RU2378373C2 - Способ генерации антиген-специфических противотуберкулезных клеток - Google Patents
Способ генерации антиген-специфических противотуберкулезных клеток Download PDFInfo
- Publication number
- RU2378373C2 RU2378373C2 RU2008104232/13A RU2008104232A RU2378373C2 RU 2378373 C2 RU2378373 C2 RU 2378373C2 RU 2008104232/13 A RU2008104232/13 A RU 2008104232/13A RU 2008104232 A RU2008104232 A RU 2008104232A RU 2378373 C2 RU2378373 C2 RU 2378373C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- antigen
- cells
- tuberculosis
- mnc
- mncs
- Prior art date
Links
Landscapes
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Способ по изобретению предусматривает совместное культивирование неприлипающей фракции мононуклеарных клеток (МНК), которые выделяют из периферической крови пациентов больных туберкулезом легких, с обработанными антигеном Mycobacterium tuberculosis дендритными клетками (ДК), полученными из моноцитов прилипающей фракции МНК, при этом используют зрелые ДК. Зрелые ДК получают добавлением к антиген-активированным незрелым ДК индуктора созревания, представляющего собой липополисахарид Е. coli. Совместное культивирование указанных клеток проводят в присутствии рекомбинантного человеческого интерлейкина-18 (IL-18). Способ по изобретению обеспечивает усиление пролиферативного потенциала специфических цитотоксических клеток мононуклеарного происхождения, стимуляцию уровня продукции ИФН-γ, формирование цитотоксических клеток в ответ на специфический антиген М. tuberculosis. 3 табл.
Description
Изобретение относится к иммунологии и биотехнологии, а именно к способам генерации антиген-специфических противотуберкулезных цитотоксических клеток.
В основе патогенеза туберкулеза лежит нарушение взаимодействия иммунокомпетентных клеток в результате длительного персистирования микобактерий внутри антиген-презентирующих клеток. Стандартное лечение туберкулеза основано на применении антибиотиков, подавляющих развитие микобактерий на различных этапах их жизненного цикла. Лекарственная химиотерапия часто приводит к развитию лекарственно-устойчивых штаммов возбудителей инфекции и поэтому становится неэффективной, кроме того, обладает выраженным гепатотоксическим действием. В настоящее время развитие новых эффективных подходов к лечению инфекционных заболеваний связано с использованием собственных механизмов защиты организма и их возможной модуляции. Эффективный иммунный ответ на М. tuberculosis связан с индукцией клеточного звена иммунного ответа, который в данном случае реализуется посредством Т-хелперов 1 типа. Активность Т-хелперов 1 типа напрямую зависит от представления им антигена и их направленной дифференцировки, что осуществляется дендритными клетками как основными антиген-презентирующими клеточными элементами. Дендритные клетки (ДК) усиливают врожденный иммунитет, регулируют развитие специфического иммунного ответа, обеспечивают развитие иммунологической толерантности. В настоящее время активно исследуется возможность применения дендритных клеток для модуляции специфического иммунного ответа и развития новых методов иммунокоррекции. Это связано, прежде всего, с той ролью, которую ДК играют в организме в развитии иммунного ответа, в частности, дендритные клетки обладают уникальными механизмами захвата антигена и представления его наивным Т-клеткам, определяя направленность и активность иммунных реакций. Кроме того, в эксперименте in vitro показано, что ДК, полученные из моноцитов, не поддерживают внутриклеточную репликацию вирулентного штамма М. tuberculosis H37Rv, в отличие от макрофагов, полученных из тех же самых моноцитов, благодаря снижению доступа микобактериальных вакуолей к циркулирущим эндосомам и ограничению доступа питательных веществ (Tailleux L, Neyrolles О, Honore-Bouakline S, Perret E, Sanchez F, Abastado JP, Lagrange PH, Gluckman JC, Rosenzwajg М, Herrmann JL. Constrained intracellular survival of Mycobacterium tuberculosis in human dendritic cells//J Immunol. - 2003. - V.15, №170(4). - P.1939-48).
Описан способ (прототип), при котором незрелые ДК получали из моноцитов прилипающей фракции мононуклеарных клеток (МНК) периферической крови больных туберкулезом путем культивирования в полной среде с добавлением гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (ГМ-КСФ) и интерлейкина-4 (ИЛ-4) в течение 4 дней. Затем полученные незрелые дендритные клетки в течение последующих 4 суток культивировались совместно с аутологичными Т-клетками в присутствии липидных антигенов М. tuberculosis. Была показана стимуляция пролиферативной активности Т-клеток и увеличение количества ИФН-γ -продуцирующих клеток в ответ на липидные антигены М. tuberculosis (Ulrichs Т, Moody DB, Grant E, Kaufmann SH, Porcelli SA. T-cell responses to CD 1-presented lipid antigens in humans with Mycobacterium tuberculosis infection // Infect Immun. - 2003. - Vol.71, №6. - p.3076-87).
