어 상기 상부 그립 및 상기 하부 그립에 의해 수직 배치된 상기 동종 연조직 이식체에 인장 자극 및/또는 비틀림 자극을 제공하도록 구현된 상부 고정 자극부 및 하부 고정 자극부(500); 및 상기 상부 고정 자극부 및 상기 하부 고정 자극부에 구동축(600)을 통해 각각 연결되고, 상기 구동축을 통해 상기 상부 고정 자극부 및 상기 하부 고정 자극부에 상하 방향 이동 및 회전 운동의 구동력을 전달하는 상부 구동 모터 및 하부 구동 모터(700)를 포함한다.1, an allogeneic soft tissue implant culture device according to an embodiment of the present invention includes an allogeneic soft tissue implant 100 in which autologous stem cells are transplanted and a cell culture solution 200 for culturing the autologous stem cells. Cell culture chamber 300; An upper grip and a lower grip 400 connected to the upper and lower ends of the allogeneic soft tissue implant disposed in the cell culture chamber to vertically dispose the allogeneic soft tissue implant; The upper grip and the lower grip are fixed to each other, and are arranged to be movable up and down in the fixed state, and / or rotatable in a clockwise or counterclockwise direction so as to be vertically disposed by the upper grip and the lower grip. An upper fixation stimulus and a lower fixation stimulus 500, configured to provide tensile and / or torsional stimulation to the soft tissue implant; And a driving shaft 600 connected to the upper fixed magnetic pole portion and the lower fixed magnetic pole portion, respectively, to transfer the driving force of the vertical movement and the rotational movement to the upper fixed magnetic pole portion and the lower fixed magnetic pole portion through the driving shaft. An upper drive motor and a lower drive motor 700.

상기 세포 배양 챔버(300)는 자가 줄기 세포가 이식된 동종 연조직 이식체(100) 및 상기 자가 줄기 세포를 배양하기 위한 세포 배양액(200)을 포함한다. 상기 동종 연조직 이식체(soft tissue homograft, 100)는 자가 줄기 세포가 이식된 것으로서, 동일 개체간 또는 의학적으로 인정되는 동종 개체간 상호 이식될 수 있는 연조직을 포함하는 이식체를 말한다. 상기 연조직(soft tissue)은 일반적으로 뼈가 아닌 몸체 내 조직으로서 몸체의 기관 또는 다른 구조물을 연결하거나 또는 지지하거나 또는 둘러싸는 조직을 말하고, 예를 들어, 인대, 힘줄, 아킬레스 건, 티비아리스 건 등이 있다. 상기 연조직은 주로 몸체의 무게를 지탱하거나 유지하는 부위에 분포되어 있고, 반복적인 움직임, 예를 들어 굽힘, 꼬임, 회전 등을 지지하고 유지하는 역할을 한다. 상기 연조직은 몸체의 운동과 관련성이 크기 때문에 상기 연조직 또는 이와 관련된 해당 몸체 부위에 이상이 생길 경우 운동 계통에 치명적인 질환을 야기할 수 있다. 한편, 상기 동종이라 함은 동일 개체 또는 의학적으로 동종 개체로 인정될 수 있는 관계를 말한다. 상기 동종 연조직 지지체(support)는 자기의 몸체로부터 직접 분리되거나 또는 의료학적으로 인정되는 동종 개체로부터 분리되어 획득된 몸체의 일 구조물로서 해당 치료 부위에 대체되는 지지물을 말한다. 또한, 상기 동종 연조직 지지체는 기증된 시신으로부터 합법적으로 채취될 수도 있다. 상기 동종 연조직 지지체는 몸체로부터 분리된 구조물 그 자체일 수도 있지만, 적절한 이식을 위해 다른 몸체 구조물과 조합될 수도 있다. 예를 들어, 상기 동종 연조직 지지체는 인대 그 자체일 수도 있지만, 하나 이상의 뼈 단편과 연결된 구조물, 예를 들어 뼈 단편-인대 복합 구조물 또는 뼈 단편-인대-뼈 단편 복합 구조물일 수도 있다. 또한, 상기 동종 연조직 지지체는 이식되는 몸체 부위에 따라 다양한 크기 및/또는 형상으로 구현될 수 있다. 상기 자가 줄기 세포는 이식받는 몸체에 존재하는 줄기 세포를 말한다. 상기 줄기 세포(stem cell)는 일반적으로 특정한 세포로 분화가 진행되지 않은 상태로 유지되다가 필요한 경우 신경, 혈액, 연골 등 몸체를 구성하는 다양한 종류의 세포로 분화될 가능성을 갖는 세포로 정의된다. 상기 줄기 세포는 현재 재생 의학(regenerative medicine) 분야에서 다양하게 활용되고 있고, 고전적인 약물 치료법이나 수술 치료법을 순차적으로 대체하거나 보완하고 있는 실정이다. 특히, 성체 줄기 세포(adult stem cell)는 몸체에 존재하는 특정 조직을 구성하는 세포로서, 몸체 속에 미량으로 존재하면서 몸체가 외부적인 영향을 받은 경우 정상 상태를 유지할 수 있도록 최소한의 세포를 제공해 주는 역할을 수행한다. 특히 상기 성체 줄기 세포는 장기 재생을 위한 이식 분야에서 면역 거부 반응이 미미하거나 존재하지 않기 때문에 자가 이식이 가능하다는 장점이 있다. 본 발명에 따른 자가 줄기 세포는 이식받고자 하는 몸체의 다양한 줄기 세포를 이용할 수 있으나, 이식받고자 하는 몸체의 골수로부터 획득한 자가 줄기 세포를 이용하는 것이 바람직하다. 상기 세포 배양액(200)은 상기 동종 연조직 이식체(100)의 상태 유지 및 이에 이식된 자가 줄기 세포의 성장 및 유지를 위해 필요한 요소를 포함하고 있다. 통상적으로, 자가 줄기 세포를 배양하고자 하는 경우 상기 세포 배양액(200)은 상기 자가 줄기 세포가 원활하게 성장할 수 있는 환경을 조성하기 위한 다양한 성분을 포함해야 하고, 상기 성분들의 함량 및 농도, pH 등은 몸체 내의 환경과 근접하게 조절되어야 한다. 또한, 상기 세포 배양액(200)은 상기 자가 줄기 세포의 성장 및 분화를 위한 다양한 성장 인자(growth factor), 사이토카인과 같은 세포 주기 인자, 상기 자가 줄기 세포에 영양분을 공급하기 위한 다양한 영양 물질 등을 포함해야 한다. 또한, 상기 세포 배양 챔버(300)는 세포 배양 단계에서 오염을 방지하기 위하여 멸균 상태로 유지되도록 구현될 수 있다. 또한, 상기 세포 배양 챔버(300)는 그 내부에 세포 배양액(200)을 유입 또는 유출할 수 있고, 이산화탄소 기체를 유입 또는 유출할 수 있도록 배치된 유입출부(도시되지 않음)를 더 포함할 수 있다. 또한, 상기 유입출부는 상기 세포 배양액(200) 또는 이산화탄소 기체를 이동시킬 수 있도록 구동력을 제공하는 펌프(도시되지 않음), 예를 들어, 연동식 정량 이송 펌프와 구동가능하게 연결될 수 있다.The cell culture chamber 300 includes an allogeneic soft tissue implant 100 in which autologous stem cells are transplanted, and a cell culture solution 200 for culturing the autologous stem cells. The soft tissue homograft 100 is a transplanted autologous stem cell, and refers to a transplant including soft tissue which can be transplanted with one another or between medically recognized homologous individuals. The soft tissue generally refers to tissues that connect, support, or surround organs or other structures of the body as tissues in the body, not bone, and include, for example, ligaments, tendons, Achilles tendons, tibiaris tendons, and the like. There is this. The soft tissue is mainly distributed in the site supporting or maintaining the weight of the body, and serves to support and maintain repetitive movement, for example bending, twisting, rotation, and the like. Since the soft tissue is highly related to the movement of the body, if an abnormality occurs in the soft tissue or a corresponding body portion thereof, the soft tissue may cause a fatal disease in the exercise system. On the other hand, the same kind refers to a relationship that can be recognized as the same individual or medically homogeneous. The allogeneic soft tissue support refers to a support that is directly removed from its body or is a structure of the body obtained separately from a medically recognized homogenous individual and replaced in the treatment site. In addition, the allogeneic soft tissue support may be legally collected from a donated body. The allogeneic soft tissue support may be a structure itself separated from the body, but may be combined with other body structures for proper implantation. For example, the allogeneic soft tissue support may be the ligament itself, but may also be a structure associated with one or more bone fragments, such as a bone fragment-ligament complex structure or a bone fragment-ligament-bone fragment complex structure. In addition, the allogeneic soft tissue support may be implemented in various sizes and / or shapes according to the body portion to be implanted. The autologous stem cells refer to stem cells present in the body to be transplanted. The stem cell is generally defined as a cell having the possibility of being differentiated into various kinds of cells constituting the body, such as nerves, blood, cartilage, etc., if necessary to remain undifferentiated into specific cells. The stem cells are currently used in a variety of regenerative medicine fields, and are sequentially replacing or supplementing classical drug treatments or surgical treatments. In particular, adult stem cells are cells that constitute specific tissues in the body, and they provide a minimum amount of cells that exist in the body in small amounts and maintain a normal state when the body is externally affected. Do this. In particular, the adult stem cells have an advantage of being capable of autologous transplantation because the immune rejection response is insignificant or nonexistent in the field of transplantation for organ regeneration. The autologous stem cells according to the present invention may use various stem cells of the body to be transplanted, but it is preferable to use autologous stem cells obtained from bone marrow of the body to be transplanted. The cell culture 200 contains elements necessary for maintaining the state of the allogeneic soft tissue implant 100 and growing and maintaining autologous stem cells transplanted thereto. Typically, when culturing autologous stem cells, the cell culture solution 200 should include various components to create an environment in which the autologous stem cells can grow smoothly, and the content and concentration of the components, pH, etc. It should be adjusted close to the environment within the body. In addition, the cell culture 200 may contain various growth factors for growth and differentiation of the autologous stem cells, cell cycle factors such as cytokines, various nutritional substances for supplying nutrients to the autologous stem cells, and the like. It must be included. In addition, the cell culture chamber 300 may be implemented to be maintained in a sterile state to prevent contamination in the cell culture step. In addition, the cell culture chamber 300 may further include an inlet / outlet (not shown) arranged to allow inflow or outflow of the cell culture solution 200 therein, and to inflow or outflow of carbon dioxide gas. . In addition, the inlet / outlet may be operably connected to a pump (not shown), for example, a peristaltic metering pump, which provides driving force to move the cell culture 200 or carbon dioxide gas.

