RU2345136C2

RU2345136C2 - Polynucleotide, coding protein with functional activity of glucose carrier, and protein with functional activity of glucose carrier

Info

Publication number: RU2345136C2
Application number: RU2005110955/13A
Authority: RU
Inventors: Гюнтер МЮЛЛЕР (DE); Гюнтер Мюллер; Зильке ДЛУГАЙ (DE); Зильке ДЛУГАЙ; Дерте ФОСС (DE); Дерте ФОСС; Экхард БОЛЕС (DE); Экхард БОЛЕС
Original assignee: Санофи-Авентис Дойчланд Гмбх
Priority date: 2002-09-14
Filing date: 2003-09-04
Publication date: 2009-01-27
Also published as: IL197621A; KR20050056206A; ZA200501871B; BR0314115A; IL197621A0; KR101233998B1; RU2005110955A; NO20051795L; HK1084401A1; WO2004026907A2; JP2006517088A; AU2003264257B2; MXPA05002816A; CA2498636A1; DE10242763A1; CN1694960A; JP4520854B2; CA2498636C; WO2004026907A3; IL167321A

Abstract

FIELD: chemistry, biochemistry.

SUBSTANCE: invention relates to gene engineering and biotechnology and can be used in a pharmaceutical industry. Cleared and extracted polynucleotide encodes protein with functional activity of a glucose carrier and the GLUT4 protein amino acid lineage wherein valine in position 85 is replaced by methionine. The protein under consideration features biological activity in yeast strains S. cerevisiae deprived of functional carriers of glucose and Erg4 protein.

EFFECT: production of protein with functional activity of glucose carrier in yeasty expressing system.

5 cl, 3 tbl, 1 ex

Description

Изобретение относится к штаммам дрожжей, в которых человеческий переносчик Glut 4 и Glut 1 может функционально экспрессироваться.The invention relates to yeast strains in which the human carrier Glut 4 and Glut 1 can be functionally expressed.

Большинство гетеротрофных клеток транспортирует глюкозу во внутренние отделы клетки через специальные протеины-переносчики. В различных организмах устанавливаются разные механизмы, которые способствуют транспорту глюкозы, такие как, в особенности, протеиновые симпорт-системы, Na⁺-переносчики глюкозы, зависимые от связывания протеинов системы, фосфотрансферазные системы, а также системы для облегченной диффузии. В случае эукариот поглощение глюкозы через облегченную диффузию опосредует семейство переносчиков глюкозы, которые кодируются в случае млекопитающих GLUT-генами (GLUT=переносчик глюкозы) и в случае Saccharomyces cerevisiae - НХТ-генами (НХТ=переносчик гексозы). Эти переносчики причисляют к более крупному семейству переносчиков сахара. Они отличаются наличием 12 трансмембранных спиралей и несколькими консервативными аминокислотными остатками.Most heterotrophic cells transport glucose to the internal parts of the cell through special carrier proteins. Different mechanisms are established in different organisms that promote glucose transport, such as, in particular, protein symport systems, Na ⁺ glucose transporters, protein-dependent systems, phosphotransferase systems, and also systems for facilitated diffusion. In the case of eukaryotes, glucose uptake via facilitated diffusion mediates the family of glucose transporters, which are encoded in the case of mammals with GLUT genes (GLUT = glucose transporter) and, in the case of Saccharomyces cerevisiae, with HXT genes (NHT = hexose transporter). These carriers are among the larger family of sugar carriers. They are distinguished by the presence of 12 transmembrane helices and several conservative amino acid residues.

Транспорт глюкозы играет большую роль при заболеваниях, которые ассоциированы с дефектным гомеостазом глюкозы, как, например, сахарный диабет или синдром Фанкони-Биккеля. Транспорт глюкозы у млекопитающих поэтому является объектом многочисленных исследований. Вплоть до настоящего момента идентифицированы тринадцать протеинов, подобных переносчикам глюкозы, (от GLUT1 до GLUT12, HMIT-H-мио-инозитол-переносчик). К ключевым ролям этих переносчиков относят поглощение глюкозы в различных тканях, их накопление в печени, их инсулинзависимое поглощение в мышечных клетках и адипоцитах, а также изменение уровня глюкозы за счет Я-клеток поджелудочной железы.Glucose transport plays an important role in diseases that are associated with defective glucose homeostasis, such as diabetes mellitus or Fanconi-Bickel syndrome. Mammalian glucose transport is therefore the subject of numerous studies. So far, thirteen proteins similar to glucose transporters have been identified (from GLUT1 to GLUT12, HMIT-H-myo-inositol carrier). The key roles of these carriers include glucose uptake in various tissues, their accumulation in the liver, their insulin-dependent uptake in muscle cells and adipocytes, as well as changes in glucose due to pancreatic I-cells.

GLUT1 опосредует транспорт глюкозы в эритроциты и через гематоэнцефалический барьер, однако, также экспрессируется во многих других тканях, в то время как GLUT4 ограничен инсулинзависимой тканью, в первую очередь мышечной и жировой тканью. В случае этих инсулинзависимых тканей контроль в отношении нацеливания GLUT4-переносчиков во внутриклеточные компартменты или компартменты клеточных мембран представляет собой важный механизм регуляции поглощения глюкозы. В присутствии инсулина внутриклеточный GLUT4 обратно распределяется на клеточной мембране для облегчения поглощения глюкозы. GLUT1 также экспрессируется в этих инсулинзависимых тканях и его распределение в клетке также находится под влиянием инсулина, однако, в меньшей степени. Сверх того, относительная эффективность, с которой GLUT1 или GLUT4 катализируют транспорт сахара, определяется не только величиной конъюгирования каждого переносчика с поверхностью клетки, но и также их кинетическими свойствами.GLUT1 mediates the transport of glucose into red blood cells and through the blood-brain barrier, however, it is also expressed in many other tissues, while GLUT4 is limited to insulin-dependent tissue, primarily muscle and adipose tissue. In the case of these insulin-dependent tissues, monitoring for targeting GLUT4 transporters to intracellular compartments or cell membrane compartments is an important mechanism for regulating glucose uptake. In the presence of insulin, intracellular GLUT4 is redistributed on the cell membrane to facilitate glucose uptake. GLUT1 is also expressed in these insulin-dependent tissues and its distribution in the cell is also influenced by insulin, however, to a lesser extent. Moreover, the relative efficiency with which GLUT1 or GLUT4 catalyzes the transport of sugar is determined not only by the magnitude of the conjugation of each carrier with the cell surface, but also by their kinetic properties.

Тот факт, что различные изоформы переносчиков глюкозы коэкспрессируются, а также быстрый метаболизм глюкозы, усложняет исследования роли и конкретных свойств каждой изоформы переносчика глюкозы в этих инсулинзависимых тканях. Для решения этой проблемы используют гетерологичные системы экспрессии, как Xenopus-ооциты, клетки культуры тканей, клетки насекомых и дрожжевые клетки. Однако подчеркивается, что в случае этих систем возникает ряд затруднений: слишком слабая активность гетерологично экспрессированных переносчиков, собственные переносчики глюкозы в этих системах, внутриклеточная ретенция значительной части переносчиков или даже продуцирование неактивных переносчиков.The fact that various isoforms of glucose transporters are coexpressed, as well as fast glucose metabolism, complicates the study of the role and specific properties of each glucose transporter isoform in these insulin-dependent tissues. To solve this problem, heterologous expression systems are used, such as Xenopus oocytes, tissue culture cells, insect cells and yeast cells. However, it is emphasized that in the case of these systems a number of difficulties arise: the activity of heterologically expressed carriers is too weak, the glucose carriers of their own in these systems, the intracellular retention of a significant part of the carriers, or even the production of inactive carriers.

Естественно встречающийся протеин GLUT4 млекопитающих, в особенности таковой человека, может в определенных условиях функционально экспрессироваться в штаммах Saccharomyces cerevisiae. Дрожжевыми клетками являются одноклеточные эукариотические организмы. Поэтому для некоторых протеинов они лучше пригодны для экспрессии, чем бактериальные системы, в особенности для осуществления скрининга для идентификации фармацевтически активных веществ.The naturally occurring GLUT4 protein of mammals, especially that of humans, can, under certain conditions, be functionally expressed in Saccharomyces cerevisiae strains. Yeast cells are unicellular eukaryotic organisms. Therefore, for some proteins, they are better suited for expression than bacterial systems, in particular for screening for the identification of pharmaceutically active substances.

Настоящее изобретение относится к очищенному и выделенному полинуклеотиду, включающему последовательность ДНК, которая кодирует протеин GLUT4V85M. В этом протеине в положении 85 аминокислотной цепи человеческого протеина GLUT4 аминокислота валина заменена на метионин. Этот измененный протеин GLUT4V85M открывает дальнейшие альтернативы в отношении экспрессии функционального протеина GLUT4. Протеин GLUT4 в связи с Saccharomyces cerevisiae следует рассматривать как функциональный, если в штамме Saccharomyces cerevisiae, все переносчики глюкозы которого неактивны (=hxt(-)), после экспрессии этого протеина GLUT4 наблюдается поглощение глюкозы. Поглощение глюкозы может быть установлено либо путем измерения транспорта с помощью радиоактивно меченной глюкозы, либо по росту на среде с глюкозой как единственного источника углерода.The present invention relates to a purified and isolated polynucleotide comprising a DNA sequence that encodes a protein GLUT4V85M. In this protein, at position 85 of the amino acid chain of the GLUT4 human protein, the amino acid valine is replaced by methionine. This modified GLUT4V85M protein opens up further alternatives for the expression of the functional GLUT4 protein. The GLUT4 protein in connection with Saccharomyces cerevisiae should be considered functional if, in the Saccharomyces cerevisiae strain, all glucose transporters of which are inactive (= hxt (-)), glucose uptake is observed after the expression of this GLUT4 protein. Glucose uptake can be established either by measuring transport using radioactively labeled glucose, or by growth on a medium with glucose as the sole carbon source.