Интерлейкин-18 (ИЛ-18) - провоспалительный цитокин, который стимулирует продукцию ИФН-γ Т- и НК-клетками, тем самым способствуя активации макрофагов и уничтожению инфицированных микобактериями клеток. Однако у пациентов, больных туберкулезом, наблюдается значительное снижение продукции ИЛ-18 и ИФН-γ М. tuberculosis-стимулированными мононуклеарными клетками in vitro. Добавление в культуру антител к ИЛ-18, приводящее к связыванию эндогенного цитокина, резко снижает М. tuberculosis-индуцированную продукцию ИФН-γ, что говорит о роли ИЛ-18 в синтезе ИФН-γ. Рекомбинантный человеческий ИЛ-18 (рчИЛ-18) в дозе 10 нг/мл стимулирует М. tuberculosis-индуцированную секрецию ИФН-γ у больных туберкулезом. Добавление рчИЛ-18 при совместном культивировании зрелых антиген-активированных ДК и МНК необходимо для стимуляции и поддержания направленной дифференцировки наивных Т-клеток в Т-хелперы 1 типа.
Задачей настоящего изобретения является создание способа генерации антиген-специфических цитотоксических клеток из периферической крови больных туберкулезом.
Сущность предлагаемого изобретения заключается в совместном культивировании неприлипающей фракции МНК, выделенных из периферической крови больных туберкулезом с обработанными антигеном M. tuberculosis дендритными клетками (ДК), полученными из моноцитов прилипающей фракции МНК. Причем для культивирования берутся зрелые ДК, полученные добавлением к антиген-активированным незрелым ДК индуктора созревания, например, липополисахарида E. coli, а совместное культивирование неприлипающей фракции МНК и зрелых ДК проводят в присутствии рекомбинантного человеческого интерлейкина-18.
Техническим результатом изобретения является активация антиген-специфических иммунных реакций по Т-хелпер 1 типу на антиген М. tuberculosis с помощью цитотоксических ИФН-γ-продуцирующих клеток, полученных при сокультивировании мононуклеарных клеток периферической крови больных туберкулезом легких с аутологичными антигенпрезентирующими дендритными клетками и интерлейкином-18 in vitro.
Изобретение осуществляется следующим образом.
Выделенные из периферической крови пациентов больных туберкулезом мононуклеарные клетки прилипающей фракции культивируются в концентрации 1 млн/мл в полной среде, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ L-глютамина, 10 мМ HEPES, 5×10-5 мМ 2-меркаптоэтанола, 80 мкг/мл гентамицина, 100 мкг/мл ампициллина в атмосфере 5% CO2 при 37°С с добавлением ГМ-КСФ (50 нг/мл) и ИЛ-4 (200 нг/мл). Через 24 часа культивирования к полученным незрелым ДК добавляется специфический антиген M. tuberculosis ESAT-6 в дозе 3 мкг/мл, а еще через 2 часа для созревания незрелых дендритных клеток в течение последующих 24 часов вносится липополисахарид Е. coli (штамм 055:В5, Sigma) в дозе 5 мкг/мл.
Полученные дендритные клетки культивируются с мононуклеарными клетками неприлипшей фракции в соотношении 1:10 с добавлением рчИЛ-18 в дозе 40 нг/мл.
Для определения эффективности модуляции противотуберкулезного иммунного ответа с помощью полученных ДК оценивали пролиферативную активность МНК, предварительно культивированных с антиген-активированными ДК, в ответ на специфический антиген M. tuberculosis ESAT-6 (табл.1).
