RU2366707C1 - Способ генерации антиген-специфических цитотоксических клеток с активностью против клеток, инфицированных вирусом гепатита в - Google Patents
Способ генерации антиген-специфических цитотоксических клеток с активностью против клеток, инфицированных вирусом гепатита в Download PDFInfo
- Publication number
- RU2366707C1 RU2366707C1 RU2008109616/13A RU2008109616A RU2366707C1 RU 2366707 C1 RU2366707 C1 RU 2366707C1 RU 2008109616/13 A RU2008109616/13 A RU 2008109616/13A RU 2008109616 A RU2008109616 A RU 2008109616A RU 2366707 C1 RU2366707 C1 RU 2366707C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cells
- antigen
- hepatitis
- mnc
- virus
- Prior art date
Links
Landscapes
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к иммунологии и биотехнологии. Выделяют из периферической крови пациентов больных хроническим вирусным гепатитом В дендритные клетки, презентирующие антиген вируса гепатита В. Культивируют с неприлипающей фракцией мононуклеарных клеток в присутствии провоспалительного цитокина рчИЛ-18. Изобретение позволяет генерировать клетки, обладающие высоким цитотоксическим потенциалом в отношении клеток, инфицированных антигенами гепатита В. 3 табл.
Description
Изобретение относится к иммунологии и биотехнологии, а именно к способам генерации антиген-специфических клеток с цитотоксической активностью против клеток, инфицированных вирусом гепатита В.
В основе патогенеза хронического вирусного гепатита В лежит нарушение взаимодействия иммунокомпетентных клеток. Персистенция вируса гепатита В развивается в результате подавления индукции и реализации иммунного ответа. Механизмами ускользания вируса из-под иммунного ответа являются: интеграция генома вируса в геном иммунокомпетентных клеток; изменение протективных эпитопов каждые 5-6 лет; истощение антивирусных Т-клонов; аутоагрессия против Т-клеток, экспрессирующих вирусные пептиды; блокирование представления собственных антигенов за счет снижения синтеза ФНО-α; репликация вируса в органах, не подлежащих иммунному надзору; персистенция вируса в иммунокомпетентных клетках и разобщение всех клеток иммунной системы. Стандартное лечение хронического вирусного гепатита В основано на применении интерферонов и противовирусных средств, подавляющих репликацию вируса. Лекарственная химиотерапия часто приводит к развитию лекарственно-устойчивых штаммов возбудителей инфекции и поэтому становится неэффективной, кроме того, обладает выраженным гепатотоксическим действием. В настоящее время развитие новых эффективных подходов к лечению инфекционных заболеваний связано с использованием собственных механизмов защиты организма и их возможной модуляции. Эффективный иммунный ответ на вирус гепатита В связан с индукцией клеточного звена иммунного ответа, который в данном случае реализуется посредством Т хелперов 1 типа. Активность Т хелперов 1 типа напрямую зависит от представления им антигена и их направленной дифференцировки, что осуществляется дендритными клетками как основными антиген-презентирующими клеточными элементами. Дендритные клетки (ДК) усиливают врожденный иммунитет, регулируют развитие специфического иммунного ответа, обеспечивают развитие иммунологической толерантности. В настоящее время активно исследуется возможность применения дендритных клеток для модуляции специфического иммунного ответа и развития новых методов иммунокоррекции. Это связано, прежде всего, с той ролью, которую ДК играют в организме в развитии иммунного ответа, в частности, дендритные клетки обладают уникальными механизмами захвата антигена и представления его наивным Т-клеткам, определяя направленность и активность иммунных реакций.
Описан способ (прототип), при котором незрелые ДК получали из моноцитов прилипающей фракции мононуклеарных клеток (МНК) периферической крови больных хроническим вирусным гепатитом В путем культивирования в полной среде с добавлением гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (ГМ-КСФ) и интерлейкина-4 (ИЛ-4) в течение 7 дней, незрелые ДК в течение 2 суток культивировались с ФНО-α. Затем полученные дендритные клетки, обработанные антигенным пептидом HbcAg18-27 в течение последующих 5 суток культивировались совместно с аутологичными Т-клетками. Была показана стимуляция цитотоксической активности Т-клеток и увеличение количества ИФН-γ-продуцирующих CD8+ клеток в ответ на антигенный пептид HbcAg18-27. При этом МНК ПК, сокультивированные с ДК, обработанными специфическим белком, индуцируют специфическую Т клеточную реакцию, в которой уровень секреции цитокинов и литической аткивности выше, чем в реакции, индуцированной клетками памяти [Li RB, Chen HS, Xie Y, Fei R, Cong X, Jiang D, Wang SX, Wei L, Wang Y. Dendritic cells from chronic hepatitis В patients can induce HBV antigen-specific T cell responses. World J Gastroenterol 2004; 10(11): 1578-1582].