Очищенный и выделенный полинуклеотид, включающий последовательность ДНК, которая кодирует протеин GLUT4V85M, согласно предпочтительному варианту осуществления, может включать последовательность следующих групп или состоять из них:A purified and isolated polynucleotide comprising a DNA sequence that encodes a GLUT4V85M protein according to a preferred embodiment may include or consist of the following groups of sequences:

а) нуклеотидная последовательность, согласно идентифицированной последовательности Seg ID № 1;a) the nucleotide sequence according to the identified sequence Seg ID No. 1;

b) нуклеотидная последовательность, которая в строгих условиях гибридизируется с последовательностью Seg ID № 1 и кодирует протеин GLUT4V85M.b) a nucleotide sequence which, under stringent conditions, hybridizes with the sequence Seg ID No. 1 and encodes the protein GLUT4V85M.

Очищенный и выделенный полинуклеотид предпочтительно кодирует протеин GLUT4V85M, обладающий аминокислотной последовательностью Seg ID № 2. Очищенный и выделенный полинуклеотид, включающий последовательность ДНК, которая кодирует, как описано выше, протеин GLUT4V85M, оперативным образом может быть связан с промотором. В качестве промотора используют в особенности прокариотические или эукариотические промоторы, как, например, Lac-, trp-, ADH- или HXT7-промотор. Часть полинуклеотида кодирующая протеин GLUT4V85M точно связана оперативным образом с промотором, если при использовании этого промотора при помощи вектора в бактериальном или эукариотическом организме образуется мРНК, которая может транслироваться в протеин GLUT4V85M. Таким вектором является, например, вектор p4H7GLUT4V85M (Seg ID № 3). Протеин GLUT4V85M может экспрессироваться в дрожжевых клетках с помощью этого вектора.The purified and isolated polynucleotide preferably encodes a GLUT4V85M protein having the amino acid sequence of Seg ID No. 2. The purified and isolated polynucleotide comprising the DNA sequence that encodes, as described above, the GLUT4V85M protein can be operatively linked to a promoter. As a promoter, especially prokaryotic or eukaryotic promoters are used, such as, for example, the Lac, trp, ADH or HXT7 promoter. A part of the polynucleotide encoding the GLUT4V85M protein is precisely operatively linked to the promoter if, when using this promoter, mRNA is formed using a vector in a bacterial or eukaryotic organism, which can be translated into the GLUT4V85M protein. Such a vector is, for example, the vector p4H7GLUT4V85M (Seg ID No. 3). The protein GLUT4V85M can be expressed in yeast cells using this vector.

Вышеописанный полинуклеотид, включающий последовательность ДНК, которая кодирует протеин GLUT4V85M, согласно предпочтительному варианту осуществления, пригоден для репликации этого полинуклеотида в дрожжевой клетке или для экспрессии части полинуклеотида, кодирующей протеин GLUT4V85M в протеин GLUT4V85M в дрожжевой клетке. В качестве дрожжевой клетки в особенности пригодна клетка Saccharomyces cerevisiae. Для репликации и экспрессии в дрожжевой клетке полинуклеотид, включающий последовательность ДНК, которая кодирует протеин GLUT4V85M, находится в виде дрожжевого вектора. Область полинуклеотида кодирующая протеин GLUT4V85M оперативным образом может быть связана со специфичным для дрожжевых клеток промотором, как, например, с ADH-промотором (промотор алкогольдегидрогеназа) или РХТ7-промотором (промотор переносчик гексозы). В случае дрожжевых векторов речь идет о группе векторов, которая создана для клонирования ДНК в дрожжах.The above polynucleotide comprising a DNA sequence that encodes a GLUT4V85M protein according to a preferred embodiment is suitable for replicating this polynucleotide in a yeast cell or for expressing a portion of a polynucleotide encoding a GLUT4V85M protein to a GLUT4V85M protein in a yeast cell. As a yeast cell, a Saccharomyces cerevisiae cell is particularly suitable. For replication and expression in a yeast cell, a polynucleotide comprising a DNA sequence that encodes a GLUT4V85M protein is in the form of a yeast vector. The polynucleotide region encoding the GLUT4V85M protein can be operatively linked to a yeast cell-specific promoter, such as, for example, the ADH promoter (alcohol dehydrogenase promoter) or the TXT7 promoter (hexose transfer promoter). In the case of yeast vectors, we are talking about a group of vectors that is designed to clone DNA in yeast.

Изобретение относится, далее, к дрожжевой клетке Saccharomyces cerevisicae, в которой все переносчики глюкозы более не являются функциональными (=hxt(-)) и в которой не содержится функциональный протеин Erg4. В случае такой дрожжевой клетки речь идет предпочтительно о дрожжевой клетке, депонированной в DSMZ (Немецкая коллекция микроорганизмов и клеточных культур ГмбХ, Mascheroder Weg 16, 38124 Брауншвейг) в качестве Saccharomyces cerevisiae DSM 15187.The invention further relates to the yeast cell Saccharomyces cerevisicae, in which all glucose transporters are no longer functional (= hxt (-)) and which do not contain the functional Erg4 protein. In the case of such a yeast cell, it is preferably a yeast cell deposited in DSMZ (German Collection of Microorganisms and Cell Culture GmbH, Mascheroder Weg 16, 38124 Braunschweig) as Saccharomyces cerevisiae DSM 15187.

Изобретение относится также к дрожжевой клетке, в которой все переносчики глюкозы более не являются функциональными и в которой не содержится функциональный протеин Fgy1 и функциональный протеин Erg4. Отсутствие протеина Erg4 или протеина Fgy1 может сводиться в особенности к разрыву соответствующего кодирующего участка генома или к частичному или полному удалению кодирующего участка генома.The invention also relates to a yeast cell in which all glucose transporters are no longer functional and which do not contain the functional Fgy1 protein and the functional Erg4 protein. The absence of Erg4 protein or Fgy1 protein can be reduced in particular to rupture of the corresponding coding region of the genome or to partial or complete removal of the coding region of the genome.

В качестве дрожжевой клетки, которая не содержит функциональных переносчиков глюкозы, функционального протеина Fgy1 и никакого функционального протеина Erg4, предпочтительно используют дрожжевую клетку, депонированную в DSMZ в качестве Saccharomyces cerevisiae DSM 15184.As a yeast cell that does not contain functional glucose transporters, Fgy1 functional protein and no Erg4 functional protein, a yeast cell deposited in DSMZ as Saccharomyces cerevisiae DSM 15184 is preferably used.

Дрожжевую клетку, как описанная выше, предпочтительно используют для экспрессии (= выражение) протеина GLUT1 или протеина GLUT4 млекопитающего в особенности такого, как крыса, мышь, кролик, свинья, крупный рогатый скот или человекообразные обезьяны. Согласно предпочтительному варианту осуществления, дрожжевую клетку используют для экспрессии человеческого протеина GLUT4 или GLUT1.A yeast cell, as described above, is preferably used to express (= expression) a GLUT1 protein or a GLUT4 protein of a mammal, in particular a rat, mouse, rabbit, pig, cattle or anthropoid apes. According to a preferred embodiment, the yeast cell is used to express the human protein GLUT4 or GLUT1.

Дрожжевая клетка Saccharomyces cerevisiae, все переносчики глюкозы, а также протеин Erg4 которой не являются более функциональными, может содержать полинуклеотид согласно настоящему изобретению, который включает последовательность ДНК, кодирующую протеин GLUT4V85M. Эта дрожжевая клетка также может экспрессировать протеин GLUT4V85M и тем самым содержать этот протеин.A Saccharomyces cerevisiae yeast cell, all glucose transporters, as well as Erg4 protein which is no longer functional, may contain a polynucleotide according to the present invention, which includes a DNA sequence encoding a GLUT4V85M protein. This yeast cell can also express the GLUT4V85M protein and thereby contain this protein.

Такой штамм дрожжей, содержащий полинуклеотид, который включает последовательность ДНК, кодирующую протеин GLUT4V85M, представляет собой предпочтительно депонированный в DSMZ штамм дрожжей Saccharomyces cerevisiae DSM 15185.Such a yeast strain containing a polynucleotide that includes a DNA sequence encoding a GLUT4V85M protein is preferably a Saccharomyces cerevisiae DSM 15185 yeast strain deposited in DSMZ.