Таблица 1 Пролиферативный ответ мононуклеарных клеток пациентов, больных туберкулезом легких, культивированных с антиген-активированными ДК и интерлейкином-18 in vitro (n=16). |
||
Группы | Спонтанный пролиферативный ответ, имп/мин | ESAT-6-стимулированный пролиферативный ответ, имп/мин |
МНК | 1003,818±215,35 | 1345,303±273,93 |
МНК+рчИЛ-18 | 1360,939±279,11 | 1833,758±310,69 |
МНК+ДК(без антигена) | 2846,37±434,325 | 2987,148±549,88 |
МНК+ДК(с антигеном) | 3041,424±619,85** | 3014,758±553,83** |
МНК+ДК(с антигеном)+рчИЛ-18 | 3344,242±610,76* | 3100,515±563,14* |
Примечание: МНК - интактные клетки неприлипающей фракции мононуклеарных клеток МНК+рчИЛ-18 - интактные клетки неприлипающей фракции мононуклеарных клеток, культивированные в присутствии рчИЛ-18 МНК+ДК (без антигена) - МНК, культивированные с ДК, которым не представлялся антиген М. tuberculosis ESAT-6 МНК+ДК (с антигеном) - МНК, культивированные с ДК, которым представлялся антиген М. tuberculosis ESAT-6 МНК+ДК (с антигеном)+рчИЛ-18 - МНК, культивированные с ДК, которым представлялся антиген M.tuberculosis ESAT-6 с добавлением рчИЛ-18. **- различия достоверны (р<0.05) по сравнению с группой МНК. *- различия достоверны (р<0.05) по сравнению с группой МНК+рчИЛ-18 |
Кроме того, для тестирования активации Т-хелперов 1 типа оценивали количество клеток, продуцирующих ИФН-γ, с помощью технологии ELISpot и уровень продукции ИФН-γ в кондиционных средах от клеточных культур МНК в ответ на антиген ESAT-6 с помощью иммуноферментного анализа (табл.2).
Таблица 2 Продукция ИФН-γ МНК пациентов, больных туберкулезом легких, культивированных с антиген-активированными ДК и интерлейкином-18 in vitro (n=16). |
||||
Количество ИФН-γ-продуцирующих клеток (на 100 тыс. МНК) | Содержание ИФН-γ в кондиционных средах МНК, пг/мл | |||
Спонтанное | ESAT-6 | Спонтанное | ESAT-6 | |
МНК | 36±3 | 64±7 | 13±3 | 139±49 |
MHK+IL-18 | 45±41 | 119±23 | 58±35 | 187±99 |
МНК+ДК(без антигена) | 82±11 | 102±6 | 100±78 | 383±140 |
МНК+ДК(с антигеном) | 84±11** | 163±35** | 718±318** | 882±376** |
МНК+ДК(с антигеном)+IЕ-18 | 114±13* | 266±39*(#) | 728±364* | 1257±469*(#) |
Примечание: МНК - интактные клетки неприлипающей фракции мононуклеарных клеток МНК+рчИЛ-18 - интактные клетки неприлипающей фракции мононуклеарных клеток, культивированные в присутствии рчИЛ-18 МНК+ДК (без антигена) - МНК, культивированные с ДК, которым не представлялся антиген М tuberculosis ESAT-6 МНК+ДК (без антигена) - МНК, культивированные с ДК, которым представлялся антиген М. tuberculosis ESAT-6 МНК+ДК (с антигеном)+рчИЛ-18 - МНК, культивированные с ДК, которым представлялся антиген М. tuberculosis ESAT-6 с добавлением рчИЛ-18. **- различия достоверны (р<0.05) по сравнению с группой МНК. *- различия достоверны (р<0.05) по сравнению с группой MHK+IL-18 # - различия достоверны (р<0.05) по сравнению с группой МНК+ДК |
Для исследования потенциальной цитотоксической активности мы определяли экспрессию молекул перфорина мононуклеарными клетками, предварительно культивированными с антиген-активированными ДК в ответ на специфический антиген ESAT-6. Перфорин - фактор цитотоксичности, мономерный белок, вызывающий образование пор в цитоплазматической мембране, что приводит к лизису инфицированных клеток. Показано достоверное повышение количества перфорин-позитивных клеток, что служит показателем активации цитотоксических клеток, необходимых для уничтожения М. tuberculosis (табл.3).