Направленность развития протективного иммунного ответа зависит от многих факторов, в том числе во многом от баланса про- и противовоспалительных цитокинов. Интерлейкин-18 (ИЛ-18) - провоспалительный цитокин, который стимулирует продукцию ИФН-γ Т- и НК-клетками, тем самым, способствуя активации макрофагов и уничтожению инфицированных вирусом клеток. Показано, что культивация CD4+ Т-лимфоцитов периферической крови детей, больных гепатитом В, в присутствии рекомбинантного НВс антигена и рекомбинантных ИЛ-18 и ИЛ-12 вызывает значительное увеличение антигенспецифической продукции ИФН-γ, что является основополагающим моментом противовирусной защиты организма Szkaradkiewicz A. [Szkaradkiewicz A, Jopek А, Wysocki J. Effects of IL-12 and IL-18 on HBcAg-specific cytokine production by CD4 T lymphocytes of children with chronic hepatitis В infection. // Antiviral Res. 2005 Apr; 66(1):23-7]. Культивация мононуклеарных клеток периферической крови взрослых больных гепатитом В в присутствии НВс антигена и ИЛ-18 также приводит к увеличению продукции ИФН-γ и усилению цитотоксической активности этих клеток против клеток линии HepG2.2.15, трансфецированной вирусом гепатита В [Sun Y, Chen HY, Xin SJ. Effect of IL-18 on peripheral blood mononuclear cells of chronic hepatitis В and hepatitis В virus DNA released by HepG2.2.15 cell lines. // Hepatobiliary Pancreat Dis Int. 2004 May; 3(2):230].
Таким образом, для эффективной модуляции противовирусной защиты необходимо повысить потенциал цитотоксической активности мононуклеарных антиген-специфических клеток, продуцирующих ИФН-γ.
Задачей настоящего изобретения является создание способа генерации максимально эффективных антиген-специфических цитотоксических клеток из периферической крови больных хроническим вирусным гепатитом В.
Сущность предлагаемого изобретения заключается в следующем.
Мононуклеарные клетки неприлипающей фракции периферической крови больных хроническим вирусным гепатитом В культивируют с обработанными антигеном вируса гепатита В дендритными клетками в присутствии рекомбинантного человеческого интерлейкина-18.
Техническим результатом изобретения является активация антиген-специфических иммунных реакций по Т-хелпер 1 типу на антиген вируса гепатита В с помощью цитотоксических ИФН-γ-продуцирующих клеток, полученных при сокультивировании мононуклеарных клеток периферической крови больных хроническим вирусным гепатитом В с аутологичными антигенпрезентирующими дендритными клетками и интерлейкином-18 in vitro.
Предложенный способ позволяет генерировать клетки, обладающие высоким цитотоксическим потенциалом в отношении клеток, инфицированных антигенами гепатита В, за счет синергизма воздействия на модуляцию специфического иммунного ответа аутологичных активированных дендритных клеток и провоспалительного цитокина интерлейкина-18.
Изобретение осуществляется следующим образом.
Выделенные из периферической крови пациентов больных хроническим вирусным гепатитом В мононуклеарные клетки прилипающей фракции культивируются в концентрации 1 млн/мл в полной среде, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ L-глютамина, 10 мМ HEPES, 5×10-5 мМ 2-меркаптоэтанола, 80 мкг/мл гентамицина, 100 мкг/мл ампициллина в атмосфере 5% СО2 при 37°С с добавлением ГМ-КСФ (50 нг/мл) и ИЛ-4 (200 нг/мл). Через 24 часа культивирования к полученным незрелым ДК добавляется специфический антиген вируса гепатита В HBcAg в дозе 5 мкг/мл, а еще через 2 часа для созревания незрелых дендритных клеток в течение последующих 24 часов вносится рчФНО-α в дозе 25 нг/мл.
Полученные дендритные клетки культивируются с мононуклеарными клетками неприлипшей фракции в соотношении 1:10 с добавлением рчИЛ-18 в дозе 40 нг/мл.