상기 상부 그립 및 하부 그립(400)은 상기 동종 연조직 이식체(100)를 수직 방향으로 고정하기 위한 모듈이다. 구체적으로, 상기 상부 그립 및 하부 그립(400)은 상기 세포 배양 챔버(300) 내에 배치된 상기 동종 연조직 이식체(100)의 상 말단 및 하 말단에 각각 연결 부착되어 상기 동종 연조직 이식체(100)를 수직 배치시킨다. 또한, 상기 상부 그립 및 하부 그립(400)은 상기 세포 배양 챔버(300) 내에 배치되고, 상기 동종 연조직 이식체(100)를 연결 부착한 상태로 상하 방향으로 대칭되도록 배치된다. 또한, 상기 상부 그립 및 하부 그립(400)은 이하 설명될 상부 고정 자극부 및 하부 고정 자극부(500)와 고정 연결된다. 즉, 상기 상부 그립(400)은 그 상단부가 상기 상부 고정 자극부(500)의 하단과 고정 배치되되 그 하단부는 상기 동종 연조직 이식체(100)의 상단부와 연결 부착되고, 상기 하부 그립(400)은 그 하단부가 상기 하단 고정 자극부(500)의 상단과 고정 배치되되 그 상단부는 상기 동종 연조직 이식체(100)의 하단부와 연결 부착된다. 상기 상부 그립(400)의 하단부 및 상기 하부 그립(400)의 상단부는 상기 동종 연조직 이식체(100)와 구동가능하게 연결 부착될 수 있는 다양한 구조, 예를 들어 집게형 구조물, 오목형 구조물, 고리형 구조물 등으로 구현될 수 있다. 다만, 이하 설명될 상부 구동 모터 및 하부 구동 모터(700)에 의해 발생하는 구동력이 상기 동종 연조직 이식체(100)에 적절하게 전달되기 위해서는 상기 상부 그립(400)의 하단부 및 상기 하부 그립(400)의 상단부는 상기 동종 연조직 이식체(100)가 가능한 한 움직이지 않도록 강하게 고정해야 한다.The upper grip and the lower grip 400 are modules for fixing the allogeneic soft tissue implant 100 in the vertical direction. Specifically, the upper grip and the lower grip 400 are connected to the upper and lower ends of the allogeneic soft tissue implant 100 disposed in the cell culture chamber 300, respectively, so that the allogeneic soft tissue implant 100 is provided. Vertically. In addition, the upper grip and the lower grip 400 is disposed in the cell culture chamber 300, it is arranged to be symmetrical in the vertical direction in the state attached to the allograft soft tissue implant 100. In addition, the upper grip and the lower grip 400 is fixedly connected to the upper fixed magnetic pole portion and the lower fixed magnetic pole portion 500 to be described below. That is, the upper grip 400 has an upper end fixedly disposed with the lower end of the upper fixed magnetic pole part 500, and the lower end thereof is connected to the upper end of the allogeneic soft tissue implant 100 and the lower grip 400 is attached thereto. The lower end is fixedly disposed with the upper end of the lower fixed stimulation unit 500, the upper end is attached to the lower end of the allograft soft tissue implant 100. The lower end of the upper grip 400 and the upper end of the lower grip 400 are various structures that can be operatively connected to the allogeneic soft tissue implant 100, for example, tongs-shaped structures, concave structures, rings It may be implemented as a mold structure and the like. However, in order for the driving force generated by the upper drive motor and the lower drive motor 700 to be described below to be properly transmitted to the allogeneic soft tissue implant 100, the lower end of the upper grip 400 and the lower grip 400 are provided. The upper end of the allograft soft tissue implant 100 should be fixed so as not to move as much as possible.

상기 상부 고정 자극부 및 하부 고정 자극부(500)는 이하 설명될 상부 구동 모터 및 하부 구동 모터(700)에 의해 발생하는 구동력을 상기 상부 그립 및 하부 그립(40)에 의해 연결 부착된 상기 동종 연조직 이식체(100)에 전달하는 부분이다. 구체적으로, 상기 상부 고정 자극부 및 하부 고정 자극부(500)는 상기 상부 그립 및 상기 하부 그립(400)을 각각 고정하되, 상기 고정된 상태로 상하 방향 이동하거나, 및/또는 시계 또는 반시계 방향으로 회전 가능하도록 배치되어 상기 상부 그립 및 상기 하부 그립(400)에 의해 수직 배치된 상기 동종 연조직 이식체(100)에 인장 자극 및/또는 비틀림 자극을 제공하도록 구현된다. 상기 상부 고정 자극부(500)의 하단부는 상기 상부 그립의 상단부와 고정 연결되고, 상기 하부 고정 자극부(500)의 상단부는 상기 하부 그립의 하단부와 고정 연결된다. 한편, 상기 상부 고정 자극부 및 하부 고정 자극부(500)는 상기 동종 연조직 이식체 배양 장치 내에서 회전 운동 및 상하 운동이 가능하도록 구현된다. 즉, 상기 상부 고정 자극부 및 하부 고정 자극부(500)는 이하 설명될 상부 구동 모터 및 하부 구동 모터(700)와 구동축(600)을 통해 각각 연결되고, 상기 상부 구동 모터 및 하부 구동 모터(700)에 의해 발생되는 구동력이 상기 구동축(600)을 통해 상기 상부 고정 자극부 및 하부 고정 자극부(500)에 전달된다.The upper fixed magnetic pole portion and the lower fixed magnetic pole portion 500 is the homogeneous soft tissue connected to the driving force generated by the upper drive motor and the lower drive motor 700 to be described below by the upper grip and the lower grip 40. It is the portion to be delivered to the implant (100). Specifically, the upper fixed magnetic pole portion and the lower fixed magnetic pole portion 500 is fixed to the upper grip and the lower grip 400, respectively, and move up and down in the fixed state, and / or clockwise or counterclockwise direction And is provided to be rotatable so as to provide tensile and / or torsional stimulation to the allogeneic soft tissue implant 100 vertically disposed by the upper grip and the lower grip 400. The lower end of the upper fixed magnetic pole part 500 is fixedly connected to the upper end of the upper grip, and the upper end of the lower fixed magnetic pole part 500 is fixedly connected to the lower end of the lower grip. On the other hand, the upper fixed stimulation unit and the lower fixed stimulation unit 500 is implemented to enable rotational movement and vertical movement in the allogeneic soft tissue implant culture device. That is, the upper fixed magnetic pole portion and the lower fixed magnetic pole portion 500 are respectively connected through the upper drive motor and the lower drive motor 700 and the drive shaft 600 to be described below, the upper drive motor and the lower drive motor 700 The driving force generated by) is transmitted to the upper fixed magnetic pole part and the lower fixed magnetic pole part 500 through the drive shaft 600.

상기 상부 구동 모터 및 하부 구동 모터(700)는 구동력을 발생하는 장치로서, 상기 구동력을 이미 설명된 상기 상부 고정 자극부 및 하부 고정 자극부(500), 상기 상부 그립 및 하부 그립(400) 및 상기 동종 연조직 이식체(100)에 전달한다. 구체적으로, 상기 상부 구동 모터 및 하부 구동 모터(700)는 상기 상부 고정 자극부 및 상기 하부 고정 자극부에 구동축(600)을 통해 각각 연결되고, 상기 구동축(600)을 통해 상기 상부 고정 자극부 및 상기 하부 고정 자극부(500)에 상하 방향 이동 및 회전 운동의 구동력을 전달하도록 구현된다. 상기 상부 구동 모터(700)는 구동축(600)을 통해 상기 상부 고정 자극부(500)에 연결되고, 상기 하부 구동 모터(700)는 구동축(600)을 통해 상기 하부 고정 자극부(500)에 연결된다. 상기 구동축(600)은 상기 상부 구동 모터 및 하부 구동 모터(700)에 의해 발생된 구동력을 상기 상부 고정 자극부 및 상기 하부 고정 자극부(500)에 상하 방향 이동이 가능하도록 및/또는 회전 운동이 가능하도록 전달한다.The upper driving motor and the lower driving motor 700 are devices for generating a driving force, and the driving force is the upper fixed magnetic pole portion and the lower fixed magnetic pole portion 500, the upper grip and the lower grip 400 and the previously described. To allogeneic soft tissue implant (100). In detail, the upper driving motor and the lower driving motor 700 are respectively connected to the upper fixed magnetic pole part and the lower fixed magnetic pole part through a drive shaft 600, and the upper fixed magnetic pole part and the driving shaft 600. The lower fixed magnetic pole unit 500 is implemented to transmit the driving force of the vertical movement and rotational movement. The upper drive motor 700 is connected to the upper fixed magnetic pole part 500 through a drive shaft 600, and the lower drive motor 700 is connected to the lower fixed magnetic pole part 500 through a drive shaft 600. do. The drive shaft 600 may move the driving force generated by the upper drive motor and the lower drive motor 700 to the upper fixed magnetic pole portion and the lower fixed magnetic pole portion 500 to move in the vertical direction and / or the rotational movement is performed. Deliver as much as possible.