Дрожжевую клетку, все переносчики глюкозы, а также протеин Erg4 которой более не являются функциональными, которая содержит полинуклеотид, включающий последовательность ДНК, кодирующую протеин GLUT4V85M, можно получать, например, тем, чтоA yeast cell, all glucose transporters, as well as Erg4 protein which is no longer functional, which contains a polynucleotide including a DNA sequence encoding a GLUT4V85M protein, can be obtained, for example, by the fact that

а) получают дрожжевую клетку, все переносчики глюкозы, а также протеин Erg4 которой более не являются функциональными;a) a yeast cell is obtained, all glucose transporters, as well as the Erg4 protein of which are no longer functional;

b) получают выделенный и очищенный полинуклеотид, который включает последовательность ДНК, кодирующую протеин GLUT4V85M, и который может реплицироваться в дрожжевой клетке;b) an isolated and purified polynucleotide is obtained that includes a DNA sequence encoding a GLUT4V85M protein and which can replicate in a yeast cell;

с) дрожжевую клетку из а) трансформируют с помощью полинуклеотида из b);c) the yeast cell from a) is transformed with the polynucleotide from b);

d) трансформированную дрожжевую клетку селекционируют;d) a transformed yeast cell is selected;

е) в случае необходимости, экспрессируют протеин GLUT4V85M.e) if necessary, express the protein GLUT4V85M.

Выделенный и очищенный полинуклеотид, который включает последовательность ДНК, кодирующую протеин GLUT4V85M, представляет собой предпочтительно реплицируемый в дрожжевой клетке вектор, в котором клонируется последовательность ДНК. Таким вектором является, например p4H7GLUT4V85M (Seg ID № 3).The isolated and purified polynucleotide, which includes the DNA sequence encoding the GLUT4V85M protein, is preferably a vector replicated in a yeast cell in which the DNA sequence is cloned. Such a vector is, for example, p4H7GLUT4V85M (Seg ID No. 3).

Изобретение относится также к дрожжевой клетке, все переносчики глюкозы, а также протеины Egy1 и Erg4 которой более не являются функциональными, и которая содержит полинуклеотид, который включает последовательность ДНК, кодирующую протеин GLUT4V85M. Эта дрожжевая клетка также может экспрессировать протеин GLUT4V85M и тем самым содержать этот протеин. Такой штамм дрожжей представляет собой предпочтительно депонированный в DSMZ штамм дрожжей Saccharomyces cerevisiae DSM 15186.The invention also relates to a yeast cell, all glucose transporters, as well as the Egy1 and Erg4 proteins of which are no longer functional, and which contains a polynucleotide that includes a DNA sequence encoding a GLUT4V85M protein. This yeast cell can also express the GLUT4V85M protein and thereby contain this protein. Such a yeast strain is preferably a strain of yeast Saccharomyces cerevisiae DSM 15186 deposited in DSMZ.

Дрожжевую клетку, все переносчики глюкозы, а также протеин Fgy1, как и протеин Erg4 которой более не являются функциональными и которая содержит полинуклеотид, включающий последовательность ДНК, кодирующую протеин GLUT4V85M, можно получать, например, тем, чтоA yeast cell, all glucose transporters, as well as the Fgy1 protein, as well as the Erg4 protein of which are no longer functional, and which contains a polynucleotide including a DNA sequence encoding the GLUT4V85M protein, can be obtained, for example, by the fact that

а) получают дрожжевую клетку, все переносчики глюкозы, а также протеин Fgy1, как и Erg4 которой более не являются функциональными;a) a yeast cell is obtained, all glucose transporters, as well as the Fgy1 protein, as well as Erg4 of which are no longer functional;

Вышеуказанный выделенный и очищенный полинуклеотид, который включает последовательность ДНК, кодирующую протеин GLUT4V85M, предпочтительно представляет собой реплицируемый в дрожжевой клетке вектор, в котором клонируется последовательность ДНК. Таким вектором является, например p4H7GLUT4V85M (Seg ID № 3).The above isolated and purified polynucleotide, which includes the DNA sequence encoding the GLUT4V85M protein, is preferably a vector replicated in a yeast cell into which the DNA sequence is cloned. Such a vector is, for example, p4H7GLUT4V85M (Seg ID No. 3).

Изобретение относится также к дрожжевой клетке, все переносчики глюкозы которой более не являются функциональными, которая содержит полинуклеотид, включающий последовательность ДНК, которая кодирует протеин GLUT4V85M.The invention also relates to a yeast cell, all of whose glucose transporters are no longer functional, which contains a polynucleotide comprising a DNA sequence that encodes a GLUT4V85M protein.

Эта дрожжевая клетка может также экспрессировать протеин GLUT4V85M и тем самым содержать этот протеин. Такой штамм дрожжей представляет собой предпочтительно депонированный в DSMZ штамм дрожжей Saccharomyces cerevisiae DSM 15188.This yeast cell can also express the GLUT4V85M protein and thereby contain this protein. Such a yeast strain is preferably a strain of yeast Saccharomyces cerevisiae DSM 15188 deposited in DSMZ.

Дрожжевую клетку, все переносчики глюкозы которой более не являются функциональными и которая содержит полинуклеотид, включающий последовательность ДНК, которая кодирует протеин GLUT4V85M, можно получать, например, тем, чтоA yeast cell, all glucose carriers of which are no longer functional, and which contains a polynucleotide comprising a DNA sequence that encodes a protein GLUT4V85M, can be obtained, for example, by the fact that

а) получают дрожжевую клетку, все переносчики глюкозы которой более не являются функциональными;a) receive a yeast cell, all glucose transporters of which are no longer functional;

В случае вышеуказанного выделенного и очищенного полинуклеотида, который включает последовательность ДНК, кодирующую протеин GLUT4V85M, речь идет предпочтительно о реплицируемом в дрожжевой клетке векторе, в котором клонируется последовательность ДНК. Таким вектором является, например, p4H7GLUT4V85M (Seg ID № 3).In the case of the aforementioned isolated and purified polynucleotide, which comprises a DNA sequence encoding a GLUT4V85M protein, it is preferably a vector replicated in a yeast cell in which the DNA sequence is cloned. Such a vector is, for example, p4H7GLUT4V85M (Seg ID No. 3).

Изобретение также относится к протеину с аминокислотной последовательностью согласно Seg ID № 2. Этот протеин представляет собой человеческий протеин GLUT4, в котором в положении 85 аминокислотной цепи валин заменен метионином.The invention also relates to a protein with an amino acid sequence according to Seg ID No. 2. This protein is a human protein GLUT4 in which at position 85 of the amino acid chain, valine is replaced by methionine.

Изобретение относится также к способу идентификации соединения, которое стимулирует активность протеина GLUT4, отличающемуся тем, чтоThe invention also relates to a method for identifying a compound that stimulates the activity of a GLUT4 protein, characterized in that

а) получают дрожжевую клетку, все переносчики глюкозы, а также протеин Erg4 которой более не являются функциональными и которая содержит полинуклеотид, включающий последовательность ДНК, которая кодирует протеин GLUT4V85M;a) a yeast cell is obtained, all glucose transporters, as well as the Erg4 protein which are no longer functional, and which contains a polynucleotide comprising a DNA sequence that encodes a GLUT4V85M protein;

b) получают химическое соединение;b) receive a chemical compound;

с) дрожжи из а) вводят в контакт с химическим соединением из b);c) the yeast from a) is brought into contact with the chemical compound from b);

d) определяют поглощение глюкозы дрожжами из с);d) determining the glucose uptake by the yeast from c);

е) определенное значение поглощения глюкозы из d) соотносят к определенному значению поглощения глюкозы в дрожжевой клетке согласно а), которую не вводили в контакт с химическим соединением согласно b), причем соединение, которое вызывает увеличение поглощенного количества глюкозы в дрожжах согласно d), стимулирует активность протеина GLUT4V85M. В случае соединений, которые стимулируют активность протеина GLUT4V85M, нужно считать, что они также стимулируют активность GLUT4.e) a specific glucose uptake from d) is correlated with a specific glucose uptake in a yeast cell according to a) that has not been brought into contact with a chemical compound according to b), and a compound that causes an increase in the absorbed amount of glucose in the yeast according to d) stimulates protein activity GLUT4V85M. In the case of compounds that stimulate the activity of the GLUT4V85M protein, it should be considered that they also stimulate the activity of GLUT4.

Изобретение относится также к лекарственному средству, которое содержит соединение, идентифицированное вышеописанным способом, а также, далее, добавки и вспомогательные вещества для приготовления лекарственного средства. Далее, изобретение относится к применению соединения, идентифицированного вышеописанным способом, для получения лекарственного средства для лечения диабета типа I и/или II.The invention also relates to a medicinal product, which contains a compound identified by the above method, as well as, further, additives and auxiliary substances for the preparation of a medicinal product. The invention further relates to the use of a compound identified by the above method for the manufacture of a medicament for the treatment of type I and / or II diabetes.

Изобретение относится также к лекарственному средству, содержащему соединение, которое идентифицировано вышеописанным способом, а также добавки и вспомогательные вещества для приготовления лекарственного средства. Далее, изобретение относится к применению соединения, которое идентифицировано вышеописанным способом, для получения лекарственного средства для лечения диабета.The invention also relates to a medicinal product containing a compound that is identified by the above method, as well as additives and auxiliary substances for the preparation of a medicinal product. The invention further relates to the use of a compound that is identified by the above method for the manufacture of a medicament for the treatment of diabetes.