Для определения эффективности модуляции противовирусного иммунного ответа с помощью полученных ДК оценивали пролиферативную активность МНК, предварительно культивированных с антиген-активированными ДК, в ответ на специфический антиген вируса гепатита В HBcAg (табл.1).
| Таблица 1 | ||
| Пролиферативный ответ мононуклеарных клеток пациентов, больных хроническим вирусным гепатитом В, культивированных с антиген-активированными ДК и интерлейкином-18 in vitro (n=16). | ||
| Группы | Спонтанный пролиферативный ответ, имп/мин | НВсAg-стимулированный пролиферативный ответ, имп/мин |
| МНК | 721,98±127,70 | 1102,54±308,65 |
| МНК+рчИЛ-18 | 1560,47±644,18 | 2867,11±1325,05 |
| МНК+ДК (без антигена) | 4249,20±2403,54*(**) | 6100,60±2975,46* |
| МНК+ДК (с антигеном) | 5574,30±2090,43* | 6047,00±2498,02*# |
| МНК+ДК (с антигеном)+рчИЛ-18 | 8399,76±5560,53*(**) | 11260,19±7325,00** |
| Примечание: | МНК - интактные клетки неприлипающей фракции мононуклеарных клеток | |
| МНК+рчИЛ-18 - интактные клетки неприлипающей фракции мононуклеарных клеток, культивированные в присутствии рчИЛ-18 | ||
| МНК+ДК (без антигена) - МНК, культивированные с ДК, которым не представлялся, антиген вируса гепатита В НВсAg | ||
| МНК+ДК (с антигеном) - МНК, культивированные с ДК, которым представлялся антиген вируса гепатита В HBcAg | ||
| МНК+ДК (с антигеном) + рчИЛ-18 - МНК, культивированные с ДК, которым представлялся антиген вируса гепатита В HBcAg с добавлением рчИЛ-18 | ||
| ** - различия достоверны (р<0.05) по сравнению с группой МНК. | ||
| * - различия достоверны (р<0.05) по сравнению с группой МНК+IL-18 | ||
| # - различия достоверны (р<0.05) по сравнению с группой МНК+ДК (с антигеном) | ||
Кроме того, для тестирования активации Т-хелперов 1 типа оценивали уровень продукции ИФН-γ в кондиционных средах от клеточных культур МНК в ответ на НВсAg с помощью иммуноферментного анализа (табл.2).
| Таблица 2 | ||
| Продукции ИФН-γ МНК пациентов, больных хроническим вирусным гепатитом В, культивированных с антиген-активированными ДК и интерлейкином-18 in vitro (n=16). | ||
| Содержание ИФН-γ в кондиционных средах МНК, пг/мл | ||
| Спонтанная продукция | НВсAg-стимулированная продукция | |
| МНК | 12,29±3,37 | 16,06±5,02 |
| МНК+IL-18 | 11,23±2,25 | 24,04±9,42 |
| МНК+ДК (без антигена) | 15,91±4,17 | 20,13±4,65 |
| МНК+ДК (с антигеном) | 16,39±3,48 | 23,39±5,89* |
| МНК+ДК (с антигеном)+IL-18 | 17,03±3,41** | 34,39±17,85** |
| Примечание: | МНК - интактные клетки неприлипающей фракции мононуклеарных клеток | |
| МНК+рчИЛ-18 - интактные клетки неприлипающей фракции мононуклеарных клеток, культивированные в присутствии рчИЛ-18 | ||
| МНК+ДК (без антигена) - МНК, культивированные с ДК, которым не представлялся антиген вируса гепатита В НВсAg | ||
| МНК+ДК (с антигеном) - МНК, культивированные с ДК, которым представлялся антиген вируса гепатита В HBcAg | ||
| МНК+ДК (с антигеном) + рчИЛ-18 - МНК, культивированные с ДК, которым представлялся антиген вируса гепатита В HBcAg с добавлением рчИЛ-18 | ||
| ** - различия достоверны (р<0.05) по сравнению с группой МНК. | ||
| * - различия достоверны (р<0.05) по сравнению с группой МНК+IL-18 | ||
Для исследования потенциальной цитотоксической активности определяли экспрессию молекул перфорина мононуклеарными клетками, предварительно культивированными с антиген-активированными ДК в ответ на специфический антиген HBcAg. Перфорин - фактор цитотоксичности, мономерный белок, вызывающий образование пор в цитоплазматической мембране, что приводит к лизису инфицированных клеток. Показано достоверное повышение количества перфорин-позитивных клеток, что служит показателем активации цитотоксических клеток, необходимых для уничтожения инфицированных клеток (табл.3).