따라서, 본 발명에 따르면, 상기 자가 줄기 세포가 이식된 동종 연조직 이식체(100) 및 상기 세포 배양액(200)을 상기 세포 배양 챔버(300)에 도입함으로써, 통상적인 세포 배양 과정을 수행할 수 있다. 또한, 본 발명에 따르면, 상기 세포 배양 챔버(300) 내부 또는 외부에 배치된 상기 상부 그립 및 하부 그립(400)에 상기 동종 연조직 이식체(100)의 상단부와 하단부를 각각 연결 부착한 후 상기 상부 구동 모터 및 하부 구동 모터(700)를 구동시키면 상기 세포 배양 과정을 수행함과 동시에 상기 상부 그립 및 하부 그립(400)에 연결 부착된 동종 연조직 이식체(100)에 물리적 자극, 즉 상하 방향 이동에 의한 인장 자극 및/또는 회전 운동에 의한 비틀림 자극을 제공할 수 있다. 이와 같이, 상기 동종 연조직 이식체(100)에 물리적 자극을 제공함으로써, 상기 동종 연조직 이식체가 이식된 몸체 내에서 효율적으로 조직 분화가 일어나서 이식된 몸체 본연의 조직으로 쉽게 융화될 수 있도록 한다.Therefore, according to the present invention, by introducing the allogeneic soft tissue implant 100 and the cell culture solution 200 into which the autologous stem cells are transplanted, the cell culture chamber 300 can be performed. . Further, according to the present invention, the upper and lower ends of the allograft soft tissue implant 100 are attached to the upper grip and the lower grip 400 disposed inside or outside the cell culture chamber 300, respectively, and then the upper part. When the driving motor and the lower driving motor 700 are driven, the cell culture process is performed and at the same time, physical stimulation, that is, vertical movement, is performed on the allograft soft tissue implant 100 attached to the upper grip and the lower grip 400. Torsional stimulation by tensile stimulation and / or rotational movement can be provided. As such, by providing a physical stimulus to the allogeneic soft tissue graft 100, the allogeneic soft tissue graft can be efficiently differentiated within the transplanted body so that the allogeneic soft tissue implant can be easily integrated into the implanted body.

도 2는 수로 채널을 포함된 본 발명의 일 실시예에 따른 동종 연조직 이식체 배양 장치를 도시한다.Figure 2 shows an allogeneic soft tissue implant culture device according to one embodiment of the present invention comprising a channel.

도 2에 따르면, 본 발명의 일 실시예에 따른 동종 연조직 이식체 배양 장치는 그 외부 표면에 배치되되, 상기 세포 배양 챔버(300) 내에 배치된 세포 배양액의 온도를 유지 제어하고 이산화탄소를 공급하도록 구현된 수로 채널(310)을 더 포함한다. 상기 수로 채널(310)이 상기 세포 배양 챔버(300)의 외부 표면에 배치됨으로써, 상기 세포 배양 챔버(300) 내에 세포 배양액(200)의 오염을 방지하되, 상기 수로 채널(310) 내로 물을 유입시키고, 상기 물의 온도를 일정하게 유지 제어해 주면 상기 세포 배양 챔버(300) 내 온도가 일정하게 유지될 수 있다. 또한, 상기 수로 채널(310)이 상기 세포 배양 챔버(300)의 외부 표면에 배치됨으로써, 상기 세포 배양 챔버(300) 내로 이산화탄소를 원활하게 공급할 수 있다. 따라서, 세포 배양 단계에 따른 원하는 온도 유지가 가능하여, 세포 배양에 필요한 이산화탄소가 지속적으로 공급될 수 있어서 세포 배양 효율을 높일 수 있다. 한편, 상기 수로 채널(310)은 세포 배양 챔버(300)의 외부 표면의 다양한 위치에 구현될 수 있으나, 가능한 넓은 범위에서 표면적이 넓게 상기 세포 배양 챔버(300)와 맞닿도록 배치되는 것이 바람직하다.According to FIG. 2, the allogeneic soft tissue implant culture device according to the embodiment of the present invention is disposed on an outer surface thereof and is implemented to maintain and control the temperature of the cell culture solution disposed in the cell culture chamber 300 and to supply carbon dioxide. The channel channel further includes a channel 310. The channel channel 310 is disposed on the outer surface of the cell culture chamber 300, thereby preventing contamination of the cell culture liquid 200 in the cell culture chamber 300, while introducing water into the channel channel 310. When the temperature of the water is kept constant and controlled, the temperature in the cell culture chamber 300 can be kept constant. In addition, the channel channel 310 is disposed on the outer surface of the cell culture chamber 300, it is possible to smoothly supply carbon dioxide into the cell culture chamber 300. Therefore, it is possible to maintain the desired temperature according to the cell culture step, the carbon dioxide required for cell culture can be continuously supplied to increase the cell culture efficiency. Meanwhile, the channel channel 310 may be implemented at various positions on the outer surface of the cell culture chamber 300, but the channel channel 310 may be disposed to contact the cell culture chamber 300 with a wide surface area in a wide range possible.

도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 동종 연조직 이식체 배양 장치에서 배양되는 자가 줄기 세포가 이식된 동종 연조직 이식체를 도시한다.Figure 3 illustrates an allogeneic soft tissue implant with autologous stem cells cultured in an allogeneic soft tissue implant culture device according to one embodiment of the invention.

도 3에 따르면, 본 발명의 일 실시예에 따른 동종 연조직 이식체(100)를 세부적으로 도시한다. 상기 동종 연조직 이식체(100)는 상기 자가 줄기 세포를 포함하는 하나 이상의 포어(pore)(110)를 포함한다. 상기 동종 연조직 이식체(100) 표면은 극세사침(120)에 의해 자극받아 1 이상의 포어(110)가 형성된다. 상기 포어(110)의 크기(직경)는 약 1 내지 약 100 마이크로미터(㎛) 범위 중 선택될 수 있고, 약 10 마이크로미터(㎛)의 크기(직경)로 형성되는 것이 바람직하다. 상기 포어(110)의 수는 특별히 제한되지 않지만, 상기 동종 연조직 이식체(100) 표면적 내에 가능한 많은 수의 포어가 형성되는 것이 바람직하다.According to FIG. 3, an allogeneic soft tissue implant 100 according to one embodiment of the invention is shown in detail. The allogeneic soft tissue implant 100 includes one or more pores 110 comprising the autologous stem cells. The surface of the allogeneic soft tissue implant 100 is stimulated by the microneedle 120 to form one or more pores 110. The size (diameter) of the pore 110 may be selected from a range of about 1 to about 100 micrometers (μm), and preferably formed in a size (diameter) of about 10 micrometers (μm). The number of the pores 110 is not particularly limited, but it is preferable that as many pores as possible be formed in the surface area of the allogeneic soft tissue implant 100.

도 4는 동종 연조직 이식체에 인장 자극을 제공하는 본 발명의 일 실시예에 따른 동종 연조직 이식체 배양 장치를 도시한다.Figure 4 illustrates an allogeneic soft tissue implant culture device according to one embodiment of the present invention for providing tensile stimulation to allogeneic soft tissue implants.