Далее, изобретение относится к применению соединения, идентифицированного вышеописанным способом, для получения лекарственного средства для лечения диабета.The invention further relates to the use of a compound identified by the above method for the manufacture of a medicament for the treatment of diabetes.

Настоящее изобретение относится также к способу идентификации соединения, которое ингибирует протеин, кодирующий ген Erg4, отличающемуся тем, чтоThe present invention also relates to a method for identifying a compound that inhibits a protein encoding an Erg4 gene, characterized in that

а) получают дрожжевую клетку, все переносчики глюкозы которой более не являются функциональными и которая содержит полинуклеотид, включающий последовательность ДНК, которая кодирует протеин GLUT4V85M и может реплицироваться в дрожжевой клетке;a) receive a yeast cell, all glucose transporters of which are no longer functional and which contains a polynucleotide comprising a DNA sequence that encodes a protein GLUT4V85M and can replicate in the yeast cell;

е) определенное значение поглощения глюкозы из d) соотносят к определенному значению поглощения глюкозы в дрожжевой клетке согласно а), которую не вводили в контакт с химическим соединением согласно b), причем соединение, которое вызывает повышение поглощенного количества глюкозы в дрожжах согласно d), ингибирует активность протеина Erg4.e) a specific glucose uptake from d) is correlated with a specific glucose uptake in a yeast cell according to a) that has not been brought into contact with a chemical compound according to b), and a compound that causes an increase in the absorbed amount of glucose in the yeast according to d) inhibits Erg4 protein activity.

Изобретение относится, далее, к способу идентификации соединения, которое ингибирует соответствующий протеин гена FGY1, отличающемуся тем, чтоThe invention further relates to a method for identifying a compound that inhibits the corresponding protein of the FGY1 gene, characterized in that

а) получают дрожжевую клетку, все переносчики глюкозы и протеин Erg4 которой более не являются функциональными и которая содержит протеин GLUT4;a) a yeast cell is obtained, all glucose transporters and Erg4 protein of which are no longer functional and which contains GLUT4 protein;

е) определенное значение поглощения глюкозы из d) соотносят к определенному значению поглощения глюкозы в дрожжевой клетке согласно а), которую не вводили в контакт с химическим соединением согласно b), причем соединение, которое вызывает повышение поглощенного количества глюкозы в дрожжах согласно d), ингибирует активность протеина Fgy1.e) a specific glucose uptake from d) is correlated with a specific glucose uptake in a yeast cell according to a) that has not been brought into contact with a chemical compound according to b), and a compound that causes an increase in the absorbed amount of glucose in the yeast according to d) inhibits protein activity Fgy1.

Изобретение относится также к лекарственному средству, содержащему соединение, идентифицированное вышеописанным способом, а также добавки и вспомогательные вещества для приготовления лекарственного средства.The invention also relates to a medicinal product containing a compound identified by the above method, as well as additives and auxiliary substances for the preparation of a medicinal product.

Изобретение поясняется ниже подробнее в отношении технических деталей.The invention is explained below in more detail with respect to technical details.

Гибридизация означает связывание двух однонитиевых нуклеиновых кислот, которые обладают комплементарными последовательностями оснований, с образованием двунитиевых молекул. Гибридизация может происходить между двумя нитями ДНК, одной нитью ДНК и одной нитью РНК, а также между двумя нитями РНК. В принципе, гибридные молекулы можно получать тем, что участвующие в гибридизации нуклеиновые кислоты, которые могут быть сначала двунитиевыми, нагревают настолько, что они распадаются на однонитиевые молекулы без вторичной структуры. Это происходит, например, за счет кипячения на водяной бане в течение 10 минут. Затем оставляют медленно охлаждаться. Во время фазы охлаждения происходит сочетание парами комплементарных цепей с образованием двунитиевых гибридных молекул. Гибридизацию осуществляют в лабораторных условиях обычно при помощи фильтров для гибридизации, на которые путем блоттинга или электрофореза наносят однонитиевые или денатурируемые полинуклеотидные молекулы. Гибридизацию соответствующих комплементарных полинуклеотидных молекул можно визуализировать тем, что эти гибридизируемые полинуклеотидные молекулы снабжают радиоактивной флуоресцирующей меткой. Описываются требования к степени соответствия или точности в отношении пригодности определенных условий. При высоких требованиях к соответствию являются более высокими, чем в случае более низких требований контролирования. При гибридизации нуклеиновых кислот, в зависимости от применения и поставленной задачи, устанавливают определенные, различные в отношении требований, условия. При высоких требованиях, реакционные условия при гибридизации устанавливают так, что в реакцию гибридизации друг с другом могут вступать только очень хорошо подходящие друг другу комплементарные молекулы. Более низкие требования к строгости реакционных условий позволяют осуществляться также частичной гибридизации молекул с более или менее большими участками непарных оснований или оснований, у которых отсутствуют пары.Hybridization means the binding of two single-stranded nucleic acids that have complementary base sequences to form double-stranded molecules. Hybridization can occur between two strands of DNA, one strand of DNA and one strand of RNA, as well as between two strands of RNA. In principle, hybrid molecules can be obtained by the fact that nucleic acids involved in hybridization, which may be first double-stranded, are heated so much that they break up into single-stranded molecules without a secondary structure. This happens, for example, by boiling in a water bath for 10 minutes. Then let it cool slowly. During the cooling phase, pairs of complementary chains combine to form double-stranded hybrid molecules. Hybridization is carried out under laboratory conditions, usually using hybridization filters, onto which single-stranded or denatured polynucleotide molecules are applied by blotting or electrophoresis. Hybridization of the corresponding complementary polynucleotide molecules can be visualized by the fact that these hybridizable polynucleotide molecules are provided with a radioactive fluorescent label. Describes the requirements for degree of compliance or accuracy with respect to the suitability of certain conditions. High compliance requirements are higher than lower control requirements. When hybridizing nucleic acids, depending on the application and the task set, certain conditions are set that are different with respect to requirements. Under high requirements, the reaction conditions during hybridization are set so that only very well-matched complementary molecules can enter into the hybridization reaction with each other. Lower requirements for the severity of the reaction conditions also allow partial hybridization of molecules with more or less large portions of unpaired bases or bases that lack pairs.

Условия гибридизации нужно понимать как строгие с точки зрения требований в особенности, если гибридизацию осуществляют в водном, содержащем 2xSSC растворе при температуре 68°С по меньшей мере в течение 2 часов и затем промывают сначала в течение 5 минут в содержащем 2xSSC/0,1% SDS растворе при комнатной температуре, затем в течение 1 часа в содержащем 1xSSC/0,1% SDS растворе при температуре 68°С и в течение 1 следующего часа в содержащем 0,2% SSC/0,1% SDS растворе при температуре 68°С.Hybridization conditions must be understood as stringent from the point of view of requirements, in particular, if hybridization is carried out in an aqueous solution containing 2xSSC at a temperature of 68 ° C for at least 2 hours and then washed first for 5 minutes in a mixture containing 2xSSC / 0.1% SDS solution at room temperature, then for 1 hour in a solution containing 1xSSC / 0.1% SDS at 68 ° C and for 1 next hour in a solution containing 0.2% SSC / 0.1% SDS at 68 ° FROM.

2xSSC-, 1xSSC-, соответственно, 0,2xSSC-Раствор приготовляют путем соответствующего разведения 20xSSC-раствора. 20xSSC-Раствор содержит 3 моль/л NaCl и 0,3 моль/л цитрата натрия. Значение рН составляет 7,0. Специалисту известны способы гибридизации полинуклеотидов в строгих условиях. Соответствующие указания находятся в справочниках, как в особенности “Current Protocols in Volecular Biology (Wiley Interscience; ответственные редакторы издания: Frederich M. Ausubel, Roger Brant, Robert E. Kingston, David. J. Moore, J.G. Seidmann, Kevin Struhl; ISBN: 0-471-50338-X).2xSSC-, 1xSSC-, respectively, 0.2xSSC-Solution is prepared by appropriate dilution of a 20xSSC-solution. 20xSSC-Solution contains 3 mol / L NaCl and 0.3 mol / L sodium citrate. The pH value is 7.0. Specialist known methods for the hybridization of polynucleotides in stringent conditions. Relevant directions are found in references, in particular, “Current Protocols in Volecular Biology (Wiley Interscience; editors-in-chief: Frederich M. Ausubel, Roger Brant, Robert E. Kingston, David. J. Moore, JG Seidmann, Kevin Struhl; ISBN: 0-471-50338-X).

В случае дрожжевых векторов можно различать разные подгруппы. Ylp-Векторы (дрожжевые интегрирующие плазмиды) соответствуют по существу используемым для клонирований в бактериях векторам, однако содержат селекционируемый дрожжевой ген (например, URA3, LEU2).In the case of yeast vectors, different subgroups can be distinguished. Ylp vectors (yeast integrating plasmids) correspond to the vectors essentially used for cloning in bacteria, but contain a breeding yeast gene (e.g., URA3, LEU2).

Только если после введения этого вектора приходят к интеграции чужеродной ДНК в дрожжевую хромосому, эти последовательности реплицируются вместе с хромосомой и стабильно передаются при возникновении клона во все дочерние клетки.Only if, after the introduction of this vector, they come to the integration of foreign DNA into the yeast chromosome, these sequences are replicated along with the chromosome and are stably transmitted when a clone occurs in all daughter cells.