| Таблица 3 | ||
| Уровень экспрессии внутриклеточного белка перфорина мононуклеарными клетками больных хроническим вирусным гепатитом В, культивированных с антиген-активированными ДК и интерлейкином-18 in vitro (n=8). | ||
| Группы | Спонтанная экспрессия перфорина (% позитивных клеток) | ESAT-6-стимулированная экспрессия перфорина (% позитивных клеток) |
| МНК | 9,09±1,69 | 12,93±2,05 |
| МНК+рчИЛ-18 | 10,81±1,49 | 12,89±1,82 |
| МНК+ДК (без антигена) | 14,68±2,80** | 13,97±1,74 |
| МНК+ДК (с антигеном) | 14,26±2,31 | 16,82±2,57 |
| МНК+ДК (с антигеном)+рчИЛ-18 | 15,37±2,53** | 18,98±2,99*(#)(##) |
| Примечание: | МНК - интактные клетки неприлипающей фракции мононуклеарных клеток | |
| МНК+рчИЛ-18 - интактные клетки неприлипающей фракции мононуклеарных клеток, культивированные в присутствии рчИЛ-18 | ||
| МНК+ДК (без антигена) - МНК, культивированные с ДК, которым не представлялся, антиген вируса гепатита В НВсAg | ||
| МНК+ДК (с антигеном) - МНК, культивированные с ДК, которым представлялся антиген вируса гепатита В HBcAg | ||
| МНК+ДК (с антигеном) + рчИЛ-18 - МНК, культивированные с ДК, которым представлялся антиген вируса гепатита В HBcAg с добавлением рчИЛ-18 | ||
| ** - различия достоверны (р<0.05) по сравнению с группой МНК. | ||
| * - различия достоверны (р<0.05) по сравнению с группой МНК+IL-18 | ||
| # - различия достоверны (р<0.05) по сравнению с группой МНК+ДК | ||
| ## - различия достоверны (р<0.05) по сравнению с группой МНК+ДК (без антигена) | ||
Совместное культивирование ДК и МНК больных хроническим вирусным гепатитом В является эффективным способом генерации специфических цитотоксических клеток мононуклеарного происхождения, что проявляется в усилении их пролиферативного потенциала, стимуляции уровня продукции ИФН-γ и формировании цитотоксических клеток, экспрессирующих перфорин в ответ на специфический антиген HBV. Использование рекомбинантного человеческого ИЛ-18 для усиления индукции ответа Т хелперов 1 типа статистически достоверно увеличивает цитокинпродуцирующий и цитотоксический потенциал мононуклеарных клеток in vitro. Таким образом, в результате проведенных исследований разработан способ генерации антиген-специфических противовирусных цитотоксических клеток с помощью антиген-активированных аутологичных дендритных клеток и рчИЛ-18 in vitro. Такой способ генерации противовирусных цитотоксических клеток значительно повышает их противовирусный потенциал и позволит в дальнейшем найти применение в лечении гепатита В. Способ экономичен, что также существенно в условиях лечебных учреждений.