도 4에 따르면, 상기 동종 연조직 이식체(100)는 본 발명의 일 실시예에 따른 동종 연조직 이식체 배양 장치로부터 인장 자극을 받고 있다. 구체적으로, 상기 동종 연조직 이식체(100)의 상단부와 하단부는 상기 상부 그립 및 하부 그립(400)에 의해 연결 부착되어 있고, 상기 상부 그립 및 하부 그립(400)은 상기 상부 고정 자극부 및 하부 고정 자극부(500)에 고정 배치되어 있다. 만약 상부 구동 모터 및 하부 구동 모터(도시되지 않음)가 구동축(도시되지 않음)을 통해 상하 방향 이동을 발생시키는 구동력을 제공하면, 상기 상부 구동 모터 및 하부 구동 모터(도시되지 않음)와 고정 배치된 상기 상부 고정 자극부 및 하부 고정 자극부(500)는 상기 상부 그립 및 하부 그립(400)에 연결 배치된 상기 동종 연조직 이식체(100)에 인장 자극을 제공한다. 즉, 상기 상부 고정 자극부(500)가 a 길이만큼 상향 이동함과 동시에 상기 하부 고정 자극부(500)가 a 길이만큼 하향 이동하면 상기 동종 연조직 이식체(100)는 상하 방향으로 2a 길이만큼 늘어난다. 이는 인체의 연조직이 늘어나는 것, 예를 들어 무릎의 굽힘에 의한 슬관절의 펴짐과 같은 동일한 자극이 상기 동종 연조직 이식체(100)에 제공되는 것과 같다. 한편, 상기 상부 고정 자극부(500)가 a 길이만큼 하향 이동함과 동시에 상기 하부 고정 자극부(500)가 a 길이만큼 상향 이동하면 상기 동종 연조직 이식체(100)는 상하 방향으로 2a 길이만큼 줄어든다. 이는 인체의 연조직이 줄어드는 것, 예를 들어 무릎의 펴짐에 의한 슬관절의 압축과 같은 동일한 자극이 상기 동종 연조직 이식체(100)에 제공되는 것과 같다. 따라서, 이와 같은 인장 자극이 상기 동종 연조직 이식체(100)에 제공됨으로써, 이식되는 몸체의 조직으로 쉽게 분화될 수 있다. 따라서, 본 발명의 일 실시예에 따른 동종 연조직 이식체 배양 장치는 상기 동종 연조직 이식체(100)에 인장 자극을 제공하기 위하여 상기 상부 고정 자극부(500)는 상기 동종 연조직 이식체(100)의 전체 길이 대비 10% 이하 범위 내에서 상향 이동함과 동시에 상기 하부 고정 자극부(500)는 상기 동종 연조직 이식체(100)의 전체 길이 대비 10% 이하 범위 내에서 하향 이동하도록 구현될 수 있다. 한편, 상기 상부 고정 자극부 및 하부 고정 자극부(500)는 상하 방향으로 동시에 이동할 수 있을 뿐만 아니라 일방이 이동하되 타방은 고정된 상태로 유지될 수도 있다. 또한, 상기 동종 연조직 이식체(100)에 인장 자극을 제공하기 위하여 상기 상부 고정 자극부 및 상기 하부 고정 자극부는 초당 1회 이하의 빈도로 상하 방향 이동하도록 구현될 수 있다.According to FIG. 4, the allogeneic soft tissue implant 100 is subjected to tensile stimulation from an allogeneic soft tissue implant culture device according to an embodiment of the present invention. Specifically, the upper and lower ends of the allogeneic soft tissue implant 100 are connected and attached by the upper grip and the lower grip 400, and the upper grip and the lower grip 400 are the upper fixed magnetic pole part and the lower fixed part. It is fixed to the magnetic pole part 500. If the upper drive motor and the lower drive motor (not shown) provide a driving force to generate the vertical movement through the drive shaft (not shown), and fixedly arranged with the upper drive motor and the lower drive motor (not shown) The upper fixed magnetic pole portion and the lower fixed magnetic pole portion 500 provides tensile stimulation to the allogeneic soft tissue implant 100 disposed in connection with the upper grip and the lower grip 400. That is, when the upper fixed stimulator 500 moves upward by a length and the lower fixed stimulator 500 moves downward by a length, the allogeneic soft tissue implant 100 is extended by 2a in the vertical direction. . This is the same as providing the same soft stimulus to the allogeneic soft tissue implant 100 as elongation of the soft tissues of the human body, for example, stretching of the knee joint by bending of the knee. Meanwhile, when the upper fixed stimulator 500 moves downward by a length and the lower fixed stimulator 500 moves upward by a length, the allogeneic soft tissue implant 100 is reduced by 2a in the vertical direction. . This is the same as providing the same soft stimulus to the allogeneic soft tissue implant 100 as the soft tissues of the human body are reduced, for example, compression of the knee joint by the extension of the knee. Thus, such a tensile stimulus is provided to the allogeneic soft tissue implant 100 so that it can be easily differentiated into the tissue of the body to be implanted. Accordingly, the apparatus for culturing allogeneic soft tissue according to an embodiment of the present invention provides the upper fixed stimulation part 500 of the allogeneic soft tissue implant 100 to provide tensile stimulation to the allogeneic soft tissue implant 100. The lower fixed stimulation unit 500 may move upwards within 10% or less of the total length and move downward within 10% or less of the total length of the allogeneic soft tissue implant 100. On the other hand, the upper fixed magnetic pole portion and the lower fixed magnetic pole portion 500 may not only move in the vertical direction at the same time, one side is moved but the other may be maintained in a fixed state. In addition, in order to provide tensile stimulation to the allogeneic soft tissue implant 100, the upper fixed magnetic pole portion and the lower fixed magnetic pole portion may be implemented to move up and down at a frequency of less than once per second.

도 5는 동종 연조직 이식체에 비틀림 자극을 제공하는 본 발명의 일 실시예에 따른 동종 연조직 이식체 배양 장치를 도시한다.FIG. 5 illustrates an allogeneic soft tissue implant culture device according to one embodiment of the present invention for providing torsional stimulation to allogeneic soft tissue implants.

도 5에 따르면, 상기 동종 연조직 이식체(100)는 본 발명의 일 실시예에 따른 동종 연조직 이식체 배양 장치로부터 비틀림 자극을 받고 있다. 구체적으로, 상기 동종 연조직 이식체(100)의 상단부와 하단부는 상기 상부 그립 및 하부 그립(도시되지 않음)에 의해 연결 부착되어 있고, 상기 상부 그립 및 하부 그립(도시되지 않음)은 상기 상부 고정 자극부 및 하부 고정 자극부(500)에 고정 배치되어 있다. 만약 상부 구동 모터 및 하부 구동 모터(도시되지 않음)가 구동축(도시되지 않음)을 통해 시계/반시계 방향 이동을 발생시키는 구동력을 제공하면, 상기 상부 구동 모터 및 하부 구동 모터(도시되지 않음)와 고정 배치된 상기 상부 고정 자극부 및 하부 고정 자극부(500)는 상기 상부 그립 및 하부 그립(400)에 연결 배치된 상기 동종 연조직 이식체(100)에 비틀림 자극을 제공한다. 즉, 상기 상부 고정 자극부(500)가 b 각도만큼 시계 방향으로 회전함과 동시에 상기 하부 고정 자극부(500)가 b 각도만큼 반시계 방향으로 회전하면 상기 동종 연조직 이식체(100)는 상기 동종 연조직 이식체(100)의 세로 축을 기준으로 시계/반시계 방향으로 b 각도만큼 비틀어진다. 이는 인체의 연조직이 비틀어지는 것과 같은 동일한 자극이 상기 동종 연조직 이식체(100)에 제공되는 것과 같다. 한편, 상기 상부 고정 자극부(500)가 b 각도만큼 반시계 방향으로 회전함과 동시에 상기 하부 고정 자극부(500)가 b 각도만큼 시계 방향으로 회전하면 상기 동종 연조직 이식체(100)는 상기 동종 연조직 이식체(100)의 세로 축을 기준으로 반시계/시계 방향으로 b 각도만큼 비틀어진다. 이는 인체의 연조직이 비틀어지는 것과 같은 동일한 자극이 상기 동종 연조직 이식체(100)에 제공되는 것과 같다. 따라서, 이와 같은 비틀림 자극이 상기 동종 연조직 이식체(100)에 제공됨으로써, 이식되는 몸체의 조직으로 쉽게 분화될 수 있다. 따라서, 본 발명의 일 실시예에 따른 동종 연조직 이식체 배양 장치는 상기 동종 연조직 이식체에 비틀림 자극을 제공하기 위하여 상기 상부 고정 자극부는 45 도 이하 범위 내에서 시계 방향으로 회전함과 동시에 상기 하부 고정 자극부는 45 도 이하 범위 내에서 반시계 방향으로 회전하도록 구현되거나, 또는 상기 상부 고정 자극부는 45 도 이하 범위 내에서 반시계 방향으로 회전함과 동시에 상기 하부 고정 자극부는 45 도 이하 범위 내에서 시계 방향으로 회전하도록 구현될 수 있다. 한편, 상기 상부 고정 자극부 및 하부 고정 자극부(500)는 시계 및 반시계 방향으로 동시에 회전할 수 있을 뿐만 아니라 일방이 회전하되 타방은 고정된 상태로 유지될 수도 있다. 또한, 상기 동종 연조직 이식체 배양 장치는 상기 동종 연조직 이식체(100)에 비틀림 자극을 제공하기 위하여 상기 상부 고정 자극부 및 상기 하부 고정 자극부는 초당 1회 이하의 빈도로 시계 및/또는 반시계 방향으로 회전하도록 구현될 수 있다. 또한, 상기 동종 연조직 이식체 배양 장치는 상기 동종 연조직 이식체(100)에 인장 자극 및 비틀림 자극을 동시에 제공하도록 구현될 수 있다. 따라서, 상기 동종 연조직 이식체(100)에 인장 자극 및/또는 비틀림 자극을 제공하기 위하여 상기 상부 고정 자극부 및 상기 하부 고정 자극부는 초당 1회 이하의 빈도로 상하 방향 이동 및/또는 시계 또는 반시계 방향으로 회전하도록 구현될 수 있다.According to FIG. 5, the allogeneic soft tissue implant 100 is subjected to torsional stimulation from the allogeneic soft tissue implant culture device according to an embodiment of the present invention. Specifically, the upper and lower ends of the allogeneic soft tissue implant 100 are connected by the upper grip and the lower grip (not shown), and the upper grip and the lower grip (not shown) are the upper fixed stimulus. It is fixed to the upper and lower fixed magnetic pole portion 500. If an upper drive motor and a lower drive motor (not shown) provide a driving force for generating a clockwise / counterclockwise movement through the drive shaft (not shown), the upper drive motor and the lower drive motor (not shown) The upper fixed magnetic pole portion and the lower fixed magnetic pole portion 500 is fixedly disposed to provide a torsional stimulus to the allogeneic soft tissue implant 100 disposed in connection with the upper grip and the lower grip 400. That is, when the upper fixed magnetic pole part 500 rotates in the clockwise direction by the b angle and the lower fixed magnetic pole part 500 rotates in the counterclockwise direction by the angle b, the allogeneic soft tissue implant 100 is homogeneous. Twist b angle clockwise / counterclockwise about the longitudinal axis of the soft tissue implant 100. This is as if the same stimulus, such as twisting soft tissues of the human body, is provided to the allogeneic soft tissue implant 100. Meanwhile, when the upper fixed magnetic pole part 500 rotates counterclockwise by the b angle and the lower fixed magnetic pole part 500 rotates clockwise by the b angle, the allogeneic soft tissue implant 100 is homogeneous. Twist b angle counterclockwise / clockwise about the longitudinal axis of the soft tissue implant 100. This is as if the same stimulus, such as twisting soft tissues of the human body, is provided to the allogeneic soft tissue implant 100. Thus, such a torsional stimulus is provided to the allogeneic soft tissue implant 100 so that it can be easily differentiated into the tissue of the body to be implanted. Accordingly, the apparatus for culturing allogeneic soft tissues according to an embodiment of the present invention rotates the upper fixed magnetic pole portion clockwise within a range of 45 degrees or less so as to provide a torsional stimulus to the allogeneic soft tissue implant. The magnetic pole portion is implemented to rotate counterclockwise within a range of 45 degrees or less, or the upper fixed magnetic pole portion rotates counterclockwise within a range of 45 degrees or less and the lower fixed magnetic pole portion clockwise within a range of 45 degrees or less. It can be implemented to rotate. On the other hand, the upper fixed magnetic pole portion and the lower fixed magnetic pole portion 500 may not only rotate in the clockwise and counterclockwise direction at the same time, but one side rotates but the other may be kept fixed. In addition, the allogeneic soft tissue implant culture device is the upper fixed magnetic pole portion and the lower fixed magnetic pole portion in order to provide a torsional stimulation to the allogeneic soft tissue implant 100, clockwise and / or counterclockwise at a frequency of less than once per second It can be implemented to rotate. In addition, the allogeneic soft tissue implant culture device may be implemented to simultaneously provide tensile and torsional stimulation to the allogeneic soft tissue implant 100. Thus, in order to provide tensile and / or torsional stimulation to the allogeneic soft tissue implant 100, the upper fixed stimulus and the lower fixed stimulus are moved up and down and / or clockwise or counterclockwise at a frequency of no more than once per second. It can be implemented to rotate in the direction.