Таблица 3 Уровень экспрессии внутриклеточного белка перфорина мононуклеарными клетками больных туберкулезом, культивированных с антиген-активированными ДК и интерлейкином-18 in vitro (n=8). |
||
Группы | Спонтанная экспрессия перфорина (% позитивных клеток) | ESAT-6-стимулированная экспрессия перфорина (% позитивных клеток) |
МНК | 12,056±1,234 | 15,114±1,660 |
МНК+рчИЛ-18 | 20,484±2,90** | 19,695±3,065 |
МНК+ДК(без антигена) | 23,233±3,040 | 21,194±0,954 |
МНК+ДК(с антигеном) | 23,243±2,996** | 28,571±3,628** |
МНК+ДК(с антигеном)+рчИЛ-18 | 31,391±6,788* | 35,678±6,841*(#) |
Примечание: МНК - интактные клетки неприлипающей фракции мононуклеарных клеток МНК+рчИЛ-18 - интактные клетки неприлипающей фракции мононуклеарных клеток, культивированные в присутствии рчИЛ-18 МНК+ДК (без антигена) - МНК, культивированные с ДК, которым не представлялся антиген М. tuberculosis ESAT-6 МНК+ДК (без антигена) - МНК, культивированные с ДК, которым представлялся антиген М. tuberculosis ESAT-6 МНК+ДК (с антигеном)+рчИЛ-18 - МНК, культивированные с ДК, которым представлялся антиген М. tuberculosis ESAT-6 с добавлением рчИЛ-18. ** - различия достоверны (р<0.05) по сравнению с группой МНК. * - различия достоверны (р<0.05) по сравнению с группой MHK+IL-18 # - различия достоверны (р<0.05) по сравнению с группой МНК+ДК |
Совместное культивирование ДК и МНК больных туберкулезом легких является эффективным способом генерации специфических цитотоксических клеток мононуклеарного происхождения, что проявляется в усилении их пролиферативного потенциала, стимуляции уровня продукции ИФН-γ и формировании цитотоксических клеток, экспрессирующих перфорин в ответ на специфический антиген М. tuberculosis. Использование рекомбинантного человеческого ИЛ-18 для усиления индукции ответа Т-хелперов 1 типа статистически достоверно увеличивает цитокинпродуцирующий и цитотоксический потенциал мононуклеарных клеток in vitro. Таким образом, в результате проведенных исследований разработан способ генерации антиген-специфических противотуберкулезных цитотоксических клеток с помощью антиген-активированных аутологичных дендритных клеток и рчИЛ-18 in vitro. Такой способ генерации дендритных и противотуберкулезных цитотоксических клеток не только снижает время и затраты на их получение, но и максимально отражает процесс дифференцировки клеток in vivo.
Claims (1)
- Способ генерации антиген-специфических клеток с противотуберкулезной активностью, заключающийся в совместном культивировании неприлипающей фракции мононуклеарных клеток (МНК), выделенных из периферической крови больных туберкулезом, с обработанными антигеном Mycobacterium tuberculosis дендритными клетками (ДК), полученными из моноцитов прилипающей фракции МНК, отличающийся тем, что для совместного культивирования берут зрелые ДК, полученные добавлением к антиген-активированным незрелым ДК индуктора созревания липополисахарида E.coli, а совместное культивирование неприлипающей фракции МНК и зрелых ДК проводят в присутствии рекомбинантного человеческого интерлейкина-18 (ИЛ-18).
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2008104232/13A RU2378373C2 (ru) | 2008-02-04 | 2008-02-04 | Способ генерации антиген-специфических противотуберкулезных клеток |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2008104232/13A RU2378373C2 (ru) | 2008-02-04 | 2008-02-04 | Способ генерации антиген-специфических противотуберкулезных клеток |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2008104232A RU2008104232A (ru) | 2009-08-10 |
RU2378373C2 true RU2378373C2 (ru) | 2010-01-10 |
Family
ID=41049149
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2008104232/13A RU2378373C2 (ru) | 2008-02-04 | 2008-02-04 | Способ генерации антиген-специфических противотуберкулезных клеток |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2378373C2 (ru) |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2458985C1 (ru) * | 2011-03-18 | 2012-08-20 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт клинической иммунологии" Сибирского отделения Российской академии медицинских наук (ФГБУ "НИИКИ" СО РАМН) | Способ генерации антиген-специфических цитотоксических клеток с противоопухолевой активностью |
WO2014007667A1 (ru) * | 2012-06-25 | 2014-01-09 | Volgushev Sergei Anatolievich | Аутологичная вакцина для лечения туберкулеза легких и способ ее получения |
RU2521506C1 (ru) * | 2013-04-01 | 2014-06-27 | Общество с ограниченной ответственностью "БиоМедТех" (ООО "БиоМедТех") | Способ генерации антиген-специфических цитотоксических клеток с противоопухолевой активностью при раке молочной железы |