Claims (1)
- Способ генерации антиген-специфических цитотоксических клеток с активностью против клеток, инфицированных вирусом гепатита В, заключающийся в совместном культивировании мононуклеарных клеток периферической крови больных хроническим вирусным гепатитом В с обработанными антигеном вируса гепатита В аутологичными дендритными клетками, отличающийся тем, что культивирование дендритных клеток проводят с неприлипающей фракцией мононуклеарных клеток в присутствии рекомбинантного человеческого интерлейкина-18.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2008109616/13A RU2366707C1 (ru) | 2008-03-11 | 2008-03-11 | Способ генерации антиген-специфических цитотоксических клеток с активностью против клеток, инфицированных вирусом гепатита в |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2008109616/13A RU2366707C1 (ru) | 2008-03-11 | 2008-03-11 | Способ генерации антиген-специфических цитотоксических клеток с активностью против клеток, инфицированных вирусом гепатита в |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2366707C1 true RU2366707C1 (ru) | 2009-09-10 |
Family
ID=41166565
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2008109616/13A RU2366707C1 (ru) | 2008-03-11 | 2008-03-11 | Способ генерации антиген-специфических цитотоксических клеток с активностью против клеток, инфицированных вирусом гепатита в |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2366707C1 (ru) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2458985C1 (ru) * | 2011-03-18 | 2012-08-20 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт клинической иммунологии" Сибирского отделения Российской академии медицинских наук (ФГБУ "НИИКИ" СО РАМН) | Способ генерации антиген-специфических цитотоксических клеток с противоопухолевой активностью |
| RU2520091C2 (ru) * | 2012-08-16 | 2014-06-20 | Общество с ограниченной ответственностью "АваксисБио" | Способ стимуляции цитотоксического иммунного ответа против клеток опухолевой линии аденокарциномы молочной железы, экспрессирующих специфические антигены, с помощью дендритных клеток, трансфецированных полиэпитопной днк-конструкцией |
-
2008
- 2008-03-11 RU RU2008109616/13A patent/RU2366707C1/ru not_active IP Right Cessation
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2458985C1 (ru) * | 2011-03-18 | 2012-08-20 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт клинической иммунологии" Сибирского отделения Российской академии медицинских наук (ФГБУ "НИИКИ" СО РАМН) | Способ генерации антиген-специфических цитотоксических клеток с противоопухолевой активностью |
| RU2520091C2 (ru) * | 2012-08-16 | 2014-06-20 | Общество с ограниченной ответственностью "АваксисБио" | Способ стимуляции цитотоксического иммунного ответа против клеток опухолевой линии аденокарциномы молочной железы, экспрессирующих специфические антигены, с помощью дендритных клеток, трансфецированных полиэпитопной днк-конструкцией |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US9492529B2 (en) | Method for priming of T cells | |
| US20200360497A1 (en) | Compositions and methods for producing dendritic cells | |
| CN105924527B (zh) | 嵌合抗原受体及其基因和重组表达载体、car30-nkt细胞及其制备方法和应用 | |
| JP2014511704A5 (ru) | ||
| AU758622B2 (en) | Method for activating natural killer (NK) cells | |
| US20200121745A1 (en) | Compositions and methods for cancer therapy with dengue virus and dendritic cells | |
| Silin et al. | Synthetic and natural immunomodulators acting as interferon inducers | |
| US20210236568A1 (en) | Compositions and methods for therapy with dengue virus | |
| EP2003978B1 (en) | Allogeneic cell therapy for treatment of opportunistic infection | |
| JP2021176862A (ja) | デングウイルス及び樹状細胞による併用療法のための組成物及び方法 | |
| JP2016155851A (ja) | 制御性ｔ細胞の阻害のための方法および組成物 | |
| RU2458985C1 (ru) | Способ генерации антиген-специфических цитотоксических клеток с противоопухолевой активностью | |
| RU2366707C1 (ru) | Способ генерации антиген-специфических цитотоксических клеток с активностью против клеток, инфицированных вирусом гепатита в | |
| TWI459955B (zh) | 一種活化樹突狀細胞和巨噬細胞的醫藥組合物 | |
| KR101867942B1 (ko) | 바이러스 항원 특이적인 t 세포의 유도 및 증식 방법 | |
| JPH06504450A (ja) | ヒトあるいは動物有機体を措置するための細胞組成物 | |
| RU2378373C2 (ru) | Способ генерации антиген-специфических противотуберкулезных клеток | |
| Kulkarni et al. | In vitro T-cell proliferative response to the flavivirus, West Nile | |
| RU2465324C1 (ru) | Способ генерации специфического иммунного ответа против антигенов вируса иммунодефицита человека | |
| RU2526799C2 (ru) | Фармацевтическая композиция и способ получения противовирусных фракций (антивирус-с) | |
| KR20170047336A (ko) | 화합물 및 방법 | |
| RU2637631C2 (ru) | Способ иммунотерапии хронического вирусного гепатита с | |
| Saharan | Paradigm shift in discovery & secretion of Biosimilars via path breaking innovation | |
| Pordanjani et al. | Engineered dendritic cells-derived exosomes harboring HIV-1 Nefmut-Tat fusion protein and heat shock protein 70: A promising HIV-1 safe vaccine candidate | |
| JP2003511419A (ja) | ウイルス／抗原処理された樹状細胞による抗原特異的ｔ細胞の活性化 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20160312 |