도 6은 배양 조건이 프로그램화된 세포 배양 시스템 장치와 구동 가능하게 연결된 본 발명의 일 실시예에 따른 동종 연조직 이식체 배양 장치를 도시한다.FIG. 6 illustrates an allogeneic soft tissue implant culture device in accordance with one embodiment of the present invention in which the culture conditions are operably linked to a programmed cell culture system device.

도 6에 따르면, 본 발명의 일 실시예에 따른 동종 연조직 이식체 배양 장치는 세포 배양 시스템(800)과 구동 가능하게 연결된다. 상기 세포 배양 시스템(800)은 이미 설명된 세포 배양 챔버(300), 상기 상부 그립 및 하부 그립(400), 상기 상부 고정 자극부 및 하부 고정 자극부(500) 및 상기 상부 구동 모터 및 하부 구동 모터(700)의 구동을 제어하기 위한 프로그램이 내장되어 있어서 사용자의 지시에 의해 제어될 수 있다. 따라서, 사용자는 상기 동종 연조직 이식체(100)을 배양함에 요구되는 상기 세포 배양 챔버(300) 내의 온도, 압력, 습도 등을 손쉽게 제어할 수 있고, 특히 상기 동종 연조직 이식체(100)에 제공되는 인장 자극 및/또는 비틀림 자극을 손쉽고 정교하게 제어할 수 있다.According to FIG. 6, the allogeneic soft tissue implant culture device according to the embodiment of the present invention is operably connected to the cell culture system 800. The cell culture system 800 includes the cell culture chamber 300, the upper grip and the lower grip 400, the upper fixed magnetic pole portion and the lower fixed magnetic pole portion 500, and the upper driving motor and the lower driving motor as described above. A program for controlling the driving of the 700 is built-in and can be controlled by a user's instruction. Therefore, the user can easily control the temperature, pressure, humidity, etc. in the cell culture chamber 300 required for culturing the allogeneic soft tissue implant 100, and particularly provided to the allogeneic soft tissue implant 100. Tensile and / or torsional stimuli can be easily and precisely controlled.

도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 생체배양기에서 물리적 자극 전 후 줄기세포 담지겔 이식 경골건의 Real time PCR 분석 결과를 도시한다. Figure 7 shows the results of Real time PCR analysis of stem cell-supported gel graft tibial tendon before and after physical stimulation in a bioculture according to an embodiment of the present invention.

구체적으로, 생체배양기 내에서 1, 3, 7일간 물리적 자극을 준 줄기세포 담지겔 이식 경골건의 collagen type I, type III 및 tenascin-c gene의 Real time PCR을 분석한 결과이다. collagen I gene은 1일차 및 7일차의 경우 0.11±0.01 및 0.34±0.02으로 3배 증가하였다. collagen III gene은 1일차 및 7일차의 경우 0.31±0.01 및 0.67±0.03으로 2.2배 증가하였다. Tenascin-C는 1일차 및 7일차의 경우 0.42±0.01 및 0.79±0.02으로 1.9배 증가하였다. 인대 조직의 대표적인 표식자인 tenascin-C의 증가를 확인하였고, 이를 통하여 물리적으로 자극한 인간골수 유래 중간엽 줄기세포가 인대조직으로 분화되었음을 확인하였다.Specifically, the results of real time PCR analysis of collagen type I, type III and tenascin-c genes of stem cell-supported gel-graft tibia tendon, which were physically stimulated for 1, 3, and 7 days in the incubator. The collagen I genes increased threefold to 0.11 ± 0.01 and 0.34 ± 0.02 in the 1st and 7th day. The collagen III gene increased by 2.2-fold in the 1st and 7th days to 0.31 ± 0.01 and 0.67 ± 0.03. Tenascin-C increased 1.9 fold to 0.42 ± 0.01 and 0.79 ± 0.02 for Day 1 and Day 7. The increase of tenascin-C, a representative marker of ligament tissue, was confirmed. Through this, the physically stimulated human bone marrow-derived mesenchymal stem cells were differentiated into ligament tissue.

도 8는 본 발명의 일 실시예에 따른 생체배양기내에서 물리적 자극을 준 줄기세포 담지겔 이식군의 GAG 함량 분석 결과를 도시한다.Figure 8 shows the results of GAG content analysis of the stem cell-supported gel transplant group subjected to physical stimulation in the incubator according to an embodiment of the present invention.

구체적으로, 돼지 경골건 표면에 접종한 줄기세포 담지겔 이식군 (5x105 cell/cm2)을 생체배양기내에서 물리적 자극을 준 군과 물리적 자극을 주지 않은 군의 배지에서 분비한 GAG의 함량 분석을 진행하였다. 1, 3, 7일간 배양한 배양액을 모은 후 GAG assay kit을 이용하여 656 nm파장에서 흡광도를 측정하였다. 표준 chondroitin-4-sulfate 곡선의 선형 회귀분석 값은 99.9%의 결과가 나왔다. 물리적 자극을 준 군이 주지 않은 군보다 높은 GAG 함량을 보였고, 물리적 자극을 주지 않은 군은 1일째에 14.187±0.080 ㎍/㎕, 3일째는 25.542±0.599 ㎍/㎕, 7일째는 36.346±0.843 ㎍/㎕, 물리적 자극 1일째는 14.986±0.765 ㎍/㎕, 3일째는 33.298±0.936 ㎍/㎕, 7일째는 44.791±0.087 ㎍/㎕로 증가되는 양상을 보였다. 결과적으로 7일간 물리적 자극을 주고 배양된 줄기세포 담지겔 이식군은 자극을 주지 않은 군 보다 약 23% 증가하였다.Specifically, the analysis of the content of GAG secreted in the culture medium of the stem cell-supported gel transplant group (5x10 5 cell / cm 2 ) inoculated on the surface of the pig tibia tendon in the incubator and the group without physical stimulation Proceeded. After culturing the cultures for 1, 3, 7 days, the absorbance was measured at 656 nm using a GAG assay kit. The linear regression of the standard chondroitin-4-sulfate curve yielded 99.9%. The group with physical stimulation showed higher GAG content than the group without physical stimulation, and the group without physical stimulation showed 14.187 ± 0.080 μg / μl on day 1, 25.542 ± 0.599 μg / μl on day 3, and 36.346 ± 0.843 μg on day 7 / Μl, physical stimulation was 14.986 ± 0.765 μg / μl on day 1, 33.298 ± 0.936 μg / μl on day 3, and 44.791 ± 0.087 μg / μl on day 7. As a result, the stem cell supported gel transplantation group cultured with physical stimulation for 7 days was increased by about 23% compared to the group without stimulation.

도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 생체배양기내에서 물리적 자극을 준 줄기세포 담지겔 이식군의 콜라겐 함량 분석 결과를 도시한다.Figure 9 shows the results of the collagen content analysis of the stem cell-supported gel transplant group subjected to physical stimulation in the incubator according to an embodiment of the present invention.