Исходя из этого способа получают плазмиды, которые могут автономно реплицироваться на основании эукариотических ORls (сайт инициации репликации). Такие дрожжевые векторы называют YRp-векторами (дрожжевые реплицирующиеся плазмиды) или ARS-векторами (автономно реплицирующаяся последовательность). Далее, имеются YEp-векторы (дрожжевые эписональные плазмиды), которые производятся от дрожжевой плазмиды размером 2 мкм и содержат селекционируемый маркерный ген. Класс YAC-векторов (дрожжевая искусственная хромосома) ведет себя как самостоятельные хромосомы.Based on this method, plasmids are obtained that can autonomously replicate based on eukaryotic ORls (replication initiation site). Such yeast vectors are called YRp vectors (yeast replicating plasmids) or ARS vectors (autonomously replicating sequence). Further, there are YEp vectors (yeast episonal plasmids) that are derived from a 2 μm yeast plasmid and contain a selectable marker gene. The class of YAC vectors (artificial yeast chromosome) behaves as independent chromosomes.

Дрожжевой вектор, содержащий ген для экпрессии, вводят в дрожжи, чтобы он мог экспрессироваться, путем трансформации. Для этого пригодны, например, такие способы, как электропорация или инкубация компетентных клеток за счет векторной ДНК. Пригодные промоторы экспрессии дрожжей известны специалисту. Таковыми являются, например, SOD1-промотор (супероксиддисмутаза), ADH-промотор (алкогольдегидрогеназа), промотор гена кислой фосфатазы, НХТ2-промотор (переносчик глюкозы 2), НХТ7-промотор (переносчик глюкозы 7), GAL2-промотор (переносчик галактозы) и другие. Конструкция, состоящая из промотора экспрессии дрожжей и гена для экспрессии (например, GLUT4V85M), является целью экспрессии компонента дрожжевого вектора. Этот дрожжевой вектор для осуществления экспрессии может находиться в виде самореплицирующейся частицы независимо от генома дрожжей или может быть стабильно интегрирован в геном дрожжей. В качестве дрожжевого вектора, в принципе, пригодна любая полинуклеотидная последовательность, которая может размножаться в дрожжах. В качестве дрожжевых векторов можно использовать в особенности дрожжевые плазмиды или искусственные дрожжевые хромосомы (дрожжевые искусственные хромосомы). Дрожжевые векторы содержат, как правило, “сайт инициации репликации” (2 микрона, ars) для начала репликации, а также селекционный маркер, который обычно состоит из ауксотрофного маркера или гена устойчивости к антибиотикам. В качестве дрожжевых векторов специалисту известны, например, рВМ272, pCS19, pEMBCYe23, pFL26, pG6, pNN414, pTV3, p426MET25, p4H7 и другие.A yeast vector containing the gene for expression is introduced into the yeast so that it can be expressed by transformation. Suitable for this are, for example, methods such as electroporation or incubation of competent cells using vector DNA. Suitable yeast expression promoters are known to those skilled in the art. Such are, for example, the SOD1 promoter (superoxide dismutase), the ADH promoter (alcohol dehydrogenase), the acid phosphatase gene promoter, the HXT2 promoter (glucose transporter 2), the HXT7 promoter (glucose transporter 7), the GAL2 promoter (galactose transporter), and others. A construct consisting of a yeast expression promoter and an expression gene (e.g., GLUT4V85M) is the goal of expressing a yeast vector component. This yeast vector for expression can be in the form of a self-replicating particle, regardless of the yeast genome, or can be stably integrated into the yeast genome. As a yeast vector, in principle, any polynucleotide sequence that can propagate in yeast is suitable. As yeast vectors, in particular yeast plasmids or artificial yeast chromosomes (artificial yeast chromosomes) can be used. Yeast vectors typically contain a “replication initiation site” (2 microns, ars) to initiate replication, as well as a selection marker, which usually consists of an auxotrophic marker or antibiotic resistance gene. As yeast vectors, for example, pBM272, pCS19, pEMBCYe23, pFL26, pG6, pNN414, pTV3, p426MET25, p4H7 and others are known to those skilled in the art.

Под селекцией клетки в объеме настоящего изобретения нужно понимать ее целенаправленное обогащение на основании селекционного маркера, как, например, устойчивость к антибиотику или к возможности роста на определенной минимальной среде, а также, ее выделение и последующее культивирование на агаровой пластинке или в погруженной культуре.Under the selection of cells in the scope of the present invention, it is necessary to understand its targeted enrichment based on a selection marker, such as resistance to an antibiotic or the possibility of growth on a certain minimal medium, as well as its isolation and subsequent cultivation on an agar plate or in an immersed culture.

К обычно используемым методам специалисты относят культивирование, трансформацию и селекцию трансформированной дрожжевой клетки, а также экспрессию протеина в дрожжевой клетке. Указания на этот счет можно найти в стандартных руководствах, как, например, Walker Graeme M. “Yeast Physiology and Biotechnology”, Wiley and Sons, ISBN: 0-471-9446-8; или “Protein Synthesis and Targeting in Yeast”, редакторы Alistair J.P. Brown, Mick F. Fruite and John E.G. Mc Cartly; Springer Berlin; ISBN: 3-540-56521-3; или “Methods in Yeast Genetics”, 1997, A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual; Adams Alison (ред.); Cold Spring Harbor Laboratory; ISBN: 0-87969-508-0.Commonly used methods include cultivation, transformation and selection of a transformed yeast cell, as well as protein expression in a yeast cell. Indications for this can be found in standard manuals, such as Walker Graeme M. “Yeast Physiology and Biotechnology”, Wiley and Sons, ISBN: 0-471-9446-8; or “Protein Synthesis and Targeting in Yeast,” editors Alistair J.P. Brown, Mick F. Fruite and John E.G. Mc Cartly; Springer Berlin; ISBN: 3-540-56521-3; or “Methods in Yeast Genetics”, 1997, A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual; Adams Alison (eds.); Cold Spring Harbor Laboratory; ISBN: 0-87969-508-0.

В случае дрожжей Saccharomyces cerevisiae известны 17 переносчиков гексозы и дополнительно три переносчика мальтозы, которые, поскольку они в достаточной степени интенсивно экспрессируются, способны транспортировать гексозы в дрожжи. Известен штамм, из которого путем делеции удалены все переносчики, которые пригодны для поглощения гексозы. Этот штамм содержит лишь еще оба гена МРН2 и МРН3, которые гомологичны протеинам транспорта мальтозы. Оба гена МРН2 и МРН3 в присутствии глюкозы репрессируются в среде. Установление характеристики этого штамма дрожжей описывается Wieczorke и др., FEBS Lett., 464, 123-128 (1999). Этот штамм не в состоянии размножаться на субстрате с глюкозой в качестве единственного источника углерода. Из этого штамма можно селекционировать мутанты, которые, исходя из соответствующего вектора GLUT1, функционально экспрессируются (штамм hxt fgy1-1).In the case of Saccharomyces cerevisiae yeast, 17 hexose transporters and an additional three maltose transporters are known, which, since they are sufficiently intensively expressed, are capable of transporting hexoses to yeast. A strain is known from which all carriers that are suitable for the absorption of hexose are deleted by deletion. This strain contains only both the MPH2 and MPH3 genes, which are homologous to the maltose transport proteins. Both genes MPH2 and MPH3 in the presence of glucose are repressed in the medium. The characterization of this yeast strain is described by Wieczorke et al., FEBS Lett., 464 , 123-128 (1999). This strain is not able to multiply on a substrate with glucose as the sole carbon source. Mutants can be selected from this strain, which, based on the corresponding GLUT1 vector, are functionally expressed (hxt fgy1-1 strain).

Если в случае дрожжевого штамма hxt fgy1-1 трансформируют плазмидный вектор, который несет ген GLUT4 под контролем дрожжевого промотора, глюкоза все же транспортируется только очень незначительно. Функциональная экспрессия GLUT4 требует дальнейших адаптаций этого дрожжевого штамма, чтобы обеспечить значительный транспорт глюкозы c помощью GLUT4. Такие дрожжевые штаммы, которые поглощают глюкозу с помощью единственного переносчика глюкозы GLUT4 в клетках, можно выделять на субстратах с глюкозой в качестве единственного источника углерода. Для этого трансформируют дрожжевой штамм hxt fgy1-1, который несет ген GLUT4 под функциональным контролем дрожжевого промотора. Трансформированные таким образом дрожжевые клетки получают на питательной среде, которая содержит глюкозу в качестве единственного источника углерода, и инкубируют на ней. После инкубации в течение нескольких дней, например, при температуре 30°С наблюдают рост отдельных колоний. Одну из этих колоний выделяют. Если из этой колонии удаляют дрожжевую плазмиду, то размножения на питательной среде с глюкозой в качестве единственного источника углерода не происходит. Если этот штамм, который теперь не содержит векторной плазмиды, снова путем трансформации снабжают дрожжевым вектором, который несет ген GLUT4 под функциональным контролем дрожжевого промотора, то этот штамм снова способен размножаться на среде с глюкозой в качестве единственного источника углерода.If, in the case of the yeast strain hxt fgy1-1, the plasmid vector that carries the GLUT4 gene under the control of the yeast promoter is transformed, glucose is only very slightly transported. Functional expression of GLUT4 requires further adaptations of this yeast strain to allow significant glucose transport using GLUT4. Such yeast strains that absorb glucose using a single glucose transporter GLUT4 in cells can be isolated on substrates with glucose as the sole carbon source. To do this, transform the yeast strain hxt fgy1-1, which carries the GLUT4 gene under the functional control of the yeast promoter. The yeast cells transformed in this way are obtained on a nutrient medium that contains glucose as the sole carbon source and incubated on it. After incubation for several days, for example, at a temperature of 30 ° C, the growth of individual colonies is observed. One of these colonies is isolated. If a yeast plasmid is removed from this colony, then propagation on a nutrient medium with glucose as the sole carbon source does not occur. If this strain, which now does not contain a vector plasmid, is again transformed with a yeast vector that carries the GLUT4 gene under the functional control of the yeast promoter, then this strain is again able to propagate on a medium with glucose as the sole carbon source.