RU2596920C2 (ru) * | 2013-07-26 | 2016-09-10 | Общество с ограниченной ответственностью "АваксисБиотерапевтикс" | Способ получения антиген-специфических цитотоксических клеток, обладающих активностью против клеток рака молочной железы |
-
2008
- 2008-02-04 RU RU2008104232/13A patent/RU2378373C2/ru not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
Ulrichs Т. et al. "T-cell responses to CD1-presented lipid antigens in humans with Mycobacterium tuberculosis infection", Infect Immun., 2003, vol.71, N6, p.3076-87. НОВИКОВ Д.К., НОВИКОВА В.И. Клеточные методы иммунодиагностики. - Минск: "Беларусь", 1979, с.92-101. * |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2458985C1 (ru) * | 2011-03-18 | 2012-08-20 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт клинической иммунологии" Сибирского отделения Российской академии медицинских наук (ФГБУ "НИИКИ" СО РАМН) | Способ генерации антиген-специфических цитотоксических клеток с противоопухолевой активностью |
WO2014007667A1 (ru) * | 2012-06-25 | 2014-01-09 | Volgushev Sergei Anatolievich | Аутологичная вакцина для лечения туберкулеза легких и способ ее получения |
RU2521506C1 (ru) * | 2013-04-01 | 2014-06-27 | Общество с ограниченной ответственностью "БиоМедТех" (ООО "БиоМедТех") | Способ генерации антиген-специфических цитотоксических клеток с противоопухолевой активностью при раке молочной железы |
RU2596920C2 (ru) * | 2013-07-26 | 2016-09-10 | Общество с ограниченной ответственностью "АваксисБиотерапевтикс" | Способ получения антиген-специфических цитотоксических клеток, обладающих активностью против клеток рака молочной железы |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
RU2008104232A (ru) | 2009-08-10 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Venkatasubramanian et al. | IL-21-dependent expansion of memory-like NK cells enhances protective immune responses against Mycobacterium tuberculosis | |
Wilczynski et al. | The characterization and role of regulatory T cells in immune reactions | |
US20080254064A1 (en) | Compositions and methods for priming monocytic dendritic cells and t cells for th-1 response | |
JP6804984B2 (ja) | 腫瘍、後天性免疫不全症候群および白血病の二重免疫バイオスティミュレーションによる処置における使用のための治療剤 | |
CN109913412B (zh) | 体外诱导和/或扩增tscm的组合物、培养基和方法 | |
RU2378373C2 (ru) | Способ генерации антиген-специфических противотуберкулезных клеток | |
RU2458985C1 (ru) | Способ генерации антиген-специфических цитотоксических клеток с противоопухолевой активностью | |
US7494812B2 (en) | Generation of human regulatory T cells by bacterial toxins for the treatment of inflammatory disorders | |
Won et al. | A Salmonella Typhi ghost induced by the E gene of phage φX174 stimulates dendritic cells and efficiently activates the adaptive immune response | |
KR20130091061A (ko) | 결핵균의 Rv2005c 단백질을 유효성분으로 포함하는 수지상 세포의 성숙화 유도용 조성물 | |
RU2521506C1 (ru) | Способ генерации антиген-специфических цитотоксических клеток с противоопухолевой активностью при раке молочной железы | |
KR101126408B1 (ko) | 마이코박테리움 아비움 종 파라투버클로시스의 fap로 미성숙 수지상 세포를 성숙화 유도 및 1형 면역 반응을 유도하는 방법 | |
RU2392946C2 (ru) | Аутологичная вакцина для лечения онкологических заболеваний и способ ее получения | |
JP5717116B2 (ja) | 抗原特異的ヒトTh17細胞を調整する方法 | |
Gao et al. | Attenuated Streptococcus pneumoniae vaccine candidate SPY1 promotes dendritic cell activation and drives a Th1/Th17 response | |
EP1280889B1 (en) | Compositions and methods for producing antigen-presenting cells | |
Strygin et al. | Mycobacterium vaccae lysate induces anti-allergic immune response in vitro | |
US10443040B2 (en) | Method for preparing antigen-specific cytotoxic T-cells by using activated B-cells and use thereof | |
RU2366707C1 (ru) | Способ генерации антиген-специфических цитотоксических клеток с активностью против клеток, инфицированных вирусом гепатита в | |
Khamisabadi et al. | Listeria monocytogenes activated dendritic cell based vaccine for prevention of experimental tumor in mice | |
RU2372936C1 (ru) | Способ получения аутологичной вакцины для лечения туберкулеза | |
RU2465324C1 (ru) | Способ генерации специфического иммунного ответа против антигенов вируса иммунодефицита человека | |
Won GaYeon et al. | A Salmonella Typhi ghost induced by the E gene of phage υX174 stimulates dendritic cells and efficiently activates the adaptive immune response. | |
WO2014007667A1 (ru) | Аутологичная вакцина для лечения туберкулеза легких и способ ее получения | |
Guo et al. | Immune responses induced by Mycobacterium tuberculosis heat-resistant antigen (Mtb-HAg) upon co-administration with Bacillus Calmette-Guérin in mice |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20170205 |