구체적으로, 돼지 경골건 표면에 접종한 줄기세포 담지겔 이식군 (5x105 cell/cm2)을 생체배양기내에서 물리적 자극을 준 군과 물리적 자극을 주지 않은 군의 배지에서 분비한 collagen의 함량 분석을 진행하였다. 1, 3, 7일간 배양한 배양액을 모은 후 collagen assay kit을 이용하여 550 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 표준 collagen 곡선의 선형 회귀분석 값은 99.9%의 결과가 나왔음. 물리적 자극을 준 군이 주지 않은 군보다 높은 collagen 함량을 보였고, 물리적 자극을 주지 않은 군은 1일째에 0.769±0.012 ㎍/㎕, 3일째는 0.949±0.052 ㎍/㎕, 7일째는 1.382±0.028 ㎍/㎕, 물리적 자극 1일째는 0.811±0.106 ㎍/㎕, 3일째는 1.218±0.072 ㎍/㎕, 7일째는 1.803±0.065 ㎍/㎕로 증가되는 양상을 보였다. 결과적으로 7일간 물리적 자극을 주고 배양된 줄기세포 담지겔 이식군은 자극을 주지 않은 군 보다 약 30% 증가하였다.Specifically, the content of collagen secreted in the medium of the stem cell-supported gel transplanted group (5x10 5 cell / cm 2 ) inoculated on the surface of swine tibial tendon in the incubator and the group without physical stimulation Proceeded. After culturing the cultures for 1, 3, 7 days, the absorbance was measured at 550 nm using a collagen assay kit. The linear regression of the standard collagen curve was 99.9%. The group with physical stimulation showed higher collagen content than the group without physical stimulation, and the group without physical stimulation showed 0.769 ± 0.012 μg / μl on day 1, 0.949 ± 0.052 μg / μl on day 3, and 1.382 ± 0.028 μg on day 7 / Μl, physical stimulation was increased to 0.811 ± 0.106 μg / μl on day 1, 1.218 ± 0.072 μg / μl on day 3, 1.803 ± 0.065 μg / μl on day 7. As a result, the stem cell supported gel transplantation group cultured with physical stimulation for 7 days was increased by about 30% compared to the group without stimulation.

이하 하나 이상의 구체예를 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, one or more embodiments will be described in more detail with reference to Examples. However, these examples are provided to illustrate one or more embodiments illustratively and the scope of the present invention is not limited to these examples.

실험예Experimental Example 1: 물리적 자극을 동반한  1: with physical stimulation 연조직Soft tissue 지지체 배양 Support culture

<실험예 1-1> 연조직 지지체 준비 Experimental Example 1-1 Preparation of Soft Tissue Scaffold

생체배양기의 효과를 입증하기 위하여, 돼지 및 인간에서 얻은 경골건을 세척 및 살균하고, 탈세포화 과정을 수행하였다. 그후, 중성 콜라겐과 자가 줄기 세포를 혼합하여 경골건에 주입하였다. 이때 상기 경골건은 극세사침(M100SWBL 모델, 대한민국)을 적용하여 직경이 약 10 마이크로미터(㎛)인 미세 포어를 형성하였다.To demonstrate the effectiveness of the incubator, the tibialis tendon obtained from pigs and humans was washed and sterilized and decellularized. Thereafter, neutral collagen and autologous stem cells were mixed and injected into the tibial tendon. At this time, the tibial tendon was applied to the microfine needle (M100SWBL model, Korea) to form a fine pore having a diameter of about 10 micrometers (㎛).

<< 실험예Experimental Example 1-2> 물리적 자극 조건에 따른  1-2> depending on physical stimulus conditions 경골건에On tibial tendon 주입된 세포의 배양  Culture of Infused Cells

생체배양기 내에서 물리적 자극 조건 및 시간 설정에 따라 상기에서 제작된 경골건에 접종된 줄기세포 담지 겔 이식체의 물리적 강도 성향을 비교 분석하였다. 즉, 이식체의 강도 향상에 미치는 영향을 확인하기 위하여 다음과 같은 방법으로 진행하였다. 시편의 크기를 12 x 1 cm2 (가로x세로)로 준비한 후 챔버 내에 장착하였다. 실험 군의 경우 컴퓨터 프로그램 상에서 10 % (양 말단 각각 2 mm)의 인장(tension) 자극과 90˚(상하 시계 및 반 시계 방향으로 각각 45˚의 비틀림(torsion) 자극 및 1 Hz의 빈도수 (frequency) 조건으로 1, 3, 7일 동안 생체배양기 내에서 물리적 자극을 주어 실험을 진행하였다(표 1). 대조군의 경우 생체배양기 챔버 내에서 물리적인 자극을 주지 않고 7일간 배양하였다.The physical strength propensity of stem cell-supported gel grafts inoculated into the tibialis tendon produced above was compared and analyzed according to the physical stimulation conditions and time settings in the incubator. In other words, to determine the effect on the strength of the implant was carried out in the following way. Specimens were prepared in a size of 12 × 1 cm 2 (horizontal × vertical) and then mounted in the chamber. In the experimental group, 10% (2 mm each end) tension stimulation, 90 ° (torsion stimulation 45 ° in the clockwise and counterclockwise directions, respectively) and frequency of 1 Hz on the computer program. The experiment was conducted by giving a physical stimulus in the incubator for 1, 3, and 7 days under conditions (Table 1), and the control group was cultured for 7 days without physical stimulation in the incubator chamber.


군
group
물리적 자극 조건Physical stimulus conditions
회수기간
Payback period


N수

N number Tension (10 %)Tension (10%) Torsion (90˚)Torsion (90˚) FrequencyFrequency 상부Top 하부bottom 상부Top 하부bottom 상부Top 하부bottom 대조군Control group -- -- -- -- -- -- -- 7일7 days 33
실험군
Experimental group
1One 2 mm2 mm 2 mm2 mm 45˚45˚ 45˚45˚ 1 hz1 hz 1 hz1 hz 1일1 day 33 22 2 mm2 mm 2 mm2 mm 45˚45˚ 45˚45˚ 1 hz1 hz 1 hz1 hz 4일4 days 33 33 2 mm2 mm 2 mm2 mm 45˚45˚ 45˚45˚ 1 hz1 hz 1 hz1 hz 7일7 days 33

실험예Experimental Example 2 : 물리적 자극을 준 줄기세포  2: Stem Cells with Physical Stimulation 담지겔Support Gel 이식군의Transplant group 실시간  real time PCRPCR 분석 analysis

물리적 자극을 준 이식군에서 세포의 분화에 따른 유전자의 발현 양상을 분석하기 위하여 mRNA를 분석하였다. RNA은 RNeasy mini kit (74136, Qiagen, USA)을 사용하여 추출하였다. 수거한 조직 30 mg에 RLT Plus buffer 600 ㎕를 넣고 균질화 시켰다. 3분간 최대 RPM으로 원심분리하고 파이펫팅하여 상층액을 조심스럽게 제거하였다. 2 ㎖ 수집 튜브에 gDNA 제거 스핀 컬럼(Eliminator spin column)을 올리고 균질화하여 용해된 조직을 넣어주었다. 10,000 x g에서 30초간 원심분리하여 여과된 액을 남기고 컬럼은 제거 하였다. 70 % 에탄올 600 ㎕를 수집 튜브에 넣고 파이펫팅하여 혼합하였다. 새로운 2 ㎖ 수집 튜브에 RNeasy 스핀 컬럼을 올리고 1,000 ㎕ 혼합액을 넣어주었다. 뚜껑을 닫고 10,000 xg에서 15초간 원심분리하고 여과된 액은 제거하였다. RNeasy 스핀 컬럼에 RW1 buffer 700 ㎕를 넣고, 10,000 xg에서 15초간 원심분리하고 여과된 액은 제거하였다. RNeasy 스핀 컬럼에 RPE buffer 500 ㎕를 넣고, 10,000 xg에서 15초간 원심분리하고 여과된 액은 제거하였다. RNeasy 스핀 컬럼에 RPE buffer 500 ㎕를 넣고, 10,000 xg에서 2분간 원심분리하고 여과된 액은 제거하였다. 새로운 1.5 ㎖ 수집 튜브에 RNeasy 스핀 컬럼을 올리고, 스핀 컬럼 멤브레인에 RNase-free water 50 ㎕를 넣고, RNA 추출물을 얻기 위하여 10,000 x g에서 1분간 원심분리 하였다. MRNA was analyzed to analyze the expression of genes according to the differentiation of cells in the transplanted group. RNA was extracted using the RNeasy mini kit (74136, Qiagen, USA). Into the collected tissue 30 mg 600 μl of RLT Plus buffer was homogenized. The supernatant was carefully removed by centrifugation and pipetting at maximum RPM for 3 minutes. The gDNA removal spin column was placed in a 2 ml collection tube and homogenized to add dissolved tissue. The column was removed by centrifugation at 10,000 x g for 30 seconds, leaving the filtered solution. 600 μl of 70% ethanol was placed in a collection tube and pipetted to mix. Raise the RNeasy spin column in a new 2 ml collection tube and add 1,000 μl of mixture. The lid was closed and centrifuged at 10,000 xg for 15 seconds and the filtrate was removed. 700 μl of RW1 buffer was placed on an RNeasy spin column, centrifuged at 10,000 × g for 15 seconds, and the filtrate was removed. 500 μl of RPE buffer was added to an RNeasy spin column, centrifuged at 10,000 × g for 15 seconds, and the filtrate was removed. 500 μl of RPE buffer was added to an RNeasy spin column, centrifuged at 10,000 × g for 2 minutes, and the filtrate was removed. The RNeasy spin column was placed in a new 1.5 mL collection tube, 50 μl of RNase-free water was added to the spin column membrane, and centrifuged at 10,000 × g for 1 minute to obtain RNA extract.