Вышеуказанные дрожжевые штаммы являются объектом Международной заявки РСТ/ЕР02/01373 c датой подачи заявки 9 февраля 2002 г., которая учитывает приоритет заявки DE 10106718.6 от 14 февраля 2002 г.The above yeast strains are the subject of International Application PCT / EP02 / 01373 with the filing date of February 9, 2002, which takes into account the priority of the application DE 10106718.6 of February 14, 2002

Дрожжевые штаммы, все собственные переносчики гексоз (переносчики глюкозы) которых не являются более функциональными, депонированы в Немецкой коллекции микроорганизмов и клеточных культур ГмбХ (DSMZ) уже в связи с Международной заявкой РСТ/ЕР02/01373 в более ранний период времени под номером DSM 14035, DSM 14036 или DSM 14037.Yeast strains, all of whose own carriers of hexoses (glucose carriers) are no longer functional, were deposited in the German collection of microorganisms and cell cultures GmbH (DSMZ) already in connection with the International application PCT / EP02 / 01373 in an earlier period of time under the number DSM 14035, DSM 14036 or DSM 14037.

Полинуклеотидные и аминокислотные последовательности GLUT4 доступны, например, под следующими регистрационными номерами в банке генов: М20747 (кДНК; человек); EMBL: D28561 (кДНК; крыса); EMBL: M23382 (кДНК; мышь); Swissprot: P14672 (протеин; человек); Swissprot: P19357 (протеин; крыса) и Swissprot: P14142 (протеин; мышь).GLUT4 polynucleotide and amino acid sequences are available, for example, under the following gene bank numbers: M20747 (cDNA; human); EMBL: D28561 (cDNA; rat); EMBL: M23382 (cDNA; mouse); Swissprot: P14672 (protein; human); Swissprot: P19357 (protein; rat) and Swissprot: P14142 (protein; mouse).

Полинуклеотидные последовательности и аминокислотные последовательности GLUT1 раскрыты под следующими кодовыми номерами в указанных банках данных: EMBL: М20653 (кДНК; человек); EMBL: M13979 (кДНК; крыса); EMBL: M23384 (кДНК; мышь); Swissprot: P11166 (протеин; человек); Swissprot: P11167 (протеин; крыса) и Swissprot: P17809 (протеин; мышь).The polynucleotide sequences and amino acid sequences of GLUT1 are disclosed under the following code numbers in the indicated data banks: EMBL: M20653 (cDNA; human); EMBL: M13979 (cDNA; rat); EMBL: M23384 (cDNA; mouse); Swissprot: P11166 (protein; human); Swissprot: P11167 (protein; rat) and Swissprot: P17809 (protein; mouse).

Лекарственные средства представляют собой готовые препаративные формы введения фармакологически активных веществ для лечения заболеваний или физических отсутствующих функций у человека и животного. Для пероральной терапии известны, например, порошки, гранулы, таблетки, пилюли, пастилки, драже, капсулы, жидкие экстракты, настойки, сиропы. Для наружного применения используют, например, аэрозоли, спреи, гели, мази или порошки. Парентеральное применение возможно с помощью растворов для инъекции или инфузии при использовании ампул, бутылочек или шприц-ампул. Специалисту в области фармацевтической технологии (галенового производства) известны эти и другие лекарственные средства.Medicines are ready-made formulations for the administration of pharmacologically active substances for the treatment of diseases or physical missing functions in humans and animals. For oral therapy, for example, powders, granules, tablets, pills, lozenges, dragees, capsules, liquid extracts, tinctures, syrups are known. For external use, for example, aerosols, sprays, gels, ointments or powders are used. Parenteral administration is possible with injection or infusion solutions using ampoules, bottles or syringe ampoules. Specialist in the field of pharmaceutical technology (galenical production) are aware of these and other drugs.

Вспомогательные вещества для приготовления лекарственного средства позволяют получать композицию с активным веществом, которая обеспечивает в каждом случае применения оптимально подобранное выделение, распределение и проявление действия биологически активного вещества. Такими вспомогательными веществами, например, являются наполнители, связующие, порофоры или смазки, как лактоза, сахароза, маннит, сорбит, целлюлоза, крахмал, дикальцийфосфат, полигликоли, альгинаты, поливинилпирролидон, карбоксиметилцеллюлоза, тальк или диоксид кремния.Excipients for the preparation of a medicinal product make it possible to obtain a composition with an active substance, which in each case of application provides the optimum selection, distribution and manifestation of the action of a biologically active substance. Such excipients, for example, are fillers, binders, porophores or lubricants such as lactose, sucrose, mannitol, sorbitol, cellulose, starch, dicalcium phosphate, polyglycols, alginates, polyvinylpyrrolidone, carboxymethyl cellulose, talc or silicon dioxide.

Диабет или сахарный диабет проявляется в выделении глюкозы с мочой при значительном повышении уровня глюкозы в крови (гипергликемия) по причине хронического нарушения обмена веществ, которое основано на недостатке инсулина или пониженном действии инсулина. Отсутствующее или пониженное действие инсулина приводит к недостаточной резорбции и использованию поглощенной кровью глюкозы клетками организма. В жировой ткани под воздействием инсулин-антагонистических гормонов происходит повышенный липолиз с увеличением количества свободных жирных кислот в крови.Diabetes or diabetes mellitus manifests itself in the release of glucose in the urine with a significant increase in blood glucose (hyperglycemia) due to a chronic metabolic disorder, which is based on a lack of insulin or a reduced effect of insulin. Absent or reduced action of insulin leads to insufficient resorption and the use of glucose absorbed by the blood in the cells of the body. In adipose tissue under the influence of insulin-antagonistic hormones, increased lipolysis occurs with an increase in the amount of free fatty acids in the blood.

При ожирении (ожирение, тучность) речь идет о ненормальном увеличении массы по причине нарушенного энергетического баланса за счет чрезмерного поглощения калорий, которое создает риск в отношении здоровья.In obesity (obesity, obesity) we are talking about an abnormal increase in weight due to a disturbed energy balance due to excessive absorption of calories, which poses a health risk.

Определение количества гексозы, которое поглощается полученным, как только что описано выше, штаммом дрожжей, можно осуществлять посредством изучения поглощения с помощью радиоактивно меченой глюкозы. Для этого определенную концентрацию дрожжевых клеток, например, количество 60 мг, в расчете на мокрую массу, на мл, суспендируют, например, в 100 мкл буфера и смешивают с определенным количеством ¹⁴С- или ³Н-меченой глюкозы в качестве единственного источника углерода. Клетки инкубируют и в определенные моменты отбирают определенные количества клеток. Определение поглощенного количества глюкозы осуществляют с помощью LSC (жидкостной сцинтилляционный счетчик). Определение количества гексозы, которое поглощается полученным, как только что описано, штаммом дрожжей, однако также можно осуществлять с помощью теста в отношении роста на средах с глюкозой в качестве единственного источника углерода. Для этого определяют скорость роста штамма после добавления соединения, например, путем регулярных измерений оптической плотности культуры при 600 нм и эти значения сравнивают со скоростью роста контрольного штамма (например, дрожжевой штамм дикого типа).The determination of the amount of hexose that is absorbed by the yeast strain obtained, as just described above, can be carried out by studying the absorption with radioactively labeled glucose. For this, a certain concentration of yeast cells, for example, the amount of 60 mg, calculated on the wet weight, per ml, is suspended, for example, in 100 μl of buffer and mixed with a certain amount of ¹⁴ C- or ³ H-labeled glucose as the sole carbon source. Cells are incubated and at certain times certain numbers of cells are taken. Determination of the absorbed amount of glucose is carried out using an LSC (liquid scintillation counter). The determination of the amount of hexose that is absorbed by the yeast strain obtained as just described, however, can also be carried out using a growth test on media with glucose as the sole carbon source. To do this, determine the strain growth rate after adding the compound, for example, by regularly measuring the optical density of the culture at 600 nm and these values are compared with the growth rate of the control strain (for example, wild-type yeast strain).

Соединение получают, в частности, путем химического синтеза или путем выделения химических веществ из биологических организмов. Химический синтез можно осуществлять также автоматизированно. Получаемые путем синтеза или выделения соединения можно растворять в пригодном растворителе. Пригодными растворителями являются в особенности водные растворы, которые содержат определенную долю органического растворителя, как, например, диметилсульфоксид.The compound is obtained, in particular, by chemical synthesis or by isolating chemicals from biological organisms. Chemical synthesis can also be carried out automatically. Compounds obtained by synthesis or isolation can be dissolved in a suitable solvent. Suitable solvents are in particular aqueous solutions which contain a certain proportion of an organic solvent, such as dimethyl sulfoxide.