cDNA 합성을 하기 위하여 SuperScript®VILO cDNA Synthesis Kit (11754-050, Invitrogen, USA)을 사용하였고, 다음과 같은 방법으로 진행하였다. 5x VILO Reaction Mix 4 ㎕, 10x SuperScript Enzyme Mix 2 ㎕, RNA 2.5 ㎍을 혼합한 후 최종 부피를 20 ㎕로 맞추기 위하여 DEPC-treated water를 첨가하였다. 혼합한 시약을 25 ℃에서 10분간 인큐베이팅, 42 ℃에서 60분간 인큐베이팅, 85 ℃에서 5분간 반응시키고 종료시켰다. 사용하기 전까지 -20 ℃ 냉동고에 보관하였다.was used SuperScript ® VILO cDNA Synthesis Kit (11754-050 , Invitrogen, USA) to make the cDNA synthesis, it was performed in the following way. 4 μl of 5 × VILO Reaction Mix, 2 μl of 10x SuperScript Enzyme Mix, 2.5 μl of RNA were added, and DEPC-treated water was added to adjust the final volume to 20 μl. The mixed reagents were incubated at 25 ° C. for 10 minutes, incubated at 42 ° C. for 60 minutes, and reacted at 85 ° C. for 5 minutes and terminated. Store at -20 ° C freezer until use.

그 후, Real time PCR 분석을 위하여 SYBR®Premix Ex Taq(RR420Q, TaKaRa, JAPAN)을 사용하였고, 다음과 같은 방법으로 진행하였다. SYBR®Premix Ex Taq (1x) 12.5 ㎕, 0.2 uM PCR Forward Primer 0.5 ㎕, 0.2 uM PCR Reverse Primer 0.5 ㎕, cDNA 합성 시료 2.0 ㎕와 DW water 9.5 ㎕를 혼합하여 총 부피를 25 ㎕로 맞추었다. Real time PCR 기기 (TP800, TaKaRa, JAPAN)를 사용하여 1 step은 1 cylce, 95 ℃에서 30초간 진행하였고, 2 step은 95 ℃에서 5초, 60 ℃에서 30초간 40 cycle로 진행하였다. primer는 collagen type I, type III 및 tenascin-c를 사용하였다(표 2).Then, it was used as the SYBR ® Premix Ex Taq (RR420Q, TaKaRa, JAPAN) for the Real time PCR analysis was performed in the following way. 12.5 μl of SYBR ® Premix Ex Taq (1x), 0.5 μl of 0.2 uM PCR Forward Primer, 0.5 μl of 0.2 uM PCR Reverse Primer, 2.0 μl of cDNA synthesis sample and 9.5 μl of DW water were mixed to adjust the total volume to 25 μl. Using a real time PCR instrument (TP800, TaKaRa, JAPAN) 1 step was carried out for 30 seconds at 1 cylce, 95 ℃, 2 step was carried out 40 cycles for 5 seconds at 95 ℃, 30 seconds at 60 ℃. The primers used collagen type I, type III and tenascin-c (Table 2).

GenesGenes Forward primer sequencesForward primer sequences Reverse primer sequencesReverse primer sequences Collagen ICollagen i 5'-CAGGGTGTTCCTGGAGACCT-3'
(서열번호 1)5'-CAGGGTGTTCCTGGAGACCT-3 '
(SEQ ID NO: 1) 3'-AGGAGAGCCATCAGCACCTT-5'
(서열번호 2)3'-AGGAGAGCCATCAGCACCTT-5 '
(SEQ ID NO: 2) Collagen IIICollagen iii 5'-GAAAATGGAAAACCTGGGGA-3'
(서열번호 3)5'-GAAAATGGAAAACCTGGGGA-3 '
(SEQ ID NO: 3) 3'-CACCCTTTGGACCAGGACTT-5'
(서열번호 4)3'-CACCCTTTGGACCAGGACTT-5 '
(SEQ ID NO: 4) Tenascin-CTenascin-c 5'-TACAGCCTGGCAGACCTGAG-3'
(서열번호 5)5'-TACAGCCTGGCAGACCTGAG-3 '
(SEQ ID NO: 5) 3'-ATTGCTTGGGAGCAGTCCTT-5'
(서열번호 6)3'-ATTGCTTGGGAGCAGTCCTT-5 '
(SEQ ID NO: 6) GAPDHGAPDH 5'-AAGGGTCATCATCTCTGCCC-3'
(서열번호 7)5'-AAGGGTCATCATCTCTGCCC-3 '
(SEQ ID NO: 7) 3'-GTGATGGCATGGACTGTGGT-5'
(서열번호 8)3'-GTGATGGCATGGACTGTGGT-5 '
(SEQ ID NO: 8)

실험예Experimental Example 3 : 물리적 자극을 준 줄기세포  3: Stem Cells with Physical Stimulation 담지겔Support Gel 이식군의Transplant group GAGGAG 분석 analysis

돼지 경골건 표면에 접종한 줄기세포 담지겔 이식군 (5x105 cell/cm2)을 생체배양기내에서 물리적 자극을 준 군과 물리적 자극을 주지 않은 군의 배지에서 분비한 GAG의 함량 분석을 진행하였다. 1, 3, 7일간 배양한 배양액을 모은 후 GAG assay kit을 이용하여 GAG(Glycosaminoglycan) 함량 분석을 진행하였다. 자세한 방법은 다음과 같다. 표준시약으로 Sulfated Glycosaminoglycan(0~5㎍)을 이용하여 마이크로센트리퓨즈 튜브(microcentrifuge tube)에 넣고, 정제수로 최종 부피를 100 ㎕로 맞추었다. 1, 3, 7일간 배양한 줄기세포 담지겔 이식군의 배지를 마이크로센트리퓨즈 튜브에 넣고, 최종 부피를 100 ㎕로 맞추었다. 준비한 모든 튜브에 1.0 ㎖의 glycosaminoglycan Dye Reagent를 첨가하고 나서 vortex mixer를 이용하여 30 분 동안 섞었다. 그 후 10,000 xg에서 10 분 동안 원심 분리하였다. 원심분리 후, 상층 액을 제거하고 tube 바닥이나 벽에 있는 용액을 좀 더 깨끗이 제거하기 위해서 튜브를 뒤집고, 흡수지(absorbent paper)를 사용하였다. Glycosaminoglycan-dye complex pellet에 1 ㎖의 Blyscan Dissociation Reagent를 첨가하고, 10분 동안 볼텍스 혼합기를 이용하여 글라이코사민글라이칸(glycosaminoglycan)과 결합한 dye를 녹였다. UV spectrometer를 이용하여 656 nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다. GAG의 최종 농도는 chondroitin-4-sulfate의 표준 곡선을 이용하여 정량하였다(도 8 참조).The contents of GAG secreted from the medium of the stem cell-supported gel transplanted group (5x10 5 cell / cm 2 ) inoculated on the surface of the swine tibial tendon in the incubator and the group without physical stimulation were analyzed. . After culturing the culture medium for 1, 3, 7 days, GAG (Glycosaminoglycan) content analysis was performed using a GAG assay kit. The detailed method is as follows. Sulfated Glycosaminoglycan (0-5 ㎍) was used as a standard reagent in a microcentrifuge tube, and the final volume was adjusted to 100 100 with purified water. The medium of the stem cell supporting gel transplant group cultured for 1, 3 and 7 days was placed in a microcentrifuge tube, and the final volume was adjusted to 100 μl. 1.0 ml of glycosaminoglycan Dye Reagent was added to all the prepared tubes, followed by mixing for 30 minutes using a vortex mixer. It was then centrifuged at 10,000 xg for 10 minutes. After centrifugation, the supernatant was removed and the tube was flipped over to remove the solution at the bottom or wall of the tube, and absorbent paper was used. 1 ml of Blyscan Dissociation Reagent was added to the glycosaminoglycan-dye complex pellet, and the dye bound to glycosaminoglycan was dissolved using a vortex mixer for 10 minutes. Absorbance was measured at a wavelength of 656 nm using a UV spectrometer. Final concentration of GAG was quantified using a standard curve of chondroitin-4-sulfate (see FIG. 8).