Введение в контакт штамма дрожжей с соединением для идентификации соединения, согласно настоящему изобретению, осуществляют в особенности в предусмотренных для этой цели лабораторных робототехнических устройствах. Такие устройства могут состоять из специально изготовленных камер с углублениями, титрационных микропланшетов, сосудов Эппендорфа или лабораторной стеклянной посуды. Лабораторные робототехнические устройства, как правило, разработаны в расчете на высокие скорости пропускания. Способ, как указанный выше, осуществляемый с помощью лабораторного робототехнического устройства, поэтому называют также как HTS (высокопроизводительный скрининг).The introduction of a yeast strain into contact with a compound for identifying a compound according to the present invention is carried out especially in laboratory robotic devices provided for this purpose. Such devices may consist of specially made chambers with recesses, microtiter plates, Eppendorf vessels, or laboratory glassware. Laboratory robotic devices are typically designed for high transmittance rates. A method as described above, carried out using a laboratory robotic device, is therefore also called HTS (high throughput screening).

Последовательность Seg ID № 1 представляет собой полинуклеотидную последовательность, включающую кодирующую область протеина GLUT4V85M. Seg ID № 2 представляет собой аминокислотную последовательность протеина GLUT4V85M. Seg ID № 3 представляет собой полинуклеотидную последовательность вектора p4H7GLUT4V85M.Seg ID No. 1 is a polynucleotide sequence comprising the coding region of the GLUT4V85M protein. Seg ID No. 2 is the amino acid sequence of the GLUT4V85M protein. Seg ID No. 3 is the polynucleotide sequence of the vector p4H7GLUT4V85M.

ПримерыExamples

Применение штаммов дрожжейThe use of yeast strains

Все, описанные в настоящей работе штаммы дрожжей, происходят от штамма CEN-PK2-1C (MATa leu2-3, 112 ura3-52 trp1-289 his3-Δ1MAL2-8^cSUC2). Получение штамма дрожжей с делециями в генах переносчиков гексозы (НХТ) описано Wieczorke и др., FEBS Lett., 464, 123-128 (1999): EBY-18ga (MATa Δhxt1-17 Δgal2 Δagt1 Δstl1 leu2-3, 112 ura3-52 trp1-289 his3-Δ1 MAL2-8^cSUC2); EBY.VW4000 (MATa Δhxt1-17 Δgal2 Δagt1 Δmph2 Δmph3 Δstl1 leu2-3, 112 ura3-52 trp1-289 his3-Δ1 MAL2-8^cSUC2). Среды основаны на 1% дрожжевого экстракта и 2% пептона (YP), в то время как минимальные среды состояли из 0,67% азотистого основания дрожжей без аминокислот (YNB) (Difco) и содержали добавки для ауксотрофных потребностей, а также различные источники углерода. Дрожжевые клетки культивировали в аэробных условиях при температуре 30°С в ротационном шейкере или на агаровых пластинках. За ростом клеток следили путем измерения оптической плотности при 600 нм (OD₆₀₀) или путем определения диаметра колоний дрожжей.All yeast strains described in this work are derived from strain CEN-PK2-1C (MATa leu2-3, 112 ura3-52 trp1-289 his3-Δ1MAL2-8 ^with SUC2). Obtaining a yeast strain with deletions in the genes of hexose transporters (NHT) is described by Wieczorke et al., FEBS Lett., 464 , 123-128 (1999): EBY-18ga (MATa Δhxt1-17 Δgal2 Δagt1 Δstl1 leu2-3, 112 ura3-52 trp1-289 his3-Δ1 MAL2-8 ^c SUC2); EBY.VW4000 (MATa Δhxt1-17 Δgal2 Δagt1 Δmph2 Δmph3 Δstl1 leu2-3, 112 ura3-52 trp1-289 his3-Δ1 MAL2-8 ^with SUC2). The media are based on 1% yeast extract and 2% peptone (YP), while the minimal media consisted of 0.67% nitrogenous yeast base without amino acids (YNB) (Difco) and contain additives for auxotrophic needs, as well as various carbon sources . Yeast cells were cultured under aerobic conditions at a temperature of 30 ° C in a rotary shaker or on agar plates. Cell growth was monitored by measuring absorbance at 600 nm (OD ₆₀₀ ) or by determining the diameter of yeast colonies.

Определение поглощения глюкозыDetermination of glucose uptake

Транспорт глюкозы определяли как поглощение D-[U-¹⁴C]-глюкозы (Amersham) и кинетические параметры определяли из графиков Eadie-Hofstee. Клетки получали путем центрифугирования, промывали фосфатным буфером и снова суспендировали в фосфатном буфере в концентрации 60 мг (мокрая масса) на мл. Поглощение глюкозы определяли при концентрации глюкозы от 0,2 мМ до 100 мМ и удельную активность субстрата изменяли от 0,1 кБк мкмоль^-1 до 55,5 кБк мкмоль^-1. Клетки и растворы глюкозы предварительно инкубировали в течение 5 минут при температуре 30°С. Поглощение глюкозы инициировали путем смешения клеток с радиоактивной глюкозой. После инкубации в течение 5 секунд смешивали с 10 мл охлажденного льдом стоп-буфера (0,1 М KiPO4, рН 6,5, 500 мМ глюкозы) и клетки быстро отфильтровывали на фильтрах из стекловолокон (диаметр = 24 мм, Whatman). Фильтры быстро промывали три раза с помощью охлажденного льдом буфера и введенную радиоактивность измеряли с помощью жидкостного сцинтилляционного счетчика. Ингибирование за счет цитохалазина В (конечная концентрация 20 мкМ, растворен в этаноле) определяли в осуществляемом в течение 15 секунд тесте на поглощение с помощью 50 мМ или 100 мМ радиоактивной глюкозы, после того как клетка в течение 15 минут была инкубирована в присутствии ингибитора или только растворителя.Glucose transport was measured as the uptake of D- [U- ¹⁴ C] -glucose (Amersham) and kinetic parameters determined from the graphs Eadie-Hofstee. Cells were obtained by centrifugation, washed with phosphate buffer and resuspended in phosphate buffer at a concentration of 60 mg (wet weight) per ml. Glucose uptake was determined at a glucose concentration of 0.2 mM to 100 mM and the specific activity of the substrate was varied from 0.1 kBq μmol ^-1 to 55.5 kBq μmol ^-1 . Cells and glucose solutions were pre-incubated for 5 minutes at a temperature of 30 ° C. Glucose uptake was initiated by mixing cells with radioactive glucose. After incubation for 5 seconds, it was mixed with 10 ml of ice-cold stop buffer (0.1 M KiPO4, pH 6.5, 500 mM glucose) and the cells were quickly filtered on fiberglass filters (diameter = 24 mm, Whatman). The filters were washed quickly three times with ice-cold buffer and the introduced radioactivity was measured using a liquid scintillation counter. Inhibition by cytochalazine B (final concentration of 20 μM, dissolved in ethanol) was determined in a 15-second absorption test using 50 mM or 100 mM radioactive glucose after the cell was incubated for 15 minutes in the presence of an inhibitor or only solvent.

Создана новая гетерологичная система экспрессии для переносчиков глюкозы клеток млекопитающих. Эта система базируется на штамме S. cerevisiae, из которого удалены все эндогенные переносчики глюкозы путем деструкции кодирующих генов. Этот штамм более неспособен поглощать глюкозу через клеточную мембрану и расти в присутствии глюкозы в качестве единственного источника углерода. Для интеграции гетерологичных переносчиков глюкозы человека или других млекопитающих, GLUT1 и GLUT4, в активной форме в клеточную мембрану дрожжей, нужно вводить дополнительные мутации в штамм дрожжей. GLUT1 активен только в мутантном штамме fgy1-1, GLUT4 активен только в двойных мутантах fgy1-1 fgy4-X.A new heterologous expression system for mammalian glucose transporters has been created. This system is based on a strain of S. cerevisiae, from which all endogenous glucose transporters are removed by the destruction of coding genes. This strain is no longer able to absorb glucose through the cell membrane and grow in the presence of glucose as the sole carbon source. To integrate heterologous carriers of glucose in humans or other mammals, GLUT1 and GLUT4, in active form into the cell membrane of yeast, additional mutations must be introduced into the yeast strain. GLUT1 is active only in the fgy1-1 mutant strain, GLUT4 is active only in the double mutants fgy1-1 fgy4-X.

Ген FGY1 может клонироваться. При этом речь идет о S. cerevisiae ORF YMR212c. По результатам изучения функции получается, что либо Fgy1, либо выработанный Fgy1 продукт ингибирует активность человеческих переносчиков глюкозы или принимает участие в слиянии транспортирующих GLUT везикул с клеточной мембраной.The FGY1 gene can be cloned. In this case, we are talking about S. cerevisiae ORF YMR212c. According to the results of the function study, it turns out that either Fgy1 or the product generated by Fgy1 inhibits the activity of human glucose transporters or takes part in the fusion of GLUT-transporting vesicles with the cell membrane.

В противоположность GLUT1 и подобно клеткам млекопитающих, большая часть протеинов GLUT4 в дрожжах локализована во внутриклеточных структурах. В целом, смогли выделить девять рецессивных мутантов (от fgy4-1 до fgy4-9), в которых GLUT4 направляется теперь дальше до клеточной мембраны и при одновременной fgy1-мутации становится там активным.In contrast to GLUT1 and like mammalian cells, most of the GLUT4 proteins in yeast are localized in intracellular structures. In total, nine recessive mutants (from fgy4-1 to fgy4-9) were identified, in which GLUT4 is now directed further to the cell membrane and, with the simultaneous fgy1 mutation, becomes active there.

Для комплементационного анализа использовали описанный Bruns и др. (Genes Dev., 8, 1087-10...5 (1994)) инсерционный банк генов. Штамм hxt fgy1-1 трансформировали сначала с помощью плазмиды GLUT4 и затем с помощью мобилизованного инсерционного банка генов. Затем искали трансформанты, которые могли расти на содержащей глюкозу среде. В случае одного из исследованных мутантов установлено, что ген ERG4 был подвергнут деструкции. ERG4 кодирует фермент (оксидоредуктаза) биосинтеза эргостерола. Этот фермент, стерол-С-24(28)-редуктаза, катализирует последнюю стадию биосинтеза эргостерола и превращает эргоста-5,7,22,24(28)-тетраенол в конечный продукт эргостерол. Протеин Erg4 содержит, по всей вероятности, восемь трансмембранных доменов и локализован в эндоплазматическом ретикулуме. erg4-Мутант является жизнеспособным, так как встраивание предшественников эргостерола в мембраны дрожжей компенсирует потерю эргостерола.For complementation analysis, the insertion gene bank described by Bruns et al. (Genes Dev., 8 , 1087-10 ... 5 (1994) was used. The hxt fgy1-1 strain was first transformed using the GLUT4 plasmid and then using a mobilized insertion gene bank. Then they looked for transformants that could grow on a glucose-containing medium. In the case of one of the studied mutants, it was found that the ERG4 gene was subjected to destruction. ERG4 encodes an enzyme (oxidoreductase) of ergosterol biosynthesis. This enzyme, sterol-C-24 (28) -reductase, catalyzes the last stage of ergosterol biosynthesis and converts ergosta-5,7,22,24 (28) -tetraenol into the final product ergosterol. The Erg4 protein contains, in all probability, eight transmembrane domains and is localized in the endoplasmic reticulum. erg4-Mutant is viable since incorporation of ergosterol precursors into yeast membranes compensates for the loss of ergosterol.

Ингибирующее влияние Erg4 на функциональность GLUT4 подтверждено целенаправленной делецией erg4 в случае штамма hxt fgy1-1. Полученный в результате штамм (hxt fgy1-1 Δerg4) обозначен как SDY022.The inhibitory effect of Erg4 on GLUT4 functionality is confirmed by a targeted deletion of erg4 in the case of hxt fgy1-1 strain. The resulting strain (hxt fgy1-1 Δerg4) is designated as SDY022.

Тесты на взаимодействия протеинов при использовании системы “расщепление с участием убикитина” показали, что человеческий GLUT4 взаимодействует непосредственно с Erg4 дрожжей. Поэтому можно исходить из того, что протеин Erg4 дрожжей в эндоплазматическом ретикулуме либо непосредственно предотвращает дальнейшую транслокацию GLUT4, либо он модифицирует GLUT4 каким-либо образом, который важен для транслокации и/или функции.Tests for protein interactions using the ubiquitin cleavage system showed that human GLUT4 interacts directly with yeast Erg4. Therefore, it can be assumed that the yeast Erg4 protein in the endoplasmic reticulum either directly prevents further translocation of GLUT4, or it modifies GLUT4 in any way that is important for translocation and / or function.

Точно так же показано, что единственная делеция ERG4 в нулевом штамме hxt, следовательно, несмотря на функциональный FGY1, активирует GLUT1, но не GLUT4. Результаты теста на рост представлены в таблице 1.It was likewise shown that a single deletion of ERG4 in the null strain hxt, therefore, despite functional FGY1, activates GLUT1 but not GLUT4. The growth test results are presented in table 1.

Для исключения того, что эргостерол сам оказывает негативное влияние на GLUT4, осуществляли тест в отношении роста на агаровых пластинках в присутствии эргостерола в анаэробных условиях. Все трансформированные с помощью GLUT4 штаммы дрожжей не могли расти в этих условиях (таблица 2). Также трансформанты GLUT1 в штамме hxt fgy1-1, в противоположность аэробному росту, в анаэробных условиях не показали никакого роста в присутствии глюкозы. Только после делеции ERG4 трансформанты GLUT1 могли расти.To exclude that ergosterol itself has a negative effect on GLUT4, an agar growth test was performed in the presence of ergosterol under anaerobic conditions. All yeast strains transformed with GLUT4 could not grow under these conditions (Table 2). Also, GLUT1 transformants in the hxt fgy1-1 strain, in contrast to aerobic growth, under anaerobic conditions showed no growth in the presence of glucose. Only after deletion of ERG4 did GLUT1 transformants grow.

Замена Val85 на Met путем мутагенеза in vitro сделала GLUT4 независимым от мутации fgy1-1 и привела к тому, что GLUT4V85M уже в штамме hxt erg4 был функционален. Это наблюдение указывает на то, что Fgy1 прямо или косвенно воздействует на это положение, которое находится внутри второй трансмембранной спирали переносчиков GLUT.Replacing Val85 with Met by in vitro mutagenesis made GLUT4 independent of the fgy1-1 mutation and led to the fact that GLUT4V85M was already functional in the hxt erg4 strain. This observation indicates that Fgy1 directly or indirectly affects this position, which is located inside the second transmembrane helix of GLUT transporters.

В таблице 3 представлено описание штаммов дрожжей, депонированных, согласно настоящей заявке, в Немецкой коллекции микроорганизмов и клеточных культур (DSMZ) - Mascheroder Weg 1b, 38124 Брауншвейг.Table 3 provides a description of the yeast strains deposited, according to this application, in the German collection of microorganisms and cell cultures (DSMZ) - Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig.

Таблица 1Table 1 Рост трансформантов GLUT1 и GLUT4 на содержащей глюкозу средеGrowth of GLUT1 and GLUT4 transformants on glucose-containing medium ГенотипGenotype 1% Глюкозы1% Glucose 1% Глюкозы1% Glucose

Таблица 2table 2 Рост трансформантов GLUT1 и GLUT4 на содержащей глюкозу среде с эргостеролом и без него в анаэробных условияхGrowth of GLUT1 and GLUT4 transformants on glucose-containing medium with and without ergosterol under anaerobic conditions ГенотипGenotype 1% Глюкозы1% Glucose 1% Глюкозы+33 мг/л эргостерола1% Glucose + 33 mg / L Ergosterol

Таблица 3Table 3 Признаки депонированных штаммов дрожжей (Saccharomyces cerevisiae)Signs of deposited yeast strains (Saccharomyces cerevisiae) Номер депониро-вания в
DSMZEscrow number in
DSMZ ГенотипGenotype ФенотипPhenotype ПлазмидаPlasmid

The strain grows in the presence of 1% maltose as a carbon source; auxotroph for glucose, leucine, tryptophan, histidine and uracil.

The strain grows in the presence of 1% maltose as a carbon source; auxotroph for glucose, leucine, tryptophan, and histidine. p4H7GLUT4V85M (selection marker URA3), = identified sequence No. 3.

Основная среда: 0,67 % дрожжевого азотистого основания дрожжей без аминокислот (Difco); рН 6,2.Main environment: 0.67% yeast nitrogenous base of the yeast without amino acids (Difco); pH 6.2.

Дополнение в случае ауксотрофий: лейцин (0,44 мМ), триптофан (0,19 мМ), гистидин (0,25 мМ), урацил (0,44 мМ). Мальтозу можно использовать в количестве 1-2 %.Supplement in the case of auxotrophy: leucine (0.44 mm), tryptophan (0.19 mm), histidine (0.25 mm), uracil (0.44 mm). Maltose can be used in an amount of 1-2%.

Claims

1. Purified and isolated polynucleotide encoding a protein with functional activity of the glucose transporter and having a DNA sequence that essentially corresponds to the sequence encoding the GLUT4V85M protein.

2. The polynucleotide according to claim 1, characterized in that the polynucleotide comprises a sequence of one of the following groups:
a) the nucleotide sequence according to Seq ID No. 1;
b) a nucleotide sequence that, under stringent conditions, hybridizes to Seq ID No. 1 and encodes a GLUT4V85M protein.

3. The polynucleotide according to claim 1, wherein the GLUT4V85M protein has an amino acid sequence according to Seq ID No. 2.

4. A protein with functional activity of the glucose transporter, characterized in that it is encoded either by the nucleotide sequence encoding the GLUT4V85M protein, or by the nucleotide sequence shown in Seq ID No. 1, or the nucleotide sequence which under strict conditions hybridizes with Seq ID No. 1 and encodes protein GLUT4V85M, or the nucleotide sequence encoding a protein GLUT4V85M with the amino acid sequence according to Seq ID No. 2.

5. The protein according to claim 4, consisting of the amino acid sequence according to Seq ID No. 2.