실험예Experimental Example 4 : 물리적 자극을 준 줄기세포  4: Stem Cells with Physical Stimulation 담지겔Support Gel 이식군의Transplant group 콜라겐 분석 Collagen Analysis

돼지 경골건 표면에 접종한 줄기세포 담지겔 이식군 (5x105 cell/cm2)을 생체배양기내에서 물리적 자극을 준 군과 물리적 자극을 주지 않은 군의 배지에서 분비한 collagen의 함량 분석을 진행하였다. 1, 3, 7일간 배양한 배양액을 모은 후 collagen assay kit을 이용하여 collagen의 함량 분석을 진행하였다. 자세한 방법은 다음과 같다. 표준시약으로 collagen solution (0~50 ㎍)을 이용하여 마이크로센트리퓨즈 튜브에 넣고, 정제수로 최종 부피를 100 ㎕로 맞추었다. 1, 3, 7일간 배양한 줄기세포 담지겔 이식군의 배지를 마이크로센트리퓨즈 튜브에 넣고, 최종 부피를 100 ㎕로 맞추었다. 준비한 모든 튜브에 1 ㎖의 Sircol dye reagent를 첨가하고 나서 볼텍스 혼합기를 이용하여 30 분 동안 섞었다. 그 후 10,000 xg에서 10 분 동안 원심 분리하였다. 원심분리 후, 상층 액을 제거하고 튜브 바닥이나 벽에 있는 용액을 좀 더 깨끗이 제거하기 위해서 튜브를 뒤집고, 흡수지 (absorbent paper)를 사용하였다. Collagen-dye complex pellet에 Alkali reagent를 첨가하고, 10분 동안 볼텍스 혼합기를 이용하여 Collagen과 결합한 dye를 녹였다. UV spectrometer를 이용하여 550 nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다. Collagen의 최종 농도는 collagen의 표준 곡선을 이용하여 정량하였다(도 9 참조).The contents of collagen secreted in the culture medium of the stem cell-supported gel transplanted group (5x10 5 cell / cm 2 ) inoculated on the surface of swine tibial tendon in the incubator were not physically stimulated. . After culturing the culture medium for 1, 3, 7 days, the collagen content was analyzed using the collagen assay kit. The detailed method is as follows. Collagen solution (0-50 μg) was used as a standard reagent in a microcentrifuge tube, and the final volume was adjusted to 100 μl with purified water. The medium of the stem cell supporting gel transplant group cultured for 1, 3 and 7 days was placed in a microcentrifuge tube, and the final volume was adjusted to 100 μl. 1 ml of Sircol dye reagent was added to all the prepared tubes, followed by mixing for 30 minutes using a vortex mixer. It was then centrifuged at 10,000 xg for 10 minutes. After centrifugation, the supernatant was removed and the tube was flipped over to remove the solution at the bottom or wall of the tube and absorbent paper was used. Alkali reagent was added to the collagen-dye complex pellet, and the dyes bound with the collagen were dissolved using a vortex mixer for 10 minutes. Absorbance was measured at a wavelength of 550 nm using a UV spectrometer. The final concentration of collagen was quantified using the standard curve of collagen (see Figure 9).

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Claims (10)

자가 줄기 세포가 이식된 동종 연조직 이식체 및 상기 자가 줄기 세포를 배양하기 위한 세포 배양액을 포함하는 세포 배양 챔버;
상기 세포 배양 챔버 내에 배치된 상기 동종 연조직 이식체의 상 말단 및 하 말단에 각각 연결 부착되어 상기 동종 연조직 이식체를 수직 배치시키는 상부 그립 및 하부 그립;
상기 상부 그립 및 상기 하부 그립을 각각 고정하되, 상기 고정된 상태로 상하 방향 이동하거나, 및/또는 시계 또는 반시계 방향으로 회전 가능하도록 배치되어 상기 상부 그립 및 상기 하부 그립에 의해 수직 배치된 상기 동종 연조직 이식체에 인장 자극 및/또는 비틀림 자극을 제공하도록 구현된 상부 고정 자극부 및 하부 고정 자극부; 및
상기 상부 고정 자극부 및 상기 하부 고정 자극부에 구동축을 통해 각각 연결되고, 상기 구동축을 통해 상기 상부 고정 자극부 및 상기 하부 고정 자극부에 상하 방향 이동 및 회전 운동의 구동력을 전달하는 상부 구동 모터 및 하부 구동 모터;
를 포함하는 동종 연조직 이식체 배양 장치.A cell culture chamber comprising an allogeneic soft tissue implant into which autologous stem cells have been transplanted and a cell culture for culturing the autologous stem cells;
An upper grip and a lower grip connected to the upper and lower ends of the allogeneic soft tissue implant disposed in the cell culture chamber to vertically position the allogeneic soft tissue implant;
The upper grip and the lower grip are fixed to each other, and are arranged to be movable up and down in the fixed state, and / or rotatable in a clockwise or counterclockwise direction so as to be vertically disposed by the upper grip and the lower grip. An upper fixed stimulus and a lower fixed stimulus configured to provide tensile and / or torsional stimuli to the soft tissue implant; And
An upper driving motor connected to the upper fixed magnetic pole part and the lower fixed magnetic pole part through a driving shaft, and transmitting a driving force of vertical movement and rotational movement to the upper fixed magnetic pole part and the lower fixed magnetic pole part through the driving shaft; Lower drive motors;
Allogeneic soft tissue implant culture device comprising a. 제1항에 있어서, 상기 세포 배양 챔버는 그 외부 표면에 배치되되, 상기 세포 배양 챔버 내에 배치된 세포 배양액의 온도를 유지 제어하고 이산화탄소를 공급하도록 구현된 수로 채널을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 동종 연조직 이식체 배양 장치.The homogeneous method of claim 1, wherein the cell culture chamber further comprises a channel channel disposed on an outer surface of the cell culture chamber and configured to maintain and control the temperature of the cell culture liquid disposed in the cell culture chamber and supply carbon dioxide. Soft tissue implant culture device. 제1항에 있어서, 상기 동종 연조직 이식체는 인대, 또는 뼈 단편과 연결된 인대인 것을 특징으로 하는 동종 연조직 이식체 배양 장치.The apparatus of claim 1, wherein the allogeneic soft tissue implant is a ligament or a ligament connected to a bone fragment. 제1항에 있어서, 상기 동종 연조직 이식체는 상기 자가 줄기 세포를 포함하는 하나 이상의 포어(pore)를 포함하는 것을 특징으로 하는 동종 연조직 이식체 배양 장치.The apparatus of claim 1, wherein the allogeneic soft tissue implant comprises one or more pores comprising the autologous stem cells. 제1항에 있어서, 상기 동종 연조직 이식체에 인장 자극을 제공하기 위하여 상기 상부 고정 자극부는 상기 동종 연조직 이식체의 전체 길이 대비 10% 이하 범위 내에서 상향 이동함과 동시에 상기 하부 고정 자극부는 상기 동종 연조직 이식체의 전체 길이 대비 10% 이하 범위 내에서 하향 이동하도록 구현되는 것을 특징으로 하는 동종 연조직 이식체 배양 장치.The method of claim 1, wherein the upper fixed stimulus portion to move up to within the range of 10% or less of the total length of the allogeneic soft tissue graft to provide tensile stimulation to the allogeneic soft tissue implant, while the lower fixed stimulation portion is Allogeneic soft tissue implant culture device, characterized in that it is implemented to move downwards in the range of less than 10% of the total length of the soft tissue implant. 제1항에 있어서, 상기 동종 연조직 이식체에 비틀림 자극을 제공하기 위하여 상기 상부 고정 자극부는 45 도 이하 범위 내에서 시계 방향으로 회전함과 동시에 상기 하부 고정 자극부는 45 도 이하 범위 내에서 반시계 방향으로 회전하도록 구현되거나, 또는 상기 상부 고정 자극부는 45 도 이하 범위 내에서 반시계 방향으로 회전함과 동시에 상기 하부 고정 자극부는 45 도 이하 범위 내에서 시계 방향으로 회전하도록 구현되는 것을 특징으로 하는 동종 연조직 이식체 배양 장치.2. The method of claim 1, wherein the upper fixed stimulus rotates clockwise within a range of 45 degrees or less to provide a torsional stimulus to the allogeneic soft tissue implant, while the lower fixed stimulus is counterclockwise within a range of 45 degrees or less. Or the upper fixed magnetic pole portion rotates in a counterclockwise direction within a range of 45 degrees or less and the lower fixed magnetic pole portion is rotated in a clockwise direction within a range of 45 degrees or less. Implant Culture Device. 제1항에 있어서, 상기 동종 연조직 이식체에 인장 자극 및/또는 비틀림 자극을 제공하기 위하여 상기 상부 고정 자극부 및 상기 하부 고정 자극부는 초당 1회 이하의 빈도로 상하 방향 이동 및/또는 시계 또는 반시계 방향으로 회전하도록 구현되는 것을 특징으로 하는 동종 연조직 이식체 배양 장치.The method of claim 1, wherein the upper fixed stimulus and the lower fixed stimulus are moved up and down and / or clockwise or semi-frequently at a frequency of once or less per second to provide tensile and / or torsional stimulus to the allogeneic soft tissue implant. Allogeneic soft tissue implant culture device characterized in that it is implemented to rotate clockwise. 제1항에 있어서, 상기 동종 연조직 이식체 배양 장치는 배양 조건이 프로그램화된 세포 배양 시스템 장치에 구동 가능하게 연결되고, 상기 세포 배양 시스템 장치에 의해 제어되는 것을 특징으로 하는 동종 연조직 이식체 배양 장치.2. The allogeneic soft tissue implant culture device of claim 1, wherein the allogeneic soft tissue implant culture device is operably connected to a cell culture system device in which culture conditions are programmed and controlled by the cell culture system device. . 제1항에 있어서, 상기 세포 배양 챔버는 멸균 상태로 유지되도록 구현된 것을 특징으로 하는 동종 연조직 이식체 배양 장치.The apparatus of claim 1, wherein the cell culture chamber is configured to be maintained in a sterile state. 제1항에 있어서, 상기 세포 배양 챔버는 그 내부에 세포 배양액을 유입 또는 유출할 수 있고 이산화탄소 기체를 유입 또는 유출할 수 있도록 배치된 유입출부를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 동종 연조직 이식체 배양 장치.The apparatus of claim 1, wherein the cell culture chamber further comprises an inlet and outlet configured to introduce or discharge cell culture therein and to introduce or discharge carbon dioxide gas. .
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